CN107653244B - 一种止血蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种止血蛋白及其制备方法和应用，所述止血蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或插入且与止血功能相关的衍生氨基酸序列。上述止血蛋白的制备方法主要包括：目的基因的合成及扩增、构建重组表达载体、构建基因工程菌、诱导表达和HisFF亲和层析纯化。该止血蛋白中杂质少，不含有毒有害成分，避免了病毒感染、病毒传播、过敏等不良反应的产生。该方法操作简单，生产周期短，成本较低，具有良好的工业化生产基础和良好的市场前景。

Description

一种止血蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明基因重组表达技术领域，具体涉及一种止血蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

根据2007年卫生部统计，每年各类伤害发生约2亿人次，因战争、交通事故、重大自然灾害等伤害死亡人数约70~75万人，然而失血过多是导致创伤死亡的主要因素之一。在各类突发性事故中，导致伤者死亡的直接原因一般不是事故本身所造成的伤害，而是伤员没能得到及时的救治，特别是治疗前创伤出血没能得到有效的控制，最终因失血过多而导致死亡。因此，有效地控制血液流失是急救和创伤治疗的重要步骤，也是挽救生命的关键措施。

在救治过程中，使用优良的止血材料可显著减少创伤部位的出血量，为伤者的抢救和治疗赢得更多的时间，在一定程度上降低创伤死亡率。因此，研制可快速、有效地控制出血的止血材料具有重要的意义。近年来，随着材料科技的不断发展，以及人们对止血产品的认识和要求的提高，胶原蛋白、角蛋白类止血材料越来越受到人们的关注和青睐。然而，当前胶原蛋白、角蛋白类产品多为提取方式获得，多采用酸、碱、氧化、还原等破坏蛋白质结构的化学提取过程，提取物为断裂的多种蛋白片段复合物，已经丧失或部分丧失了原本的生物学活性，导致其质量、性能的不稳定，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。 随着现代生物技术的发展，人们不断尝试利用转基因技术，在动物、植物和微生物表达体系中制备重组蛋白，解决了传统提取工艺的诸多缺点。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种具有优异止血功能的止血基因、止血蛋白及其制备方法，为本领域开发优良性能的止血药品提供更好更多的选择；同时解决现有止血蛋白生物活性不高、质量和性能不稳定的问题。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种止血基因， 包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经过一个或几个碱基的替换和/或缺失和/或插入且与编码止血功能相关的衍生多核苷酸序列。

进一步，本发明还提供一种止血蛋白，包括由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码得到SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或者如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或插入且与止血功能相关的衍生氨基酸序列。

本发明还提供一种融合表达载体，包含SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

进一步，本发明还提供一种止血蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1）根据权利要求1所示的多核苷酸序列，合成目的基因，再通过PCR扩增，得到止血基因并命名为PRO-1；

2）构建含有止血基因PRO-1的重组表达载体；

3）将步骤2）构建好的重组表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

4）将步骤3）得到的大肠杆菌基因工程菌进行发酵培养至对数生长期；

5）发酵培养结束后，对大肠杆菌基因工程菌进行诱导和表达，即表达止血蛋白PRO-1；

6）将步骤5）表达的止血蛋白进行纯化，得到如SEQ ID NO.2所示的止血蛋白PRO-1。

另外，本发明还提供一种动物止血药物，其有效成分为上述的止血蛋白PRO-1。

如本文所使用的术语“插入”或“插入的”是指在止血蛋白中的氨基酸残基的添加，从而与止血蛋白中的氨基酸残基的数目相比，增加了所述区域中氨基酸残基的数目；或指在止血基因中的碱基的添加，从而与止血基因中的碱基的数目相比，增加了所述区域中碱基的数目。

如本文所使用的术语“替换”或“替换的”是指在止血蛋白中的一个或多个氨基酸残基的取代，从而改变了氨基酸序列，但不改变所述区域中氨基酸残基的数目；或指在止血基因中的一个或多个碱基的取代，从而改变了碱基序列，但不改变所述区域中碱基的数目。

