FR3113288A1 - Approche vaccinale basée sur des antigènes viraux trimériques - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des protéines chimériques, ayant comme particularité d’être structurés sous forme d’un trimère via un domaine de trimérisation, d’intégrer tout ou partie de la séquence de protéine(s), d’intégrer optionnellement des motifs de multimérisation ou d’oligomérisation, de pouvoir optionnellement se structurer sous forme de particules, par autoassemblage ou coacervation, de taille comprise entre 0,005 et 3 µm. Ces protéines sont adaptées pour une utilisation comme vaccin.
Description
DOMAINE DE L'INVENTION
L’invention porte sur des protéines ou polypeptides chimériques dérivés du collagène ou à domaine collagène, structurés sous forme d’un trimère et contenant dans leur séquence tout ou partie de la séquence de protéines virales, pour leur utilisation comme antigènes viraux pour le développement de vaccins contre différentes infections virales.
ARRIERE PLAN DE L'INVENTION
La vaccination, consistant à administrer à un individu sain un fragment d’un pathogène pour le protéger ultérieurement contre le pathogène à l’origine d’une maladie infectieuse, reste à ce jour l’arme la plus efficace pour faire face à une infection, notamment à une infection virale, qui plus est en période de pandémie.
La vaccination s’appuie sur la propriété de mémoire du système immunitaire adaptatif et repose sur le principe de simuler une première rencontre avec le pathogène d’intérêt pour qu’une réponse immunitaire plus efficace se produise lors d’une rencontre ultérieure avec le pathogène. Pour cela, on utilise un vaccin qui va se comporter comme un antigène et induire une réponse équivalente à celle qui se produit lors d’une infection. Dans le cas d’un vaccin pour la prévention des infections virales, on parle d’antigène viral. Ainsi, lors de l’administration d’un vaccin, l’antigène viral est capté par une cellule présentatrice d’antigène (CPA) au niveau du site d’injection/administration. Les voies d’administration peuvent être intramusculaire, sous-cutanée, orale ou autres. Une fois l’antigène phagocyté, la CPA présente l’antigène au lymphocyte T4, conduisant à son activation, qui active à son tour soit majoritairement les lymphocytes T8 « tueurs », soit les lymphocytes B producteurs d’anticorps. Des cellules mémoires (lymphocytes T et B) ainsi que des anticorps persistent dans l’organisme et sont la base de l’approche vaccinale et de la réponse future au virus ou au pathogène cible (Cunningham et al., Vaccine 2016: 34 ; 6655–6664).
Un « antigène » désigne tout agent, de préférence une macromolécule, qui peut provoquer une réponse immunitaire chez un individu. Le terme peut être utilisé pour désigner une macromolécule individuellement ou un fragment de cette macromolécule antigénique. Tel qu'utilisé ici, « antigène » est de préférence utilisé pour désigner une protéine ou une partie de celle-ci contenant un ou plusieurs épitopes. Un épitope est la partie de l'antigène qui est reconnu par les anticorps ou les récepteurs des lymphocytes T. Quelques épitopes sont appelés épitopes conformationnels discontinus. Ces épitopes sont composés d’acides aminés qui ne sont pas adjacents dans la séquence primaire de la protéine, mais qui forment une structure tridimensionnelle spécifique, lorsque la structure tridimensionnelle de la protéine est observée.
Par conséquent, il est clair que la structuration de la protéine va influencer les motifs protéiques reconnus par le système immunitaire.
Dans le cas d’une approche vaccinale pour la prévention des infections virales mais aussi bactériennes, les candidats-vaccins développés peuvent être classés en cinq groupes, définissant cinq approches vaccinales possibles pour un même virus. On distingue les approches basées sur des virus ou bactéries inactivés, des virus atténués vivants, des sous-unités protéiques du virus ou plus récemment des vecteurs viraux d’ingénierie et des antigènes à base d’acides nucléiques (ADN et ARN) (De Geest et alAngew Chem Int Ed Engl. 2020 Jul 14). L’objectif de ces différentes approches est le développement d’anticorps neutralisants. Plusieurs points sont critiques pour garantir le succès d’une approche vaccinale plutôt qu’une autre et portent notamment sur sa capacité à induire une réponse immunitaire forte avec production d’anticorps neutralisants et cellules T mémoires, sur la facilité ou non à formuler le vaccin, sa facilité à être produit à grande échelle, son mode d’administration, sa dose, son délai d’efficacité et bien sûr son rapport bénéfice/risque (MacDonald et al., Vaccine 2020: 38 ; 5364–5371).
La présente invention porte plus particulièrement sur l’approche basée sur l’utilisation de protéines de virus comme antigène. Dans un virus dit enveloppé, on distingue des protéines exprimées en surface et plus particulièrement la protéine S pour Spicule, E pour Enveloppe et M pour Membranaire, qui sont généralement des glycoprotéines, et des protéines « internes » comme la protéine N pour protéine de la Nucléocapside (Li et al. J Med Virol 2020: 92 ; 424-432).
L’infection d’une cellule par un virus se fait par la reconnaissance d’un récepteur qui est spécifique pour le virus et qui correspond classiquement à une protéine de surface de la cellule cible. L’expression de ce récepteur est souvent limitée à certains types de cellules ou de tissus. A l’opposé, la reconnaissance du récepteur cellulaire s’exerce via un composant externe de la particule virale ou virion. Dans le cas des virus enveloppés, ce sont les glycoprotéines de l’enveloppe virale qui assurent la reconnaissance d’un récepteur sur la cellule à infecter. Dans le cas des virus nus, cette interaction se fait par les protéines de la capside.
Comme indiqué précédemment, l’une des approches vaccinales majoritairement retenues consiste à utiliser comme antigène tout ou partie d’une protéine virale et notamment l’une des glycoprotéines de surface impliquée dans l’adsorption du virus dans la cellule cible (Dimitrov D. Nat Rev Microbiol 2004 Feb; 2(2):109-22).
La particularité de certaines des glycoprotéines de surface impliquées dans l’adsorption de virus dans la cellule hôte est leur structuration sous forme d’un trimère, résultant de l’association de trois polypeptides identiques sous forme d’une protéine trimérique. C’est cette trimérisation qui garantit l’efficacité de reconnaissance au récepteur cible et l’entrée du virus. Ainsi, on peut citer comme protéines trimériques : les protéines GP120 et GP41 du virus de l’immunodéficience humaine VIH (Merk et al., Current Opinion in Structural Biology 2013, 23:268–276), l’hémagglutinine du virus influenza (Krammer et al., Current Opinion in Virology 2013, 3:1–10), les protéines S des coronavirus et notamment des SARS-CoV-1 et -2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 1 et 2)et du MERS (Coronavirus du Syndrome Respiratoire du Moyen-Orient) (Sternberg et al., Life Sciences 2020 : 257 ; 118056), la glycoprotéine B des virus de l’herpès et d’Epstein-Barr (Backovic et al., PNAS 2009 : February 24 vol. 106 n°8 ; 2880-2885), la glycoprotéine GP1 du virus Ebola (Bale et al., Viruses 2013 : 4 ; 447-470), les glycoprotéines 1 et 2 des virus de Lassa (Hastie et al., Current Opinion in Virology 2018, 31:52–58), la glycoprotéine E1 des togavirus (Petrova et al., Vaccine 2016 Feb 17;34(8):1006-11)ou encore la glycoprotéine F de fusion du virus respiratoire syncitial, du virus de la rougeole ou du virus de la parotidite virale (Chang et al., Viruses 2012 : 4 ; 613-636).
L’utilisation de protéines, en particulier virales, comme antigène pour une approche vaccinale a démontré son efficacité, avec notamment une meilleure sécurité. Cependant, cette approche est moins immunogène. Cela serait la conséquence d’une différence de conformation par rapport à la protéine native ciblée. Cela a pour conséquence de nécessité l’utilisation de doses plus fortes et la co-administration d’adjuvants pour induire une réponse immunitaire spécifique (Nanishi et al., Current Opinion in Pediatry 2020, 32: 125–138).
Cette limitation est particulièrement vraie pour les glycoprotéines virales trimériques dont il est difficile de reproduire la conformation trimérique équivalente à celle de la protéine native, lorsqu’elles sont produites sous forme recombinante. De fait, la plupart des approches utilisant tout ou partie de ces glycoprotéines comme antigène, utilisent une forme monomérique ou dimérique obtenue par fusion au domaine Fc des anticorps.
