FR3112942A1 - Ligands protéiques immunomodulateurs dérivés du collagène utilisables par voie injectable - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne des protéines ou polypeptides de synthèse, ligands des récepteurs LAIR-1 et/ou OSCAR et/ou de LAIR-2 ayant comme particularité d’être structurés sous forme d’une triple-hélice soit via tout ou partie du domaine de trimérisation naturel des collagènes natifs (propeptide-C), soit via un domaine collagène synthétique, soit via le domaine zipper des collagènes de défense ou encore via le domaine V de trimérisation des collagènes bactériens, d’intégrer un ou plusieurs motifs répétés ou non, identiques ou non, de liaison à LAIR-1 et/ou LAIR-2 et/ou OSCAR, de comprendre optionnellement des domaines linker de type collagène comprenant des triplets G-X-Y, n fois répétés, où X et Y peuvent être n’importe quel acide aminé, et de de pouvoir être injectés dans la circulation sanguine, pour leur utilisation comme modulateurs de la réponse immunitaire dans différents contextes physiopathologiques.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION
L’invention porte sur des protéines ou polypeptides, dérivés du collagène, ou à domaine collagène, pour leur utilisation dans le traitement des situations/contextes/maladies inflammatoires via l’activation/l’inhibition du récepteur LAIR-1 ou du récepteur OSCAR ou de la protéine soluble LAIR-2, sous une forme adaptée à une administration par voie intraveineuse, en particulier sans induire d’activation plaquettaire. La préparation injectable comprend des protéines et polypeptides dérivés du collagène, capables de se lier et d’activer (spécifiquement) ou de bloquer/inhiber les récepteurs cellulaires LAIR-1 et OSCAR et/ou la protéine soluble LAIR-2 et d’induire une modulation de la production de facteurs ou médiateurs associés à la réponse inflammatoire dans différents contextes physiopathologiques. La présente invention porte également sur l’utilisation de ces mêmes protéines ou polypeptides lorsqu’ils sont déposés/greffés en surface d’un support et ce pour les mêmes indications ou lorsqu’ils sont utilisés en application topique ou sous-cutanée.
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION
Le collagène, protéine la plus abondante de la matrice extracellulaire, forme une famille composée de 28 types différents organisés en différentes structures macromoléculaires (fibrille, réseau, …) jouant un rôle majeur dans la plasticité tissulaire. Ils ont tous comme caractéristique d’être structurés en triple-hélice, indispensable à leur activité biologique. Longtemps considérés comme ayant un rôle structurel dans les tissus, les collagènes sont maintenant reconnus comme étant des acteurs à part entière de nombreux processus cellulaires tels que l’adhésion, la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire.
On définit les collagènes ou les protéines à domaine collagène par leur caractéristique commune de contenir un ou plusieurs domaine(s) ayant une structure en triple hélice formée par l’association de trois chaines polypeptidiques, ou chaines , enroulées les unes aux autres. Cette caractéristique est permise par la présence, tous les trois acides aminés, d’une glycine au niveau des motifs hélicoïdaux qui sont constitués de séquences répétées de type G-X-Y ou X est souvent une proline et Y une hydroxyproline. Cette hydroxyproline joue un rôle dans la stabilisation de la triple hélice et est caractéristique des collagènes. Les résidus prolines sont hydroxylés essentiellement par la prolyl-4-hydroxylase (P-4-H) en 4-hydroxyproline. Il existe une deuxième hydroxylase, la prolyl-3-hydroxylase qui permet l’hydroxylation de la proline lorsque celle-ci est en position X, alors qu’en position Y se trouve déjà une proline hydroxylée par la P-4-H. Dans une molécule de collagène, les chaines α peuvent être identiques (homotrimère) ou toutes différentes (hétérotrimère).
La formation et l’amorçage d’une triple-hélice nécessite préalablement la reconnaissance entre elles des trois chaînes α. Elle se fait par l’intermédiaire de séquences polypeptidiques, ne possédant pas une glycine tous les trois acides aminés, situées en position C-terminale et formant le propeptide-C. Ce propeptide-C est requis pour assurer l’association des chaines monomériques entre elles sous la forme d’une triple-hélice. Toutes les séquences à l’intérieur de ce propeptide-C ne sont pas indispensables à l’amorçage de la triple-hélice et selon la présente invention, cet amorçage peut se faire en associant uniquement :
- la séquence discontinue de 15 aa qui détermine l’assemblage type spécifique des chaines α décrit parHulmes DJ, J Struct Biol. 2002 Jan-Feb; 137(1-202) : 2-10,
- le domaine « coiled-coil » situé au début du propeptide-C, par exemple celui impliqué dans la trimérisation du collagène III comme décrit parBulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701.Ce domaine est constitué de 4 heptapeptides décrit parMcAlinden et coll., J Biol Chem. 2003 Oct 24; 278(43) : 42200-7), et
- un motif contenant 8 résidus cystéine qui permettent la formation de ponts disulfures intra-et inter-catenaires. La présence de ponts disulfures entre les chaines au niveau du télopeptide-C ou du propeptide-C n’est pas requise pour l’association des chaines et la formation de la triple hélice mais permettrait la formation de multimères de collagène.
Comme indiqué précédemment, il existe d’autres protéines contenant des domaines analogues au collagène formées de la répétition de séquences, continues ou non, de type G-X-Y, n fois répétées. C’est le cas notamment des collagènes dits de défense regroupant un ensemble de protéines solubles analogues du collagène jouant un rôle dans le système immunitaire inné. On peut citer par exemple la protéine SP-D (Surfactant protein D), les MBL (Mannose-binding leptin) ou la protéine C1q (Casals et al., Molecular Immunology, 2019, 112: 291-304). Elles contiennent toutes un domaine collagène structuré en triple-hélice. Dans ce cas, l’amorçage de cette triple-hélice se fait par l’intermédiaire d’un domaine de trimérisation de type zipper (ou domaine de fermeture à glissière trimérique). De fait, et comme décrit dans la présente demande, il est possible de former un domaine collagène structuré en triple-hélice contenant des motifs de liaison à LAIR-1 et/ou LAIR-2 et/ou OSCAR en utilisant les domaines zipper de ces protéines ou tout autre domaine de trimérisation connu et ce, même s’ils ne sont pas impliqués dans la trimérisation d’une protéine contenant un domaine collagène.
Des données récentes ont décrit l’expression de protéines analogues du collagène par des bactéries ou des virus sur la base de la présence de séquences (G-X-Y) n fois répétées dans leur génome. Certaines de ces protéines analogues du collagène ont été étudiées et jouent un rôle de facteur de virulence en permettant d’échapper au système immunitaire des mammifères. Plus particulièrement, des études ont porté sur deux protéines analogues du collagène issues de la bactérie gram positiveStreptococcus pyogenes. Dénommées scl1 et scl2, elles sont formées d’un domaine de trimérisation globulaire ou V domaine situé en partie N-terminale et d’un domaine analogue du collagène formé d’une répétition de (G-X-Y) n fois répétée. A noter que contrairement aux collagènes, ces collagènes bactériens n’ont pas besoin que les prolines soient hydroxylées pour se structurer en triple hélice. Des travaux ont montré la possibilité de produire ces protéines de façon recombinante en systèmeE. coliet d’y intégrer des motifs de liaison présents dans la séquence des collagènes de mammifères pour développer de nouveaux biomatériaux (An et al., Frontiers in Chemistry June 2014 Volume 2 : article 40).
Cependant, à ce jour, aucune donnée n’a décrit l’insertion de motifs de liaison aux récepteurs LAIR-1 et/ou OSCAR et/ou de liaison à LAIR-2, comme décrit dans la présente demande. Surtout, il n’a jamais été suggéré ou décrit leur utilisation par voie injectable dans le système circulatoire sanguin, objet de la présente invention, pour le traitement des pathologies inflammatoires via l’activation et/ou l’inhibition du récepteur LAIR-1 ou du récepteur OSCAR ou de la protéine soluble LAIR-2.
De nombreux travaux ont cherché à créer par synthèse peptidique de nouveaux collagènes, dénommés peptides analogues du collagène, en utilisant des domaines de trimérisation synthétiques formés par la répétition du motif (GPO), n fois répété, ou O est une hydroxyproline. Ainsi, il a été montré que l’ajout en N-terminal et en C-terminal d’un minimum de 5 répétitions GPO permet à un domaine collagène de type (G-X-Y) n fois répété de se structurer en triple-hélice lorsqu’il est produit par synthèse peptidique. Les présents inventeurs sont les seuls à avoir eu l’idée d’utiliser cette répétition (GPO)n, ou n est supérieur à 3, au sein d’une chaîne polypeptidique, et de l’utiliser pour produire un collagène recombinant associant d’autres motifs d’intérêt (WO2015086748) au sein de cette même chaîne polypeptidique. Cependant, ni l’insertion de motifs de liaison à LAIR-1, LAIR-2 ou OSCAR au sein d’une seule et même chaîne polypeptidique, ni leur utilisation par voie injectable n’a été décrite ou suggérée.
Les découvertes récentes autour du rôle des collagènes dans de nombreux processus biologiques ont permis de dresser une carte de son interactome et d’identifier les sites de liaison avec différents récepteurs cellulaires, protéines ou constituants de la matrice extracellulaire. Cela ouvre la voie au développement de nouveaux collagènes, totalement caractérisés, capables d’interagir avec ces différents partenaires. Parmi ces partenaires, on peut citer différents récepteurs cellulaires (Intégrines α1β1, α2β1, α10β1, α11β1, récepteurs DDR1 et DDR2, GPVI, LAIR-1, OSCAR et intégrines dépendantes du motif RGD) et/ou des partenaires protéiques des collagènes (Facteur Willebrand et protéine SPARC) (An et al., Blood 4 february 2016 Volume 127 Number 5 : 521-522).