如本文所使用的术语“缺失”或“缺失的”是指在止血蛋白中的一个或多个氨基酸残基的缺失，从而降低了所述多肽的所述区域中氨基酸残基的数目；或指在止血基因中的一个或多个碱基的缺失，从而降低了所述多核苷酸的所述区域中碱基的数目。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过创造性的设计和从头合成了具有止血功能的基因和止血蛋白，为止血药品提供更好更多的选择。本发明止血蛋白具有优异止血功能，能快速止血，有效减少出血量。经验证，该止血蛋白PRO-1片断能够将出血时间缩短了86%，出血量减少了72%。

2、本发明止血蛋白的制备方法主要包括：目的基因的合成及扩增、构建重组表达载体、构建基因工程菌、诱导表达和HisFF亲和层析纯化等步骤。由于本发明采用亲和柱层析的方式对设计并表达的蛋白进行纯化，使最终得到的止血蛋白中杂质少，得到的止血蛋白的氨基酸序列单一、完整，生物活性高，质量和性能稳定。不含有毒有害成分，避免了病毒感染、病毒传播、过敏等不良反应的产生。为解决现有止血蛋白生物活性不高、质量和性能不稳定的问题，提供更好的选择。

3、本发明采用微生物诱导表达的方式获得蛋白，避免了其动物源性导致病毒感染和传播的发生。该方法操作简单，生产周期短，成本较低，具有良好的工业化生产基础和良好的市场前景。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳图；

泳道1为DNA Marker（上海生工100~5000bp Marker S Plus），泳道2~3为PCR扩增的止血基因PRO-1片段；

图2为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

泳道1为蛋白Marker（Aidlab宽分子量蛋白质Marker）；泳道2~3为纯化后的融合蛋白；泳道4为经酶解纯化后的止血蛋白PRO-1；

图3为止血蛋白PRO-1出血量对比图；

图4为止血蛋白PRO-1出血时间对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

下述实施例中主要使用的试剂及仪器如下：

Trisbase(Amresco);HCl(SionpharmChemicalReagentCo.,Ltd);Acrylamide(Sigma);N,N'-Methylenebisacrylamide(Aladdin);SDS(Amresco)；TEMED(Amresco,)；过硫酸铵(Amresco,); 冰乙酸(国药)； methanol(国药)；甘氨酸(Amresco,)；考马斯亮蓝 R-250(Amresco);NaCl (国药); 甘油 (国药)；咪唑（索莱宝）；尿素（国药）；IPTG（sigma）；Yeast Extract(OXOID); Tryptone (OXOID,LP0042)；Agar(OXOID, LP0028A)；Amp(Amresco, 0339);DNA Polymerase (Takara)；Regular Agarose G-10 (BIOWEST)；Universal DNA Purification Kit (TIANGEN)；质粒小提试剂盒（TIANGEN）；DNA Ladder(Invitrogen)；Protein Ladder(Invitrogen)；XhoI (宝生物)；NcoΙ (宝生物)；Syntheticprimes (上海生工)； Trans1-T1 感受态细胞(北京全式金)；基因测序 (南京金斯瑞)；BL21(DE3)（北京全式金）。

实施例1

一、一种止血基因及止血蛋白

一种止血基因，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经过一个或几个碱基的替换和/或缺失和/或插入且与编码止血功能相关的衍生多核苷酸序列。

一种止血蛋白，包括由所述SEQ ID NO.1核苷酸序列编码得到的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或者如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或插入且与止血功能相关的衍生氨基酸序列。

一种融合表达载体，包含所述SEQ ID NO.1核苷酸序列。

实施例2

一种止血蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1）止血基因的合成和扩增

根据SEQ ID No.1所示的止血基因的核苷酸序列，于生工生物工程（上海）有限公司进行全基因合成并测序验证，得到模板基因PRO-1。

根据模板基因PRO-1的核苷酸序列，设计引物PRO-1-F和PRO-1-R，引入NcoΙ和XhoI酶切位点。以合成的PRO-1为模板，以PRO-1-F和PRO-1-R为引物进行PCR扩增。

