CN102224167B - 具有止血活性并能够诱导血小板聚集的重组蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够诱导血小板聚集的重组蛋白，并涉及其用途。

Description

具有止血活性并能够诱导血小板聚集的重组蛋白
本发明涉及由描述用于与血小板胶原受体相互作用的肽序列的组件(assembly)组成的重组蛋白。这些蛋白具有独立于三螺旋形成的促聚集活性。其可在细菌和在哺乳动物细胞中产生。 
胶原是所有多细胞生物的胞外基质的主要结构组分。其为由28个在发育过程中和在组织稳态(tissue homeostasis)中起作用的不同类型组成的蛋白家族。其能够装配成为纤维、微纤维和网络形式的多种超分子结构。 
胶原具有下述共同特征：含有一个或多个具有由三个多肽链，或α链卷绕在一起而形成的三螺旋结构的域。因为所有三个均为氨基酸，该特征通过螺旋基序中的甘氨酸的存在成为可能，所述基序由重复的G-X-Y序列组成，其中X通常为脯氨酸而Y通常为羟脯氨酸。此羟脯氨酸对于三螺旋的稳定化是必需的并且是胶原的特征。脯氨酸残基主要由脯氨酰-4-羟化酶(P-4-H)羟化成为4-羟脯氨酸。存在第二羟化酶，脯氨酰-3-羟化酶，其使得脯氨酸在位置X时能够羟化，而在位置Y时已经发现了由P-4-H羟化的脯氨酸。在胶原分子中，α链可为相同或不同的。 
胶原分子由侧翼为非螺旋域(称作N-和C-前肽)的螺旋域(或胶原域)形成。形成分子的三个α链的识别及其装配的起始在C-末端(C-前肽)的调控下进行。该过程是在内质网进行的。随后，N-和C-前肽在胶原成熟过程中切出，留下短的非螺旋序列，端肽。 
胶原在血管壁处通过维持其完整性和弹性起重要作用。该壁是由纤维状的I型胶原和III型胶原，以及网络形式的IV型胶原形成的，应注意III型胶原也在动脉粥样硬化斑块(atheromatous plaque)处强烈表达。此外，胶原能够通过直接与特定细胞受体相互作用来调节某些细胞的功能。因此，胶原，主要是I型和III型，是血小板功能的强力激活剂。 
III型胶原是由排列为三螺旋的三个α1链组成的同三聚体。而两个存在于所述α1链C-末端的G-P-P三联体(可能经羟化)对于三螺旋的核化和折叠是充分而必需的(Bulleid等，EMBO J.1997 Nov 17；16(22)：6694-701)。相反，这两个三联体不足以使得所述三个链能够发生起始的组合。有趣的是，注意到 Bulleid等(1997)在维持三个三联体时观察到更高效的三螺旋形成，且该效率甚至比野生型分子更高。几种蛋白涉及单体链的装配过程：HSP47(热休克蛋白)和PDI(蛋白二硫键异构酶，protein disulfide isomerase)。位于单体链的C-末端的C-前肽，表现为涉及α链的比对(alignment)和所述蛋白稳定化所必需的二硫桥的形成(Bulleid等，EMBO J.1997 Nov 17；16(22)：6694-701)。因此该C-前肽仅对确保单体链的组合是必需的。关于其应记住以下几点： 
- 其由确定α1链的特定标准装配的15个氨基酸的不连续序列组成(Hulmes DJ，J Struct Biol.2002 Jan-Feb；137(1-2)：2-10)。 
- 位于C-前肽起始处的卷曲螺旋域涉及胶原III的三聚化(Bulleid等，EMBO J.1997 Nov 17；16(22)：6694-701)。该域由四个七肽组成(McAlinden等，J Biol Chem.2003 Oct 24；278(43)：42200-7)。 
- 其含有使得链内(intracatenary)和链间(intercatenary)二硫桥能够形成的八个半胱氨酸残基。 
在C-端肽或C-前肽中在链之间二硫桥联的存在对于链的组合和三螺旋的形成并不是必需的(Bulleid等，Biochem J.1996 Jul 1；317(Pt 1)：195-202)。应注意该实验是用N-前肽进行的。三聚体和α三螺旋的概念似为悖论性的彼此独立。在缺乏N-前肽时，留下C前肽的半胱氨酸2或C-端肽的两个半胱氨酸似为明智的。该后者基序，称作结序列(knot sequence)(GPCCG)，仅由于α1链的装配和折叠的初步现象使得二硫桥能够形成(Boudko和Engel，J Mol Biol.2004 Jan 30；335(5)：1289-97)。 
无论是来源于创伤或动脉粥样硬化的后果，对动脉壁的损伤伴随着血管内皮的破坏和血栓形成组分如胶原的暴露。在此之后血小板粘着于损伤位点，与富含胶原或胶原片段的表面相接触，其激活并形成血栓。与该胶原相接触的血小板的粘着和稳定化是由于血小板表面存在的受体与所述胶原之间具有高亲和力的多重相互作用而能够发生的。该粘着可于von Willebrand因子(vWF)的A1域与由糖蛋白(Gp)GpIb-V-IX(其自身通过其A3域或通过血小板受体和胶原之间的直接相互作用结合于胶原)形成的血小板复合物的结合之后间接发生。几种受体可在高度特异性的肽序列处结合胶原分子，所述序列即为整联蛋白α2β1，其在与胶原相接触的血小板的稳定化中起重要作用，以及GpVI，被视为对于血小板激活为最重要的受体。另一种受体，TIIICBP(III型胶原结合蛋白)已描述为能够直接结合胶原。 
血管流速是确定募集的血小板胶原受体的类型的主要决定因素。在升高的流速，血小板与胶原通过vWF通过GpIb受体相互作用，然后其通过藉由GpVI结合而激活；整联蛋白α2β1仅作为血小板-胶原连接的稳定剂而介入。在低流速，血小板通过整联蛋白α2β1结合于胶原，然后结合于GpVI，从而导致其激活，其为引起血小板聚集的步骤。同样，也涉及其它的血小板胶原受体如TIIICBP。在所有情况下，GpVI在血小板激活中起主要作用。 
血小板粘着现为与血小板激活无关的过程。事实上，许多肽，对应于胶原的短肽基序，能够诱导血小板的粘着而不导致其激活。无论如何，这些肽中的一些具有诱导血小板激活的能力，并显示所谓促聚集活性。其三螺旋结构似为该活性的必需先决条件。应指出当这些肽中的一些保持单体形式时，其通过仍待鉴定、但可为占据位点使天然胶原无法获得的机理显示抗聚集活性。 
大多数目标为鉴定涉及血小板与III型胶原的粘着的肽序列的工作使用显示最高聚集活性、对应于CNBr消化片段的片段α1(III)CB4。 
