JP2023510893A - 抗腫瘍融合タンパク質及びその製造方法と使用 - Google Patents

Abstract

本発明は抗腫瘍融合タンパク質及びその製造方法と使用を提供する。具体的に、本発明の融合タンパク質はＣＰＰエレメント、任意に連結エレメント及びＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＳＨ２ドメイン又はその活性断片を含有し、本発明で得られる融合タンパク質は非常に優れた抗腫瘍作用を有する。【選択図】なし

Description

本発明は、生物及び薬物の分野に関し、より具体的に、抗腫瘍融合タンパク質及びその製造方法と使用に関する。

免疫チェックポイント阻害剤は既に腫瘍免疫療法の重要な標的になっており、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする免疫チェックポイント阻害療法は人体自身の免疫系を利用して悪性腫瘍を抵抗し、実質的に患者の全生存期間を改善する新世代の抗癌免疫療法である。しかしながら、多くの研究では、わずか20～30％の少数の患者が当該阻害剤に応答し、そして一部の患者は薬物治療を受けると、薬剤耐性が生じることが報告された。単独投与の応答率が低い現状において、新規な免疫チェックポイント阻害剤の開発及び異なる免疫チェックポイント薬物の併用策は、現在、患者の応答率を向上させる新たなアプローチになっている。

しかし、完全に臨床における低応答率及び薬剤耐性の問題を解決することができず、そして複数の療法の併用に併用の時系列、投与量の最適化、薬剤経済学などの問題がある。そのため、異なる免疫チェックポイントの共通標的を設計するユニバーサル免疫チェックポイント阻害剤（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋ ｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ、ＵＩＣＢ）は上記問題の重要な突破口になる可能性がある。

よって、本分野では、より有効的な抗腫瘍融合タンパク質の開発が切望されている。

本発明の目的は、より有効的な抗腫瘍融合タンパク質を提供することである。

本発明の第一の側面では、Ｎ末端からＣ末端の式Ｉ又はＩＩで表される構造を有する融合タンパク質を提供する。

（式中において、Ｚ１はＣＰＰエレメントである。Ｌはなしか、連結エレメントである。Ｚ２はＳＨＰ２及び／又はＳＨＰ１のＳＨ２ドメイン又はその活性断片である。「－」は上記エレメントを連結するペプチド結合又はペプチドリンカーを表す。）

もう一つの好適な例において、前記Ｚ１、Ｚ２は頭－頭、頭－尾、尾－頭、又は尾－尾の様態で連結している。

もう一つの好適な例において、前記の「頭部」とは、ポリペプチド又はその断片のＮ末端、特に、野生型ポリペプチド又はその断片のＮ末端である。

もう一つの好適な例において、前記の「尾部」とは、ポリペプチド又はその断片のＣ末端、特に、野生型ポリペプチド又はその断片のＣ末端である。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ１、Ｚ２はＤ型又はＬ型アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ１、Ｚ２が頭－頭の様態で連結している場合、前記Ｚ１、Ｚ２はＬ型又はＤ型アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、前記Ｚ１、Ｚ２が尾－尾の様態で連結している場合、前記Ｚ１、Ｚ２はＬ型又はＤ型アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、前記のＣＰＰエレメントはヒトに又は非ヒト哺乳動物由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記のＣＰＰエレメントは野生型及び突然変異型を含む。

もう一つの好適な例において、前記のＣＰＰエレメントは全長の、成熟形態のＣＰＰ、又はその活性断片を含み、好ましくは長さが５－３０アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、前記ＣＰＰエレメントはＴＡＴ膜透過ペプチドである。

もう一つの好適な例において、前記ＣＰＰエレメントは、ポリアルギニン（Ｒ５－９）、ＭＰＧ、ＣＡＤＹ、ｐＶＥＣ、ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド、ＶＰ２２、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ＣＰＰエレメントの配列は配列番号１、１５－２１のいずれかで示される。

もう一つの好適な例において、Ｌはグリシン及びセリンからなる。

もう一つの好適な例において、Ｌは－（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_ｎ－の構造を有し、ただし、ｎは１－５、好ましくは１－３である。

もう一つの好適な例において、Ｌは－（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ）_ｎ－の構造を有し、ただし、ｎは１－５、好ましくは１－３である。