WO2015086748 décrit l’ingénierie de collagènes possédant la capacité à induire l’adhésion, l’activation et l’agrégation de plaquettes sanguines ainsi que la liaison au facteur Willebrand par l’ajout au sein d’une même séquence polypeptidique d’un ou plusieurs motifs de liaison décrits pour interagir avec le récepteur plaquettaire GPVI et les intégrines α1β1, α2β1, α10β1, α11β1. Par ailleurs, l’un des résultats les plus important de WO2015086748 a été de décrire pour la première fois la macro-structuration de ces collagènes sous forme de particules, ce qui n’avait jamais été décrit avant car cette forme particulaire n’est jamais observée pour les collagènes natifs. De plus, WO2015086748 décrit pour la première fois leur utilisation par voie injectable (circulation sanguine), ce que personne n’avait imaginé faire pour des protéines ou peptides de type collagène.
L’établissement de l’interactome de certains collagènes a été rendu possible par l’utilisation de peptides permettant de diviser la séquence complète de ces collagènes en plusieurs peptides, dont une partie est commune à deux peptides contigus. Regroupés sous le terme de toolkit, et développés par l’équipe de Richard FARNDALE, ils couvrent la totalité des séquences des collagènes fibrillaires homotrimériques de type II et III. Ainsi, Farndale et son équipe ont décrit de nombreux motifs de liaison ou d’interaction entre ces collagènes et différents récepteurs cellulaires, protéines, ou autres molécules (Farndale, Essays in Biochemistry, 2019 EBC201880070 : 1-12).
Parmi les récepteurs cellulaires interagissant avec les collagènes, deux ont été identifiés comme exprimés par les cellules immunitaires (Jurgensen HJ, Cell Mol Life Sci. 2020 Feb 25).Ils possèdent comme fonction de réguler la réponse immunitaire. On distingue ainsi le récepteur LAIR-1 pourleukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1, également appelé CD305, qui possède une activité inhibitrice et le récepteur OSCAR pourosteoclast-associated receptor, qui possède une activité activatrice des cellules immunitaires.
LAIR-1 est une protéine transmembranaire appartenant à la super famille des immunoglobulines. Elle est exprimée en surface de nombreuses cellules myéloïdes et lymphoïdes. Elle est notamment exprimée en surface ou après activation des cellules T et B, des neutrophiles, des monocytes ou encore des macrophages (Meyaard L, J. Leukoc.Biol. April 2008 volume 83 : 799-803). Elle possède un domaine extracellulaire capable de lier le collagène ou des protéines à domaine collagène comme la protéine C1q. Elle possède par ailleurs deux domaines intracellulaires de type ITIMs, pour immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs, qui une fois phosphorylés par des kinases de la famille des Src recrutent les phosphates SHP-1 (Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase) et SHP-2 qui régulent négativement les voies de signalisation intracellulaires nécessaires à l’activation des leukocytes ou d’autres cellules immunitaires. Différents contextes pathologiques sont associés à une diminution de l’expression ou de l’activation de LAIR-1 comme dans la leucémie lymphocytique chronique, le lupus érythémateux systémique ou encore la polyarthrite rhumatoïde. Dans le contexte de certaines maladies auto-immunes dépendantes du collagène, il a été suggéré que les auto-anticorps ciblant différents collagènes peuvent interférer avec la liaison collagène-LAIR-1 et jouer un rôle majeur dans ces pathologies. C’est le cas pour le collagène de type XVII dans la pemphigoïde bulleuse, le collagène de type II dans la polyarthrite rhumatoïde et le lupus ou encore le collagène de type VII dans l’épidermolyse bulleuse (Lebbink et al., JEM Vol. 203, N°6, June 12, 2006: 1419-1425).
L’expression de LAIR-1 est régulée par compétition entre la forme soluble de LAIR-1, générée par le clivage de l’ectodomaine du récepteur et par LAIR-2 soluble (ou CD306) qui est produit en réponse à l’activation du récepteur LAIR-1.
De nombreux travaux se sont intéressés au rôle de LAIR-1 dans la modulation de la réponse immunitaire. Ainsi, LAIR-1 a été décrit comme jouant un rôle dans les pathologies pulmonaires en diminuant l’inflammation des voies aériennes dépendante des neutrophiles (Kumawat et al., Front. Immunol . 2019 ; 10 : 1-9) suggérant son ciblage dans ce type de pathologies.Park et al.,J. Biol. Chem.2020 295 : 2239ont démontré que l’activation de LAIR-1 est capable de supprimer l’activation des cellules T dans le contexte de la polyarthrite rhumatoïde renforçant l’intérêt de l’activation de ce récepteur dans les maladies auto-immunes. Geerdink et al. J Allergy Clin Immunol. 2018 volume 141 ; 2 : 811-814 ont montré que LAIR-1 limite la formation des pièges extracellulaires des neutrophiles ou NET (Neutrophil extracellular trap) dans la bronchiolite virale.
Plus largement l’activation de LAIR-1 et son effet bénéfique sur la diminution de l’inflammation ont été décrits dans différents contextes pathologiques comme les maladies auto-immunes, l’athérosclérose, l’ischémie-reperfusion, le rejet de greffe, l’ostéoclastogenèse, dans l’homéostasie de l’interface mère-fœtus, dans les anémies, les infections virales, en particulier les infections à coronavirus, les infections bactériennes ou encore les allergies.
De fait, on peut plausiblement conclure que son activation aura un rôle bénéfique dans toute situation pathologique associée à une augmentation anormale de la réponse immunitaire comme par exemple dans le sepsis ou encore dans les contextes infectieux induisant une réponse inflammatoire majorée comme les orages cytokiniques ou encore dans les maladies fibrosantes ou autres.
A l’inverse, l’activation de LAIR-1 par les cellules cancéreuses exprimant en surface du collagène est une cible de choix pour le traitement de certains cancers. En effet, l’augmentation de l’expression en surface de cellules néoplasiques de nombreux collagènes a été décrite et associée à une augmentation de la progression tumorale qui est une conséquence d’une diminution de la réponse immunitaire et de l’activation de LAIR-1 (Rygiel et coll., Molecular Immunology. 2011 : 402-406).
A ce jour, il n’existe aucune protéine ou peptide dérivé du collagène capable de se lier et d’activer spécifiquement le récepteur LAIR-1 pour une utilisation, en particulier sous une forme adaptée à une administration par voie injectable dans la circulation sanguine, comme médicament dans le traitement des pathologies inflammatoires et/ou infectieuses. Seul un anticorps monoclonal présentant une activité stimulatrice du récepteur a été développé (Xie et al., Monoclonal antibodies in immunodiagnosis and immunotherapy. 2014 Volume 33 ; 2 : 141-147)sans que son activité n’ait été testéein vivo. De fait les protéines et polypeptides ligands activateurs de LAIR-1 dérivés du collagène décrits dans la présente demande représentent à la fois les premiers ligands d’ingénierie capables de lier et d’activer LAIR-1 et les premiers utilisables par voie injectable, mimant au plus proche les ligands naturels de LAIR-1 que sont les collagènes natifs et C1q.
La mise au point de ces polypeptides ou protéines selon l’invention, ligands du récepteur LAIR-1, mais également de son inhibiteur physiologique LAIR-2, s’appuie sur les travaux publiés parLebbink et al., Matrix biology. 2009 ; 28 : 202-210, décrivant les motifs de liaison à LAIR-1 et LAIR-2 présents dans la séquence des collagènes fibrillaires de type II et III. Bien qu’ayant décrit ces motifs de liaison, l’équipe de Farndale n’a jamais décrit une quelconque utilisation comme ligands du récepteur LAIR-1 à des fins thérapeutiques comme décrit dans la présente invention. Parmi les peptides présentant la meilleure activité de liaison à LAIR-1, on peut citer les peptides 30 des collagènes II et III ou encore le peptide 56 pour le collagène de type II et les peptides 38 et 44 pour le collagène de type III. Pour LAIR-2, on peut citer le peptide 17 du collagène de type II, les peptides 45 et 51 pour le collagène de type III. A noter que certains peptides possèdent à la fois une activité de liaison avec LAIR-1 et LAIR-2 mais également avec d’autres récepteurs. On peut par exemple citer l’exemple du peptide 30 du collagène de type III qui possède une activité de liaison décrite pour LAIR-1, LAIR-2 et GPVI plaquettaire. A noter queKim et al., Adv. Healthcare Mater. 2017 Vol 6 Issue 24 december 20 : 1700707ont montré que ce peptide 30 trimérique immobilisé en surface d’un support possède bien une activité inhibitrice de l’inflammation dépendante de LAIR-1 mais qu’il est incapable d’activer LAIR-1 lorsqu’il est utilisé en solution, renforçant d’autant l’intérêt des ligands de la présente invention utilisables en solution par voie injectable dans la circulation sanguine.
Comme indiqué précédemment, d’autres protéines contenant un domaine collagène structuré en triple-hélice, appelées collagène de défense, sont capables de lier LAIR-1 et de l’activer (Son et al., PNAS. October 23, 2012 ; E3160-E3167). Il s’agit des protéines C1q, MBL (Mannose-binding leptin) et SP-D (surfactant protein-D). Ces protéines sont constituées de deux régions. L’une, globulaire, est principalement responsable de la reconnaissance des cibles, de la liaison à la région Fc des immunoglobulines mais aussi de la reconnaissance des protéines de surface de bactéries ou de virus. L’autre, dite région analogue du collagène et formée d’une répétition de triplet G-X-Y et structurée en triple-hélice, est impliquée dans les fonctions effectrices de ces protéines dans l’immunité, notamment l’activation du complément.