在过去数年已描述了多种肽基序能够结合并激活血小板。已以两种可能性质的肽形式对其进行了测试： 
-类似胶原，由保守GPO基序重复n次的重复形成，不存在于III型胶原的天然序列中； 
-或对应于α1(III)CB4序列中存在的肽基序形成的肽，主要通过化学合成获得(Farndale等，Biochem Soc Trans.2008 Apr；36(Pt 2)：241-50)。 
整联蛋白α2β1针对在多种细胞类型(包括内皮细胞和血小板)中胶原、层粘连蛋白和其它配体的受体。α2β1通过其域I在纤维状胶原序列中存在的肽基序处结合胶原。已描述了多种针对I型胶原α1链处存在的GFOGER具有最高亲和力的基序。对于III型胶原，且与I型胶原相反，几种GXYGER基序对于最适结合似为必需的，其中GLOGER、GMOGER、GROGER和GAOGER为主要的基序(Kim等，J Biol Chem.2005 Sep 16；280(37)：32512-20)。已描述了其它的基序如GLOGEN和GLKGEN，但其对α2β1显示低亲和力(Raynal等，J Biol Chem.2006 Feb 17；281(7)：3821-31)。应注意所有从这些基序合成的肽在其组织为三螺旋形式时显示粘着活性。 
糖蛋白VI(GPVI)为属于免疫球蛋白(Ig)超家族的60-65kDa的I型跨膜糖蛋白。其在血小板表面以与对于Ig受体常见的γ链(FcRγ)的非共价复合物的形式组成型表达。描述为与该受体相互作用的肽为类似于由4至10个GPO 三联体的重复形成的胶原的肽(Morton等，Biochem J.1995 Mar 1；306(Pt 2)：337-44和Smethurst等，J Biol Chem.2007 Jan 12；282(2)：1296-304)。尽管包含10％ GPO基序，该三联体的最大重复数在III型胶原的天然序列中不超过三。在此还应注意在半胱氨酸或赖氨酸残基的修饰之后化学方式获得的三螺旋或聚合形式的形成对于赋予这些肽促聚集活性是必需的。而且，在3位羟脯氨酸的存在对于该活性是必需的。相反，当其为单体形式时，这些肽显示抗聚集活性(Asselin等，Biochem J.1999 Apr 15；339(Pt 2)：413-8)。最近，Jarvis等鉴定了III型胶原序列中显示最高粘着活性的肽基序。其由位于α1(III)CB4的氨基酸523至549的残基GAOGLRGGAGPOGPEGGKGAAGPOGPO组成(Jarvis等，Blood.2008 May 15；111(10)：4986-96)。该肽基序由三个GPO组成，其并非连续的，且似为与GpVI适当相互作用所必需的最小数目。 
血小板受体GpIb与胶原之间的间接相互作用依赖于vWF，其为由内皮细胞和血小板响应血管损伤或在壁压(parietal pressure)增加之后而分泌的血浆多聚蛋白。其在经受升高流速的血管区域的损伤位点处血小板的募集中起主要作用。该因子由三个称为A1、A2和A3的域组成。其通过其A3域结合胶原，并通过其A1域结合GpIb受体。III型胶原似具有对于vWF的A3域具有高亲和力的单一位点，其也存在于II型胶原中。该肽基序位于氨基酸403和413之间，且由GPRGQOVMGFO组成，其中某些氨基酸对于结合vWF是至关重要的(Lisman T等，Blood.2006 Dec 1；108(12)：3753-6)。Verkleij等将由GAAGPOGPOGSAGTOGLQ组成的氨基酸541至558鉴定为潜在结合位点(Verkleij等，Blood.1998 May 15；91(10)：3808-16)。该肽基序位于Lisman等描述的vWF基序与GMOGER整联蛋白α1β2结合基序之间。 
Fauvel-Lafève团队描述了位于片段α1(III)CB4的氨基酸655和662之间的八肽KOGEOGPK的存在。已鉴定了由该八肽识别的血小板受体并称为TIIICBP(III型胶原结合蛋白)(Monnet E等，J Biol Chem.2000 Apr 14；275(15)：10912-7)。该八肽在静止和流动条件下能够抑制血小板与III型胶原、但非与I型胶原的相互作用。最近，Pires等显示该八肽仅在当其为同源三聚体形式时具有对聚集的抑制活性。相反，其在三螺旋形式中在这些末端添加半胱氨酸和GPP的结构给予其促聚集活性(Pires等，Eur J Med Chem.2007 May；42(5)：694-701)。 
胶原的生物学和超结构特性，特别是其结合于膜受体的能力，开辟了广阔的应用领域，因为其在组织中具有多种作用。然而，这些应用仅在能够以 大量并以可重复的方式得到这些胶原的均质制备物时方才有意义。 
为此目的使用了两种产生方法。在这两个区域进行的工作和开发通常高度靶向给定的应用。因此，化学合成可产生仅代表所述蛋白微小部分的短肽，通常为目标肽基序。其主要应用涉及止血，且更精确而言，涉及胶原与血小板之间连接的调节。 
然而，这些肽通常仅具有一种所寻求的活性，且这取决于所述肽的三维构型，特别是三螺旋的形成。因此，对于开发可由提供高产量的生物系统产生的功能化的重组胶原蛋白有显著的需要。主要的障碍是这些胶原衍生蛋白产生和纯化的难度，因为其趋于聚集和粘着。 
迄今，短肽序列(少于50个氨基酸)均由化学合成而非通过细胞产生系统产生(Farndale等，Biochem Soc Trans.2008 Apr；36(Pt 2)：241-50)。而且，这些基序以分离的方式合成。相反，显示血小板结合活性的重组III型胶原的合成已通过细胞产生系统进行，且所用的是其完整序列，例如前α1(III)。寻求的目标是合成能够组织成为三螺旋的完整前胶原(WO 9 307 889)。这些重组胶原原则上具有多种应用，即完整胶原序列的应用。 
因此，问题是如何合成具有较简单结构的较小蛋白(其因此在产生方面较为不困难)，但其仍然保留天然蛋白的目标生物学活性。 
本发明因此涉及拥有获得促聚集活性所需的基序的重组蛋白，其以无法构造成三螺旋形式的单体形式合成。无法形成该三螺旋结构是缺乏下述的结果：I)其彼此之间的α链识别基序，II)非螺旋胶原N-和C-末端域以及III)引发三螺旋所需的两个GPO三联体。令人惊讶的是，在缺乏三螺旋形成的情况下获得了促聚集活性。 
申请人以令人意想不到的方式显示可以将三种类型的肽序列组合在具有促聚集活性的单一单体蛋白之内。 
本发明的重组蛋白因此组合了： 