もう一つの好適な例において、Ｌは１－６個のプロリン、好ましくは１－３個のプロリンを含む。

もう一つの好適な例において、前記のＺ２はヒトに又は非ヒト哺乳動物由来のものである。

もう一つの好適な例において、前記のＺ２は野生型及び突然変異型を含む。

もう一つの好適な例において、前記のＺ２は全長の、成熟形態のＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＳＨ２ドメイン、又はその活性断片を含む。

もう一つの好適な例において、Ｚ２は、Ｎ末端ＳＨ２ドメイン、Ｃ末端ＳＨ２ドメイン、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、Ｚ２は、さらに、Ｃ末端ＳＨ２ドメインのＩＴＩＭモチーフ結合領域を含む。

もう一つの好適な例において、Ｚ２はＳＨＰ２のＮ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号２における１－９９番目又は９－５１番目のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号２における９、２８、４９及び５１番目のアミノ酸を含有し、そして長さが４３－９９アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、Ｚ２はＳＨＰ２のＣ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号３における２７－３９番目又は２９－３７番目のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号３における２９、３１、３６及び３７番目のアミノ酸を含有し、そして長さが９－１０８又は１３－１０８アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、Ｚ２はＳＨＰ１のＮ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号１２における９－５１番目のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号１２における９、２８、４９、５１番目のアミノ酸を含有し、そして長さが４３－９９アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、Ｚ２はＳＨＰ１のＣ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号１３における２９－３７番目のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号１３における２９、３１、３６、３７番目のアミノ酸を含有し、そして長さが９－１０７アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、Ｚ２はＮ末端からＣ末端の式ＩＩＩで表される構造を有する。

（ただし、ＡはＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＮ末端ＳＨ２ドメイン又はその活性断片である。Ｌはなしか、連結エレメントである。ＢはＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＣ末端ＳＨ２ドメイン又はその活性断片である。「－」は上記エレメントを連結するペプチド結合又はペプチドリンカーを表す。）

もう一つの好適な例において、エレメントＡはＳＨＰ２のＮ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号２における１－９９番目又は番目９－５１番目を有し、好ましくは配列番号２における９、２８、４９及び５１番目を含有し、そして長さが４３－９９アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、エレメントＢはＳＨＰ２のＣ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号で示される配列を有し、かつ配列番号３における２７－３９番目又は２９－３７番目を含有し、好ましくは配列番号３における２９、３１、３６及び３７番目を含有し、そして長さが９－１０８又は１３－１０８アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、エレメントＡはＳＨＰ１のＮ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号１２における９－５１番目のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号１２における９、２８、４９、５１番目のアミノ酸を含有し、そして長さが４３－９９アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、エレメントＢをＳＨＰ１のＣ末端ＳＨ２ドメインで、配列番号１３における２９－３７番目のアミノ酸を有し、好ましくは配列番号１３における２９、３１、３６、３７番目のアミノ酸を含有し、そして長さが９－１０７アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、前記Ｌ’の長さは１～２０ａａ、好ましくは３～１５ａａ、より好ましくは５～１０ａａである。

もう一つの好適な例において、前記Ｌ’のアミノ酸配列は、以下の群から選ばれる：
（１）アミノ酸配列が配列番号１０で示されるポリペプチド；
（２）配列番号１０で示されるアミノ酸配列が、１個又は複数個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～３個、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を経てなるもので、（１）に記載のポリペプチドの機能を有する、配列番号１０で示されるアミノ酸配列のポリペプチドから誘導されたポリペプチド。

もう一つの好適な例において、Ｚ２は配列番号１１又は１４で示される配列を有する。

もう一つの好適な例において、Ｚ２の配列は配列番号１１又は１４で示される。

もう一つの好適な例において、前記のペプチドリンカーの長さは０－１０アミノ酸、好ましくは０－５アミノ酸である。

もう一つの好適な例において、前記融合タンパク質は、以下の群から選ばれる：
（Ａ）配列番号４－８のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（Ｂ）配列番号４－８のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性（好ましくは９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、最も好ましくは９７％以上、例えば９８％以上、９９％以上の相同性）を有し、かつ腫瘍抑制活性を有するポリペプチド；
（Ｃ）配列番号４－８のいずれかで示されるアミノ酸配列が１－５個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を経てなるもので、かつ残腫瘍抑制活性が維持された誘導ポリペプチド。