L’interaction avec le récepteur LAIR-1 se fait via le domaine ou région collagène de ces protéines et chacune semble être spécifique à certains types cellulaires : C1q pour les cellules dendritiques, MBL pour les neutrophiles, SP-D pour les macrophages. Bien que le domaine collagène soit identifié comme le site de liaison, les séquences spécifiques à cette liaison ne sont pour l’heure pas connues.
La présente invention vise ainsi des séquences spécifiques de ce domaine collagène pour la réalisation de polypeptides ou protéines de liaison à LAIR-1. De fait, selon la description de la présente invention, il est possible de faire l’ingénierie du domaine collagène de ces collagènes de défense en y ajoutant un ou plusieurs motifs de liaison à LAIR-1 ou LAIR-2, tout en conservant la structure en triple-hélice de ces protéines via un domaine de trimérisation. Ainsi, l’invention est basée sur une séquence polypeptidique dans laquelle est comprise : une séquence permettant la trimérisation, des séquences permettant la liaison aux récepteurs d'intérêt et des séquences collagènes linkers. L'association de 3 polypeptides va conduire à la formation d'un trimère. Dans le cas de la présente invention, ce trimère va se structurer en triple-hélice qui est un cas particulier de trimère à conformation particulière permise par la séquence collagène qui compose ces polypeptides.
De même, selon la description de la présente invention, il est possible de faire l’ingénierie du domaine collagène des collagènes bactériens, comme scl2, en y ajoutant un ou plusieurs motifs de liaison à LAIR-1 ou LAIR-2 et d’obtenir une protéine trimérique par l’utilisation, dans la séquence du polypeptide, du domaine V de trimérisation de ces collagènes bactériens.
La présente invention décrit également l’ingénierie de protéines ou peptides ligands spécifiques capables de lier et d’activer ou d’inhiber le récepteur OSCAR (osteoclast-associated receptor). OSCAR est un immunorécepteur activateur de type immunoglobuline du complexe LRC (leukocyte receptor complex) qui associé au récepteur FcRϒ (Fc receptor common ϒ), qui contient un domaine ITAM, recrute la protéine kinase Syk et induit une signalisation. Il est exprimé par les ostéoclastes, où il joue un rôle dans l’ostéoclastogenèse, par les monocytes, et les cellules dendritiques (Nemeth et al., Journal of Immunology 2011, 186 : 13-18). Le récepteur OSCAR contribue à la pathogénèse et à la sévérité de nombreuses maladies comme l’ostéoporose, l’athérosclérose, les maladies pulmonaires obstructives chroniques comme la BPCO ou encore l’arthrose rhumatoïde et est une cible de choix pour le traitement de ces pathologies. Compte-tenu de son expression en surface de nombreuses cellules du système immunitaire, la présente invention se propose d’utiliser les protéines ou polypeptides ligands développés comme inducteur de la réponse immunitaire dans le cas de maladies infectieuses ou de cancer où la réponse immunitaire est insuffisante ou inhibée. Par ailleurs, dans un mode de revendication particulier, ces protéines ou polypeptides ligands peuvent être utilisés comme adjuvants dans des approches vaccinales pour prévenir les infections virales ou traiter le cancer en stimulant la réponse immunitaire. Dans un mode de réalisation particulier, les polypeptides de la présente invention, bien que capables de se lier au récepteur OSCAR, se comportent comme des inhibiteurs de ce récepteur en bloquant sa signalisation intracellulaire.
Comme pour le récepteur LAIR-1, OSCAR a comme ligand naturel les collagènes et les protéines de l’immunité telle que la SP-D (Surfactant protein D). Les motifs de liaison de OSCAR aux collagènes fibrillaires, collagène de type II et III, ont été décrits par l’équipe de Farndale (Zhou et al., Blood. 2016 volume 127 number 5 : 529-537). Comme pour le récepteur LAIR-1, l’équipe de Farndale n’a cependant jamais indiqué leur possible utilisation comme ligands du récepteur OSCAR à des fins thérapeutiques comme décrit dans la présente demande et en particulier leur utilisation par voie injectable. Parmi les peptides présentant la meilleure activité de liaison à OSCAR, on peut citer les peptides 1 et 26 du collagène de type II ou les peptides 36 et 39 du collagène de type III. S’agissant des motifs de liaison à OSCAR présent dans le domaine collagène de la protéine SP-A, ils ont été discutés dans l’article deBarrow et al., Journal of Immunology. 2015, 205 194 : 3317-3326.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
La présente invention concerne donc des protéines ou polypeptides de synthèse, ligands des récepteurs LAIR-1 et/ou OSCAR et/ou de LAIR-2 ayant comme particularité :
- d’être structurés sous forme d’une triple-hélice soit via tout ou partie du domaine de trimérisation naturel des collagènes natifs (propeptide-C), soit via un domaine collagène synthétique, soit via le domaine zipper des collagènes de défense ou encore via le domaine V de trimérisation des collagènes bactériens,
- d’intégrer un ou plusieurs motifs répétés ou non, identiques ou non, de liaison à LAIR-1 et/ou LAIR-2 et/ou OSCAR,
- de comprendre optionnellement des domaines linker de type collagène comprenant des triplets G-X-Y, n fois répétés, où X et Y peuvent être n’importe quel acide aminé,
- de pouvoir être injectés dans la circulation sanguine, ou de pouvoir être greffés à un support, pour leur utilisation comme modulateurs de la réponse immunitaire dans différents contextes physiopathologiques,
- de pouvoir se structurer ou non sous forme de particules, par autoassemblage ou coacervation, de taille comprise entre 0,005 et 3 µm,
- et de ne pas induire d’activation ni d’agrégation plaquettaire.
BREVE DESCRIPTION DES SEQUENCES
Les séquences SEQ N°1 à 6 décrivent plusieurs polypeptides illustratifs de l’invention qui possèdent dans leur séquence un domaine collagène intégrant deux sites de liaison à LAIR-1, LAIR-2 et/ou OSCAR et un domaine de trimérisation pouvant être l’un de ceux décrit dans la présente invention ainsi que des domaines linker GXY comme expliqué ci-après.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 3 illustre sur les six séquences polypeptidiques illustratives de polypeptides selon l’invention, les différents domaines fonctionnels desdits polypeptides.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
L’approche est basée sur l’ingénierie de protéines trimériques et l’invention concerne des protéines comprenant au sein d’une même chaîne polypeptidique, une séquence assurant la trimérisation de ladite protéine sous la forme de triple-hélice avec deux autres polypeptides identiques, une séquence comprenant au moins un motif peptidique ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR. La protéine selon l’invention peut aussi comprendre une ou plusieurs séquences ou motifs de liaison collagène situé(e)s entre le ou les motifs peptidiques ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR.
Dans le cadre de l’invention, la notion de protéine fait référence à une ou plusieurs chaînes polypeptidiques, qui sont des biopolymères linéaires, pouvant être très longs, composés de plus d’une vingtaine d'acides aminés. On parle ainsi généralement de polypeptide ou de protéine au-delà d'une vingtaine d’acides aminés dans la molécule, et de peptide jusqu'à une vingtaine de résidus. Ainsi dans la plupart des cas selon la présente invention, on aura à faire à des protéines bien que cette définition ne soit pas exclusive de biopolymères comprenant moins de cinquante acides aminés.
La structure primaire d’une protéine fait référence à la séquence en acides aminés, la structure secondaire définit l’arrangement des acides aminés stabilisés par liaisons hydrogène en arrangements de type hélice alpha, feuillets beta par exemple. La structure tertiaire fait référence à la forme générale de la protéine entière décrivant les interactions de structures secondaires entre elles, stabilisée par des liaisons faibles de type hydrophobes, électrostatiques telles qu’hydrogène, ioniques, salines voire des liaisons covalentes tels que des ponts disulfures. Enfin la structure quaternaire fait référence à l’assemblage de deux, ou plus, protéines (ou chaines polypeptidiques) entre elles, chaque protéine est une sous-unité du complexe protéique ainsi créé.
Il est précisé que les polypeptides selon l’invention ont comme particularité de se structurer en triple-hélice par l’association de trois chaînes polypeptidiques identiques, la formation de cette triple-hélice est permise par la présence dans la séquence de ces polypeptides d’un domaine de trimérisation et d’un domaine collagène de type (GXY), n fois répété. Il est précisé que la formation de cette triple-hélice peut se faire à l’intérieur d’un système cellulaire (cellules eucaryotes ou procaryotes). Cependant, il est aussi possible de former cette triple-hélice lorsque les polypeptides selon l’invention sont produits via un système acellulaire de type réticulocytes ou via une synthèse peptidique chimique.
Dans le cadre de l'invention, les « oligomères » ou « polymères » ou « multimères » protéiques ont la même signification, c'est-à-dire qu’ils correspondent à l’association de plusieurs protéines ayant une structure quaternaire trimérique (trimère en triple-hélice), étant des complexes d'au moins deux protéines, lesdites protéines pouvant être identiques ou différentes.
Les « protéines recombinantes » sont des protéines codées par des acides nucléiques (ou ADN recombinants, c’est à dire une molécule d'acide désoxyribonucléique créée en laboratoire composée de séquences nucléotidiques provenant de plusieurs sources y compris des séquences qui n'existent pas dans les organismes vivants) qui sont intégrés dans une cellule hôte permettant l’expression hétérologue de ces protéines.