- 具有至少一个重复的四个GPO三联体的肽基序， 
- 描述为对存在于天然胶原序列中的多个血小板受体具有结合活性的肽序列， 
- 这些由GXY三联体的重复形成的基序之间的结合序列。 
由细菌和哺乳动物细胞产生这些蛋白使得能够具有大量的这些新一代的重组抗原，其为类似于胶原的肽序列与存在于胶原天然形式的序列的组合的 成果。这些类型的蛋白并不需要偏好不组成型产生胶原的细胞作为用于该生产的宿主细胞。事实上，其序列并不允许多种天然胶原α链的识别。相反，必需偏好表达胶原成熟关键酶如脯氨酰-4-羟化酶(P4H)和HSP47的胶原产生细胞。现有的重组胶原产生系统相反使用并不天然产生胶原的细胞(Olsen等，Adv Drug Deliv Rev.2003 Nov 28；55(12)：1547-67以及Ruggiero和Koch，Methods.2008 May；45(1)：75-85)。这涉及共转染编码酶如P4H的基因。 
本发明的重组蛋白具有许多优点，包括： 
- 将目标基序组合在一个小蛋白之内，其更容易使用细胞产生系统产生， 
- 在缺乏三螺旋结构情况下的促聚集活性， 
- 其序列中缺乏胶原酶识别位点，但存在HSP47识别位点，使其能够由胶原产生细胞产生， 
- 通过参照测试(血小板聚集测试)显示的其生物学活性，其用于监测现有的抗血小板治疗并用于探索血小板功能。 
本发明的重组蛋白的生物学特性使其能够预见许多应用。 
第一个应用涉及使用这些蛋白作为诊断工具探索血栓形成疾病：血小板聚集测试，体外血栓形成模型和评价现有抗血小板治疗(阿司匹林，氯吡格雷)和将来治疗的有效性。产生的蛋白来源于人蛋白，且在其序列中具有针对就其在血小板粘着和激活中的作用而描述的某些血小板受体的结合位点。现有的测试使用动物来源的胶原，其序列与人序列并不具有完美的同源性。此外，在多种蛋白之间血小板受体相互反应位点的数量和位置的变化使得能够提出更多相关的靶验证测试。存在使得能够更加特异性地研究每个血小板受体的肽片段，但其产生方法与本发明的产生方法不同，即化学合成相对细胞的天然产生(翻译后修饰的重要性)。 
本发明可在止血绷带(因此在血管损伤情况下强化了就地(on-site)血小板募集)或预防出血风险的止血粘着剂(手术背景)的组成方面起作用。产品目前已上市，但使用动物来源的胶原。 
另一个应用是使用这些蛋白以激活瘢痕形成。某些伤口的瘢痕形成需要某些细胞群体(包括血小板)的就地迁移、粘着和分化。这些过程依赖于这些细胞的表面整联蛋白。存在于本发明蛋白的结构中的某些肽基序因此能够通过促进瘢痕形成与这些整联蛋白相互作用。 
在非常接近的领域，可提出将这些重组蛋白用于某些皮肤病学乳剂的组成中。 
抑制血小板功能的蛋白的另一个应用是治疗动脉粥样硬化。血小板受体是具有对抗动脉粥样硬化疾病的并发症前景的治疗靶物。迄今，并无能够在内皮下膜(subendothelium)中阻断血小板粘着起始阶段的分子。本发明蛋白的多种蛋白结构使得其能够与这些受体相互作用导致血小板的抗粘着作用(位点遮掩)和/或血小板促聚集作用。所述多种作用可用相同蛋白通过调节其物理化学特性来获得。 
本发明因此提供了具有多种应用的生物试剂，其可在试剂盒的组成中发挥作用以：评价血小板功能，激活细胞分化以供诊断血液学功能障碍，通过对纤维化区域成像来进行检测。本发明还可进入止血绷带的组成以供血小板的就地募集(在血管损伤情况下)，预防出血风险的止血粘着剂，或皮肤病学乳剂。 
序列描述
SEQ ID No.1：Coll-III样重组蛋白 
SEQ ID No.2：编码Coll-III样重组蛋白的多核苷酸 
SEQ ID No.3-6：引物 
发明详述 
本发明涉及分离的多肽，其具有SEQ ID NO：1的多肽或SEQ ID NO：1的位置25至位置152的多肽的序列。 
本发明还涉及分离的多肽，其在其全长与SEQ ID NO：1的多肽或SEQ IDNO：1的位置25至位置152的多肽具有至少70％同一性，并能够在血小板聚集度计(aggregometer)中在37℃以1000rpm搅拌下诱导超过30％的人血血小板的聚集。 
在一个优选实施方案中，这些多肽包含下述肽基序： 
-GX1X2GER，其中X1和X2独立地代表选自A、R、N、D、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y、V和O的氨基酸； 
-(GPX3)n，其中n为4至10，且X3代表P或O； 
-GPRGQX4GVMGFX5，其中X4和X5独立地代表P或O。 
P为脯氨酸而O为羟脯氨酸。 
在另一个优选实施方案中，这些多肽包含下述肽基序： 
-GAPGER， 
-KPGEPGPK， 
-(GPP)n其中n为4至10， 
-RGD。 
本发明还涉及分离的多核苷酸，其特征在于其编码本发明的多肽。 
在一个优选实施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO:2的多核苷酸序列。 
本发明还涉及特异性结合于SEQ ID NO:1的多肽的抗体。 
本发明还涉及在转录方向包含下述的表达盒： 
-宿主生物中的功能性启动子 
-本发明的多核苷酸， 
-相同宿主生物中的功能性终止序列。 
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸和/或本发明的表达盒的载体。 
本发明还涉及用本发明的多核苷酸、本发明的表达盒和/或本发明的载体转化的宿主生物。 
本发明还涉及用作药物的组合物，其包含本发明的多肽，本发明的多核苷酸，本发明的表达盒，本发明的载体和/或本发明的宿主生物。 
在一个优选实施方案中，本发明涉及用于治疗血栓形成疾病的组合物。 
在另一个优选实施方案中，本发明涉及用于治疗止血障碍的组合物。 
本发明还涉及这些组合物作为瘢痕形成剂的用途。 
最后，本发明涉及包含如上所述的多肽的化妆品组合物。 
本发明涉及分离的多肽，其具有SEQ ID NO:1的多肽或SEQ ID NO:1的位置25至位置152的多肽的序列。 
SEQ ID NO:1位置1至位置24的肽对应于使得所述重组蛋白能够由宿主细胞分泌的信号肽。该信号肽可缺失或可由本领域技术人员公知的另一个信号肽代替。本领域技术人员能够选取适用于本发明多肽在多种原核或真核表达系统中表达和分泌的同源或异源的信号肽。优选地，本发明的多肽在真核细胞或生物中，特别是在哺乳动物细胞中产生。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的多核苷酸包含使得其能够分泌至胞外介质的信号肽。在另一个实施方案中，本发明涉及在切割所述信号肽之后获得的成熟多肽。 