もう一つの好適な例において、前記の融合タンパク質のアミノ配列は配列番号４－８のいずれかで示される。

本発明の第二の側面では、単離されたポリヌクレオチドであって、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。

もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは、前記突然変異タンパク質又は融合タンパク質のＯＲＦの横に、さらに、シグナルペプチド、分泌ペプチド、タグ配列（例えば６Ｈｉｓ）、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる補助エレメントを含有する。

もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

本発明第三の側面では、本発明の第二の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

もう一つの好適な例において、前記ベクターは一つ又は複数のプロモーターを含み、前記プロモーターは操作可能に前記核酸配列、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、複製開始点、選択的マーカー、核酸制限部位、及び／又は相同組換え部位と連結している。

もう一つの好適な例において、前記ベクターはプラスミド、ウイルスベクターを含む。

もう一つの好適な例において、前記のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ポックスウイルス、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ベクターは、発現ベクター、シャトルベクター、組込みベクターを含む。

本発明第四の側面では、本発明の第三の側面に記載のベクターを含むか、あるいはそのゲノムに本発明の第二の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。

もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は真核細胞、例えば酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞（ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む）である。

もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。

もう一つの好適な例において、前記酵母細胞は、ピキア酵母、クルイウェロマイセス酵母、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる一つ又は複数の由来の酵母で、好ましくは、前記の酵母細胞は、クルイウェロマイセス酵母を含み、より好ましくはクリュイベロミセス・マルシアヌス、及び／又はクルイベロミセス・ラクチスである。

もう一つの好適な例において、前記宿主細胞は、大腸菌、小麦胚芽細胞、昆虫細胞、ＳＦ９、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、酵母細胞、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

本発明の第五の側面では、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
発現に適切な条件において、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞を培養することにより、融合タンパク質を発現させる工程；及び／又は前記融合タンパク質を単離する工程。

本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質及びその薬物学的に許容される担体を含有する薬物組成物を提供する。

もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は、さらに、腫瘍の活性を抑制するためのほかの薬物を含む。

もう一つの好適な例において、腫瘍の活性を抑制するためのほかの薬物は、ＰＤ－１抗体、ＰＤ－Ｌ１抗体、ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＢＴＬＡ抗体、ＣＴＬＡ－４抗体、ＣＤ４７抗体、ＮＫＧ２Ａ抗体、ＮＫＴＲ－２１４， ＧＤＦ－１５抗体、ＬＩＬＲＢ４抗体、ＬＡＩＲ１抗体、Ｔｉｍ－３抗体、Ｌａｇ－３抗体、Ｔｉｇｈｔ抗体、 ＣＤ１６０抗体、ＫＬＲＧ－１抗体、ＧＰ４９Ｂ抗体、ＣＤ３１抗体、ＣＤ３８抗体、Ｌａｉｒ－１抗体、ＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ抗体、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＥＧＦＲモノクローナル抗体、ＣＤ２０モノクローナル抗体、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲモノクローナル抗体、リカーチン（Ｌｉｃａｒｔｉｎ）、ゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）、ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）、カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）、コンベルセプト（Ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）、アパルタミド （ＡＲＮ－５０９）、Ｒｏｖａ－Ｔ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、Ｔβ４、ＥＧＦＲを標的とする小分子阻害剤、タキソール（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＴＸＴ）、シスプラチン（ＤＤＰ）、カルボプラチン（ＣＢＰ）、オキサリプラチン、ネダプラチン、シクロホスファミド（ＣＴＸ）、イホスファミド（ＩＦＯ）、ドキソルビシン（ＡＤＭ）、ピラルブシン（ＴＨＰ）、エピルビシン（ＥＰＩ）、フルオロウラシル（５－Ｆｕ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、ビノレルビン（ＮＶＢ）、ペメトレキセド（ＰＥＭ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、エトポシド（ＶＰ－１６）、カペシタビン（ゼローダ）、酢酸ロイプロリド、ゴセレリン酢酸塩、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、トリパリマブ、シンチリマブ、カムレリズマブ、チスレリズマブ、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ＨＥＲ２モノクローナル抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ－ＤＭ１、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ＣＴＬＡ－４抗体はイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）を含む。

