CN112877335B - 三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因及其编码蛋白和应用。三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。本发明为三疣梭子蟹的病害防治、基因辅助选育奠定了基础，且在开发抗菌药物、菌凝集制剂、新型免疫活性剂、饲料添加剂生产等方面具有潜在的应用价值。

Description

三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

血管生成素(angiopoietin，Ang)属于纤维蛋白原相关蛋白(Fibrinogen-relatedproteins,FREP)家族，是第一个被确定的来源于人肿瘤组织具有促血管生成功能的细胞因子。目前在哺乳动物中发现4种血管生成素，包括Ang1、Ang2、Ang3和Ang4。它们可以与内皮细胞受体酪氨酸激酶(Tie2)结合。这些蛋白具有共同的结构，即N端分泌相关的信号肽、介导同源寡聚体形成的螺旋样结构域(coiled-coil domain)和C端介导配体活性的纤维蛋白原样(fibrinogen-like，FBG)结构域。

在无脊椎动物中，发现了与哺乳动物血管生成素的结构域类似的FREP分子，其功能报道大多数是参与在先天性免疫防御。FREPs的FBG结构域主要参与糖识别，其中含有特异性糖结合位点，能够特异性结合N-乙酰-D-半乳糖胺与N-乙酰-D-葡糖胺，可以作为模式识别受体发挥免疫功能。

三疣梭子蟹是我国重要的海水养殖品种。随着养殖产业规模不断扩大，梭子蟹病害问题日趋严重，特别是弧菌病严重困扰梭子蟹养殖产业的健康发展。研究血管生成素同源分子PtANG对理解三疣梭子蟹的免疫防御机制、进行病害防治具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明旨在提供一种三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因，三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

所述PtANG基因编码蛋白为序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列所示。

一种三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因编码蛋白的应用，所述三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因编码蛋白的重组表达产物在制备抗菌药物、菌凝集制剂或菌结合制剂中的应用。

所述三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因编码蛋白的重组表达产物在用于制备革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌的抗菌药物中的应用。

所述革兰氏阴性菌为副溶血弧菌、溶藻弧菌或铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌为藤黄微球菌或金黄色葡萄球菌。

所述三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因编码蛋白的重组表达产物在用于制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌的凝集剂或结合制剂。

进一步的说在10mM Ca²⁺存在下，重组蛋白PtFREP对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌具有明显的凝集效果。

所述革兰氏阴性菌为副溶血弧菌、溶藻弧菌或铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌或藤黄微球菌；所述真菌为毕赤酵母菌。

本发明所具有的优点：

本发明利用转录组测序获得的unigene和RACE技术从三疣梭子蟹中克隆到血管生成素PtANG基因cDNA全长序列，通过PCR技术扩增编码PtANG成熟肽的基因片段并将其克隆到pET32a(+)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)实现体外重组表达。重组蛋白PtANG经TALON柱纯化和透析后，革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌)、对革兰氏阴性菌(副溶血弧菌、溶藻弧菌、铜绿假单胞菌)、真菌(毕赤酵母菌)具有明显凝集效果均具有凝集和结合活力。重组蛋白PtANG对副溶血弧菌、溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，最小抑菌浓度分别为1.66～3.32μM、0.83～1.66μM、0.83～1.66μM、1.66～3.32μM、0.83-1.66μM。

本发明的PtANG基因及其重组蛋白可生产抑菌药物、菌凝集制剂、菌结合制剂等，应用于水产养殖过程中相关虾蟹疾病的治疗，或用于饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂的生产等，另外还可以为进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治和基因辅助选育提供参考。

附图说明

图1为本发明实例提供的三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因的核苷酸和氨基酸序列(红色下划线：起始密码子和终止密码子；红色框部分：信号肽；阴影部分：FBG结构域；黑色下划线：coiled-coil结构域；波浪线下划线：糖结合位点)。

图2为本发明实例提供的纯化后三疣梭子蟹血管生成素PtANG编码成熟肽的基因扩增产物(其中，M：DNA marker，1、2：成熟肽的基因扩增产物)。

图3为本发明实例提供的诱导和纯化后三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白(图3a中，M：蛋白marker；1：未诱导PtANG菌体中表达的蛋白；2：IPTG诱导后PtANG表达的蛋白；3：纯化的PtANG重组蛋白。图3b中，M：蛋白marker；1：未诱导pET-32a菌体中表达的蛋白；3：IPTG诱导后pET-32a表达的蛋白；4：纯化的pET-32a重组蛋白)。