Pour pallier cette limitation, la société CLOVER Biopharmaceutical a eu l’idée de fusionner tout ou partie de la séquence de ces glycoprotéines trimériques à la séquence du domaine C-propeptide du collagène de type I, impliquée dans la trimérisation du collagène de type I( http://www.cloverbiopharma.com/index.php?m=content&c=index&a=lists&catid=42). Cette approche permet la formation d’une protéine trimérique chimérique qui semble être un bon candidat comme antigène viral. Une forte limitation de cette approche concerne la taille du domaine C-propeptide du collagène de type I retenu, de 311 acides aminés, qui conduit à l’expression d’une protéine de très grande taille lorsqu’elle est fusionnée à tout ou partie de la séquence de ces glycoprotéines. Ceci est lié au fait que CLOVER a muté le site de clivage normalement impliqué dans l’élimination du C-propeptide lors de la maturation du collagène, afin de maintenir sous forme d’un trimère la protéine chimérique produite. Une autre limitation de cette approche est l’absence de possibilité de multimériser la protéine chimérique trimérique produite, pour former des pseudo-particules virales, dénommées VLP (Virus-like particles). Cette présentation est connue pour permettre une forte augmentation de l’immunogénicité (Irvine et al., Current Opinion in Immunology 2020, 65: 1–6). Pour permettre la formation de particules, les protéines chimériques trimériques décrites dans l’invention possèdent dans leur séquence un domaine de multimérisation permettant la formation desdites particules.
On définit les collagènes ou les protéines à domaine collagène par leur caractéristique commune de contenir un ou plusieurs domaine(s) ayant une structure en triple hélice formée par l’association de trois chaines polypeptidiques, ou chaines , enroulées les unes aux autres. Cette caractéristique est permise par la présence, tous les trois acides aminés, d’une glycine au niveau des motifs hélicoïdaux qui sont constitués de séquences répétées de type G-X-Y ou X est souvent une proline et Y une hydroxyproline. Cette hydroxyproline joue un rôle dans la stabilisation de la triple hélice et est caractéristique des collagènes. Les résidus prolines sont hydroxylés essentiellement par la prolyl-4-hydroxylase (P-4-H) en 4-hydroxyproline. Il existe une deuxième hydroxylase, la prolyl-3-hydroxylase qui permet l’hydroxylation de la proline lorsque celle-ci est en position X, alors qu’en position Y se trouve déjà une proline hydroxylée par la P-4-H. Dans une molécule de collagène, les chaines α peuvent être identiques (homotrimère) ou toutes différentes (hétérotrimère).
La formation et l’amorçage d’une triple-hélice nécessite préalablement la reconnaissance entre elles des trois chaînes α. Elle se fait par l’intermédiaire de séquences polypeptidiques, ne possédant pas une glycine tous les trois acides aminés, situées en position C-terminale et formant le propeptide-C. Ce propeptide-C est un domaine de trimérisation et est requis pour assurer l’association des chaines monomériques entre elles sous la forme d’une triple-hélice.
L’ensemble de la séquence polypeptidique du propeptide-C n’est pas indispensable à l’amorçage de la triple-hélice et selon la présente invention, cet amorçage peut se faire en associant uniquement :
- la séquence discontinue de 15 aa qui détermine l’assemblage type spécifique des chaines α décrit parHulmes DJ, J Struct Biol. 2002 Jan-Feb; 137(1-202) : 2-10,
- le domaine « coiled-coil » situé au début du propeptide-C, par exemple celui impliqué dans la trimérisation du collagène III comme décrit parBulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701.Ce domaine est constitué de 4 heptapeptides décrit parMcAlinden et coll., J Biol Chem. 2003 Oct 24; 278(43): 42200-7, et
- un motif contenant 8 résidus cystéine qui permettent la formation de ponts disulfures intra-et inter-catenaires. La présence de ponts disulfures entre les chaines au niveau du télopeptide-C ou du propeptide-C n’est pas requise pour l’association des chaînes et la formation de la triple hélice mais permettrait la formation de multimères de collagène.
De fait, et contrairement à l’approche développée par CLOVER Biopharmaceuticals, celle décrite dans la présente invention est basée sur l’ingénierie de ce domaine C-propeptide en réduisant au maximum la séquence nécessaire à la trimérisation des protéines chimériques selon l’invention.
Il existe d’autres protéines contenant des domaines analogues au collagène formées de la répétition de séquences, continues ou non, de type G-X-Y, n fois répétées. C’est le cas notamment des collagènes dits de défense regroupant un ensemble de protéines solubles analogues du collagène jouant un rôle dans le système immunitaire inné. On peut citer par exemple la protéine SP-D (Surfactant protein D), les MBL (Mannose-binding leptin) ou la protéine C1q (Casals et al., Molecular Immunology 2019 112 : 291-304). Elles contiennent toutes un domaine collagène structuré en triple-hélice. Dans ce cas, l’amorçage de cette triple-hélice se fait par l’intermédiaire d’un domaine de trimérisation de type zipper (ou domaine de fermeture à glissière trimérique). De fait, et comme décrit dans la présente demande, il est possible de former une protéine chimérique trimérique via les domaines zipper de ces protéines ou tout autre domaine de trimérisation connu et tout ou partie de la séquence de protéines, en particulier virales.
Des données récentes ont décrit l’expression de protéines analogues du collagène par des bactéries ou virus, sur la base de la présence de séquences (G-X-Y) n fois répétées dans leur génome. Certaines de ces protéines analogues du collagène ont été étudiées et jouent un rôle de facteur de virulence en permettant d’échapper au système immunitaire des mammifères supérieurs. Plus particulièrement, des études ont portés sur deux protéines analogues du collagène issues de la bactérie Gram positiveStreptococcus pyogenes. Dénommées scl1 et scl2, elles sont formées d’un domaine de trimérisation globulaire ou V domaine situé en partie N-terminale et d’un domaine analogue du collagène formé d’une répétition de (G-X-Y) n fois répétée. A noter que contrairement aux collagènes, ces collagènes bactériens n’ont pas besoin que les prolines soient hydroxylées pour se structurer en triple hélice. Des travaux ont montré la possibilité de produire ces protéines de façon recombinante en systèmeEscherichia coli.
De nombreux travaux ont cherché à créer par synthèse peptidique de nouveaux collagènes, dénommés peptides analogues du collagène, en utilisant des domaines de trimérisation synthétiques formés par la répétition du motif (GPO), n fois répété, ou O est une hydroxyproline. Ainsi, il a été montré que l’ajout en N-terminal et en C-terminal d’un minimum de 5 répétitions GPO permet à un domaine collagène de type (G-X-Y) n fois répété de se structurer en triple-hélice lorsqu’il est produit par synthèse peptidique. Les présents inventeurs sont les seuls à avoir eu l’idée d’utiliser cette répétition (GPO)n, ou n est supérieur à 3 en association avec la séquence de tout ou partie de protéines, en particulier virales, pour produire une protéine trimérique chimérique.
BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION
La présente invention concerne donc des protéines chimériques, ayant comme particularité :
- d’être structurés sous forme d’un trimère via un domaine de trimérisation, par exemple soit via une partie du domaine de trimérisation naturel des collagènes natifs (propeptide C), soit via un domaine collagène synthétique (GPO n fois), soit via le domaine zipper des collagènes de défense ou encore via le domaine V de trimérisation des collagènes bactériens,
- d’intégrer tout ou partie de la séquence de protéine(s), en particulier de protéine(s) virale(s),
- d’intégrer optionnellement des motifs de multimérisation ou d’oligomérisation,
- de pouvoir optionnellement se structurer sous forme de particules, par autoassemblage ou coacervation, de taille comprise entre 0,005 et 3 µm.
BREVE DESCRIPTION DES SEQUENCES
Les séquences SEQ N°1 à 4 décrivent plusieurs polypeptides et les séquences SEQ ID N°5 à 8, les séquences nucléotidiques correspondantes selon l’invention. Chaque polypeptide est composé du domaine de liaison au récepteur (domaine RBD) de la protéine S du virus SARS-Cov2, fusionné à un domaine de trimérisation pouvant être l’un de ceux décrits dans la présente invention.
La Figure 2 illustre sur les quatre séquences polypeptidiques illustratives de polypeptides selon l’invention, les différents domaines fonctionnels desdits polypeptides.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
L’invention décrite dans le présent brevet repose sur l’ingénierie de protéines chimériques trimériques. Elles sont le résultat de l’association de trois polypeptides chimériques identiques. Les polypeptides chimériques comprennent : une séquence assurant la trimérisation de ladite chaîne polypeptidique sous la forme d’une protéine trimérique avec deux autres chaînes polypeptidiques identiques, une séquence comprenant tout ou partie de la séquence de protéine(s), en particulier virale(s) et, optionnellement un domaine de multimérisation permettant la formation de multimères ou d’oligomères de cette protéine trimérique etin fineleur association sous forme de particules. Selon l’invention, les séquences dérivées de protéines, en particulier virales, au sein des polypeptides, peuvent correspondre, pour tout ou partie, aux séquences des protéines GP120 et GP41 du VIH, être celle de l’hémagglutinine du virus influenza, celles des protéines S des coronavirus, en particulier la sous-unité S1 de la protéine S du SARS-COV-2, de la glycoprotéine B des virus de l’herpès et d’Epstein-Barr, de la glycoprotéine GP1 du virus Ebola, des glycoprotéine 1 et 2 des virus de Lassa, de la glycoprotéine E1 des togavirus ou encore de la glycoprotéine F de fusion du virus respiratoire syncitial, du virus de la rougeole, du virus de la parotidite virale. Tout ou partie de la séquence de protéine(s) peut aussi être issu d’une protéine de bactéries, d’une protéine de cellules cancéreuses ou d’une protéine allergisante.