Par « première séquence d'acides aminés » et « deuxième séquence d'acides aminés » dans la description de la molécule ou de la protéine de l'invention, il n'est pas entendu qu’un ordre spécifique des séquences soit envisagé. C'est juste pour la clarté du mode de réalisation de mieux distinguer les deux séquences comprises dans la molécule ou protéine recombinante de l'invention.
Telle qu'utilisée ici, une première séquence ayant au moins x% d'identité avec une seconde séquence signifie que x% représente le nombre d'acides aminés dans la première séquence qui sont identiques aux acides aminés correspondants de la deuxième séquence lorsque les deux séquences sont alignées de manière optimale via un alignement global, par rapport à la longueur totale de la deuxième séquence d'acides aminés. Les deux séquences sont alignées de manière optimale lorsque x est maximal. L'alignement et la détermination du pourcentage d'identité peuvent être effectués manuellement ou automatiquement en utilisant un algorithme d'alignement global, par exemple l'algorithme Needleman et Wunsch, décrit dans Needleman et Wunsch, J. Mol Biol., 48, 443-453 (1970), avec par exemple les paramètres suivants pour la comparaison de séquences polypeptidiques : matrice de comparaison : BLOSUM62 de Henikoff et Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 10915-10919 (1992), pénalité d'écart : 8 et pénalité de longueur d'écart : 2 ; et les paramètres suivants pour la comparaison de séquences polynucléotidiques : matrice de comparaison : correspond à = + 10, à décalage = 0 ; pénalité pour écart : 50 et pénalité pour longueur d'écart : 3.
Ainsi l’invention vise en son premier objet un polypeptide comprenant, c’est-à-dire au sein de la chaîne polypeptidique :
- une séquence assurant la trimérisation du polypeptide, sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice, par association avec deux autres polypeptides identiques,
- et une séquence comprenant au moins un motif peptidique ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR.
Il est entendu qu’afin que la triple hélice se forme, il convient en effet que trois polypeptides identiques soient réunis.
De manière avantageuse, un polypeptide selon l’invention peut être choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID N°1 à 6 ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Dans la littérature, il est fait référence à la notion de domaines de trimérisation pour ce qui concerne la ou les séquences responsable(s) de la trimérisation du collagène. Ceci étant, la séquence assurant la trimérisation du polypeptide, ou domaine de trimérisation, peut provenir de source autre que le collagène et on peut citer par exemple le domaine de trimérisation de la fibritine, en particulier un domaine de trimérisation de la fibritine de bactériophage, plus particulièrement un domaine de trimérisation de la fibritine provenant du bactériophage T4 ou de bactériophages apparentés tels que les bactériophages T - même ou le phage RB69 ou le phage AR1.
Selon un autre mode de réalisation, un polypeptide selon l’invention peut comprendre des séquences de liaison collagène, ou motif linker collagène, de type (GXY) n fois répétées où X et Y peuvent être n’importe quel acide aminé, n étant compris entre 1 et 50, en particulier entre 1 et 10, en particulier encore entre 1 et 5, en particulier encore entre 1 et 3 ; ces motifs de liaison collagène, ou motif linker collagène, sont compris entre les motifs peptidiques ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR. De tels motifs linker collagène sont figurés dans les séquences 1 à 6 sur les figures 3A à 3F. Ils correspondent en particulier au domaine compris entre la position 2 et la position 10, au domaine compris entre la position 38 et la position 55 et au domaine compris entre la position 80 et la position 106 de la SEQ ID N°1 ; au domaine compris entre la position 2 et la position 10, au domaine compris entre la position 38 et la position 55 et au domaine compris entre la position 80 et la position 121 de la SEQ ID N°2 ; au domaine compris entre la position 2 et la position 10, au domaine compris entre la position 38 et la position 55 et au domaine compris entre la position 80 et la position 106 de la SEQ ID N°3 ; au domaine compris entre la position 2 et la position 10, au domaine compris entre la position 32 et la position 55 et au domaine compris entre la position 80 et la position 112 de la SEQ ID N°4 ; au domaine compris entre la position 76 et la position 84, au domaine compris entre la position 112 et la position 129 et au domaine compris entre la position 154 et la position 180 de la SEQ ID N°5 ; ou encore au domaine compris entre la position 2 et la position 10, au domaine compris entre la position 38 et la position 52 et au domaine compris entre la position 80 et la position 94 de la SEQ ID N°6 ; ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation du polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques, peut être une séquence comprenant tout ou partie du propeptide-C dérivé de collagènes.
Plus particulièrement, une séquence comprenant tout ou partie du propeptide-C du collagène comprend la séquence discontinue de 15 acides aminés déterminant l’assemblage des chaines α, le domaine « coiled-coil » situé au début du propeptide-C, un motif contenant 8 résidus cystéine qui permettent la formation de ponts disulfures intra-et inter-catenaires.
De manière avantageuse, cette séquence comprenant tout ou partie du propeptide-C dérivé de collagène est le domaine compris entre la position 107 et la position 350 de la séquence SEQ ID N°1 (propeptide C complet ; ) ou le domaine compris entre la position 122 et la position 265 de la séquence SEQ ID N°2 (propeptide C raccourci, ), ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
En particulier par exemple, le motif « coil-like » est celui impliqué dans la trimérisation du collagène III comme décrit par Bulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22) : 6694-701. Ce domaine est constitué de 4 heptapeptides tels que décrit par McAlinden et coll., J Biol Chem. 2003 Oct 24; 278(43) : 42200-7).
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques est une séquence synthétique comprenant la répétition de (GPO) n fois répété avec n compris entre 2 et 15, dans laquelle O est une hydroxyproline. Dans les séquences préférées décrites et divulguées dans la présente demande, les triplets en question sont indiqués par GPP et non pas GPO, ceci étant les polypeptides selon l’invention concernent bien des séquences avec des triplets GPO. En effet l’hydroxyproline n’est pas un acide aminé naturel codé par un codon mais issu de modification post traductionnelle. Ainsi le nucléotide codant un polypeptide selon l’invention, y compris ceux ici divulgués, contient le codon correspondant à la proline et le polypeptide traduit (lorsque produit dans un organisme hôte) contient des triplets GPP qui sont transformés in situ par la machinerie cellulaire en GPO. Les triplets GPP doivent donc se lire GPO.
De manière avantageuse, cette séquence synthétique comprenant la répétition de (GPO) n fois répété (illustré GPP dans les séquences listées) avec n compris entre 2 et 15, dans laquelle O est une hydroxyproline est le domaine entre la position 107 et la position 128 de la séquence SEQ ID N°3 ( ) ou le domaine entre la position 95 et la position 109 de la séquence SEQ ID N°6 ( ), ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité. Comme expliqué plus avant les triplets GPP des séquences en question doivent donc se lire GPO.
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques est de type zipper issue de protéines de l’immunité innée choisie dans le groupe comprenant C1q, SP-D, MBL, les collectines, les pentraxines.
De manière avantageuse, cette séquence de type zipper issue de protéines de l’immunité innée choisie dans le groupe comprenant C1q, SP-D, MBL, les collectines, les pentraxines est le domaine compris entre la position 113 et la position 147 de la séquence SEQ ID N°4 (MBL Zipper ; ) ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité. Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques est une séquence comprenant tout ou partie de collagènes bactériens et peut être choisie parmi la protéine scl2 de Streptococcus pyogenes ou le domaine globulaire V de ces collagènes bactériens.
De manière avantageuse, la séquence comprenant tout ou partie de collagènes bactériens choisie parmi la protéine scl2 de Streptococcus pyogenes ou le domaine globulaire V de ces collagènes bactériens est le domaine compris entre la position 1 et la position 74 de la séquence SEQ ID N°5 (Domaine V Scl2 bactérien ; ) ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Selon un mode de réalisation de l’invention, les polypeptides selon l’invention contiennent au moins un, en particulier deux ou au moins deux, voire trois ou au moins trois motif(s) peptidique(s), ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR, comprend des séquences de type (GXY) n fois répétées, X et Y pouvant être n’importe quel acide aminé, n pouvant aller de 1 à 50.
Ce motif, ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR, peut lui-même être répété y fois avec y allant de 1 à 50. Lorsqu’un polypeptide selon l’invention comprend deux, trois, ou plus, motif(s) peptidique(s), ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR, ces motifs peuvent être identiques ou différents, au sein du polypeptide.
Selon un mode de réalisation de l’invention les séquences de liaison situées entre plusieurs motifs peptidiques ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR, sont formées de la répétition de triplets GXY ou X et Y pouvant être n’importe quel acide aminé.
De manière avantageuse, un motif peptidique, ayant une activité de liaison au récepteur LAIR-1 et/ou LAIR-2 est le domaine compris entre la position 11 et la position 37 ainsi que le domaine compris entre la position 56 et la position 79 de la séquence SEQ ID N°1 (Figure 3A) ; le domaine entre la position 11 et la position 37 ainsi que le domaine compris entre la position 56 et la position 79 de la séquence SEQ ID N°2 ( ) ; le domaine entre la position 11 et la position 37 ainsi que le domaine compris entre la position 56 et la position 79 de la de la séquence SEQ ID N°3 ( ) ; le domaine entre la position 11 et la position 31 ainsi que le domaine compris entre la position 56 et la position 79 de la de la séquence SEQ ID N°4 ( ) ; ou encore le domaine entre la position 85 et la position 111 ainsi que le domaine compris entre la position 130 et la position 153 de la de la séquence SEQ ID N°5 ( ) ; ou encore toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
De manière avantageuse un motif peptidique, ayant une activité de liaison au récepteur OSCAR est le domaine compris entre la position 11 et la position 37 ainsi que le domaine compris entre la position 53 et la position 79 de la séquence SEQ ID N°6 ( ) ; ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
L’invention vise aussi une protéine trimérique comprenant l’association sous forme de triple hélice de trois polypeptides identiques selon l’invention.