图4为本发明实例三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白对细菌和真菌凝集活性图(检测荧光标记的副溶血弧菌、溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和毕赤酵母菌，rPtANG、rTrx、CaCl₂和EDTA分别是25nmol L^-1、25nmol L^-1、10mmol L^-1和10mmol L^-1，PBS和rTrx分别作为空白和阴性对照)。

图5为本发明实例三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白对细菌、真菌结合活性图(其中M：蛋白marker；E：微生物与PtANG重组蛋白的洗脱液；S：微生物与重组蛋白孵育离心后上清液；W：微生物与PtANG重组蛋白孵育后洗涤液)。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

本发明中的三疣梭子蟹血管生成素PtANG的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的检测；

b)三疣梭子蟹cDNA文库构建；

c)三疣梭子蟹转录组测序及分析；

d)三疣梭子蟹unigene序列的同源性分析及PtANG基因片段的筛选；

e)RACE扩增获得PtANG的全长序列以及全长序列的验证。

实施例1.

三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因为SEQ ID No.1中所示的碱基序列。

参见图1，序列表SEQ ID No.1为：

GGGCGTGGTCTCAGTAGTGGTGATAGTGGTGGTGGTAACAGTAGTAGACACAACCACCTAACAACCTCAATAACCCCATTAACAATCAAACAAAGTAGAGATAATTATTATTGGTTTATATAATTGCTTTTGTGTTTCTTTTTTTTTCAATAATGGCAATTTACAGGTTAATCTTCTATTTATCCCTGCTCTTCTTTTGTTTGACGGAGGCAGCCTCACGTGCAGGCAGGACGAGGGAACAGCTAGCCTCCTTGCACAGACAGATACGCGCCTTGGAGGAGATCCAGGAAGAGGTACGCGGGGATCTGGCCACACTGCACGGTCACATGAAACCCCTGAAGGAGGTACAAGCTGATCTGAAGAAGCTACGAGCTGATATAGACGCCTTAACCTCGCTAGTTGAATCCACCATGCCGGAAGATTGCTGGGCGGCCAAAGCTAGAGGGTCTACGAAGAGGATTGTGACAGTGAAGCCTCCAGGACTGGCGCCGCGGGAGGTGGTGTGCGACCAGGTCCGGGAGGGAGGCGGCTGGACACTCATGCTGGCCAGAACCCCGACACACGAGAACAACAATTTGAGGGAAAACTTCAATAAAACGTGGAAGGAGTACCGGGAGGGGTTTGGTGACCTGCGAGGGGAATTTTGGATAGGTAACGAGGTAGTGCACGCTCTCACCAGCGAAATACCTTACCAGCTGTACGTCTTGCTTGAGGATTGGGATGGAAATGTTGCAGAAGGGATGTGGAATCAATTTAGGATAGCGAGTGAGGCGGAGGACTACCGGCTTAGTGTGGAGGGGTACCATGCCTTGAGCACCACTGGGGACTCCTTCAGCCTCCACCACCACCGCCGCCCCTTCTCCACCTACGACAGAGACAACGACACAGATGACCACGACCACTGCGCCAGGAGTTATGGTGGCGGATGGTGGTACTTTCAATGCCATGTGTCTCATCTGACGGGGTCCGCGCTGCCACGTCGCGAGGGAGGGCAACACGCCATCATGTGGAAGAGCTGGAAAAACACCGAGGGTCTGAGGAGTGCCTACATGGCCATCCGTCCACGCCCACCCAAGATGCAGACTTTTGCTGCACCTTCCTACCACCGCTCACCCCGCGCTGCCATGCCCTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCATTTATTATTACGTTCCTTTGTTCTTATTTAATACCAGCAGACAGTAGGTAAGTAACTCTCATATCAATCAAGAGGGACACTGTGAACGTGCTTTGGTACACCTTGATGTGCCTCGCTGAAACGGTAACACGCTGAAAAGTTTAGGAACCAATGTATTATAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCCCTGTAGGTATAACGCAATAATTCATGTAGTATATTCCCTCTGTAACAAACCAATAAACGAAACGAATCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA

(a)序列特征

●长度：1473bp(有效长度153～1133bp)

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)

(f)特异性名称：CDS

构建具体操作如下：

1.三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA纯化：利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取三疣梭子蟹成体组织的总RNA。琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop检测RNA的纯度，Qubit对RNA浓度进行精确定量，Agilent 2100精确检测RNA的完整性。

2.三疣梭子蟹cDNA文库构建：将上述获得mRNA样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I和RNase H合成二链cDNA，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPureXP beads纯化PCR产物，得到最终的文库(由北京诺禾致源科技股份有限公司构建合成)。

3.转录组测序及分析：cDNA文库检验合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq/MiSeq测序。对于无参考基因组物种的转录组分析，先将测序所得的序列拼接成转录本，以转录本为参考序列，进行后续分析。高通量测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列，我们称之为Raw Data或Raw Reads。然而，原始测序序列中含有带接头的、低质量的reads。为了保证信息分析质量，必须对raw reads过滤得到clean reads，后续分析都基于clean reads。获得clean reads后，采用Trinity转录组拼接软件对clean reads进行拼接。取每条基因中最长的转录本作为unigene，以此进行后续的分析。后续分析包括基因功能注释(基因功能注释数据库包括Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swiss-prot，KEGG，GO)、CDS预测、基因表达水平分析、直系同源基因筛选等生物信息学分析。

4.三疣梭子蟹unigene序列的同源性分析及PtANG基因片段的筛选：在三疣梭子蟹转录组中获得1条ANG相关的unigene(c_93640_g1)，将其在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，结果显示该序列与南美白对虾的PvANG(XP_027219075.1)、与鱼类PnANG7、CcANGPT7具有部分同源性，确定为三疣梭子蟹PtANG基因的unigene序列。

5.三疣梭子蟹PtANG基因cDNA ORF序列的克隆：根据与PtANG基因同源的unigene序列设计特异引物F(5'CCTAACAACCTCAATAACCCCAT 3')和R(5'GTGTACCAAAGCACGTTCACAGT3')，用三疣梭子蟹cDNA模板进行扩增PtANG的ORF。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Axygen胶回收试剂盒进行PCR产物回收和纯化，再与pMD-19T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态DH5α(北京全式金生物技术有限公司)，挑选阳性克隆用载体引物M13进行测序，所得结果经SeqMan软件进行拼接，得到三疣梭子蟹PtANG基因ORF cDNA序列见SEQ ID No.1。

6.三疣梭子蟹PtANG基因cDNA全长序列的扩增：：以上述步骤5测序拼接的PtANGORF序列上设计扩增3'端的两条特异引物3P1(5'TTAGGATAGCGAGTGAGGCGGAGGAC 3')和3P2(5'GAGACAACGACACAGATGACCACGACC 3')，特异引物3P1分别与100×UPM(5'CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3')进行3'端的第一次扩增，以cDNA为模板进行全长的验证。特异引物3P2分别与Nup(5'AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT 3')进行3'端的第二次扩增，以第一次扩增的结果为模板进行全长的验证。测序及分析同5。

ORF扩增反应体系及反应条件：

25μL反应体系：

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。

3'RACE第一次扩增反应体系及反应条件：

25μL反应体系：

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：98℃变性2min；98℃变性20s，64℃退火30s，72℃延伸2min，5个循环；98℃变性20s，61℃退火30s，72℃延伸2min，8个循环；98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

3'RACE第二次扩增反应体系及反应条件：

50μL反应体系：

反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：98℃变性2min；98℃变性20s，64℃退火30s，72℃延伸2min，5个循环；98℃变性20s，61℃退火30s，72℃延伸2min，8个循环；98℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃延伸10min。

序列表SEQ ID No.1从三疣梭子蟹中克隆到PtANG基因cDNA全长1475bp，其中开放阅读框981bp，5'非翻译区152bp，3'非翻译区342bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。

实施例2.