本发明的多肽具有生物活性，特别是使用血小板聚集度计(Regulest，Florange，France)依照参考技术(Born，1962)检测的对人血血小板的促聚集活性。使富含血小板的血浆(PRP)与激动剂(290μl PRP中10μl)相接触，并实时监视介质的清除(涉及落于管底部的聚集物的形成)(聚集曲线)。在缺乏血小板 聚集时，信号保持水平(持续混浊的介质)。能够通过在测量结束时检查试管来验证聚集物的存在与否。血小板聚集测试反应的评价在37℃进行，同时连续搅拌(1000rpm)。装置如下所述进行校准：0％聚集为富含血小板的血浆(通过缓慢离心和浓缩调整至300x109/L获得的制备物)，而100％聚集为贫血小板血浆(通过快速离心获得的制备物)。血小板制备物的质量通过验证其对用于开发抗血小板治疗的参照激动剂(5μM ADP和1μg/ml胶原)的反应来确认。当蛋白能够以不可逆的方式诱导超过30％的聚集时，认为其为促聚集的。 
表达于许多细胞类型表面的受体识别肽基序赋予下述类型的多肽活性： 
-细胞粘着， 
-细胞募集。 
多肽的促聚集作用，独立于其三螺旋结构，是血小板表面存在的一种或多种受体(α1β2、TIIICBP和GPVI)激活的结果。 
本发明还涉及SEQ ID NO：1的多肽的片段，其保留SEQ ID NO：1的多肽的至少一种活性。术语多肽的“片段”指包含其来源的多肽的部分但非全部的多肽。因此，本发明涉及包含SEQ ID NO：1的多肽的至少100、110、120、130、140或150个氨基酸的片段的多肽。 
SEQ ID NO：1的多肽的这些片段保留SEQ ID NO：1的多肽的至少一种活性，特别是对人血血小板的促聚集活性。本发明因此涉及SEQ ID NO：1的多肽的生物活性片段。术语“生物活性片段”指保留其来源的多肽的功能的多肽的片段。SEQ ID NO：1的多肽的生物活性片段因此保留该多肽的至少一种功能，并优选地保留SEQ ID NO：1的多肽的所有生物活性。用于制备多肽片段的方法以及用于测量本发明多肽的生物活性的技术对于本领域技术人员是周知的。 
本发明还涉及具有SEQ ID NO：1的多肽的至少一种活性、并与SEQ IDNO：1的多肽至少70％相同的多肽。优选地，这些多肽与SEQ ID NO：1的多肽具有相同的特性和特别是相同的生物活性。本发明涉及与SEQ ID NO：1的多肽具有至少70％、80％、90％、95％、98％且优选至少99％的相同的氨基酸的多肽。“相同的氨基酸”意指两个序列之间不变或未变化的氨基酸。这些多肽可与SEQ ID NO：1的多肽相比具有至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。 
本发明还涉及与SEQ ID NO：1的多肽具有至少70％、80％、90％、95％、98％且优选至少99％的同源性的多肽。“同源性”意指蛋白序列之间相似性的量度。这些多肽可与SEQ ID NO：1的多肽相比具有至少一个氨基酸的缺失、 添加或取代。两个序列之间的同源性程度，通过分数量化，是基于序列的保守取代(preserving substitution)和/或同一性的百分比。 
与SEQ ID NO：1的多肽具有一定程度的同源性或同一性的本发明的多肽包含至少100或150个氨基酸。 
测量和鉴定多肽之间同一性程度和同源性程度的方法对于本领域技术人员是已知的。例如，可使用Vector NTi 9.1.0软件包(Invitrogen INFORMAX，http://www.invitrogen.com)的AlignX比对工具(Clustal W算法)，优选使用缺省设定。 
本发明的多肽是从其天然环境分离或纯化的。所述多肽可借助多种方法制备。特别地，这些方法是通过合适的宿主细胞产生重组多肽及其后续纯化，通过化学合成产生或，最终地，这些多种方法的组合。这些多种产生方法对于本领域技术人员是周知的。优选地，本发明的多肽是由重组原核或真核细胞产生的。本发明的多肽因此可在细菌或哺乳动物细胞中产生。 
本发明还涉及包含本发明的多肽的融合蛋白，蛋白或嵌合蛋白。术语“多肽”指蛋白以及修饰的多肽。 
在本发明的一个实施方案中，本发明的多肽是糖基化的。SEQ ID NO：1的多肽特别在存在于位置102和141的赖氨酸氨基酸处具有O-糖基化位点(在GXY三联体的位置3)。在一个优选实施方案中，SEQ ID NO：1的多肽的位置93处的天冬酰胺残基是糖基化的。 
本发明还涉及编码上述定义的多肽的多核苷酸。根据本发明，“多核苷酸”意指单链的核苷酸链或其DNA或RNA互补物，或双链核苷酸链，其可为互补或基因组DNA。优选地，本发明的多核苷酸是DNA，特别是双链DNA。术语“多核苷酸”还意指修饰的多核苷酸。本发明的多核苷酸是从其天然环境分离或纯化的。优选地，本发明的多核苷酸可通过如Sambrook等(MolecularCloning：A Laboratory Manual，1989)中所述的经典的分子生物学技术或通过化学合成来制备。 
在第一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：2的多核苷酸。在第二个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO：2的多核苷酸，其序列位于SEQ ID NO：2的位置73与位置459之间。这些多核苷酸编码上述定义的多肽。 
本发明还涉及多核苷酸，其与SEQ ID NO：2的多核苷酸或其序列位于SEQ ID NO：2位置73和位置459之间的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、 85％、90％、95％、98％且优选至少99％同一性。这些多核苷酸优选编码保留SEQ ID NO：1的多肽的生物活性的多肽。 
“相同的核苷酸”意指在两个序列之间不变或未变化的多核苷酸。这些多核苷酸可与参照多核苷酸相比具有至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。 