Selon un mode de réalisation de l’invention, les protéines ou polypeptides selon l’invention, tant sous la forme monomérique ou trimérique structurée en triple-hélice, sont incapables de lier le facteur Willebrand ni d’activer les plaquettes et/ou les récepteurs plaquettaires responsables de l’activation, de l’adhésion et de l’agrégation des plaquettes sanguines. L'effet pro-agrégant du polypeptide dépendant de sa structuration en triple hélice est la conséquence de l'activation d'un ou plusieurs récepteurs présents à la surface des plaquettes (α2β1, GPIb et GPVI).
Cette capacité de liaison et d’activation des plaquettes peut être évaluée selon une technique connue et documentée telle que décrite dans le document EP2337796.
Cette propriété, et son absence, peut être évaluée par un test ELISA de liaison au facteur Willebrand ou d’agrégation plaquettaire bien connu de l’homme du métier et détaillé dans la section exemple de la présente demande.
Les protéines selon l’invention n’induisent donc aucune activation plaquettaire ni aucune coagulation sanguine.
L’invention vise aussi un polypeptide ou une protéine selon l’invention pour son utilisation dans le traitement des pathologies inflammatoires via l’activation et/ou l’inhibition du récepteur LAIR-1 ou du récepteur OSCAR ou de la protéine soluble LAIR-2, en particulier sous une forme adaptée à une administration par voie intraveineuse, en particulier sans induire d’activation plaquettaire.
L’invention vise aussi une protéine trimérique comprenant l’association sous forme de triple hélice de trois polypeptides identiques selon l’invention.
L’invention vise aussi une protéine trimérique structurée sous la forme d’une triple hélice de trois polypeptides selon l’invention, pour son utilisation dans le traitement des pathologies inflammatoires via l’activation et/ou l’inhibition du récepteur LAIR-1 ou du récepteur OSCAR ou de la protéine soluble LAIR-2, en particulier sous une forme adaptée à une administration par voie intraveineuse, sans induire d’activation plaquettaire.
Selon un mode de réalisation, les pathologies inflammatoires sont choisies dans le groupe comprenant la leucémie lymphocytique chronique, le lupus érythémateux systémique, la polyarthrite rhumatoïde et les maladies auto-immunes et notamment celles ayant comme composante la présence d’auto-anticorps dirigés contre des collagènes.
Selon un mode de réalisation, les pathologies inflammatoires sont choisies dans le groupe comprenant l’ostéoporose, l’athérosclérose, les maladies pulmonaires obstructives chroniques comme la BPCO ou l’arthrose rhumatoïde ou encore la vascularite, les allergies ou le cancer.
Selon un mode de réalisation, les pathologies inflammatoires sont choisies dans le groupe comprenant les pathologies associées à une augmentation anormale de la réponse immunitaire comme par exemple le sepsis ou encore dans les contextes infectieux, les infections d’origine virales ou bactériennes, en particulier les infections à Coronavirus, induisant une réponse inflammatoire majorée pouvant aller jusqu’aux orages cytokiniques ou encore dans les maladies fibrosantes ou celles ayant comme composante une réponse inflammatoire majorée dans le contexte d’une cicatrisation/régénération tissulaire.
Selon un mode de réalisation, le polypeptide monomérique ou la protéine trimérique structurée sous la forme d’une triple hélice de trois polypeptides selon l’invention, est sous la forme de particules. Selon un mode de réalisation de l’invention les particules ont un diamètre moyen allant de 0,005 à 6 µm, particulièrement entre 0,005 à 5 µm, plus particulièrement encore entre 0,05 à 3 µm et sont formées par l’association de plusieurs protéines selon l’invention sous forme de multimères, d’oligomères ou de polymères.
Selon un mode de réalisation avantageux, les particules en question sont obtenues par coacervation, agrégation ou auto-assemblage et forment des polymères ou oligomères ou multimères.
L’invention vise ainsi aussi une préparation injectable, en particulier par voie veineuse, pour son utilisation dans le traitement des pathologies inflammatoires via l’activation et/ou l’inhibition du récepteur LAIR-1 ou du récepteur OSCAR ou de la protéine soluble LAIR-2, comprenant :
- des particules selon l’invention, lesdites particules comprenant des protéines selon l’invention ; et
- au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les protéines des particules selon l’invention peuvent être des protéines trimériques structurées sous la forme d’une triple hélice de trois polypeptides selon l’invention, y compris multimérisées ou oligomérisées.
Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide monomérique ou la protéine trimérique structurée sous la forme d’une triple hélice de trois polypeptides selon l’invention peuvent être absorbés, adsorbés ou greffés à un support. Les protéines absorbés, adsorbés ou greffés peuvent être soit sous la forme d’un polypeptide (une seule chaîne polypeptidique) ou d’une protéine trimérisée (association de trois polypeptides identiques), ou encore de particules de protéines multimérisées ou oligomérisées selon l’invention.
Les polypeptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. De préférence, les polypeptides recombinants sont produits par des cellules procaryotes ou eucaryotes génétiquement modifiées. Les polypeptides peuvent ainsi être produits dans des bactéries, des levures ou dans des cellules de mammifères. Dans certains modes de réalisation de l'invention, les polypeptides sont glycosylés.
Les séquences nucléotidiques correspondant aux séquences polypeptidiques SEQ ID N°1 à 6 sont respectivement les séquences SEQ ID N° 7 à 12.
L'hydroxylation se fait dans la cellule par le complexe prolyl-4 hydroxylase. On indique la mention GPO lorsque l'on fait de la synthèse peptidique. Les séquences avantageuses citées dans la description contiennent toutes des séquences GPP car l’hydroxyproline n’est pas un acide aminé naturel codé par un codon particulier. En effet lorsqu’elles sont exprimées dans une cellule hôte exprimant la prolyl-4 hydroxylase, la proline située en position deux est hydroxylée et devient une hydroxyproline, transformant GPP en GPO ou O est l’hydroxyproline. Ainsi dans les séquences peptidiques citées et divulguées dans la présente demande, il n’y a pas de O, cependant les polypeptides selon l’invention contiennent effectivement un O à la place du P en seconde position et les triplets figurés GPP dans les séquences citées et divulguées ici doivent et peuvent se lire GPO. En effet, afin de former un trimère organisé en triple hélice, il est nécessaire de disposer de triplets GPO et pas GPP.
Les particules peuvent être obtenues par auto-assemblage des protéines ou peptides. Dans de tels modes de réalisation, les particules ne comprennent pas de support, elles consistent uniquement en des protéines ou polypeptides. L'auto-assemblage peut être réalisé par différents moyens, tels que par coacervation ou par agrégation, induits par exemple par précipitation, concentration, ajouts de métaux ou de sels, variation de température. Les particules de la présente invention peuvent avoir un diamètre moyen allant de 0.05 µm à 6 µm, ou de 1 à 5 µm ou de 2 à 4 µm tel que mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS).
Des véhicules ou des excipients pharmaceutiquement acceptables selon l'invention, c'est à dire des véhicules ou des excipients dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs, sont bien connus de l'homme du métier. De manière non limitative, des exemples d'excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables incluent les solvants, agents d'écoulement, agents de mise en suspension, agents de solubilisation, stabilisants, conservateurs, tampons, antioxydants et agents chélatants. Les préparations injectables selon la présente invention peuvent être préparées selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation, l’invention vise une protéine trimérique constituée de l’assemblage sous forme de triple-hélice de trois polypeptides identiques selon l’invention.
EXEMPLES
Production des protéines selon l’invention
Production en cellules de mammifère : exemple en cellules CHO
Dans un mode de production particulier, les polypeptides selon l’invention peuvent être produits en cellules de mammifère comme par exemple en cellules CHO comme décrit ci-après. Une pré-culture des cellules CHO-S (Invitrogen) de 3 semaines est réalisée avant la transfection. Les cellules sont entretenues dans un milieu dédié aux cellules CHO (Power-CHO, EXCEL 302, proCHO4, proCHO5,…) complémenté avec 4 mM de L-glutamine (Lonza) et 1X de proHT (Lonza) en shakeflask 125 mL et en conditions agitées (80 rpm) dans un incubateur à 37°C avec 5 % de CO2. Deux jours avant la transfection, les cellules sont ensemencées à 5.105cellules viables/mL par un changement complet du milieu utilisé et cultivées dans 12,5 mL de milieu dédié aux cellules CHO complémenté en shakeflask 125 mL.