もう一つの好適な例において、前記ＥＧＦＲモノクローナル抗体はネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を含む。

もう一つの好適な例において、前記ＣＤ２０モノクローナル抗体は、リツキシマブ、イブリツモマブ、トシツモマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、アテゾリズマブ、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲモノクローナル抗体は、ベバシズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記ＥＧＦＲを標的とする小分子阻害剤は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ゲフィチニブ、ゲフィチニブ（アファチニブマレイン酸塩を含む）、ダコチニブ、オシメルチニブ、ナザルチニブ（Ｎａｚａｒｔｉｎｉｂ）、ネラチニブ（マレイン酸ネラチニブを含む）、ソラフェニブ （Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、アパチニブ（例えばＡｉｔａｎ、メシル酸アパチニブ）、イマチニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、クリゾチニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、ネラチニブ、ザヌブルチニブ、アンロチニブ、セリチニブ、フルキンチニブ、ピロチニブ、レンバチニブ、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

本発明の第七の側面では、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質、本発明の第二の側面に記載のポリヌクレオチド、本発明の第三の側面に記載のベクター、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞の使用であって、腫瘍を治療又は予防するための組成物又は製剤の製造における使用を提供する。

もう一つの好適な例において、前記組成物又は製剤は、さらに、以下の群から選ばれる一つ又は複数の用途に使用される：
（ａ）Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用の増強；
（ｂ）腫瘍の生長の抑制；
（ｃ）Ｔ細胞のアポトーシスの抑制；
（ｄ）Ｔ細胞のＩＬ－２を分泌するレベルの増加；
（ｅ）ＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用の増強；
（ｆ）ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａの発現レベルの増加；
（ｇ）ＮＫ細胞のパーフォリン、グランザイムの分泌の増加；
（ｈ）ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αの分泌の増加；
（ｉ）マクロファージの貪食機能の増強；
（ｊ）マクロファージの腫瘍細胞に対する貪食殺傷作用の増強；
（ｋ）マクロファージのＮＯ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの分泌の増加。

もう一つの好適な例において、前記の組成物は薬物組成物である。

もう一つの好適な例において、前記腫瘍は、乳癌、結腸癌、肺癌、大腸癌、胃癌、食道癌、膵臓腺癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、黒色腫、多発性骨髄腫、、白血病、リンパ腫、頭頸部腫瘍、甲状腺癌、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

もう一つの好適な例において、前記腫瘍細胞は、乳癌、結腸癌、肺癌、大腸癌、胃癌、食道癌、膵臓腺癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、黒色腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、頭頸部腫瘍、甲状腺癌、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる１種又は複数種の腫瘍由来のものである。

本発明の第八の側面では、体外で非治療的に腫瘍の生長を抑制する方法であって、本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質の存在下において、腫瘍細胞を培養することにより、腫瘍の生長を抑制する工程を含む方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記腫瘍細胞は体外で培養される細胞である。
本発明の第九の側面では、腫瘍を治療する方法であって、必要な対象に本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質を投与する工程を含む方法を提供する。

もう一つの好適な例において、前記の融合タンパク質は単量体及び／又は二量体の様態で施用される。

もう一つの好適な例において、前記の対象はヒトである。

もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴及び下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、又は好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。

本発明の主な利点は以下の通りである。

（ａ） 本発明では、初めて、１種類の融合タンパク質を見出し、当該融合タンパク質はＣＣＰタンパク質、任意に連結エレメント及びＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＳＨ２ドメイン又はその活性断片を含有し、本発明で得られる融合タンパク質は非常に優れた腫瘍に対する殺傷活性を有する。

（ｂ） 本発明の融合タンパク質は、また、顕著なＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用の増強、及び／又は腫瘍の生長の抑制、及び／又はＴ細胞のアポトーシスの抑制、及び／又はＴ細胞のＩＬ－２を分泌するレベルの増加ができる。

（ｃ） 本発明の融合タンパク質は、また、ＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用の増強、ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現レベルの増加、ＮＫ細胞のパーフォリン、グランザイムの分泌の増加、 ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αの分泌の増加ができる。

（ｄ） 本発明の融合タンパク質は、また、マクロファージの貪食機能の増強、マクロファージの腫瘍細胞に対する貪食殺傷作用の増強、マクロファージのＮＯ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの分泌の増強ができる。