本发明还涉及与SEQ ID NO：2的多核苷酸或其序列位于SEQ ID NO：2位置75和位置459之间的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％且优选至少99％同源性的多核苷酸。这些多核苷酸优选编码保留SEQ ID NO：1的多肽的生物活性的多肽。 
“同源性”意指核酸序列之间相似性的量度。这些多核苷酸可与参照多核苷酸相比具有至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。两个序列之间的同源程度，用分数量化，是基于序列的保守取代和/或同一性的百分比。 
测量和鉴定核酸序列之间同一性程度和同源性程度的方法对于本领域技术人员是周知的。例如，可使用Vector NTi 9.1.0软件包(Invitrogen INFORMAX，http://www.invitrogen.com)的AlignX比对工具(Clustal W算法)，优选使用缺省设定。 
本发明还涉及能够选择性与SEQ ID NO：2的多核苷酸或其序列位于SEQID NO：2位置73和位置459之间的多核苷酸杂交的多核苷酸。优选地，选择性杂交是在中等严格条件下且优选在高严格条件下进行的。这些多核苷酸优选编码具有SEQ ID NO：1的多肽的生物活性的多肽。根据本发明，“能够选择性杂交的序列”意指与参照序列以显著高于背景噪音的水平杂交的序列。由能够选择性杂交的序列与参照序列之间的相互作用生成的信号水平通常是其它生成背景噪音的DNA序列的相互作用10倍以上，优选强至100倍以上那么强。使得能够进行选择性杂交的严格杂交条件对于本领域技术人员是周知的。一般而言，杂交和洗涤温度在给定pH和给定离子强度比参照序列的Tm低至少5℃。通常，杂交温度对于15至50个核苷酸的多核苷酸为至少30℃，且对于多于50个核苷酸的多核苷酸为至少60℃。例如，杂交在下述缓冲液中实施：6X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，0.02％ PVP，0.02％Ficoll，0.02％ BSA，500μg/ml变性的鲑精DNA。例如，洗涤是如下所述连续进行的，对于低严格条件，在2X SSC，0.1％ SDS缓冲液中，对于中等严格条件，在0.5X SSC，0.1％ SDS缓冲液中，而对于高严格条件，在0.1X SSC，0.1％ SDS缓冲液中。当然，杂交可根据其它本领域技术人员周知的常用方法 来进行(特别参见Sambrook等，Molecular Cloning：At Laboratory Manual，1989)。优选地，与参照多核苷酸选择性杂交的多核苷酸保留参照序列的功能。 
本发明通常涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。由于遗传密码的简并性，不同的多核苷酸可编码相同的多肽。 
本发明还涉及特异性结合于SEQ ID NO：1的多肽的抗体。 
“特异性结合”意指这些抗体仅结合于SEQ ID NO：1的多肽。具体而言，所述抗体并不结合于其它抗原，且特别地不结合于其它胶原性蛋白。 
本发明的抗体优选为特异性的单克隆抗体，特别是鼠类来源的，其可为嵌合的或人源化的，这可根据本领域技术人员周知的标准方法来获得。 
一般而言，制备单克隆抗体或其功能性片段(特别是鼠类起源的)的技术，可选自手册Antibodies(Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY，p.726，1988)中具体描述的那些，或者本领域技术人员周知的基于杂交瘤的制备技术。“抗体”也意指嵌合的或人源化抗体。 
本发明还涉及在转录方向包含下述的表达盒： 
-宿主生物中的功能性启动子， 
-本发明的多核苷酸， 
-相同宿主生物中的功能性终止序列。 
根据本发明的一个实施方案，将编码本发明的多肽的多核苷酸通过使用本领域技术人员周知的克隆技术插入表达盒。该表达盒包含转录和翻译编码本发明的多肽的序列所需的元件。 
有利地，该表达盒同时包含导致宿主细胞产生多肽的元件和调节该表达所需的元件。 
任何类型的启动子序列可用于本发明的表达盒。启动子的选择特别地取决于选择用于表达目标基因的宿主生物。某些启动子使得能够发生组成型表达，而相反其它启动子是可诱导的。在细菌中的功能性启动子中，可特别提出噬菌体T7 RNA聚合酶的启动子。在酵母中的功能性启动子中，可提出酿酒酵母的GAL1基因启动子或GAL4和ADH启动子。在高等真核细胞，特别是在哺乳动物细胞中的功能性启动子中，可提出CMV(巨细胞病毒)、SV40、RSF(劳氏肉瘤病毒)、人或鸡β-肌动蛋白、β-珠蛋白、PKG(磷酸甘油酸激酶)、EF1α、胸苷激酶和MMTV(小鼠乳房肿瘤病毒)。所有这些启动子描述于文献 中，且对于本领域技术人员是周知的。 
本发明的表达盒还可包含表达多肽或多核苷酸所需的任何其它序列，例如使得由宿主细胞产生的多肽能够分泌的调节元件或信号序列。可特别使用增加插入表达盒中的编码序列的表达水平的任何调节序列。根据本发明，其它位于启动子和编码序列之间的调节序列，如转录激活子(“增强子”)，可特别地与启动子调节序列组合使用。 
可在本发明的表达盒中使用广泛种类的终止序列；这些序列能使转录终止和mRNA多聚腺苷酸化。可使用任何在所选宿主生物中有功能的终止序列。 
本发明还涉及包含本发明表达盒的多核苷酸，有利地，本发明的表达盒插入载体中。 
因此，本发明还涉及用于转化宿主生物的复制或表达载体，其包含至少一个本发明的多核苷酸或表达盒。该载体可特别地对应于其中插入了本发明的多核苷酸或表达盒的质粒、粘粒、噬菌体或病毒。用于构建这些载体和用于将本发明的多核苷酸插入这些载体的技术对于本领域技术人员是周知的。一般而言，可使用在宿主细胞中能够维持、能够自我复制或能够繁殖以特别地诱导多核苷酸或多肽表达的任何载体。本领域技术人员会根据待转化的宿主生物和根据使用的转化技术选取合适的载体。 
本发明的载体特别地用于转化宿主生物，以供在所述宿主生物中复制所述载体和/或表达本发明的多肽。 
本发明还涉及用于制备本发明的多肽的方法，包括下述步骤： 
-用包含本发明的表达盒的表达载体和/或用本发明的多核苷酸转化宿主生物。 
-分离由宿主生物产生的多肽。 