三疣梭子蟹PtANG序列表SEQ ID No.1所述碱基序列，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所述。

序列表SEQ ID No.2为：

MAIYRLIFYLSLLFFCLTEAASRAGRTREQLASLHRQIRALEEIQEEVRGDLATLHGHMKPLKEVQADLKKLRADIDALTSLVESTMPEDCWAAKARGSTKRIVTVKPPGLAPREVVCDQVREGGGWTLMLARTPTHENNNLRENFNKTWKEYREGFGDLRGEFWIGNEVVHALTSEIPYQLYVLLEDWDGNVAEGMWNQFRIASEAEDYRLSVEGYHALSTTGDSFSLHHHRRPFSTYDRDNDTDDHDHCARSYGGGWWYFQCHVSHLTGSALPRREGGQHAIMWKSWKNTEGLRSAYMAIRPRPPKMQTFAAPSYHRSPRAAMP

其具有完整的编码蛋白含有326个氨基酸，该编码序列有信号肽(1-20)，预测的分子量为37.72kDa，等电点为6.95。成熟肽含有306个氨基酸，具有典型的FBG结构域(86-305)，其中预测到两个糖结合位点NKTW和NDTD。

三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白的获得，具体操作如下：

根据SEQ ID No.2对应的cDNA序列，设计含有限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点的特异性引物PtANG-QF(5'CGCGGATCCTCACGTGCAGGCAGGACG3')和PtANG-QR(5'CCGCTCGAGGTAGGAAGGTGCAGCAAAAGTCTG 3')，通过PCR技术扩增编码PtANG成熟肽的基因片段(参见图2)，反应在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600(Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为：94℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸10min。然后通过酶切将其克隆到pET32a(+)表达载体中，转化到大肠杆菌BL21(DE3)-plysS，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到LB培养基中，37℃振荡培养至OD_600nm＝0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1mM诱导4h后离心收集菌体。菌体在冰浴条件下用超声波180W处理45min(每次2s，间隔2s)，离心去掉上清，收集沉淀。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱纯化重组产物。将纯化的重组蛋白转移到透析袋中，4℃条件下，在含有2mM还原谷胱苷肽、0.2mM氧化谷胱苷肽、1mM EDTA、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、10％甘油和1％甘氨酸的及梯度降低的尿素(6、5、4、3、2、1、0M)的透析复性液(pH＝8.0)中透析，使重组蛋白复性，最后在50mM Tris-HCl(pH＝8.0)的缓冲液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析复性后的重组蛋白经PALL公司的Microsep Advance超滤离心浓缩管进行浓缩，用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测得三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白的浓度为2.7mg/mL(参见图3)。

实施例3.

1.三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白的体外抑菌试验

微生物的培养及制备：副溶血弧菌用TSB培养基28℃培养，溶藻弧菌用TSB培养基28℃培养，铜绿假单胞菌用TSB培养基37℃培养，金黄色葡萄球菌用LB培养基37℃培养，藤黄微球菌用LB培养基37℃培养，毕赤酵母用YPD培养基28℃培养，上述各菌株用摇床220rpm/min培养使菌浓度达到对数生长期时，分别用50mM Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1×10³个。

重组蛋白血管生成素PtANG抑菌活性测定：利用上述实施例所得重组蛋白PtANG用Tris-HCl(50mM，pH＝8.0)梯度稀释(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64)后，取上述稀释不同浓度的重组蛋白50μL加到无菌平底96孔板(Costar，Fisher)中，50μL Tris-HCl(50mM，pH＝8.0)设为对照，然后加入50μL菌悬液，并以只加入50μL菌液的孔为空白孔。96孔板在菌液的培养温度下孵育2小时后，加入相应的培养基150μL，空白孔加入培养基至200μL，孵育过夜。而后对加副溶血弧菌、溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、毕赤酵母的96孔板在波长为560nm下读数测吸光值，加金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的96孔板在波长为600nm下测量。最小抑菌浓度为微生物可以生长的最大重组蛋白浓度和微生物被完全抑制生长的最低浓度之间的范围。发现上述实施例重组蛋白PtANG对革兰氏阴性菌副溶血弧菌、溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，最小抑菌浓度分别为1.66～3.32μM、0.83～1.66μM、0.83～1.66μM、1.66～3.32μM、0.83-1.66μM，而对真菌毕赤酵母没有明显的抑制作用。