（ｅ） 本発明では、初めて、免疫細胞内におけるＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＮ－ＳＨ２及びＣ－ＳＨ２ドメインとＩＴＩＭの結合の遮断を切口に、遺伝子工学及びポリペプチド固相合成技術を利用してそれぞれＩＴＩＭと結合可能なＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＮ－ＳＨ２和Ｃ－ＳＨ２ドメインの融合タンパク質及び模擬ポリペプチドを設計・製造した。融合タンパク質及びポリペプチドが細胞に入るように、融合タンパク質のＮ末端及びポリペプチドのＣ末端に膜透過ペプチドＴＡＴを融合させた。ＨＩＶ１のトランス活性化タンパク質（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＡＴ）は、細胞の正常の構造と機能に影響せず、ポリペプチド及びタンパク質が効率的に快速に細胞内に導入することができる。融合タンパク質及びポリペプチドが細胞に入ると、Ｔ細胞／ＮＫ細胞／マクロファージ内において正常に発現されるＳＨＰ２又はＳＨＰ１と競争して阻害受容体の細胞内領域におけるＩＴＩＭと結合し、免疫細胞内におけるＳＨＰ２又はＳＨＰ１が常に非活性化状態にあるようにさせることで、免疫阻害受容体の抑制作用がなくなる。

（ｆ） 本発明の融合タンパク質は幅広い抗腫瘍作用を有する。

本発明者は、深く研究したところ、意外に１種類の融合タンパク質を見出し、当該融合タンパク質はＣＰＰエレメント、任意に連結エレメント及びＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＳＨ２ドメイン又はその活性断片を含有し、本発明で得られる融合タンパク質は非常に優れた腫瘍に対する殺傷活性を有し、かつ、本発明の融合タンパク質は、顕著にＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用を増強させることもできる。これに基づき、本発明を完成させた。

＜ＣＰＰエレメント＞
細胞膜は細胞と細胞外環境の主な障壁で、この天然の障壁が存在するため、多くの生体高分子が細胞膜を透過して細胞に入ることが困難で、現段階の標的送達の大きな障害の一つである。細胞膜透過ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）は、５～３０個のアミノ酸残基で構成され、細胞膜透過能力を有するポリペプチドで、タンパク質、核酸などの生体高分子を担持して細胞に入ることができる。ＣＰＰを介する生体高分子の細胞への導入は従来の手段よりも安全で効率的で、現在最も成功している体内・外で直接生体高分子を輸送する送達システムである。最初のＣＰＰの研究では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）の逆転写活性化タンパク質のうちの一つのアルギニン配列に富むポリペプチド（ＴＡＴ）が有効に細胞膜を透過して相応するウイルスプロモーターの転写を活性化させることができることが見出された。ＴＡＴは効率的に薬物を細胞内に送達することができる。ＴＡＴの膜透過機能が１１アミノ酸のコア領域（ａａ４７－ａａ５７）にあることが精確に確認され、当該領域はＴＡＴ－タンパク質形質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＴＡＴ－ＰＴＤ）と名付けられ、そして異なる異種タンパク質の細胞内輸送への応用に成功した。

ＣＰＰは、その化学的性質により、以下の３種に分かれる：（１）陽イオン型は、アルギニン及びリシン残基に富み、生理ｐＨにおいて強い正電荷を有し、主にＴＡＴ、Ｒ９、ｈＬＦなどを含む。（２）両親媒型ペプチド類は、正電荷がリシン残基によって提供され、このようなＣＰＰは疎水性と親水性のドメインを含み、そしてその両親媒性の特徴はその一次構造と二次構造の両者によって決定され、主にＭＰＧ、ＣＡＤＹ、ｐＶＥＣ、ＳＡＰなどを含む。（３）疎水型ＣＰＰは、低いネット電荷を有し、主に非極性アミノ酸からなる。例えば、カポジ線維芽細胞成長因子（Ｋ－ＦＧＦ）ペプチドが挙げられる。