Dans le cadre de l’invention, la notion de protéine fait référence à une ou plusieurs chaînes polypeptidiques, qui sont des biopolymères, pouvant être très longue(s), composée(s) d'au moins une vingtaine d'acides aminés. On parle ainsi généralement de protéine au-delà d'une cinquantaine d’acides aminés dans la molécule, et de peptide jusqu'à quelques dizaines de résidus. Ainsi dans la plupart des cas selon la présente invention, on aura à faire à des protéines bien que cette définition ne soit pas exclusive de polymères comprenant moins de cinquante acides aminés.
La structure primaire d’une protéine fait référence à la séquence en acides aminés, la structure secondaire définit l’arrangement des acides aminés stabilisés par liaisons hydrogène en arrangements de type hélice alpha, feuillets beta par exemple. La structure tertiaire fait référence à la forme générale de la protéine entière décrivant les interactions de structures secondaires entre elles, stabilisée par des liaisons faibles de type hydrophobes, électrostatiques telles qu’hydrogène, ioniques, salines voire des liaisons covalentes tels que des ponts disulfures. Enfin la structure quaternaire fait référence à l’assemblage de deux, ou plus, protéines (ou chaines polypeptidiques) entre elles, chaque protéine est une sous-unité du complexe protéique ainsi créé.
Dans le cadre de l’invention, il est fait mention de protéines chimériques ou protéines de fusion qui fait référence à des protéines synthétiques résultant de la fusion de séquences nucléotidiques provenant de deux protéines différentes donnant lieu à une nouvelle séquence nucléotidique unique. Dans le présent cas, il s’agit de séquences nucléotidiques de tout ou partie de protéine(s), en particulier virale(s), fusionnées à des séquences nucléotidiques provenant de domaines de trimérisation et de multimérisation de protéines de type collagène. Le polypeptide chimérique exprimé se structurera en une protéine chimérique trimérique par l’association avec deux autres polypeptides chimériques identiques. Tout ou partie de la séquence de protéine(s) peut aussi être issu d’une protéine de bactéries, d’une protéine de cellules cancéreuses ou d’une protéine allergisante.
Il est précisé que les polypeptides selon l’invention ont comme particularité de se structurer en une protéine chimérique trimérique par l’association de trois chaînes polypeptidiques identiques. La formation de ce trimère est permise par la présence dans la séquence de ces polypeptides d’un domaine de trimérisation. Il est précisé que la formation de ce trimère se fait à l’intérieur d’un système cellulaire (cellules eucaryotes ou procaryotes). Cependant, il est possible de former ce trimère lorsque les polypeptides selon l’invention sont produits via un système acellulaire de type réticulocytes ou autres ou via une synthèse peptidique chimique.
Dans le cadre de l'invention, les « oligomères » ou « multimères » protéiques ont la même signification, c'est-à-dire qu’ils correspondent à l’association de plusieurs protéines ayant une structure quaternaire (trimère), étant des complexes d'au moins deux protéines, lesdites protéines pouvant être identiques ou différentes.
Dans le cadre de l’invention, il est fait mention de pseudo-particules virales ou VLP (Virus-like particles) qui sont définies comme des particules sub-virales obtenues par l'assemblage spontané de protéines comprenant des protéines ou parties de protéines issues de virus selon l’invention, mais ne contenant aucun matériel génétique.
Les « protéines recombinantes » sont des protéines codées par des acides nucléiques (ou ADN recombinants, c’est à dire une molécule d'acide désoxyribonucléique créée en laboratoire composée de séquences nucléotidiques provenant de plusieurs sources y compris des séquences qui n'existent pas dans les organismes vivants) qui sont intégrés dans une cellule hôte permettant l’expression hétérologue de ces protéines.
Par « première séquence d'acides aminés » et « deuxième séquence d'acides aminés » dans la description de la molécule ou de la protéine de l'invention, il n'est pas entendu qu’un ordre spécifique des séquences soit envisagé. C'est juste pour la clarté du mode de réalisation de mieux distinguer les deux séquences comprises dans la molécule ou protéine recombinante de l'invention.
Telle qu'utilisée ici, une première séquence ayant au moins x% d'identité avec une seconde séquence signifie que x% représente le nombre d'acides aminés dans la première séquence qui sont identiques aux acides aminés correspondants de la deuxième séquence lorsque les deux séquences sont alignées de manière optimale via un alignement global, par rapport à la longueur totale de la deuxième séquence d'acides aminés. Les deux séquences sont alignées de manière optimale lorsque x est maximal. L'alignement et la détermination du pourcentage d'identité peuvent être effectués manuellement ou automatiquement en utilisant un algorithme d'alignement global, par exemple l'algorithme Needleman et Wunsch, décrit dans Needleman et Wunsch, J. Mol Biol. 1970, 48, 443-453, avec par exemple les paramètres suivants pour la comparaison de séquences polypeptidiques : matrice de comparaison : BLOSUM62 de Henikoff et Henikoff, PNAS USA. 1992, 89, 10915-10919, pénalité d'écart : 8 et pénalité de longueur d'écart : 2 ; et les paramètres suivants pour la comparaison de séquences polynucléotidiques : matrice de comparaison : correspond à = + 10, à décalage = 0 ; pénalité pour écart : 50 et pénalité pour longueur d'écart : 3.
Ainsi l’invention vise en son premier objet un polypeptide comprenant :
- une séquence assurant la trimérisation du polypeptide sous la forme d’une protéine trimérique, par association avec deux autres polypeptides identiques,
- une séquence comprenant tout ou partie de la séquence de protéine, en particulier virale, et,
- optionnellement un domaine de multimérisation permettant la formation de multimères ou d’oligomères de la protéine trimérique.
La séquence comprenant tout ou partie de la séquence de protéine(s) peut être une séquence de protéine de bactéries, de protéine de cellules cancéreuses ou de protéine allergisante.
Il est entendu qu’afin que le trimère se forme, sans formation de triple-hélice comme pour le collagène, il convient que trois polypeptides identiques soient réunis. Le polypeptide selon l’invention est un polypeptide chimérique ou protéine de fusion c’est à dire une protéine synthétique obtenue par la combinaison de différentes protéines, ou partie de protéines. Elle est obtenue par la création d’un gène comportant les régions codantes correspondant aux protéines ou parties de protéines désirées.
De manière avantageuse, un polypeptide selon l’invention peut être choisi dans le groupe comprenant les SEQ ID N°1 à 4 ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Dans la littérature, il est fait référence à la notion de domaines de trimérisation pour ce qui concerne la ou les séquences responsable(s) de la trimérisation du collagène. Ceci étant, la séquence assurant la trimérisation du polypeptide, ou domaine de trimérisation, peut provenir de source autre que le collagène et on peut citer par exemple le domaine de trimérisation de la fibritine, en particulier un domaine de trimérisation de la fibritine de bactériophage, plus particulièrement un domaine de trimérisation de la fibritine provenant du bactériophage T4 ou de bactériophages apparentés tels que les bactériophages T - même ou le phage RB69 ou le phage AR1.
Selon un autre mode de réalisation, un polypeptide selon l’invention peut comprendre des séquences de liaison collagène, ou motif linker collagène, de type (GXY) n fois répétées où X et Y peuvent être n’importe quel acide aminé, n étant compris entre 1 et 50, en particulier entre 1 et 10, en particulier encore entre 1 et 5, en particulier encore entre 1 et 3. Ces motifs de liaison collagène, ou motif linker collagène sont localisés entre la séquence assurant la trimérisation (i.e. domaine de trimérisation) et la séquence comprenant tout ou partie de la séquence de protéine(s) virale(s). Ces séquences de liaison permettent de garantir la stabilité du trimère formé.
De tels motifs linker collagène sont figurés dans les séquences 1 à 4 sur les figures 2A à 2D. Ils correspondent en particulier :
- au domaine compris entre la position 173 et la position 187 de la SEQ ID N°1 ;
- au domaine compris entre la position 173 et la position 196, de la SEQ ID N°2 ;
- au domaine compris entre la position 187 et la position 228, de la SEQ ID N°3 ;
- au domaine compris entre la position 75 et la position 98, de la SEQ ID N°4 ;
- ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation du polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique par association avec deux autres polypeptides identiques, comprend une partie du propeptide-C dérivé de collagènes. Une telle séquence ne comprend pas la totalité de sa séquence comme l’approche retenue par CLOVER Biopharmaceuticals.