Le jour de la transfection, 5.106cellules viables sont culotées par centrifugation (5 min à 1000g), puis reprises dans 5 mL de milieu RPMI (Lonza) complémenté avec 4 mM de L-Glutamine (Lonza) et 1X de ProHT (Lonza). Quatre mL de suspension sont alors répartis dans 4 shakeflasks 25 mL (1 mL par flask) contenant 9 mL de milieu RPMI complémenté (1.106cellules viables par shakeflask). Les cellules CHO-S sont alors transfectées avec le vecteur contenant la séquence codante SEQ ID N°7 pour le polypeptide de SEQ ID n°1 décrit précédemment. Un contrôle positif de transfection est réalisé en transfectant les cellules avec le vecteur pMAX-GFP et 2 contrôles négatifs de la transfection sont réalisés soit en transfectant les cellules avec un vecteur ne possédant pas la cassette de résistance à la généticine soit en ne leur faisant subir aucun traitement. La transfection est réalisée à l’aide de l’agent de transfection Fecturine (PolyPlus Transfection) ou tout autre agent de transfection adapté et selon le protocole commercial du produit optimisé. Pour la Fecturine, les conditions de transfection retenues sont 6 µg d’ADN pour 12 µL de Fecturine (ratio ADN/Agent de transfection = ½) pour 106cellules viables. L’homme de métier saura définir l’agent de transfection le plus adapté pour une transfection dite transitoire ou pour une transfection dite stable. Qu’il s’agisse d’un mode de transfection dit transitoire ou stable, les cellules sont incubées en présence des complexes de transfection en conditions statiques à 37°C et 5% CO2. A 4h post-transfection, les cellules sont resuspendues dans du milieu dédié aux cellules CHO complémenté et repassées en conditions agitées. A 24h post-transfection, une quantification de l’efficacité de transfection est réalisée sur un aliquot des témoins positif et négatifs de transfection par cytométrie en flux.
Pour la production des polypeptides selon l’invention en mode dit transitoire, un premier prélèvement de surnageant est réalisé à J+3 (J0 correspondant au jour de la transfection), puis la culture est stoppée à J+5. Le surnageant de culture contenant le polypeptide de SEQ ID n°1 sécrété par les cellules sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice est récupéré après centrifugation à 3 000 g pendant 10 minutes, permettant ainsi l’élimination des cellules et débris cellulaires, puis congelé à -20°C.
Pour la production des polypeptides selon l’invention en mode dit stable, un comptage cellulaire est réalisé à 48 heures post-transfection. La totalité des cellules est ensuite centrifugée à 1 000gpendant 5 min puis ensemencée à 3.105cellules viables/mL dans du milieu dédié aux cellules CHO complémenté + généticine (G418 Merck) à 700 µg/mL (pression de sélection). Les cellules sont ensuite entretenues trois fois par semaine par ensemencement de la totalité des cellules - dans un volume permettant de conserver un taux d’ensemencement à 3.105cellules viables/mL de milieu complet + G418 à 700 µg/mL en ShakeFlasks 125 mL. On observe une diminution de la concentration cellulaire et/ou de la viabilité cellulaire dans la première semaine de culture sous pression de sélection. La viabilité cellulaire augmente de nouveau après 2-3 semaines sous pression de sélection uniquement pour les cellules transfectées avec le vecteur contenant la séquence codante pour des polypeptides selon l’invention. La viabilité des cellules non transfectées ou transfectées avec le vecteur ne possédant pas la cassette de résistance à la généticine continue de descendre jusqu’à devenir nulle. Lorsque la culture atteint plus de 95 % de viabilité, une cryo-conservation à 5.106cellules viables/ampoule (au nombre de 10 ampoules) est réalisée. Les cellules sont congelées dans du milieu dédié aux cellules CHO complémenté + 10% de DMSO.
Pour réaliser une production des polypeptides selon l’invention, les cellules modifiées génétiquement pour produire des polypeptides selon l’invention sont décongelées et entretenues dans un milieu adapté. Les cellules sont placées dans 12,5 mL de milieu final et placées dans un shakeflask 125 mL dans un agitateur LabTherm® Kühner agité à 80 rpm, régulé à 5 % de CO2et avec une humidité comprise entre 40 et 80 %. Les cellules sont entretenues à 3.105cellules viables/mL pendant une à deux semaines. Ensuite, les cellules sont amplifiées afin d’avoir la quantité nécessaire pour réaliser une production. L’amplification consiste à entretenir les cellules dans des volumes plus élevés à chaque entretien pour garder toutes les cellules à une concentration viable.
Lorsque la quantité de cellules nécessaire à la production est obtenue, la production peut être lancée. Les cellules sont ensemencées à 3.105cellules viables/mL. La production peut être réalisée dans différents équipements : shakeflask placés dans un agitateur LabTherm® Kühner, Cultibag RM 20/50® (Sartorius), CellReady® (Merck Millipore), BioBundle® (Applikon) et d’autres équipements équivalents, de même échelle ou d’échelle supérieure. La culture des cellules est réalisée pendant 5 jours ou plus, au maximum 10 jours, selon les conditions de réalisation de la culture. Chaque jour, les paramètres de la production sont suivis ainsi que la concentration cellulaire et la viabilité cellulaire. Au cours de la production, des composants tels que des acides aminés, des vitamines, du glucose ou tout autre élément présentant un intérêt pour la production ou pour les cellules peuvent être ajoutés. Dans ce cas, il s’agit d’une culture en mode « fed – batch » ou « semi continu » qui permet de cultiver les cellules pendant au maximum 21 jours. Si aucun composé n’est ajouté pendant la culture, on parle de culture en mode « batch » ou « discontinu ».
La purification des polypeptides selon l’invention peut être réalisée par exemple via une étiquette de purification comme le tag-6(His) présent dans sa séquence. Ainsi, les cellules et débris cellulaires présents dans le milieu contenant un polypeptide selon l’invention sont éliminés par centrifugation ou filtration en profondeur (POD Millistak+® Merck Millipore ou tout un autre type de support équivalent) ou filtration tangentielle sur une membrane présentant un seuil de coupure de 0,2 µm. Le surnageant ainsi obtenu est purifié par chromatographie d’affinité sur une colonne chélatée avec un métal tel que le nickel, le cobalt, le zinc ou le cuivre. Afin de favoriser l’accroche des polypeptides selon l’invention, un tampon contenant de 0 à 50 mM imidazole, de 0 à 500 mM NaCl, de 5 à 20 mM (Na2HPO4, 2H2O) et de 5 à 20 mM (NaH2PO4, H2O) est ajouté au surnageant et ajusté à un pH entre 7 et 8. L’élution du polypeptide selon l’invention est soit réalisée par gradient en utilisant un mélange de deux tampons (tampon 1: 500 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) et 10 mM (NaH2PO4, H2O) ; tampon 2 : 20 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) et 10 mM (NaH2PO4, H2O) ajustés à un pH entre 7 et 8), soit de façon isocratique, avec un tampon contenant de 50 à 500 mM imidazole, de 0 à 500 mM NaCl, de 5 à 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) et de 5 à 10 mM (NaH2PO4, H2O) ajusté à un pH entre 7 et 8. Eventuellement, afin d’améliorer la pureté des polypeptides selon l’invention, d’autres étapes de purification peuvent être ajoutées. Il peut s’agir de filtrations, de chromatographie d’échange d’ions, de chromatographie d’affinité, de chromatographie d’interaction hydrophobe, d’exclusion stérique ou de tout autre type de chromatographie.
Les fractions d’élution d’intérêt sont mises à migrer dans un gel d’électrophorèse en conditions natives et colorées au bleu de Coomassie, avant d’être regroupées selon leur profil et dialysées dans de l’eau ou un tampon phosphate ou tout autre tampon adapté à la conservation du polypeptide selon l’invention. La concentration du polypeptide est déterminée par le kit Sircol® (TebuBio) selon les instructions du fabricant ou par le test au Bradford ou tout autre test adapté à la quantification des polypeptides selon l’invention.
Production en levures
Dans un mode de production particulier, la production des polypeptides selon l’invention est réalisée chez la levure. Les vecteurs utilisés pourront contenir des promoteurs constitutifs ou inductibles, pour permettre la production des dits polypeptides dans le système de levure retenu. Les vecteurs pourront également porter des séquences permettant de diriger l’intégration génomique, lorsque les hôtes utilisés peuvent êtreSaccharomyces. Cerevisiae,Pichiapastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorphaou toute autre souche de levure adaptée à la production de protéines recombinantes. La même séquence codante (SEQ ID N°7 pour le polypeptide de SEQ ID n°1 décrit précédemment est utilisée.
Les procédés de production des polypeptides selon la présente invention utilisent les cellules de la levurePichia pastoris. Cette levure présente l’avantage d’atteindre des rendements élevés de protéines recombinantes lors de fermentations à grande échelle. Le système d'expression dePichiainclue les avantages des systèmes d'expression procaryotes (par exemple,Escherichia. coli) - haut niveau d’expression, facilité de la mise en place d’une montée en échelle et une croissance peu coûteuse - et des systèmes d'expression eucaryotes – repliement des protéines et modifications post-traductionnelles. De tels systèmes d'expression peuvent être construits en utilisant divers procédés et kits disponibles pour l'homme du métier, par exemple, les kits PICHIA EXPRESSION disponibles auprès d'Invitrogen Corporation (San Diego, CA).
Il existe un large nombre de gènes sensibles au méthanol chez les levures méthylotrophes, telle que la levurePichia pastoris. L'expression de chaque gène, étant contrôlée par des régions régulatrices sensibles au méthanol. L’ensemble des promoteurs sensibles au méthanol est adapté pour une utilisation lors de la présente invention. Des exemples de régions régulatrices spécifiques comprennent le promoteur du gène de l'alcool oxydase 1 dePichia pastorisAOX1, le promoteur du gène de l'alcool oxydase 2 dePichia pastorisAOX2, le promoteur FLDI1, le promoteur ADH1, le promoteur GAL4, les promoteurs PHO3 et PHO5. Typiquement, l'expression chezPichia pastorissous la dépendance du promoteur du gène AOX1, hautement régulé. L'expression constitutive peut également être obtenue en utilisant, par exemple, le promoteur de la glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAP. La GAP est une enzyme clé de la glycolyse, isolée pour la première fois par Waterham en 1997 et utilisée depuis lors pour l'expression constitutive de protéines hétérologues. L'utilisation de ce promoteur présente l'avantage de ne pas nécessité une étape de lavage des cellules afin d’éliminer les sources de carbone autres que le méthanol, comme quand un système inductible au méthanol est utilisé. Ce promoteur permet également de limiter les risques et les coûts liés au stockage et à la livraison d'un grand volume de méthanol. Cette procédure convient mieux à une production à grande échelle et peut contribuer de manière significative au développement de méthodes rentables pour une production à grande échelle des polypeptides.