本发明还涉及通过在宿主生物中整合至少一个本发明的多核苷酸或表达盒或载体来转化前述宿主生物的方法。所述多核苷酸可整合入宿主生物的基因组中，或以稳定方式在宿主生物中复制。转化宿主生物的方法对于本领域技术人员是周知的，并在文献中广泛描述。 
本发明还涉及用本发明的多核苷酸、表达盒或载体转化的宿主生物。“宿主生物”根据本发明特别地意指任何单细胞或多细胞，低等或高等生物，特别是选自细菌、酵母或高等真核生物的细胞，特别是哺乳动物细胞如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、BHK(幼仓鼠肾)、HEK-293(人胚胎肾细胞系)、NSO(小 鼠骨髓瘤细胞系)、Per.C6(Crucell)和YB2/0(ATCC号CRL 1662)。“宿主生物”意指非人生物。 
本发明还涉及用作药物的组合物，其包含本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的表达盒、本发明的载体和/或本发明的宿主生物。因此，本发明还涉及包含本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的表达盒、本发明的载体和/或本发明的宿主生物的药物组合物。 
在一个优选实施方案中，本发明涉及用于预防和/或治疗血栓症的组合物。 
在另一个实施方案中，本发明涉及用于预防或治疗止血障碍的组合物。 
本发明还涉及所述组合物用作瘢痕形成剂。 
在另一个实施方案中，本发明组合物还可用作： 
-检测下述的诊断试剂： 
·某些血小板功能障碍 
·血液学疾病 
-皮肤学和化妆品乳剂的组成中的止血绷带和粘着剂的活性组分。 
本发明还涉及治疗血栓症的治疗方法，包括将有效量的本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的表达盒、本发明的载体和/或本发明的宿主生物施用于个体。 
最后本发明涉及本发明的多肽、多核苷酸和转化的宿主生物在制备药物中的用途。 
本发明涉及药物组合物，其包含如本发明中定义的多肽、多核苷酸或转化的宿主细胞以及合适的药学赋形剂。 
所述组合物可配制用于施用于哺乳动物包括人。给药方案根据所述治疗和疾病而变化。所述组合物以这样的方式制备使得能够通过消化途径或肠胃外途径施用。 
在本发明用于经口、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、局部或直肠施用的药物组合物中，活性成分可与经典的药学载体混合，以单位给药形式施用于动物或人。合适的单位给药形式包括通过经口途径的形式如片剂、明胶胶囊剂、散剂、颗粒剂和口服溶液或悬液；舌下和含服给药形式；皮下、肌肉内、静脉内、鼻内或眼内给药形式；以及直肠给药形式。 
当制备片剂形式的固体组合物时，将主要的活性成分与药学赋形剂(如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯胶或类似物)混合。片剂可用蔗糖 或其它合适的材料涂覆，或可以这样的方式处理使得其具有延长的或延迟的活性，且其连续释放预定量的活性成分。 
明胶胶囊剂的制备物是通过将活性成分与稀释剂混合，并将获得的化合物倾入软或硬明胶胶囊而获得的。 
糖浆剂或酏剂形式的制备物可含有活性成分连同增甜剂、抗菌剂以及增香剂和合适的着色剂。 
可水分散的散剂或颗粒剂可含有与分散剂或润湿剂或悬浮剂以及香味修正剂(flavour correctors)或增甜剂混合的活性成分。 
本发明还涉及包含如上所述的多肽的化妆品组合物。 
而且，这些组合物还可包含经典地用于皮肤学的活性成分如润肤剂(emollient)、水化活性成分、表皮障碍重构剂(cutaneous barrier restructuring agent)、抗刺激剂和安抚剂(soothing agent)。本发明的化妆品组合物可配制为多种适于局部施用的制备物的形式。根据一个优选实施方案，多种制备物适于局部施用，且包括乳膏(creams)、乳剂、乳、香膏剂(pomades)、洗剂(lotions)、油、水或水-醇或乙二醇溶液、散剂、喷雾剂、胶冻剂(jellies)、凝胶剂、水凝胶或用于外部施用的任何其它产品。这些化妆品组合物还可含有抗氧化剂、防腐剂等。本发明还涉及化妆处理、卫生护理或装饰的方法和/或熏香粘膜和/或皮肤的方法，所述粘膜和/或皮肤为正常的、干燥的、油性的、混合的、脱水的、衰老的、敏感的、刺激的、不舒服的、无法忍受的，具有与内在、外在或激素老化相关或者涉及外源攻击(污染物、PV、胁迫等)的不平衡，具有变应性倾向，或具有色素沉着病症，其特征为其由施用本发明的组合物组成。 
附图 
图1：编码以瞬时方式转染的粘着CHO-S细胞中的蛋白的信使RNA的表达。 
图2：图2代表由在肾上腺素存在或不存在下以瞬时方式转染的粘着CHO-S细胞的条件培养基(CM)诱导的血小板聚集。 
图3：图3代表编码所述蛋白的信使RNA在稳定细胞克隆中的表达。 
图4：图4显示通过Western印迹检测蛋白-6X-组氨酸在纯化之后获得的多种细菌级分中的存在。 
图5：图5显示由细菌中产生的蛋白诱导的血小板聚集。 
图6：图6显示通过Western印迹验证89日的免疫接种之后获得的兔血 清的特异性。 
实施例
A.通过哺乳动物细胞的瞬时产生 
1.载体构建
质粒1(NVH001-A) 
质粒NVH001-A含有下述元件： 
-来自质粒pCIneo(Promega：pCIneo Mammalian Expression Vector)的内含子 
-来自载体pUC57-NVH001(从GeneCust定购)并拥有III型胶原信号肽(NP_000081)的本发明蛋白NVH001 
-来自hGH mRNA(NM_000515)的多聚A尾 
-来自pCDF1-MCS1-EF1-copGFP(System Biosciences：pCDF cDNACloning and Expression Lentivectors)的CMV启动子。 
质粒2(NVH001-B1)、3(NVH001-B2)、4(NVH001-C1)和5(NVH001-C2) 
质粒NVH001-B1和NVH001-C1含有下述元件： 
-来自衍生的质粒pSV2-Neo(在载体ATCC 37149中的ori SV40：1-989)的SV40起点。 