2.三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白的体外微生物凝集实验

FITC染色：分别取上述培养至对数生长期的细菌、真菌1.0mL，于4℃4000rpm离心5min收集菌体，弃去培养基后用PBS洗菌3次。加入终浓度为0.1mg mL^-1的FITC，暗处慢摇染色过夜。于4℃4000rpm离心5min收集菌体，弃去培养基后用PBS洗菌3次，以去除残留的FITC。

凝菌实验：使用无菌PBS将FITC标记的菌重悬，调整菌浓度至2.5×10⁹个mL^-1。实验组中，取25μL PtANG重组蛋白与20μL FITC标记的菌悬液于1.5mL离心管中混匀；对照组中，取25μL rTrx与20μL FITC标记的菌悬液混匀。为观察Ca²⁺是否对凝集活性有影响，在实验组和对照组中分别加入10mM CaCl₂和用10mM EDTA螯合Ca²⁺。将样品置于暗处28℃慢摇孵育2h，取5μL于荧光显微镜下观察(参见图4)。发现上述实施例重组蛋白PtANG在Ca²⁺存在下对革兰氏阴性菌副溶血弧菌、溶藻弧菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌、真菌毕赤酵母菌均有显著的凝集作用。

3.三疣梭子蟹血管生成素PtANG重组蛋白的体外微生物结合实验

分别取上述培养至对数生长期的细菌、真菌各1.0mL，10000rpm离心1min收集菌体；将收集的菌体用1.0mL 37％的甲醛中固定，37℃轻摇震荡1h。将细菌、真菌于4℃4000rpm离心10min，收集菌体；用1.0mL Tris-HCl缓冲液将菌体洗2次，最后用1.0mL Tris-HCl缓冲液重悬菌体；分别将0.5mL菌悬液与0.5mL PtANG重组蛋白混合，4℃轻摇震荡30min后，于4℃4000rpm离心5min；保留上清到新的离心管，用1.0mL Tris-HCl缓冲液将沉淀洗涤2遍，第1次的洗涤液要保留到新的离心管；将菌体重组蛋白结合物与50μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液洗脱，将50μL上清液、50.0μL洗涤液分别与50μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀；分别将洗脱液、上清液、洗涤液进行15％SDS-PAGE电泳(参见图5)。由图5可见，上述实施例重组蛋白PtANG对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、副溶血弧菌和铜绿假单胞菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌以及真菌毕赤酵母菌均有结合活力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因及其编码蛋白和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggcgtggtc tcagtagtgg tgatagtggt ggtggtaaca gtagtagaca caaccaccta 60