Dans un mode de réalisation préféré, la cellule hôte peut avoir dans son génome une ou plusieurs copies des gènes codant pour les polypeptides. Par exemple, plusieurs copies d’un gène codant pour un polypeptide peuvent être intégrés en tandem dans un ou plusieurs loci chromosomiques. Les copies de gènes intégrées en tandem sont insérées de façon préférentielle dans un nombre stable de copies pendant la culture pour la production des polypeptidiques.
Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, dans lequel l’hydroxylation du polypeptide est souhaitée, la co-expression d'une enzyme post-traductionnelle du collagène, par exemple la prolyl 4-hydroxylase (P4H), est nécessaire. Les deux sous-unités de cette enzyme peuvent être exprimées grâce à la présence d’un IRES ou tout autre séquence permettant l’expression de deux gènes sous la dépendance d’un même promoteur. La P4H peut être insérée au même locus chromosomique que les polypeptides de la présente invention ou tout autre locus d’intérêt permettant son expression. De plus, les gènes codants les deux sous unités de la P4H peuvent être portés ou non par la construction portant les gènes des différents polypeptides de la présente invention. Le nombre de copies des gènes des polypeptides de la présente invention intégrées au génome de la levure peuvent varier ou non par rapport au nombre de copies des gènes de la P4H intégrées au génome de la levure.
Avant la transformation, chaque vecteur d'expression peut être linéarisé grâce à sa digestion par des enzymes de restriction dans une région homologue au locus génomique cible (par exemple, la séquence de promoteur GAP), pour diriger l'intégration des vecteurs dans le locus cible du génome de la cellule hôte. Des préparations de chaque vecteur peuvent ensuite être transformées individuellement dans des cultures des souches souhaitées par électroporation ou d'autres méthodes, et les transformants positifs peuvent être sélectionnés au moyen d'un marqueur de sélection, par exemple, la résistance aux antibiotiques ou la complémentation d'une auxotrophie. Les colonies peuvent être prélevés, striés afin d’obtenir des colonies uniques dans des conditions sélectives et sélectionnées pour confirmer le nombre de copies du gène codant pour le polypeptide par dosage PCR sur l'ADN génomique extrait de chaque souche. L'expression du produit génique peut être confirmée, par exemple, par SDS-PAGE, Western blot, ELISA, FACS, et d'autres moyens connus dans l’état de l’art.
Exemple : Construction de souches dePichia pastorisexprimant les différents polypeptides
Sauf indication contraire, les matériaux et procédés suivants ont été utilisés comme exemples de la présente invention.
Il a été mis en évidence dans la littérature que lorsque l’optimisation des codons est réalisée, il est préférable différencier les codons les plus fréquemment retrouvés dans des protéines exprimées en faibles quantités et en quantités élevés dans le même organisme (Roymondal et Sahoo, 2009). En effet, les tables d’optimisation de codons disponibles dans les bases de données (par exemple, https://www.kazusa.or.jp/codon/) contiennent les données concernant toutes les protéines corporelles. Dans la présente invention, les codons ont été sélectionné de sorte à favoriser l’expression des polypeptides d’intérêt. La même séquence codante SEQ ID N°7 pour le polypeptide de SEQ ID n°1 est utilisée comme décrit précédemment.
Le gène synthétisé a été cloné dans le vecteur pPpRSFC-PGAP-MaF, où la protéine est exprimée en fusion avec le facteur d'accouplement alpha MaF, permettant sa production extracellulaire. Le site de clivage de la protéase Kex2 et les séquences cibles pour la dipeptidyl aminopeptidase codée par le gène Ste3 sont placés entre le MaF et le gène codant pour le polylypeptide, afin d'éviter que des résidus d'acides aminés n'appartenant pas au polylpeptide soient présents à l'extrémité N-terminale du polypeptide après le processus de protéolyse. La sécrétion de la protéine dans le milieu extracellulaire favorisera la mise en place d’un procédé plus simple et plus rapide pour purifier le polypeptide tagué.
La stratégie de construction du plasmide pPpRSFC-PGAP-MaF-polypeptide est la suivante :
Le gène synthétisé et le vecteur pPpRSFC-PGAP-MaF sont digérés avec les enzymes de restriction XhoI et NotI. Après digestion, les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose et les fragments d'intérêt ont été excisés du gel d'agarose, purifiés et liés en utilisant l'ADN ligase T4. La souche d’E. coliDH5a est transformée avec la réaction de liaison et les clones sont sélectionnés dans un milieu gélosé LB contenant de la Zéocine. L'ADN plasmidique de certains clones résistants à la Zéocine est purifié et analysé par les enzymes de restriction XhoI et NotI, ainsi que par séquençage. La construction ainsi obtenue est appelée pPpRSFC-PGAP-MaF-polylpeptide, elle exprime le polypeptide sous le contrôle de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (PGAP).
Les plasmides sont digérés avec les enzymes de restriction PmeI, AvrII, BspHI ou SwaI afin de linéariser le vecteur pour son intégration dans le génome deP. pastoris, au niveau du locus glycéraldéhydes-3-phosphate déshydrogénase ou tout autre locus d’intérêt. L'ADN linéarisé est purifié conformément aux recommandations du fabricant du kit NucleoSpin ™ Gel et du kit de nettoyage PCR. Un à dix microgrammes d'ADN linéarisé est utilisé pour l’électroporation dans les souchesP. pastorisBG10 ou NRR Y-1603 ou CBS7435 en utilisant un électroporateur micropulseur Biorad, en utilisant le réglage prévu pour les levures. L'électroporation a été réalisée selon un protocole de Pichia Protocols Second Edition (Methods in Moleculr Biology, Cregg, JM, Ed. 2007. Humanan Press, Totowa, NJ). Les transformants ont été sélectionnés sur des boîtes YPDS gélosées (autolysat de levure à 1%, peptone à 2%, glucose à 2%, Sorbitol à 1M) additionnés de 100 à 3000 µg/mL de Zeocine. Les souches sécrétant les polypeptides recombinants sont identifiées par la croissance des clones, sous agitation dans un milieu minimum pour levures Extrait de levure Peptone Dextrose YPD, ou dans un milieu minimal tamponné (BBM, 0,1 M, pH 6 de phosphate de potassium, 1,3% de yeast nitrogen base sans acides aminés, 4 x 10-5% de biotine et 2% de glucose ou de glycérol ou 1% de méthanol). La concentration de chaque composant peut varier en fonction des caractéristiques de chaque polypeptide exprimé. L'expression du polypeptide d’intérêt est évaluée par SDS-PAGE et / ou Western blot.
Exemple : validation rapide de la production de polypeptides
Des colonies de transformants dePichia pastorissont utilisées pour inoculer 25 mL de milieu YPD ou de milieu BBM, cultivé sur la nuit à 30°C, sous agitation à 230 tr/min. Dans un flacon de culture de 3 litres, 600 ml de BMG à DO600 0,1 initiale sont cultivés à 30°C, sous agitation à 230 tr/min, pendant 24h, la culture pouvant être prolongée jusqu'à 72h selon le polypeptide exprimé. La température de croissance, le temps de production et le pH peuvent varier en fonction du polypeptide produit.
Mesure de la liaison des polypeptides selon l’invention à LAIR-1/LAIR-2/OSCAR par ELISA
La mesure de l’activité de liaison des polypeptides selon l’invention à LAIR-1/LAIR-2/OSCAR est réalisée par la technique dite ELISA, dans des plaques 96 puits (Nunc Maxisorp) en utilisant les formes dimérisées des récepteurs, dénommées LAIR-1-Fc, LAIR-2-Fc et OSCAR-Fc. Ils correspondant à la fusion de l’ectodomaine des récepteurs, portant les sites de liaison, au fragment cristallisable des immunoglobulines permettant la dimérisation. Pour cela, un volume de 100 µL d’une solution contenant les polypeptides à 2 µg/mL dans du tampon phosphate ou tout autre tampon adapté est ajouté dans chaque puits et incubé 18-20h à 22°C. Après trois lavages avec 200 µL de PBS-0,05% Tween, 200 µL d’une solution de BSA 1% dans du tampon phosphate (Euromedex, filtrée sur 0,45 µm) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 2h à température ambiante (22°C). Après trois lavages avec 200 µL de PBS-0,05% Tween, 100 µL de différentes concentrations (de 25 ng/mL à 2 µg/mL) de LAIR-1-Fc, LAIR-2-Fc et OSCAR-Fc sont incubés 1h30 à température ambiante (22°C). Après trois nouveaux lavages, 100 µL d’une solution contenant un anticorps anti-IgG humain-Biotinylé (monoclonal Fc Spécifique ; Clone HP-6017; Sigma réf: B3773 ; lot : 118K4839) dilué au 1/20 000edans du tampon phosphate ou tout autre tampon adapté sont incubés 1h à 22°C puis 4 lavages sont réalisés comme décrit ci-dessus. 100 µL de streptavidine-HRP diluée au 1/5 000èmedans du tampon de dilution est ensuite ajoutée et incubée 1h à 22°C puis 4 lavages sont réalisés comme décrit ci-dessus. Enfin, 125 µL de solution de tétraméthylbenzidine sont ensuite ajoutés comme substrat pour la peroxydase (TMB, Sigma) puis on incube 10 à 45 minutes maximum à l’obscurité. La réaction est interrompue par l’ajout de 125 µL d’HCl 2N (Sigma). L’absorbance est rapidement mesurée à 450 nm dans un spectrophomètre (Wallac Victor 3).