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation du polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique par association avec deux autres polypeptides identiques, peut être une séquence comprenant tout ou partie du propeptide-C dérivé de collagènes.
Plus particulièrement, une séquence comprenant une partie du propeptide-C du collagène comprend la séquence discontinue de 15 acides aminés déterminant l’assemblage des chaines α, le domaine « coiled-coil » situé au début du propeptide-C, un motif contenant 8 résidus cystéine qui permettent la formation de ponts disulfures intra-et inter-catenaires.
De manière avantageuse, cette séquence comprenant tout ou partie du propeptide-C dérivé de collagène est le domaine compris entre la position 188 et la position 331 de la séquence SEQ ID N°1 (propeptide C raccourci, ), ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
En particulier par exemple, le motif « coil-like » peut être celui impliqué dans la trimérisation du collagène III comme décrit par Bulleid et al., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701. Ce domaine est constitué de 4 heptapeptides tels que décrit par McAlinden et coll., J Biol Chem. 2003 Oct 24; 278(43) : 42200-7).
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique par association avec deux autres polypeptides identiques est une séquence synthétique comprenant la répétition de (GPO) n fois répété avec n compris entre 2 et 15, dans laquelle O est une hydroxyproline. Dans les séquences préférées décrites et divulguées dans la présente demande, les triplets en question sont indiqués par GPP et non pas GPO, ceci étant les polypeptides selon l’invention concernent bien des séquences avec des triplets GPO. En effet l’hydroxyproline n’est pas un acide aminé naturel codé par un codon mais issu de modification post traductionnelle. Ainsi le nucléotide codant un polypeptide selon l’invention, y compris ceux ici divulgués, contient le codon correspondant à la proline et le polypeptide traduit (lorsque produit dans un organisme hôte) contient des triplets GPP qui sont transformés in situ par la machinerie cellulaire en GPO. Les triplets GPP doivent donc se lire GPO.
De manière avantageuse, cette séquence synthétique comprenant la répétition de (GPO) n fois répété (illustré GPP dans les séquences listées) avec n compris entre 2 et 15, dans laquelle O est une hydroxyproline est le domaine entre la position 197 et la position 211 de la séquence SEQ ID N°2 ( ), ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité. Comme expliqué plus avant les triplets GPP des séquences en question doivent donc se lire GPO.
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique par association avec deux autres polypeptides identiques peut être de type zipper issue de protéines de l’immunité innée choisie dans le groupe comprenant C1q, SP-D, MBL, les collectines, les pentraxines.
De manière avantageuse, cette séquence de type zipper issue de protéines de l’immunité innée choisie dans le groupe comprenant C1q, SP-D, MBL, les collectines, les pentraxines est le domaine compris entre la position 229 et la position 263 de la séquence SEQ ID N°3 (MBL Zipper ; ) ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Selon un mode de réalisation, la séquence assurant la trimérisation de polypeptide selon l’invention sous la forme d’une protéine trimérique par association avec deux autres polypeptides identiques peut être une séquence comprenant tout ou partie de collagènes bactériens et peut être choisie parmi la protéine scl2 de Streptococcus pyogenes ou le domaine globulaire V de ces collagènes bactériens.
De manière avantageuse, la séquence comprenant tout ou partie de collagènes bactériens choisie parmi la protéine scl2 de Streptococcus pyogenes ou le domaine globulaire V de ces collagènes bactériens est le domaine compris entre la position 1 et la position 74 de la séquence SEQ ID N°4 (Domaine V bactérien ; ) ou toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Selon un mode de réalisation de l’invention, tout ou partie d’une protéine, en particulier virale, peut être choisi dans le groupe comprenant :
- la séquence native de la protéine, en particulier virale (ensemble des acides aminés présents naturellement dans la séquence de la protéine),
- une partie contenant un ou plusieurs domaines de la séquence native de la protéine, en particulier virale,
- une association de séquences issues de protéines, en particulier virales, identiques ou différentes.
La protéine, qui est de préférence virale, peut aussi être choisie dans le groupe comprenant une protéine de bactérie, une protéine de cellules cancéreuses et une protéine allergisante.
Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, tout ou partie d’un protéine virale peut être choisie dans le groupe comprenant la sous-unité S1 de la protéine S du SARS-COV-2, la séquence de son domaine de liaison à un récepteur cellulaire (ie domaine RBD), le domaine RBD élargi contenant le domaine RBD et des acides aminés supplémentaires de chaque côté, sans que ces acides aminés ne constituent par eux même un domaine fonctionnel quelconque de la protéine virale, et une combinaison de ceux-ci.
En particulier il peut s’agir du Domaine RBD raccourci de la protéine Spike du coronavirus SARS-COV-2, ou le Domaine RBD raccourci de la protéine Spike du coronavirus SARS-COV-2 inversé.
Selon un mode de réalisation de l’invention, tout ou partie d’une protéine virale peut être choisie dans le groupe comprenant : le domaine compris entre la position 1 et la position 172 de la séquence SEQ ID N°1 (Figure 2A) ; le domaine entre la position 1 et la position 172 de la séquence SEQ ID N°2 ( ) ; le domaine entre la position 1 et la position 172 de SEQ ID N°3 ( ) ; le domaine entre la position 99 et la position 272 de la séquence SEQ ID N°4 ( ) ; ou encore toute séquence présentant au moins 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % et préférentiellement au moins 99 % d'identité.
Selon un mode de réalisation, la présente invention vise une protéine trimérique comprenant l’association de trois polypeptides identiques selon l’invention. L’invention vise ainsi un polypeptide ou une protéine trimérique selon l’invention pour son utilisation comme antigène, en particulier un antigène viral, afin d’induire une réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène et prévenir une infection, en particulier une infection virale. Dans le cas d’utilisation d’une protéine ou fragment de protéine bactérienne, il s’agira d’induire une réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène et prévenir une infection bactérienne. Dans le cas d’utilisation d’une protéine ou fragment de protéine issue d’une cellule cancéreuse, il s’agira d’induire une réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène et traiter le cancer en question.
L’invention vise un polypeptide ou une protéine trimérique selon l’invention pour son utilisation comme antigène viral afin d’induire une réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène et prévenir une ou des infections virales. Un vaccin peut alors être créé afin de prévenir ces infections via les séquences immunogènes des présents polypeptides. Il est clairement indiqué ici que le pouvoir immunogène du polypeptide trimérique est dépendant uniquement de tout ou partie de la séquence de protéine(s) virale(s) intégrée(s) lorsqu’il est structuré sous la forme de la protéine trimérique et non dirigé contre le domaine de trimérisation.
Selon un mode de réalisation, les infections virales ciblées sont choisies dans le groupe des infections à virus possédant en leur surface des protéines structurées en trimère et dont l’une des activités est possiblement de permettre l’entrée desdits virus dans une cellule hôte. Plus précisément elles peuvent correspondre, pour tout ou partie, aux protéines GP120 et GP41 du VIH, à l’hémagglutinine du virus influenza, aux protéines S des coronavirus, en particulier la sous-unité S1 de la protéine S du SARS-COV-2, à la glycoprotéine B des virus de l’herpès et d’Epstein-Barr, à la glycoprotéine GP1 du virus Ebola, aux glycoprotéine 1 et 2 des virus de Lassa, à la glycoprotéine E1 des togavirus ou encore à la glycoprotéine F de fusion du virus respiratoire syncitial, du virus de la rougeole ou du virus de la parotidite virale.
L’invention vise un polypeptide ou une protéine trimérique selon l’invention pour son utilisation comme antigène bactérien afin d’induire une réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène et prévenir une ou des infections bactériennes. Un vaccin peut alors être créé afin de prévenir ces infections via les séquences immunogènes des présents polypeptides. Il est clairement indiqué ici que le pouvoir immunogène du polypeptide trimérique est dépendant uniquement de tout ou partie de la séquence de protéine(s) bactérienne(s) intégrée(s) lorsqu’il est structuré sous la forme de la protéine trimérique et non dirigé contre le domaine de trimérisation.
L’invention vise un polypeptide ou une protéine trimérique selon l’invention pour son utilisation comme antigène de cellule cancéreuse afin d’induire une réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène et traiter un cancer. Un vaccin peut alors être créé afin de traiter le cancer via les séquences immunogènes des présents polypeptides. Il est clairement indiqué ici que le pouvoir immunogène du polypeptide trimérique est dépendant uniquement de tout ou partie de la séquence de protéine(s) de cellule(s) cancéreuses intégrée(s) lorsqu’il est structuré sous la forme de la protéine trimérique et non dirigé contre le domaine de trimérisation.