所述引物序列如下：

PRO-1-F：GCCATGGACgacgacgacgacaagTCTTCTGGTG；

PRO-1-R：CCGCTCGAGCGGTTAGGTAACGGTGCAAGCAG。

其中，PRO-1-F的下划线序列为NcoΙ酶切位点，PRO-1-R的下划线序列为XhoΙ酶切位点。

PCR反应体系： 20 µmol/L的PRO-1-F和PRO-1-R各1 µL，25µL PrimeSTAR Max DNAPolymerase，1 µL模板基因PRO-1，加水补至总体积为50µL。

PCR反应条件：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸9s，29个循环；最后72℃延伸5 min；

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。如图1所示，扩增得到的目的片段（1.5kb左右）与预期片段大小相同，即获得目的基因PRO-1片段。

2）构建重组表达载体

分别用NcoΙ和XhoΙ双酶切处理步骤1）得到的目的基因PRO-1片段和表达载体pET-32a，回收PRO-1基因片段和表达载体pET-32a片段，并将上述片段共转化到分子克隆的感受态细胞中，通过筛选和测序，获得正确的含有止血基因PRO-1的重组表达载体（融合表达载体）。

3）构建大肠杆菌基因工程菌

（1）取BL21(DE3)感受态细胞于冰中溶解。

（2）取1ul融合表达载体加入BL21(DE3)感受态细胞轻轻混匀。

（3）在冰中静置30min后，于42℃热激60s迅速放回冰中。

（4）然后向感受态细胞中加入450ul室温LB培养基并于摇床37℃，220rpm摇1小时。

（5）再从管中取100ul菌液涂于含Amp抗生性的LB平板，37℃过夜培养。

（6）从平板上挑2个阳性克隆接于含100ug/ml Amp抗生素的5ml LB培养基中，37℃，220rpm摇菌培养3h左右，OD₆₀₀=0.6，取菌液保种。即获得含有止血基因PRO-1的重组表达载体的大肠杆菌基因工程菌。

4）大肠杆菌基因工程菌进行发酵培养、诱导和表达

（1）取20ul上述保种的大肠杆菌基因工程菌于含Amp抗性的200ml的LB液体培养基中，37℃，140rpm过夜培养。

（2）再将上述培养过夜的细菌培养液，按2%的接种量转接到含有Amp的LB液体培养基中，37℃110rpm培养3h左右，测OD₆₀₀=0.6左右，分别向培养基中加入0.5mM的IPTG诱导剂，16℃诱导培养16h，测OD₆₀₀=0.8左右，停止诱导。将菌液于3800rpm，4℃离心10min，收沉淀菌体。

5）HisFF亲和层析纯化止血蛋白

（1）取上述收集的沉淀菌体细胞20g，用100mlTris缓冲液（50mM Tris (pH 8.0),500mM NaCl, 5%wt Glycerol）重悬。

（2）均质机破碎2次，混匀20000rpm 4℃离心1h，由于目的蛋白存在于包涵体中，所以收集沉淀备用。

（3）将收集的沉淀用40ml变性buffer（50mM pH=8.0 Tris, 500mM NaCl, 5% 甘油，20mM β-巯基乙醇，8M尿素，余量为去离子水）重悬溶解。

（4）充分溶解后，20000rpm离心1h取上清液，再将上清液转入5ml HisFF亲和柱中（经变性Buffer平衡）。

（5）再用10倍变性buffer冲洗层析柱。

（6）然后依次用含有10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM和500mM咪唑的变性buffer进行阶段洗脱，收集洗脱蛋白液，然后将其透析，透析时间为12h，冻干，即得到融合蛋白。

（7）向步骤（6）获得的洗脱蛋白中加入重组肠激酶（每25ul的融合蛋白中加入1ul的重组肠激酶），在25℃条件下酶解24小时，用以去除位于止血蛋白N-末端的融合his标签，离心收集上清液。

（8）将步骤（7）收集的上清液转入5mlHisFF亲和柱中（经变性Buffer平衡），用10倍变性buffer冲洗层析柱，再用含有10mM咪唑的变性buffer洗脱，收集洗脱蛋白液，然后将其透析，透析时间为12h，冻干，即得到止血蛋白PRO-1。