acaacctcaa taaccccatt aacaatcaaa caaagtagag ataattatta ttggtttata 120

taattgcttt tgtgtttctt tttttttcaa taatggcaat ttacaggtta atcttctatt 180

tatccctgct cttcttttgt ttgacggagg cagcctcacg tgcaggcagg acgagggaac 240

agctagcctc cttgcacaga cagatacgcg ccttggagga gatccaggaa gaggtacgcg 300

gggatctggc cacactgcac ggtcacatga aacccctgaa ggaggtacaa gctgatctga 360

agaagctacg agctgatata gacgccttaa cctcgctagt tgaatccacc atgccggaag 420

attgctgggc ggccaaagct agagggtcta cgaagaggat tgtgacagtg aagcctccag 480

gactggcgcc gcgggaggtg gtgtgcgacc aggtccggga gggaggcggc tggacactca 540

tgctggccag aaccccgaca cacgagaaca acaatttgag ggaaaacttc aataaaacgt 600

ggaaggagta ccgggagggg tttggtgacc tgcgagggga attttggata ggtaacgagg 660

tagtgcacgc tctcaccagc gaaatacctt accagctgta cgtcttgctt gaggattggg 720

atggaaatgt tgcagaaggg atgtggaatc aatttaggat agcgagtgag gcggaggact 780

accggcttag tgtggagggg taccatgcct tgagcaccac tggggactcc ttcagcctcc 840

accaccaccg ccgccccttc tccacctacg acagagacaa cgacacagat gaccacgacc 900

actgcgccag gagttatggt ggcggatggt ggtactttca atgccatgtg tctcatctga 960

cggggtccgc gctgccacgt cgcgagggag ggcaacacgc catcatgtgg aagagctgga 1020

aaaacaccga gggtctgagg agtgcctaca tggccatccg tccacgccca cccaagatgc 1080

agacttttgc tgcaccttcc taccaccgct caccccgcgc tgccatgccc tgagagagag 1140

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagcattta ttattacgtt 1200

cctttgttct tatttaatac cagcagacag taggtaagta actctcatat caatcaagag 1260

ggacactgtg aacgtgcttt ggtacacctt gatgtgcctc gctgaaacgg taacacgctg 1320

aaaagtttag gaaccaatgt attatagtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1380

gtgccctgta ggtataacgc aataattcat gtagtatatt ccctctgtaa caaaccaata 1440

aacgaaacga atcttaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1473

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ile Tyr Arg Leu Ile Phe Tyr Leu Ser Leu Leu Phe Phe Cys

1 5 10 15

Leu Thr Glu Ala Ala Ser Arg Ala Gly Arg Thr Arg Glu Gln Leu Ala

20 25 30

Ser Leu His Arg Gln Ile Arg Ala Leu Glu Glu Ile Gln Glu Glu Val

35 40 45

Arg Gly Asp Leu Ala Thr Leu His Gly His Met Lys Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Val Gln Ala Asp Leu Lys Lys Leu Arg Ala Asp Ile Asp Ala Leu Thr

65 70 75 80

Ser Leu Val Glu Ser Thr Met Pro Glu Asp Cys Trp Ala Ala Lys Ala

85 90 95

Arg Gly Ser Thr Lys Arg Ile Val Thr Val Lys Pro Pro Gly Leu Ala

100 105 110

Pro Arg Glu Val Val Cys Asp Gln Val Arg Glu Gly Gly Gly Trp Thr

115 120 125

Leu Met Leu Ala Arg Thr Pro Thr His Glu Asn Asn Asn Leu Arg Glu

130 135 140

Asn Phe Asn Lys Thr Trp Lys Glu Tyr Arg Glu Gly Phe Gly Asp Leu

145 150 155 160

Arg Gly Glu Phe Trp Ile Gly Asn Glu Val Val His Ala Leu Thr Ser

165 170 175

Glu Ile Pro Tyr Gln Leu Tyr Val Leu Leu Glu Asp Trp Asp Gly Asn

180 185 190

Val Ala Glu Gly Met Trp Asn Gln Phe Arg Ile Ala Ser Glu Ala Glu

195 200 205

Asp Tyr Arg Leu Ser Val Glu Gly Tyr His Ala Leu Ser Thr Thr Gly

210 215 220

Asp Ser Phe Ser Leu His His His Arg Arg Pro Phe Ser Thr Tyr Asp

225 230 235 240

Arg Asp Asn Asp Thr Asp Asp His Asp His Cys Ala Arg Ser Tyr Gly

245 250 255

Gly Gly Trp Trp Tyr Phe Gln Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Ser

260 265 270

Ala Leu Pro Arg Arg Glu Gly Gly Gln His Ala Ile Met Trp Lys Ser

275 280 285

Trp Lys Asn Thr Glu Gly Leu Arg Ser Ala Tyr Met Ala Ile Arg Pro

290 295 300

Arg Pro Pro Lys Met Gln Thr Phe Ala Ala Pro Ser Tyr His Arg Ser

305 310 315 320

Pro Arg Ala Ala Met Pro

325

Claims (3)

1.一种三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因，其特征在于：三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

2.一种权利要求1所述的三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因编码蛋白，其特征在于：所述PtANG基因编码蛋白为序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列所示。

3.一种按权利要求2所述的三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因编码蛋白的应用，其特征在于：所述三疣梭子蟹血管生成素PtANG基因编码蛋白的重组表达产物在制备革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌的抗菌药物、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌的凝集制剂或革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或真菌的结合制剂中的应用；

所述革兰氏阴性菌为副溶血弧菌、溶藻弧菌或铜绿假单胞菌；革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌或藤黄微球菌；所述真菌为毕赤酵母菌。

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