Selon un mode de réalisation, le polypeptide monomérique ou la protéine trimérique structurée sous la forme de trois polypeptides identiques selon l’invention, est sous la forme de particules. Selon un mode de réalisation de l’invention les particules ont un diamètre moyen allant de 0,005 à 6 µm, particulièrement entre 0,005 à 5 µm, plus particulièrement encore entre 0,05 à 3 µm et sont formées par l’association de plusieurs protéines selon l’invention sous forme de multimères, d’oligomères ou de polymères. Il s’agit ainsi de pseudo-particules virales.
Selon un mode de réalisation avantageux, les particules en question sont obtenues par coacervation, agrégation ou auto-assemblage et forment des polymères ou oligomères ou multimères.
Les protéines des particules selon l’invention peuvent être des protéines trimériques structurées sous la forme de trois polypeptides identiques selon l’invention, y compris multimérisées ou oligomérisées.
La formation de ces particules peut être favorisée par la présence au sein de la séquence du polypeptide selon l’invention d’un domaine de multimérisation.
Selon un autre mode de réalisation, les particules sont obtenues par coacervation, agrégation ou auto-assemblage et forment des polymères ou oligomères ou multimères.
L’invention vise ainsi aussi une préparation vaccinale, en particulier injectable, comprenant :
- au moins un polypeptide ou une protéine trimérique selon l’invention ; et
- au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable de type adjuvant, diluant, stabilisateur, conservateur.
La composition selon l’invention peut être formulée au moyen d'un procédé de production pharmaceutique généralement connu, en étant mélangée avec un support, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Des exemples de supports, excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptables comprennent des adjuvants, des solvants pour injection, des excipients, des agglutinants et similaires. En tant qu'adjuvant, il est possible d'utiliser, sans aucune restriction particulière, toute substance généralement utilisée comme adjuvant pour des formulations vaccinales. Les exemples incluent, mais sans s'y limiter, les adjuvants précipités tels que l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate de calcium, le phosphate d'aluminium, l'alun, et le polymère de carboxyvinyle, les adjuvants à base d'huile tels que la paraffine liquide, la lanoline, l'adjuvant incomplet de Freund et l'adjuvant complet de Freund, par exemple.
En tant que solvant injectable, il est possible d'utiliser, sans aucune restriction particulière, toute substance généralement utilisée dans les injections. Des exemples comprennent, mais sans s'y limiter, des solutions isotoniques comprenant des agents auxiliaires tels qu'une solution saline physiologique, du glucose, du D-sorbitol, du D-mannose, du D-mannitol, du chlorure de sodium et similaires. Le solvant injectable peut contenir un alcool tel que l'éthanol ; un polyalcool tel que le propylène glycol et le polyéthylène glycol ; un tensioactif non ionique tel que le polysorbate 80 (marque déposée), HCO-50 ou similaire.
En tant qu'excipient, il est possible d'utiliser, sans aucune restriction particulière, toute substance généralement utilisée dans les produits pharmaceutiques. Les exemples comprennent, mais sans s'y limiter, les amidons, la cellulose cristalline et analogues.
En tant qu'agglutinant, il est possible d'utiliser, sans aucune restriction particulière, toute substance qui est généralement utilisée dans des patchs ou similaires. Les exemples comprennent, mais sans s'y limiter, les agglutinants à base de caoutchouc, les agglutinants à base de silicone et similaires.
La composition vaccinale selon le présent mode de réalisation peut être administrée conjointement avec un ingrédient actif, ou peut contenir un ingrédient actif.
La composition vaccinale selon le présent mode de réalisation peut se présentée sous une forme adaptée à l’administration à un patient, par exemple, par voie intramusculaire, intradermique, trans-cutanée ou sous-cutanée. Une autre forme alternative d’administration peut être un patch pour administration transcutanée qui se présente sous la forme d’un dispositif composé d’une bande adhésive, abritant un patch doté d’une centaine de micro-aiguilles d’environ 650 micromètres de longueur contenant ou imprégnées d’une composition vaccinale selon l’invention. Appliqué sur la peau pendant 15 à 30 minutes, il permet d’« injecter » un vaccin, les aiguilles se dissolvant dans la peau.
La protéine trimérique de la préparation injectable peut être sous la forme de particules oligomériques ou multimériques comme expliqué ci-dessus.
L’invention vise encore une préparation vaccinale telle que définie ci-dessus pour son utilisation comme antigène, en particulier viral, pour la prévention d’une ou des infections, en particulier virales. L’invention vise ainsi encore une préparation vaccinale telle que définie ci-dessus pour son utilisation comme antigène, en particulier bactérien, pour la prévention d’une ou des infections, en particulier bactériennes.
L’invention vise ainsi encore une préparation vaccinale telle que définie ci-dessus pour son utilisation comme antigène, en particulier de cellules cancéreuses, pour le traitement du cancer.
En particulier l’invention vise ainsi une préparation vaccinale selon l’invention pour son utilisation comme antigène viral pour la prévention des infections virales à virus possédant en leur surface des protéines structurées en trimère choisis dans le groupe comprenant les protéines GP120 et GP41 du virus VIH, l’hémagglutinine du virus influenza, les protéines S des coronavirus, en particulier la sous-unité S1 de la protéine S du SARS-COV-2, la glycoprotéine B des virus de l’herpès et d’Epstein-Barr, la glycoprotéine GP1 du virus Ebola, les glycoprotéine 1 et 2 des virus de Lassa, la glycoprotéine E1 des togavirus et la glycoprotéine F de fusion du virus respiratoire syncitial, du virus de la rougeole ou du virus de la parotidite virale.
Les protéines des particules selon l’invention peuvent être des protéines sous la forme d’un trimère de trois chaînes polypeptidiques selon l’invention, multimérisées ou oligomérisées en particules.
Les polypeptides sont isolés ou purifiés. Les polypeptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. De préférence, les polypeptides sont produits par des cellules procaryotes ou eucaryotes. Les polypeptides peuvent ainsi être produits dans des bactéries, des levures ou dans des cellules de mammifères. Dans certains modes de réalisation de l'invention, les polypeptides sont glycosylés.
Les particules peuvent être obtenues par auto-assemblage des protéines ou polypeptides. Dans de tels modes de réalisation, les particules ne comprennent pas de support, elles consistent uniquement en des protéines ou polypeptides. L'auto-assemblage peut être réalisé par différents moyens, tels que par coacervation ou par agrégation, induits par exemple par précipitation, concentration, ajouts de métaux ou de sels, variation de température ou être dépendant de motifs peptidiques intégrés au sein de la séquence des polypeptides selon l’invention. Les particules de la présente invention peuvent avoir un diamètre moyen allant de 0.05 µm à 6 µm, ou de 0,5 à 2 µm ou de 2 à 4 µm tel que mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS).
Dans d’autres modes de réalisation, les particules peuvent être obtenues par absorption, adsorption ou greffage des protéines ou polypeptides sur un support. Ainsi, le polypeptide monomérique ou la protéine trimérique comprenant trois polypeptides identiques selon l’invention peuvent être absorbés, adsorbés ou greffés à un support. Les protéines absorbées, adsorbées ou greffées peuvent être soit sous la forme d’un polypeptide (une seule chaîne polypeptidique) ou d’une protéine trimérisée (association de trois polypeptides identiques), ou encore de particules de protéines multimérisées ou oligomérisées selon l’invention.
Ainsi, les particules entrant dans la formulation des préparations de la présente invention comprennent des supports sur lesquels sont absorbés, adsorbés ou greffés des protéines trimériques selon l’invention capables d’induire une réponse immunitaire après injection.
Dans un mode de réalisation privilégié, les supports sont des nano ou microparticules organiques. Des exemples de nano ou microparticules incluent l’albumine, des lipides, des polymères, ou tout autre structure organique.
Le greffage des protéines ou polypeptides selon l’invention sur les supports peut se faire par liaison covalente via des fonctions présentes en surface de la particule ou via un agent de liaison bifonctionnel ou un polymère bifonctionnel. L’agent de liaison bifonctionnel ou le polymère bifonctionnel permet de fonctionnaliser les nano ou microparticules. Il présente à l’une de ses extrémités un groupement fonctionnel lui permettant de se greffer de manière covalente en surface des nano ou microparticules, et à l’autre extrémité, un groupement fonctionnel lui permettant de se greffer de manière covalente aux protéines ou polypeptides.
De préférence, le polymère bifonctionnel est un polymère hétérobifonctionnel. La présence de deux groupements fonctionnels différents permet de limiter les couplages non désirés, tels que le greffage des deux extrémités du polymère sur les microparticules. De préférence, l’affinité entre les groupements fonctionnels terminaux du polymère est également faible afin de limiter l’auto-condensation du polymère par interaction entre ces deux extrémités.