一つの好適な実施形態において、本発明のＣＰＰエレメントはＴＡＴ膜透過ペプチドである。

一つの好適な実施形態において、本発明のＣＰＰエレメントは、ポリアルギニン（Ｒ５－９）、ＭＰＧ（ヒト免疫不全ウイルス１型のｇｐ４１タンパク質の融合タンパク質ドメイン及びサル空胞ウイルス大Ｔ抗原の核局在化配列領域からなるもの、アミノ酸配列：ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１５））、ＣＡＤＹ（トリプトファン残基及びアルギニン残基を含有する２０アミノ酸からなる二次両親媒性ペプチド、アミノ酸配列：ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号１６）－ＣｙＡ）、ｐＶＥＣ（マウス血管内皮細胞由来カドヘリン、アミノ酸配列：ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号１７））、ペネトラチン（ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質における３番目のαヘリックスのうちの正電荷を多く有する配列４３－５８、アミノ酸配列：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１８））、カポジ線維芽細胞成長因子ペプチド（Ｋ－ＦＧＦ、アミノ酸配列：ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１９））、ＶＰ２２（１型単純ヘルペスウイルスの中間層タンパク質、アミノ酸配列：ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＶＤ（配列番号２０））、又はこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。

＜免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）＞
現在、多くの免疫チェックポイント阻害受容体（ＰＤ－１、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＣＤ３１及びＳＩＲＰαなど）が知られており、細胞外領域が異なるが、その細胞内領域には、いずれも、一つ又は複数の免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｏｔｉｆｓ、ＩＴＩＭ）が含まれ、ＩＴＩＭにおけるチロシンがリン酸化すると、シグナル分子のタンパク質チロシンホスファターゼ１又は２（ＳＨ２ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－１、ＳＨＰ１；ＳＨ２ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－２、ＳＨＰ２）が集まり、抑制シグナルが生じ、エフェクターＴ細胞の機能喪失及び／又はアポトーシスにつながる。そのため、ＩＴＩＭは多くの免疫チェックポイントの抑制作用を発揮する共通のドメインで、免疫チェックポイントに対して汎用性薬物を設計するための重要な標的でもある。ＳＨＰ１とＳＨＰ２は高度に相同的で、かつ同様の結合部位に集められ、ＳＨＰ１とＳＨＰ２ホスファターゼの異なる作用はまだ不明である。

＜ＳＨＰ１＞
タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨ２ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ， ＳＨＰ１）は、主に人体の各造血細胞において発現され、リンパ細胞間のシグナル伝達経路におけるチロシンリン酸化レベルを制御する重要な負調節因子である。ＳＨＰ１は、それぞれＮ－ＳＨ２（３～１０１）とＣ－ＳＨ２（１０９～２１５）の２つのＳＨ２ドメイン、１つの触媒（ＰＴＰ）ドメイン（２７２～５１４）、１つのプロリンに富む基及びチロシンリン酸化部位の尾部を含む。

＜ＳＨＰ２＞
ＳＨＰ２は非受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ１１（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｎｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ １１，ＰＴＰＮ１１）遺伝子によってコードされるタンパク質チロシンホスファターゼで、それぞれＮ－ＳＨ２（５～１０３）とＣ－ＳＨ２（１１１～２１８）の２つのＳＨ２ドメイン、１つの触媒（ＰＴＰ）ドメイン（２７６～５２３）、１つのプロリンに富む基及びチロシンリン酸化部位の尾部を含む。ＰＴＰＮ１１遺伝子は、１６のエクソンを含み、幅広く発現される７ｋｂ転写物を生成させ、５９３アミノ酸のタンパク質をコードする１．７７９ｂｐ読み枠を含む。また、ヒトとマウスのＳＨＰ２遺伝子配列の相同性は１００％である。

非活性化（ｉｎａｃｔｉｖｅ）ＳＨＰ２／ＳＨＰ１のＮ－ＳＨ２ドメインは電荷－電荷相互作用によって触媒ドメインＰＴＰと幅広く接触し、そして一部のＳＨ２ドメイン（ＮＸＧＤＹ／Ｆモチーフ）が触媒クレフトに挿入し、基質の活性化部位への進入が阻止されて触媒活性がなくなる。リン酸化チロシン残基を含有するリガンドとＮ－ＳＨ２ドメインの結合は当該ＳＨ２ドメインにおけるアロステリックスイッチの非活性化状態から活性化状態への変換につながる。このようなＳＨＰ２／ＳＨＰ１のＮ－ＳＨ２ドメインの配座の変化はＳＨ２ドメインとホスファターゼドメインの間の相互作用を阻害し、自身の抑制がなくなることで、基質の進入が許されるようになる。