Mesure de l’activation des récepteurs LAIR-1/LAIR-2/OSCAR de macrophages par les protéines selon l’invention
La mesure de la réponse de macrophages stimulés par les polypeptides selon l’invention est effectuée à partir de cellules monocytaires humaines de la lignée THP-1 obtenue chez ATCC. Les cellules sont cultivées dans du milieu RPMI-1640 contenant 10% de sérum (FBS), 100 U/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine à 37°C sous 5% de CO2. Les cellules sont différentiées en macrophages par exposition à 100 nM de PMA pendant 72 heures. Ces macrophages peuvent être utilisés à ce stade ou être utilisés pour induire une polarisation en macrophages M1 ou M2 par ajout de 100 ng/mL de LPS et 20 ng/mL d’IFN-γ ou 40 ng/ml d’Interleukine-4, respectivement, pendant 12 heures. Les macrophages obtenus sont ensuite stimulés entre 30 secondes et 60 minutes avec les protéines selon l’invention pour des concentrations allant de 1 à 500 µg/mL. Au terme des périodes de stimulation, le surnageant est collecté, conservé à – 80°C pour une utilisation ultérieure et la mesure des cytokines sécrétées. Les cellules sont lysées dans du tampon RIPA et les protéines sont quantifiées par la technique du Bradford. Une quantité égale de protéines est chargée sur un gel SDS-PAGE puis après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF (Bio-Rad). La membrane pendant 1h dans du tampon TBS-Tween 0,2% + BSA 3 % puis incubée une nuit à 4°C en présence d’anticorps primaire des voies de signalisation dépendante de LAIR-1 : CREB phosphorylé, CREB total, SHP-1 phosphorylé, SHP-1 total et GAPDH (contrôle de dépôt). Après plusieurs lavages, la membrane est incubée pendant 1 à température ambiante avec un anticorps secondaire couplé à la HRP (péroxydase de Raifort) puis les bandes obtenues sont visualisées par chemiluminescence.
Mesure de l’activité de liaison au facteur Willebrand
La mesure de l’activité de liaison du facteur Willebrand aux polypeptides selon l’invention par la technique dite ELISA est réalisée dans des plaques 96 puits (Nunc Maxisorp). Pour cela, un volume de 100 µL d’une solution contenant le polypeptide à 2 µg/mL dans du tampon phosphate ou tout autre tampon adapté est ajouté dans chaque puits et incubé 18-20h à 22°C. Après trois lavages avec 200 µL de PBS-0,05% Tween, 200 µL d’une solution de BSA 1% dans du tampon phosphate (Euromedex, filtrée sur 0,45 µm) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 2h à température ambiante (22°C). Après trois lavages avec 200 µL de PBS-0,05% Tween, 100 µL de différentes concentrations (exprimées en UI/dL) de facteur Willebrand purifié (Wilfactin 100 UI/mL, LFB) et/ou de plasma de patient dilué dans du tampon phosphate ou tout autre tampon adapté sont incubés 1h30 à température ambiante (22°C). Après trois nouveaux lavages, 100 µL d’une solution contenant un anticorps primaire anti-vWF couplé à la peroxydase de raifort (Rabbit anti-human VWF/HRP, DAKO) dilué au 1/8 000edans du tampon phosphate ou tout autre tampon adapté sont incubés 1h à 22°C puis 4 lavages sont réalisés comme décrit ci-dessus. 125 µL de solution de tétraméthylbenzidine sont ensuite ajoutés comme substrat pour la peroxydase (TMB, Sigma) puis on incube 10 à 45 minutes maximum à l’obscurité. La réaction est interrompue par l’ajout de 125 µL d’HCl 2N (Sigma). L’absorbance est rapidement mesurée à 450 nm dans un spectrophomètre (Wallac Victor 3). Un blanc est réalisé en remplaçant le vWF purifié ou le plasma par du tampon phosphate ou tout autre tampon adapté. Les polypeptides selon l’invention n’induisent pas d’activation.
Mesure de l’agrégation plaquettaire
La mesure de l’activité pro-agrégante des polypeptides selon l’invention sur les plaquettes sanguines humaines est réalisée à l’aide d’un thrombo-agrégomètre (société Soderel, Florange, France), selon la technique de référence (Born 1962). Le plasma riche en plaquettes (PRP) est mis en contact avec un agoniste (10 μL dans 290 μL de PRP) et l’éclaircissement du milieu (lié à la formation d’agrégats) est suivi en temps réel (courbe d’agrégation). En l’absence d’agrégation plaquettaire, le signal reste plat (milieu trouble persistant). Il est possible de vérifier l’absence ou la présence d’agrégats à l’examen du tube à la fin de la mesure. L’évaluation de la réponse en test d’agrégation plaquettaire est effectuée à 37°C, en agitation continue (1000 rpm). L’appareil est étalonné comme suit : 0% d’agrégation avec le plasma riche en plaquettes (préparation obtenue par centrifugation lente et concentration ajustée à 300 x 109/ L) et 100% d’agrégation avec le plasma pauvre en plaquettes (préparation obtenue par centrifugation rapide). La qualité des préparations plaquettaires est validée en vérifiant la réponse à des agonistes de référence (ADP 5 μM et collagène 1 μg/mL), utilisés pour la mise au point des thérapeutiques antiplaquettaires. Une protéine est considérée pro-agrégante quand elle est capable d’induire une agrégation supérieure à 40% et ce, de façon irréversible. Les polypeptides selon l’invention, ainsi testés, n’ont pas d’activité pro-agrégante.
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Claims (14)
- Polypeptide comprenant :
a) une séquence assurant la trimérisation du polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice, par association avec deux autres polypeptides identiques, et
b) une séquence comprenant au moins un motif peptidique ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR. - Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend des séquences de liaison, de type (GXY) n fois répétées où X et Y représentent n’importe quel acide aminé, n étant compris entre 1 et 50, entre plusieurs motifs peptidiques ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques, est une séquence comprenant tout ou partie du propeptide-C dérivé de collagènes.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques est une séquence synthétique comprenant la répétition de (GPO) n fois répété avec n compris entre 2 et 15, dans laquelle O est une hydroxyproline.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques est de type zipper issue de protéines de l’immunité innée choisies dans le groupe comprenant C1q, SP-D, MBL, les collectines, les pentraxines.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique structurée en triple-hélice par association avec deux autres polypeptides identiques est une séquence comprenant tout ou partie de collagènes bactériens et peut être choisie parmi la protéine scl2 de Streptococcus pyogenes ou le domaine globulaire V de ces collagènes bactériens.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il contient au moins un motif peptidique ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR, des séquences de type (GXY) n fois répétées, X et Y pouvant être n’importe quel acide aminé, n pouvant aller de 1 à 50 ; le motif ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR peut lui-même être répété y fois avec y allant de 1 à 50.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les séquences de liaison entre plusieurs motifs peptidiques ayant une activité de liaison à au moins un récepteur choisi dans le groupe consistant en LAIR-1, LAIR-2 et OSCAR, comprend la répétition de triplets GXY ou X et Y pouvant être n’importe quel acide aminé.
- Protéine trimérique comprenant l’association sous forme d’une triple hélice de trois polypeptides identiques tels que définis dans l’une des revendications 1 à 8.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 8 ou protéine selon la revendication 9, caractérisé en ce qu’ils sont incapables de lier le facteur Willebrand ni d’activer les plaquettes et/ou les récepteurs plaquettaires, responsables de l’activation, de l’adhésion et de l’agrégation des plaquettes sanguines.
- Protéine selon la revendication 9, caractérisée en ce qu’elle se présente sous la forme de particules ayant un diamètre moyen allant de 0,005 à 6 µm, particulièrement entre 0,005 à 5 µm, plus particulièrement encore entre 0,05 à 3 µm, formée par l’association de plusieurs protéines selon l’invention sous forme de multimères, d’oligomères ou de polymères.
- Polypeptide ou protéine selon l’une des revendications 1 à 11, pour son utilisation dans le traitement des pathologies inflammatoires via l’activation et/ou l’inhibition du récepteur LAIR-1 ou du récepteur OSCAR ou de la protéine soluble LAIR-2.
- Polypeptide ou protéine pour son utilisation selon la revendication 12, caractérisé en ce qu’il est sous une forme adaptée à une administration par voie intraveineuse.
- Polypeptide ou protéine pour son utilisation selon la revendication 12, caractérisé en ce que les pathologies inflammatoires sont choisies dans le groupe comprenant la leucémie lymphocytique chronique, le lupus érythémateux systémique, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies auto-immunes, l’ostéoporose, l’athérosclérose, les maladies pulmonaires obstructives chroniques, l’arthrose rhumatoïde, la vascularite, le cancer, les pathologies associées à une augmentation anormale de la réponse immunitaire, le sepsis, les infections d’origine virale ou bactérienne, les infections induisant une réponse inflammatoire majorée induisant des orages cytokiniques et les maladies fibrosantes.
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