Différents types de polymères bifonctionnels peuvent être utilisés pour fonctionnaliser les microparticules. Ainsi, les polymères bifonctionnels peuvent être choisis parmi les polyéthylène glycols (PEG), les poly(acide lactique-coglycolique) (PLGA), les poly(caprolactone) (PLCL), les poly(acide lactique) (PLA), les polymères de glycolide (PGA), les chitosan et dextran,etc.De préférence, le polymère est un polyéthylène glycol bifonctionnel, de préférence hétérobifonctionnel. La masse moléculaire du polymère varie généralement de 500 Da à 10 000 Da, de préférence de 2 000 à 8 000 Da, de préférence aux alentours de 5 000 Da. La masse moléculaire du polymère est typiquement choisie de manière à ce que lorsqu’une protéine ou peptide est couplé(e) aux microparticules par l’intermédiaire du polymère bifonctionnel, la chaîne du polymère atteigne une longueur suffisante pour que les propriétés de la protéine ou du polypeptide ne soient pas altérées par la présence de la microparticule.
Des véhicules ou des excipients pharmaceutiquement acceptables selon l'invention, c'est à dire des véhicules ou des excipients dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs, sont bien connus de l'homme du métier. De manière non limitative, des exemples d'excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables incluent des adjuvants, un diluant, des stabilisateurs, des conservateurs, ou d’autres composés. Les préparations injectables selon la présente invention peuvent être préparées selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Les polypeptides peuvent être préparés au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier. De préférence, les polypeptides recombinants sont produits par des cellules procaryotes ou eucaryotes génétiquement modifiées. Les polypeptides peuvent ainsi être produits dans des bactéries, des levures ou dans des cellules de mammifères. Dans certains modes de réalisation de l'invention, les polypeptides sont glycosylés.
Les séquences nucléotidiques correspondant aux séquences polypeptidiques SEQ ID N°1 à 4 sont respectivement les séquences SEQ ID N° 5 à 8.
L'hydroxylation se fait dans la cellule par le complexe prolyl-4 hydroxylase. On indique la mention GPO lorsque l'on fait de la synthèse peptidique. Les séquences avantageuses citées dans la description contiennent toutes des séquences GPP car l’hydroxyproline n’est pas un acide aminé naturel codé par un codon particulier. En effet lorsqu’elles sont exprimées dans une cellule hôte exprimant la prolyl-4 hydroxylase, la proline située en position deux est hydroxylée et devient une hydroxyproline, transformant GPP en GPO ou O est l’hydroxyproline. Ainsi dans les séquences peptidiques citées et divulguées dans la présente demande, il n’y a pas de O, cependant les polypeptides selon l’invention contiennent effectivement un O à la place du P en seconde position et les triplets figurés GPP dans les séquences citées et divulguées ici doivent et peuvent se lire GPO. En effet, afin de former un trimère organisé en triple hélice, il est nécessaire de disposer de triplets GPO et pas GPP.
Les particules peuvent être obtenues par auto-assemblage des protéines ou peptides. Dans de tels modes de réalisation, les particules ne comprennent pas de support, elles consistent uniquement en des protéines ou polypeptides. L'auto-assemblage peut être réalisé par différents moyens, tels que par coacervation ou par agrégation, induits par exemple par précipitation, concentration, ajouts de métaux ou de sels, variation de température. Les particules de la présente invention peuvent avoir un diamètre moyen allant de 0.05 µm à 6 µm, ou de 1 à 5 µm ou de 2 à 4 µm tel que mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS).
Des véhicules ou des excipients pharmaceutiquement acceptables selon l'invention, c'est à dire des véhicules ou des excipients dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs, sont bien connus de l'homme du métier. De manière non limitative, des exemples d'excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables incluent les solvants, agents d'écoulement, agents de mise en suspension, agents de solubilisation, stabilisants, conservateurs, tampons, antioxydants et agents chélatants. Les préparations injectables selon la présente invention peuvent être préparées selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
EXEMPLES
Production des protéines selon l’invention
Production en cellules de mammifère : exemple en cellules CHO
Dans un mode de production particulier, les polypeptides selon l’invention peuvent être produits en cellules de mammifère comme par exemple en cellules CHO comme décrit ci-après. Une pré-culture des cellules CHO-S (Invitrogen) de 3 semaines est réalisée avant la transfection. Les cellules sont entretenues dans un milieu dédié aux cellules CHO (Power-CHO, EXCEL 302, proCHO4, proCHO5,…) complémenté avec 4 mM de L-glutamine (Lonza) et 1X de proHT (Lonza) en shakeflask 125 mL et en conditions agitées (80 rpm) dans un incubateur à 37°C avec 5 % de CO2. Deux jours avant la transfection, les cellules sont ensemencées à 5.105cellules viables/mL par un changement complet du milieu utilisé et cultivées dans 12,5 mL de milieu dédié aux cellules CHO complémenté en shakeflask 125 mL.
Le jour de la transfection, 5.106cellules viables sont culotées par centrifugation (5 min à 1 000g), puis reprises dans 5 mL de milieu RPMI (Lonza) complémenté avec 4 mM de L-Glutamine (Lonza) et 1X de ProHT (Lonza). Quatre mL de suspension sont alors répartis dans 4 shakeflasks 25 mL (1 mL par flask) contenant 9 mL de milieu RPMI complémenté (1.106cellules viables par shakeflask). Les cellules CHO-S sont alors transfectées avec le vecteur contenant la séquence codante (SEQ ID N°5) pour le polypeptide de SEQ n°1 décrit précédemment. Un contrôle positif de transfection est réalisé en transfectant les cellules avec le vecteur pMAX-GFP et 2 contrôles négatifs de la transfection sont réalisés soit en transfectant les cellules avec un vecteur ne possédant pas la cassette de résistance à la généticine soit en ne leur faisant subir aucun traitement. La transfection est réalisée à l’aide de l’agent de transfection Fecturine (PolyPlus Transfection) ou tout autre agent de transfection adapté et selon le protocole commercial du produit optimisé. Pour la Fecturine, les conditions de transfection retenues sont 6 µg d’ADN pour 12 µL de Fecturine (ratio ADN/Agent de transfection = ½) pour 106cellules viables. L’homme de métier saura définir l’agent de transfection le plus adapté pour une transfection dite transitoire ou pour une transfection dite stable. Qu’il s’agisse d’un mode de transfection dit transitoire ou stable, les cellules sont incubées en présence des complexes de transfection en conditions statiques à 37°C et 5 % CO2. A 4h post-transfection, les cellules sont resuspendues dans du milieu dédié aux cellules CHO complémenté et repassées en conditions agitées. A 24h post-transfection, une quantification de l’efficacité de transfection est réalisée sur un aliquot des témoins positif et négatifs de transfection par cytométrie en flux.
Pour la production des polypeptides selon l’invention en mode dit transitoire, un premier prélèvement de surnageant est réalisé à J+3 (J0 correspondant au jour de la transfection) puis la culture est stoppée à J+5. Le surnageant de culture contenant le polypeptide de SEQ n°1 sécrété par les cellules est récupéré après centrifugation à 3 000 g pendant 10 minutes, permettant ainsi l’élimination des cellules et débris cellulaires, puis congelé à -20°C.
Pour la production des polypeptides selon l’invention en mode dit stable, un comptage cellulaire est réalisé à 48 heures post-transfection. La totalité des cellules est ensuite centrifugée à 1 000gpendant 5 min puis ensemencée à 3.105cellules viables/mL dans du milieu dédié aux cellules CHO complémenté + généticine (G418 Merck) à 700 µg/mL (pression de sélection). Les cellules sont ensuite entretenues trois fois par semaine par ensemencement de la totalité des cellules - dans un volume permettant de conserver un taux d’ensemencement à 3.105cellules viables/mL de milieu complet + G418 à 700 µg/mL en ShakeFlasks 125 mL. On observe une diminution de la concentration cellulaire et/ou de la viabilité cellulaire dans la première semaine de culture sous pression de sélection. La viabilité cellulaire augmente de nouveau après 2-3 semaines sous pression de sélection uniquement pour les cellules transfectées avec le vecteur contenant la séquence codante pour des polypeptides selon l’invention. La viabilité des cellules non transfectées ou transfectées avec le vecteur ne possédant pas la cassette de résistance à la généticine continue de descendre jusqu’à devenir nulle. Lorsque la culture atteint plus de 95 % de viabilité, une cryo-conservation à 5.106cellules viables/ampoule (au nombre de 10 ampoules) est réalisée. Les cellules sont congelées dans du milieu dédié aux cellules CHO complémenté + 10 % de DMSO.
Pour réaliser une production des polypeptides selon l’invention, les cellules modifiées génétiquement pour produire des polypeptides selon l’invention sont décongelées et entretenues dans un milieu adapté. Les cellules sont placées dans 12,5 mL de milieu final et placées dans un shakeflask 125 mL dans un agitateur LabTherm® Kühner agité à 80 rpm, régulé à 5% de CO2et avec une humidité comprise entre 40 et 80 %. Les cellules sont entretenues à 3.105cellules viables/mL pendant une à deux semaines. Ensuite, les cellules sont amplifiées afin d’avoir la quantité nécessaire pour réaliser une production. L’amplification consiste à entretenir les cellules dans des volumes plus élevés à chaque entretien pour garder toutes les cellules à une concentration viable.