本発明において、免疫細胞内におけるＳＨＰ２／ＳＨＰ１のＮ－ＳＨ２及びＣ－ＳＨ２ドメインとＩＴＩＭの結合の遮断を切口に、遺伝子工学及びポリペプチド固相合成技術を利用してそれぞれＩＴＩＭと結合可能なＳＨＰ２／ＳＨＰ１のＮ－ＳＨ２和Ｃ－ＳＨ２ドメインの融合タンパク質及び模擬ポリペプチドを設計・製造した。融合タンパク質及びポリペプチドが細胞に入るように、融合タンパク質のＮ末端及びポリペプチドのＣ末端に膜透過ペプチドＴＡＴを融合させた。ＨＩＶ１のトランス活性化タンパク質（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＡＴ）は、細胞の正常の構造と機能に影響せず、ポリペプチド及びタンパク質が効率的に快速に細胞内に導入することができる。融合タンパク質及びポリペプチドが細胞に入ると、Ｔ細胞内において正常に発現されるＳＨＰ２／ＳＨＰ１と競争して阻害受容体の細胞内領域におけるＩＴＩＭと結合し、免疫細胞内におけるＳＨＰ２／ＳＨＰ１が常に非活性化状態にあるようにさせることで、免疫阻害受容体の抑制作用がなくなるというのは、本発明で設計されるＩＴＩＭを標的とする汎用性免疫チェックポイント阻害剤の研究開発の構想である。

＜融合タンパク質＞
本明細書で用いられるように、「本発明のの融合タンパク質」、又は「ポリペプチド」とはいずれも本発明の第一の側面に記載の融合タンパク質のことである。

もう一つの好適な例において、前記融合タンパク質の構造はＺ１－Ｌ－Ｚ２ （Ｉ）又はＺ２－Ｌ－Ｚ１ （ＩＩ）で示され、式中において、ＢはＣＣＰタンパク質で、Ｌは無しか連結エレメントで、そしてＺ２はＳＨＰ２又はＳＨＰ１のＳＨ２ドメイン又はその活性断片である。

もう一つの好適な例において、前記融合タンパク質は配列番号４－８のいずれかで示されるアミノ配列を有する。

本明細書で用いられるように、用語「融合タンパク質」は、さらに、上記活性を有する融合タンパク質（配列番号４－８のいずれかで示される配列）の変異の様態を含む。これらの変異の様態は、１～３個（通常は１～２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換、ならびにＣ末端及び／又はＮ末端への１個又は複数（通常は３個以内、好ましくは２個以内、より好ましくは１個以内）のアミノ酸の付加又は欠失を含むが、これらに限定されない。例えば、本分野において、機能が近い、又は類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。また、例えば、Ｃ末端及び／又はＮ末端への一つ又は複数のアミノ酸の付加又は欠失も、通常、タンパク質の構造及び機能を変えることはない。また、前記用語は、単量体と多量体の様態の本発明のポリペプチドを含む。当該用語は、さらに、線形及び非線形のポリペプチド（例えば環状ペプチド）を含む。

本発明は、さらに、上記融合タンパク質の活性断片、誘導体及び類似体を含む。本明細書で用いられるように、用語「断片」、「誘導体」及び「類似体」とは、基本的に本発明の融合タンパク質の機能又は活性を維持するポリペプチドのことである。本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似体は、（ｉ）１個又は複数個の保存的又は非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、又は（ｉｉ）１個又は複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、又は（ｉｉｉ）抗原ペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコールようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）が融合したポリペプチドでもよく、又は（ｉｖ）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（リーダー配列、分泌配列又は６×Ｈｉｓなどのタグ配列と融合した融合タンパク質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体及び類似体は当業者に公知の範囲に入っている。

１種類の好適な活性誘導体とは、式Ｉ又は式ＩＩのアミノ酸配列と比べ、３個以下、好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下のアミノ酸が性質の類似又は近似のアミノ酸で置換されてなるポリペプチドである。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。