将洗脱的目的蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，如图2所示，由于在重组肠激酶的酶解作用下融合蛋白是去除位于止血蛋白N-末端的融合his标签，所以酶解前后蛋白大小相差不大，由图2可以看出，洗脱的融合蛋白和酶解处理后的止血蛋白分子量（70kDa左右）与预期大小相符，可见，本发明获得了具有杂质较少的止血蛋白PRO-1。

三、止血蛋白的止血效果验证

选取6只健康的SD大鼠，且每只大鼠体重接近，随机分为2组，每组3只，每组实验大鼠分别进行肝脏穿刺以创建动物出血模型，其中一组为对照组（用壳聚糖进行喷撒止血），一组为实施例组（用实施例制备的止血蛋白PRO-1进行喷撒止血），其中壳聚糖与止血蛋白PRO-1的用量相同，并同时记录出血时间和出血量。

从图3和图4可以看出，与对照组相比，本发明的止血蛋白PRO-1能够将出血时间缩短了86%，出血量减少了72%。

综上，本发明的止血蛋白PRO-1具有优异止血功能，能快速止血，有效减少出血量，取得了意想不到的止血效果。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

序列表

<110> 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司；

<120> 一种止血蛋白及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1698

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

tcttctggtg tagatctggg taccgagaac ctgtacttcc aatccaatgc aatgtcggac 60

tcagaagtca atcaagaagc taagccagag gtcaagccag aagtcaagcc tgagactcac 120

atcaatttaa aggtgtccga tggatcttca gagatcttct tcaagatcaa aaagaccact 180

cctttaagaa ggctgatgga agcgttcgct aaaagacagg gtaaggaaat ggactcctta 240

agattcttgt acgacggtat tagaattcaa gctgatcaga cccctgaaga tttggacatg 300

gaggataacg atattattga ggctcacaga gaacagattg gtggcatgct gctggctctg 360

gaaatgggta aagaagacaa ctctctgtct gttatgaaag gtgttcagct gaaactggaa 420

cagggtgctc tggaagaaca gtgcgctacc tacgaagctg gttgctaccg taaccacgtt 480

cacctgcagc tgctggaaca ccaggaaacc gaattctctg ctaaaatgat ctctcagctg 540

gaatctcgtc agaaagaaca gggtctgacc gacggtgaac tgaaagaagc tcagcagacc 600

ccggaatacc tgaaaaacgt ttctctgcgt gctctgcagg acgaactgtg cctgtctctg 660

tctcagcagg gttgcctgtc tcgtgctggt gaagaacagt gcgaaaccga acgtctgctg 720

aaagaacaga ccccgtctct gtctaacctg aaagaacagt ctatgtgctc tgttttcacc 780

cgtatcaaac gtctggaaga caccctggaa gaaaacgaat gcctgcagga acagcaggtt 840

gaaaccaccc gttctaaaga aatcggtgaa ctgggtatcg aagaagaatc tctggctcac 900

cgtaccctgt ctctgaacga actggacgaa tctgaagctt acgaaaaaga agaactgaac 960

accgaactgg aactggctga agctcagctg aacatcccgt ctatgacccc gcagtgcctg 1020

tctatgtctt gcaaagttga agttctggct cacctgcagg aactggaacg tctgttccag 1080

tactacgaaa tctctatgga caccgcttgc ggtaccatgc tgcagcgtaa cctggctatg 1140

aacgctctgg ctctgacctg cgctctgcag cagacctctc gtgctgacca ggaatctcgt 1200

gttaactctg aatacaccgc taactctatc gaacaggttg ctatgtctat gccgtacgct 1260

gctaaccgtt acaaaatgca gtgcgaagac aaaaactacg ttcgtcacgc tcaggttcag 1320

gaagacgttg accgtgaaat cgctgacctg atcatggctt ctgacgaaca gcacgcttgc 1380

acctctaaat gctctgaatg catgcaggaa gaagctaaaa aagctcagtg cgctgttgaa 1440