Lorsque la quantité de cellules nécessaire à la production est obtenue, la production peut être lancée. Les cellules sont ensemencées à 3.105cellules viables/mL. La production peut être réalisée dans différents équipements : shakeflask placés dans un agitateur LabTherm® Kühner, Cultibag RM 20/50® (Sartorius), CellReady® (Merck Millipore), BioBundle® (Applikon) et d’autres équipements équivalents, de même échelle ou d’échelle supérieure. La culture des cellules est réalisée pendant 5 jours ou plus, au maximum 10 jours, selon les conditions de réalisation de la culture. Chaque jour, les paramètres de la production sont suivis ainsi que la concentration cellulaire et la viabilité cellulaire. Au cours de la production, des composants tels que des acides aminés, des vitamines, du glucose ou tout autre élément présentant un intérêt pour la production ou pour les cellules peuvent être ajoutés. Dans ce cas, il s’agit d’une culture en mode « fed – batch » ou « semi continu » qui permet de cultiver les cellules pendant au maximum 21 jours. Si aucun composé n’est ajouté pendant la culture, on parle de culture en mode « batch » ou « discontinu ».
La purification des polypeptides selon l’invention peut être réalisée par exemple via une étiquette de purification comme le tag-6(His) présent dans sa séquence. Ainsi, les cellules et débris cellulaires présents dans le milieu contenant un polypeptide selon l’invention sont éliminés par centrifugation ou filtration en profondeur (POD Millistak+® Merck Millipore ou tout un autre type de support équivalent) ou filtration tangentielle sur une membrane présentant un seuil de coupure de 0,2 µm. Le surnageant ainsi obtenu est purifié par chromatographie d’affinité sur une colonne chélatée avec un métal tel que le nickel, le cobalt, le zinc ou le cuivre. Afin de favoriser l’accroche des polypeptides selon l’invention, un tampon contenant de 0 à 50 mM imidazole, de 0 à 500 mM NaCl, de 5 à 20 mM (Na2HPO4, 2H2O) et de 5 à 20 mM (NaH2PO4, H2O) est ajouté au surnageant et ajusté à un pH entre 7 et 8. L’élution du polypeptide selon l’invention est soit réalisée par gradient en utilisant un mélange de deux tampons (tampon 1: 500 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) et 10 mM (NaH2PO4, H2O) ; tampon 2 : 20 mM imidazole, 500 mM NaCl, 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) et 10 mM (NaH2PO4, H2O) ajustés à un pH entre 7 et 8), soit de façon isocratique, avec un tampon contenant de 50 à 500 mM imidazole, de 0 à 500 mM NaCl, de 5 à 10 mM (Na2HPO4, 2H2O) et de 5 à 10 mM (NaH2PO4, H2O) ajusté à un pH entre 7 et 8. Eventuellement, afin d’améliorer la pureté des polypeptides selon l’invention, d’autres étapes de purification peuvent être ajoutées. Il peut s’agir de filtrations, de chromatographie d’échange d’ions, de chromatographie d’affinité, de chromatographie d’interaction hydrophobe, d’exclusion stérique ou de tout autre type de chromatographie.
Les fractions d’élution d’intérêt sont mises à migrer dans un gel d’électrophorèse en conditions natives et colorées au bleu de Coomassie, avant d’être regroupées selon leur profil et dialysées dans de l’eau ou un tampon phosphate ou tout autre tampon adapté à la conservation du polypeptide selon l’invention. La concentration du polypeptide est déterminée par le kit Sircol® (TebuBio) selon les instructions du fabricant ou par le test au Bradford ou tout autre test adapté à la quantification des polypeptides selon l’invention.
Production en levures
Dans un mode de production particulier, la production des polypeptides selon l’invention est réalisée chez la levure. Les vecteurs utilisés pourront contenir des promoteurs constitutifs ou inductibles, pour permettre la production des dits polypeptides dans le système de levure retenu. Les vecteurs pourront également porter des séquences permettant de diriger l’intégration génomique, lorsque les hôtes utilisés peuvent êtreSaccharomyces. Cerevisiae,Pichiapastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorphaou toute autre souche de levure adaptée à la production de protéines recombinantes. La même séquence codante (SEQ ID N°5 pour le polypeptide de SEQ ID n°1 décrit précédemment est utilisée.
Les procédés de production des polypeptides selon la présente invention utilisent les cellules de la levurePichia pastoris. Cette levure présente l’avantage d’atteindre des rendements élevés de protéines recombinantes lors de fermentations à grande échelle. Le système d'expression dePichiainclue les avantages des systèmes d'expression procaryotes (par exemple,Escherichia. coli) - haut niveau d’expression, facilité de la mise en place d’une montée en échelle et une croissance peu coûteuse - et des systèmes d'expression eucaryotes – repliement des protéines et modifications post-traductionnelles. De tels systèmes d'expression peuvent être construits en utilisant divers procédés et kits disponibles pour l'homme du métier, par exemple, les kits PICHIA EXPRESSION disponibles auprès d'Invitrogen Corporation (San Diego, CA).
Il existe un large nombre de gènes sensibles au méthanol chez les levures méthylotrophes, telle que la levurePichia pastoris. L'expression de chaque gène, étant contrôlée par des régions régulatrices sensibles au méthanol. L’ensemble des promoteurs sensibles au méthanol est adapté pour une utilisation lors de la présente invention. Des exemples de régions régulatrices spécifiques comprennent le promoteur du gène de l'alcool oxydase 1 dePichia pastorisAOX1, le promoteur du gène de l'alcool oxydase 2 dePichia pastorisAOX2, le promoteur FLDI1, le promoteur ADH1, le promoteur GAL4, les promoteurs PHO3 et PHO5. Typiquement, l'expression chezPichia pastorissous la dépendance du promoteur du gène AOX1, hautement régulé. L'expression constitutive peut également être obtenue en utilisant, par exemple, le promoteur de la glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAP. La GAP est une enzyme clé de la glycolyse, isolée pour la première fois par Waterham en 1997 et utilisée depuis lors pour l'expression constitutive de protéines hétérologues. L'utilisation de ce promoteur présente l'avantage de ne pas nécessité une étape de lavage des cellules afin d’éliminer les sources de carbone autres que le méthanol, comme quand un système inductible au méthanol est utilisé. Ce promoteur permet également de limiter les risques et les coûts liés au stockage et à la livraison d'un grand volume de méthanol. Cette procédure convient mieux à une production à grande échelle et peut contribuer de manière significative au développement de méthodes rentables pour une production à grande échelle des polypeptides.
Dans un mode de réalisation préféré, la cellule hôte peut avoir dans son génome une ou plusieurs copies des gènes codant pour les polypeptides. Par exemple, plusieurs copies d’un gène codant pour un polypeptide peuvent être intégrés en tandem dans un ou plusieurs loci chromosomiques. Les copies de gènes intégrées en tandem sont insérées de façon préférentielle dans un nombre stable de copies pendant la culture pour la production des polypeptidiques.
Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, dans lequel l’hydroxylation du polypeptide est souhaitée, la co-expression d'une enzyme post-traductionnelle du collagène, par exemple la prolyl 4-hydroxylase (P4H), est nécessaire. Les deux sous-unités de cette enzyme peuvent être exprimées grâce à la présence d’un IRES ou tout autre séquence permettant l’expression de deux gènes sous la dépendance d’un même promoteur. La P4H peut être insérée au même locus chromosomique que les polypeptides de la présente invention ou tout autre locus d’intérêt permettant son expression. De plus, les gènes codants les deux sous unités de la P4H peuvent être portés ou non par la construction portant les gènes des différents polypeptides de la présente invention. Le nombre de copies des gènes des polypeptides de la présente invention intégrées au génome de la levure peuvent varier ou non par rapport au nombre de copies des gènes de la P4H intégrées au génome de la levure.
Avant la transformation, chaque vecteur d'expression peut être linéarisé grâce à sa digestion par des enzymes de restriction dans une région homologue au locus génomique cible (par exemple, la séquence de promoteur GAP), pour diriger l'intégration des vecteurs dans le locus cible du génome de la cellule hôte. Des préparations de chaque vecteur peuvent ensuite être transformées individuellement dans des cultures des souches souhaitées par électroporation ou d'autres méthodes, et les transformants positifs peuvent être sélectionnés au moyen d'un marqueur de sélection, par exemple, la résistance aux antibiotiques ou la complémentation d'une auxotrophie. Les colonies peuvent être prélevés, striés afin d’obtenir des colonies uniques dans des conditions sélectives et sélectionnées pour confirmer le nombre de copies du gène codant pour le polypeptide par dosage PCR sur l'ADN génomique extrait de chaque souche. L'expression du produit génique peut être confirmée, par exemple, par SDS-PAGE, Western blot, ELISA, FACS, et d'autres moyens connus dans l’état de l’art.