-可为Molecular Cloning：A Laboratory Manual：第3版，Sambrook andRussell，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press中所述的那些之一的启动子/增强子 
-来自pMono-hygro-mcs(Invivogen)的潮霉素盒 
-来自载体pUC57-NVH001(从GeneCust定购)并拥有III型胶原信号肽(NP_000081)的本发明蛋白NVH001 
-来自质粒pUC57-proC(从GeneCust定购)的C-前肽 
-来自hGH mRNA(NM_000515)的多聚A尾 
质粒NVH001-B2和NVH001-C2含有与质粒NVH001-B1和C1相同的元件，除了C-前肽。 
所有最终的质粒经测序验证未在目标蛋白的DNA中和在提供的元件中引入突变。 
2.哺乳动物细胞的转染
质粒1(NVH001-A) 
1.以瞬时方式使用来自Invitrogen的Lipofectamine 2000试剂盒将载体NVH001-A转染至粘着并在含有5％胎牛血清的RPMI培养基中培养的CHO-S细胞中。 
2.在第3和4日收集培养上清，纯化产生的蛋白，然后使用聚集度计测试其血小板结合活性。 
质粒2(NVH001-B1)、3(NVH001-B2)、4(NVH001-C1)和5(NVH001-C2) 
1.以瞬时方式使用来自Invitrogen的Lipofectamine 2000试剂盒将载体NVH001-B1、NVH001-B2、NVH001-C1和NVH001-C2转染至粘着并在含有5％胎牛血清的RPMI培养基中培养的CHO-S细胞中。 
在第1、2、3、4和5日通过添加800μl TRIZOL(Invitrogen)提取转染细胞的RNA。相应的cDNA通过逆转录从1μg总RNA获得。对cDNA通过PCR进行扩增。然后在125V在2％琼脂糖凝胶上迁移30分钟之后检测扩增子。还进行了阳性对照(转染的质粒)和阴性对照。使用分子量标记(在左边)以验证扩增子大小。 
在用编码本发明蛋白的mRNA转染的细胞中的表达在第1日观察到。该表达随时间略微增加，并在第5日之后维持。mRNA表达的进展表示于图1。 
2.在第3和4日收集培养上清，纯化产生的蛋白，然后使用聚集度计测试其血小板结合活性。 
3.本发明蛋白的生物活性：血小板聚集
通过聚集度测定(aggregometry)来评价本发明蛋白的血小板结合活性。将柠檬酸试管中从健康的志愿者供体在签字同意之后收集的血样在150g离心15分钟以获得富含血小板的血浆(PRP)。将浓度调整至300giga/L。使用 
Figure BDA0000063290080000171
血小板聚集度计在37℃搅拌(1000rpm)下进行聚集测试。该技术是基于根据Born方法的光度测定读数，其由测量混浊介质PRP响应于血小板功能激活剂的光透射(transmission)的进展组成。如果形成血小板聚集物，介质被清除并观察到光透射的增加。当观察到该透射中大于30％的增加连同(associated with)对应于该清除的斜率的中断时，分子被视为具有促聚集作用。 
图2代表由在肾上腺素存在或不存在下以瞬时方式转染的粘着CHO-S细胞的条件培养基诱导的血小板聚集。 
反应混合物由在存在或不存在0.1μM肾上腺素下添加30μl条件培养基的 290μl PRP组成。测量血小板应答10分钟。自聚集(-○-)限定基线。添加0.1μM肾上腺素诱导了基线的细微移动，稳定了10分钟(-●-)。添加30μl条件培养基在2分钟之后 诱导了有限的应答(18％)。该移动在10分钟的观察过程中是稳定的。添加肾上腺素2分钟，然后添加30μl条件培养基在5分钟之内诱导了总血小板聚集 
Figure BDA0000063290080000182
该聚集是不是可逆的，表明形成的聚集物是稳定的。 
添加非转染粘着CHO-S细胞的30μl条件培养基并不诱导聚集(结果未显示)。 
B.由哺乳动物细胞的稳定产生 
1.载体构建
质粒1(NVH001-A) 
1.将内含子-NVH001-hGHpA单元从构建用于瞬时表达的载体去除，并在含有来自pMono-hygro-mcs(Invivogen)的潮霉素盒的生产载体中克隆。 
2.将最终载体测序以验证在目标蛋白的DNA和在提供的元件中未引入突变。 
3.将直链化的载体以稳定方式使用来自Invitrogen的Lipofectamine 2000试剂盒转染至粘着的CHO细胞中。通过递增水平的潮霉素B选择转染细胞。 
图3代表在稳定细胞克隆中表达编码所述蛋白的信使RNA。 
在第1、2、3和4日通过添加800μl TRIZOL(Invitrogen)提取细胞RNA。通过逆转录从1μg总RNA获得相应的cDNA。使用5′-AGCTGGCGCGCCGCCACCATG-3′(S)和5′-GCTTCCGGGAGGCCCTGGCTTCCCATC-3′(AS)引物对cDNA进行PCR扩增。然后在125V在2％琼脂糖凝胶上迁移30分钟之后检测扩增子。使用对应于质粒DNA的阳性对照。使用分子量标记(在右侧)验证扩增子大小。在细胞克隆中观察到稳定表达。 
C.在细菌中的产生 
1.构建
目标分子的DNA(NVH001)通过PCR由载体pUC57-NVH001使用tagNVH001-有义引物：GCTGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGTCGCCCGGGAGCTCCTGGAGAGAGAGGATTG和tagNVH001-反义引物：GCACGGATCCTATTAGCCAGGGCAAGGTCCAGGGGCTC进行扩增，所述引物使得能够在蛋白NVH001的N-末端侧添加6X组氨酸标记。将PCR 产物克隆在载体pET3d中(pET3d-NVH001)，使得所述分子能够在细菌中生产(New England Biolab)。 
所述DNA的存在和正确序列通过测序验证。 
2.产生
1.将载体pET3d-NVH001转染至能使蛋白大量产生的BL21细菌。 
2.将细菌接种于11营养培养基中，并在37℃温育直至获得细菌处于指数期的OD600nm。 
3.通过IPTG在30℃、5小时诱导蛋白的产生。 
4.沉淀并裂解细菌，在细菌的可溶性(上清)和不可溶性(包涵体)级分中在Macherey-Nagel抗6X-组氨酸标记柱上纯化本发明蛋白。 
图4显示了通过Western印迹检测蛋白-6X组氨酸在纯化后获得的多种细菌级分中的存在。 