gaacagtctt ctcgtgctaa atctctgaaa gctaacgctc agaacctgtt cgacaccctg 1500

gaatctaccg ctatgcgtga acgttctgaa cgtgttaacc tggaagaaga ctctcagctg 1560

gctcgtcgtg ctgttcgtga acagctgacc tctctgtgct ctgctgctga acgtgctatc 1620

caggacgaag aaccgcagaa atctcgtgtt caggcttgcg aactgaccgt tctgcacgct 1680

gcttgcaccg ttacctaa 1698

<210> 2

<211> 565

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

SSGVDLGTEN LYFQSNAMSD SEVNQEAKPE VKPEVKPETH INLKVSDGSS EIFFKIKKTT 60

PLRRLMEAFA KRQGKEMDSL RFLYDGIRIQ ADQTPEDLDM EDNDIIEAHR EQIGGMLLAL 120

EMGKEDNSLS VMKGVQLKLE QGALEEQCAT YEAGCYRNHV HLQLLEHQET EFSAKMISQL 180

ESRQKEQGLT DGELKEAQQT PEYLKNVSLR ALQDELCLSL SQQGCLSRAG EEQCETERLL 240

KEQTPSLSNL KEQSMCSVFT RIKRLEDTLE ENECLQEQQV ETTRSKEIGE LGIEEESLAH 300

RTLSLNELDE SEAYEKEELN TELELAEAQL NIPSMTPQCL SMSCKVEVLA HLQELERLFQ 360

YYEISMDTAC GTMLQRNLAM NALALTCALQ QTSRADQESR VNSEYTANSI EQVAMSMPYA 420

ANRYKMQCED KNYVRHAQVQ EDVDREIADL IMASDEQHAC TSKCSECMQE EAKKAQCAVE 480

EQSSRAKSLK ANAQNLFDTL ESTAMRERSE RVNLEEDSQL ARRAVREQLT SLCSAAERAI 540

QDEEPQKSRV QACELTVLHA ACTVT 565

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gccatggacg acgacgacga caagtcttct ggtg 34

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

ccgctcgagc ggttaggtaa cggtgcaagc ag 32

Claims (9)

1.一种止血基因，其特征在于，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种止血蛋白，其特征在于，由权利要求1所述SEQ ID NO.1核苷酸序列编码得到SEQID NO.2所示氨基酸序列。

3.一种融合表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述核苷酸序列。

4.一种动物止血药物，其特征在于，其有效成分为如权利要求2所述的止血蛋白。

5.一种止血蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）根据权利要求1所示的多核苷酸序列，合成目的基因，再通过PCR扩增，得到止血基因；

2）构建含有止血基因的重组表达载体；

3）将步骤2）构建好的重组表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

4）将步骤3）得到的大肠杆菌基因工程菌进行发酵培养至对数生长期；

5）发酵培养结束后，对大肠杆菌基因工程菌进行诱导和表达，即表达止血蛋白；

6）将步骤5）表达的止血蛋白进行纯化，得到权利要求2所述止血蛋白。

6.根据权利要求5所述止血蛋白的制备方法，其特征在于，步骤5）中所述止血蛋白的纯化，包括以下步骤：

（1）收集诱导表达后的菌体，用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集沉淀；

（2）将步骤（1）得到的沉淀用变性缓冲溶液重悬溶解，充分溶解后离心，收集上清液；

（3）将步骤（2）收集的上清液加入到HisFF柱中进行亲和层析纯化，然后用含咪唑的变性缓冲溶液作为洗脱液进行阶段洗脱，收集洗脱液，透析12~24h，冻干，即得到融合蛋白；

（4）将重组肠激酶加入步骤（3）获得的融合蛋白中进行酶解，反应结束后离心收集上清液并将其加入到HisFF亲和柱中，然后用含咪唑的变性缓冲溶液作为洗脱液进行阶段洗脱，收集洗脱产物，透析12~24h，冻干，即获得止血蛋白PRO-1。

7.根据权利要求6所述止血蛋白的制备方法，其特征在于，所述的变性缓冲溶液包括以下组分：50mM Tris、500mM NaCl、5wt%甘油、20mMβ-巯基乙醇、8M尿素、余量为去离子水，所述Tris的pH为8.0。

8.根据权利要求6所述止血蛋白的制备方法，其特征在于，所述的酶解温度为25℃，反应时间为12~48h。

9.根据权利要求6所述止血蛋白的制备方法，其特征在于，所述的含咪唑的变性缓冲溶液中咪唑浓度为10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM或500mM。

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