Exemple : Construction de souches dePichia pastorisexprimant les différents polypeptides
Sauf indication contraire, les matériaux et procédés suivants ont été utilisés comme exemples de la présente invention.
Il a été mis en évidence dans la littérature que lorsque l’optimisation des codons est réalisée, il est préférable différencier les codons les plus fréquemment retrouvés dans des protéines exprimées en faibles quantités et en quantités élevés dans le même organisme (Roymondal et Sahoo, 2009). En effet, les tables d’optimisation de codons disponibles dans les bases de données (par exemple, https://www.kazusa.or.jp/codon/) contiennent les données concernant toutes les protéines corporelles. Dans la présente invention, les codons ont été sélectionnés de sorte à favoriser l’expression des polypeptides d’intérêt. La même séquence codante SEQ ID N°5 pour le polypeptide de SEQ ID n°1 est utilisée comme décrit précédemment.
Le gène synthétisé a été cloné dans le vecteur pPpRSFC-PGAP-MaF, où la protéine est exprimée en fusion avec le facteur d'accouplement alpha MaF, permettant sa production extracellulaire. Le site de clivage de la protéase Kex2 et les séquences cibles pour la dipeptidyl aminopeptidase codée par le gène Ste3 sont placés entre le MaF et le gène codant pour le polypeptide, afin d'éviter que des résidus d'acides aminés n'appartenant pas au polypeptide soient présents à l'extrémité N-terminale du polypeptide après le processus de protéolyse. La sécrétion de la protéine dans le milieu extracellulaire favorisera la mise en place d’un procédé plus simple et plus rapide pour purifier le polypeptide tagué.
La stratégie de construction du plasmide pPpRSFC-PGAP-MaF-polypeptide est la suivante :
Le gène synthétisé et le vecteur pPpRSFC-PGAP-MaF sont digérés avec les enzymes de restriction XhoI et NotI. Après digestion, les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose et les fragments d'intérêt ont été excisés du gel d'agarose, purifiés et liés en utilisant l'ADN ligase T4. La souche d’E. coliDH5a est transformée avec la réaction de liaison et les clones sont sélectionnés dans un milieu gélosé LB contenant de la Zéocine. L'ADN plasmidique de certains clones résistants à la Zéocine est purifié et analysé par les enzymes de restriction XhoI et NotI, ainsi que par séquençage. La construction ainsi obtenue est appelée pPpRSFC-PGAP-MaF-polylpeptide, elle exprime le polypeptide sous le contrôle de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (PGAP).
Les plasmides sont digérés avec les enzymes de restriction PmeI, AvrII, BspHI ou SwaI afin de linéariser le vecteur pour son intégration dans le génome deP. pastoris, au niveau du locus glycéraldéhydes-3-phosphate déshydrogénase ou tout autre locus d’intérêt. L'ADN linéarisé est purifié conformément aux recommandations du fabricant du kit NucleoSpin ™ Gel et du kit de nettoyage PCR. Un à dix microgrammes d'ADN linéarisé est utilisé pour l’électroporation dans les souchesP. pastorisBG10 ou NRR Y-1603 ou CBS7435 en utilisant un électroporateur micropulseur Biorad, en utilisant le réglage prévu pour les levures. L'électroporation a été réalisée selon un protocole de Pichia Protocols Second Edition (Methods in Moleculr Biology, Cregg, JM, Ed. 2007. Humanan Press, Totowa, NJ). Les transformants ont été sélectionnés sur des boîtes YPDS gélosées (autolysat de levure à 1 %, peptone à 2 %, glucose à 2 %, Sorbitol à 1M) additionnés de 100 à 3 000 µg/mL de Zeocine. Les souches sécrétant les polypeptides recombinants sont identifiées par la croissance des clones, sous agitation dans un milieu minimum pour levures Extrait de levure Peptone Dextrose YPD, ou dans un milieu minimal tamponné (BBM, 0,1 M, pH 6 de phosphate de potassium, 1,3 % de yeast nitrogen base sans acides aminés, 4 x 10-5% de biotine et 2 % de glucose ou de glycérol ou 1 % de méthanol). La concentration de chaque composant peut varier en fonction des caractéristiques de chaque polypeptide exprimé. L'expression du polypeptide d’intérêt est évaluée par SDS-PAGE et / ou Western blot.
Exemple : validation rapide de la production de polypeptides
Des colonies de transformants dePichia pastorissont utilisées pour inoculer 25 mL de milieu YPD ou de milieu BBM, cultivé sur la nuit à 30°C, sous agitation à 230 tr/min. Dans un flacon de culture de 3 litres, 600 ml de BMG à DO600 0,1 initiale sont cultivés à 30°C, sous agitation à 230 tr/min, pendant 24h, la culture pouvant être prolongée jusqu'à 72h selon le polypeptide exprimé. La température de croissance, le temps de production et le pH peuvent varier en fonction du polypeptide produit.
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Claims (12)
- Polypeptide comprenant :
- une séquence assurant la trimérisation du polypeptide sous la forme d’une protéine trimérique par association avec deux autres polypeptides identiques,
- une séquence comprenant tout ou partie de la séquence de protéine virale et,
- optionnellement un domaine de multimérisation permettant la formation de multimères ou d’oligomères de la protéine trimérique. - Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend au sein de la chaîne polypeptidique, des séquences de liaison, de type (GXY) n fois répétées ou X et Y peuvent être n’importe quel acide aminé, localisées entre la séquence assurant la trimérisation et la séquence comprenant tout ou partie de la séquence de protéine virale.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation du polypeptide sous la forme d’une protéine trimérique avec deux autres polypeptides identiques, est une séquence comprenant une partie du propeptide-C dérivé de collagènes.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation du polypeptide sous la forme d’une protéine trimérique avec deux autres polypeptides identiques est une séquence synthétique comprenant la répétition de (GPO) n fois répété avec n compris entre 2 et 15, dans laquelle O est une hydroxyproline.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation du polypeptide sous la forme d’une protéine trimérique avec deux autres polypeptides identiques est de type zipper issue de protéine de l’immunité innée choisie dans le groupe comprenant C1q, SP-D, MBL, les collectines, les pentraxines.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence assurant la trimérisation du polypeptide sous la forme d’une protéine trimérique avec deux autres polypeptides identiques est une séquence comprenant tout ou partie de collagènes bactériens et peut être choisie parmi la protéine scl2 de Streptococcus pyogenes ou le domaine globulaire V de ces collagènes bactériens.
- Polypeptide selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que tout ou partie d’une protéine virale, peut être choisi dans le groupe comprenant :
- la forme native de la protéine virale,
- une partie contenant un ou plusieurs domaines de la séquence native de la protéine virale,
- une association de séquences issues de protéines virales ; identiques ou différentes. - Polypeptide selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce que tout ou partie de protéine virale peut être choisi dans le groupe comprenant la sous-unité S1 de la protéine S du SARS-COV-2, la séquence de son domaine de liaison à un récepteur cellulaire (i.e. domaine RBD), le domaine RBD élargi contenant le domaine RBD et des acides aminés supplémentaires de chaque côté, sans que ces acides aminés ne constituent par eux même un domaine fonctionnel quelconque de la protéine virale, et une combinaison de ceux-ci.
- Protéine trimérique comprenant l’association trois polypeptides identiques selon l’une des revendications précédentes.
- Polypeptide selon l’une des revendications 1 à 8 ou protéine trimérique selon la revendication 9 pour son utilisation comme antigèneviral, afin d’induire une réponse immunitaire spécifique dirigée contre cet antigène et prévenir une infectionvirale.
- Préparation vaccinale, en particulier injectable, comprenant :
- au moins un polypeptide selon l’une des revendications 1 à 8 ou une protéine trimérique selon la revendication 9 ; et
- au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable de type adjuvant, diluant, stabilisateur ou conservateur. - Préparation vaccinale selon la revendication 11 pour son utilisation comme antigène viral pour la prévention des infections virales à virus possédant en leur surface des protéines structurées en trimère choisis dans le groupe comprenant les protéines GP120 et GP41 du virus VIH, l’hémagglutinine du virus influenza, les protéines S des coronavirus, en particulier la sous-unité S1 de la protéine S du SARS-COV-2 , la glycoprotéine B des virus de l’herpès et d’Epstein-Barr, la glycoprotéine GP1 du virus Ebola, les glycoprotéine 1 et 2 des virus de Lassa, la glycoprotéine E1 des togavirus et la glycoprotéine F de fusion du virus respiratoire syncitial, du virus de la rougeole ou du virus de la parotidite virale.
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