将在洗脱抗-6X-组氨酸标记柱之后获得的每种级分的40μl置于16％聚丙烯酰胺凝胶上。以18mA在迁移缓冲液(192mM甘氨酸，25mM Tris-HCl pH 6.8和0.1％SDS)中在分子量标记(Amersham)存在下使用Mini-Protean 3迁移系统(Biorad)进行电泳。将凝胶中分离的蛋白以70V转移60分钟至PVDF膜(Biorad)上。通过将膜在37℃在含有5％脱脂乳的Tris+0.1％ Tween-20盐水溶液(TBS-T)中搅拌温育120分钟来封闭非特异性结合。然后将膜在4℃与在TBS-T中稀释至1/1000的抗-6X-组氨酸标记单克隆抗体(Cell Signaling)一起温育过夜。在TBS-T中洗涤三次5分钟之后，将膜在室温在稀释至1/10,000与过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)中温育60分钟。再次将膜在TBS中洗涤三次5分钟。其结果通过化学发光技术使用ECL试剂盒(Amersham)显现。 
在多个级分中观察到蛋白的存在。获得的主要条带具有大约19kDa的分子量，对应于该蛋白的单体形式。还可在特定级分中观察到对应于具有26kDa、43kDa和60kDa的分子量的蛋白的条带。 
3.其生物活性的阐明：血小板聚集
通过聚集度计评价本发明蛋白的血小板结合活性。将柠檬酸试管中的从健康志愿者供体经过签名同意之后收集的血样在150g离心15分钟以获得富含血小板的血浆(PRP)。将浓度调整至300giga/L。使用 
Figure BDA0000063290080000191
血小板聚集度计在37℃搅拌(1000rpm)下进行聚集测试。该技术是基于根据Born方法的光度测定读数，其由测量经过作为混浊介质起始的PRP响应于血小板功能激 活剂的光透射的进展组成。如果形成血小板聚集物，介质得到清除并观察到光透射增加。当观察到该透射中大于30％的增加连同对应于该清除的斜率上的中断时，分子被视为具有促聚集作用。 
图5显示由细菌中产生的蛋白诱导的血小板聚集。 
收集了包含由Western印迹检测到的蛋白的从抗-6X-组氨酸标记柱洗脱的多个级分，并通过离心获得冻干物。将该冻干物的一部分在0.25％戊二醛的存在下在4℃温育3小时，然后针对1X PBS在4℃透析过夜，之后将其用于聚集度计量。 
反应混合物由添加30μl含有所述蛋白的PBS的290μl PRP组成。测量血小板应答25分钟。标记-○-和 
Figure BDA0000063290080000201
的线分别显示添加PBS溶液和透析的PBS-戊二醛的溶液之后获得的响应：未观察到聚集。添加含有未经戊二醛聚集的蛋白 或经戊二醛聚集并透析(-●-)的蛋白的PBS在其添加10分钟之后显示了显著的聚集。该聚集在20分钟之后分别达到90％ 和100％(-●-)。 
D.在兔中产生抗目标蛋白的抗体
1.如前所述在BL21细菌中大量产生所述蛋白。 
2.以3周间隔对两只兔用补充弗氏佐剂(v/v)的纯化蛋白免疫接种4次，即在D0、D21、D42和D63。 
3.将兔在实验结束时在D89处死，并在对动物放血之后通过离心回收血清。 
4.通过亲和层析在特定柱上纯化IgG以消除血浆蛋白。 
图6显示了通过Western印迹确证在免疫接种89天后获得的兔血清的特异性。 
将10μl细菌中产生的两种蛋白质制备物(其聚集活性通过聚集度计量验证)置于16％聚丙烯酰胺凝胶上。以18mA在迁移缓冲液(192mM甘氨酸，25mMTris-HCl pH 6.8和0.1％ SDS)中在分子量标记(Amersham)存在下使用Mini-Protean 3迁移系统(Biorad)进行电泳。将凝胶中分离的蛋白以70V转移60分钟至PVDF膜(Biorad)上。通过将膜在37℃在含有5％脱脂乳的Tris+0.1％Tween-20盐水溶液(TBS-T)中搅拌温育120分钟来封闭非特异性结合。然后将膜在4℃与免疫接种实验中D89取出并稀释至1/100的兔血清或在TBS-T中稀释至1/1000的抗-6X-组氨酸标记单克隆抗体(Cell Signaling)一起温育过夜。在TBS-T中洗涤三次5分钟之后，将膜在室温在稀释至1/10,000与过氧化物酶偶 联的抗小鼠或抗兔抗体(Jackson Laboratories)中温育60分钟。再次将膜在TBS中洗涤三次5分钟。其结果通过化学发光技术使用ECL试剂盒(Amersham)显现。 
显影显示具有60kDa分子量的双重条带的存在，其存在于两个蛋白制备物(A，孔1和2)中。还通过抗-6X-组氨酸标记抗体检测到了该条带，显示其确实为本发明蛋白(B，孔1和2)。应注意我们不再观察到由抗-6X-组氨酸标记抗体在细菌纯化级分中检测到的其它条带。该结果显示免疫接种仅对本发明蛋白的多聚体形式有效，或本发明蛋白一旦纯化即装配为多聚体。 
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Figure IDA0000063290140000011
Figure IDA0000063290140000021
Figure IDA0000063290140000031

Claims (9)

1.一种分离的多肽，其特征为其由SEQ ID NO:1的多肽组成。
2.一种分离的多肽，其特征为其由SEQ ID NO:1的位置25至位置152的氨基酸序列组成。
3.一种分离的多核苷酸，其特征为其编码权利要求1-2之一的多肽。
4.权利要求3的分离的多核苷酸，其特征为其由SEQ ID NO:2的多核苷酸的序列组成。
5.一种表达盒，在转录方向包含下述：
-宿主生物中的功能性启动子，
-权利要求3-4之一的多核苷酸，
-相同宿主生物中的功能性终止序列。
6.一种载体，其特征为其包含权利要求3-4之一的多核苷酸和/或权利要求5的表达盒。
7.一种选自细菌、酵母或哺乳动物细胞的宿主生物，其用权利要求3-4之一的多核苷酸、权利要求5的表达盒和/或权利要求6的载体转化。
8.一种组合物，其特征为其包含权利要求1-2之一的多肽，其用作药物用于治疗止血障碍的病症、或用作瘢痕形成剂。
9.一种化妆品组合物，其特征为其包含权利要求1-2之一的多肽。
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