また、本発明は、本発明の融合タンパク質の類似体を提供する。これらの類似体と配列番号４－８のいずれかで示されるポリペプチドの違いは、アミノ酸配列の違いでもよく、配列に影響を与えない修飾形態の違いでもよく、あるいは両者でもよい。類似体は、さらに、天然Ｌ－アミノ酸と異なる残基（例えばＤ－アミノ酸）を有する類似体、及び非天然又は合成のアミノ酸（例えばβ、γ－アミノ酸）を有する類似体を含む。もちろん、本発明のポリペプチドは、上記で挙げられた代表的なポリペプチドに限定されない。

修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内又は体外のポリペプチドの化学的に誘導された形態、例えばアセチル化又はカルボキシ化を含む。修飾は、さらにグリコシル化、例えばポリペプチドの合成及び加工で又はさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行ったポリペプチドも含む。このような修飾は、ポリペプチドをグルコシル化する酵素（例えば哺乳動物のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（例えばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させたポリペプチド又は溶解性を改善したポリペプチドを含む。

＜発現ベクター及び宿主細胞＞
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のベクター又は本発明の融合タンパク質のコード配列を利用して遺伝子工学によって生成する宿主細胞、ならびに組み換え技術によって本発明に係るポリペプチドを生成する方法にも関する。

通常の組み換えＤＮＡ技術によって、本発明のポリヌクレオチド配列で組み換えの融合タンパク質を発現又は生産することができる。一般的に、以下の工程を含む：
（１）本発明の本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（又は変異体）を使用し、あるいはこのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換又は形質導入する。
（２）適切な培地において宿主細胞を培養する；
（３）培地又は細胞からタンパク質を分離し、精製する。

本発明において、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は組換え発現ベクターに挿入してもよい。用語「組み換え発現ベクター」とは、本分野でよく知られている細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物ウイルス、例えばアデノウイルス、レトロウイルス又はほかのベクターである。宿主体内で安定して複製することができれば、どんなプラスミド及びベクターでも使用できる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子及び翻訳制御エレメントを含むことである。

本発明の融合タンパク質のコードＤＮＡ配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築に当業者によく知られている方法を使用することができる。これらの方法は、体外組み換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、体内組み換え技術などを含む。前記のＤＮＡ配列は、有効に発現ベクターにおける適切なプロモーターに連結し、ｍＲＮＡ合成を指導することができる。これらのプロモーターの代表的な例として、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、λファージのＰＬプロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーターを含む真核プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲｓやほかの既知の制御可能な遺伝子の原核又は真核細胞あるいはそのウイルスにおける発現されるプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、さらに、翻訳開始用リボゾーム結合部位及び転写ターミネーターを含む。

また、発現ベクターは、好ましくは１つ又は２つ以上の選択性マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための形質、例えば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、あるいは大腸菌用のテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を提供する。

上記の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現するようにすることができる。

宿主細胞は、原核細胞（例えば大腸菌）、あるいは低等真核細胞、あるいは高等真核細胞、例えば、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞（ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む）でもよい。代表的な例として、大腸菌、小麦胚芽細胞、昆虫細胞、ＳＦ９、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、酵母細胞などがある。本発明の一つの好適な実施形態において、宿主細胞として酵母細胞（例えば、ピキア酵母、クルイウェロマイセス酵母、又はこれらの組み合わせで、好ましくは、前記の酵母細胞は、クルイウェロマイセス酵母を含み、より好ましくはクリュイベロミセス・マルシアヌス、及び／又はクルイベロミセス・ラクチスである）が選ばれる。

本発明のポリヌクレオチドが高等真核細胞において発現される場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入すると転写が強化される。エンハンサーは、ＤＮＡのシスエレメントで、通常、約１０～３００ｂｐで、プロモーターに作用して遺伝子の転写を強化する。例を挙げると、複製起点の後期側にある１００～２７０ｂｐのＳＶ４０エンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーなどを含む。

当業者は、どうやって適切なベクター、プロモーター、エンハンサー及び宿主細胞を選択するか、よくわかる。

宿主が原核細胞、例えば大腸菌である場合、ＤＮＡを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、ＣａＣｌ２法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する。必要により、形質転換はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのＤＮＡトランスフェクションの方法が用いられる。

得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでもよい。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（例えば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。

上記の方法における組み換えポリペプチドは細胞内又は細胞膜で発現し、あるいは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性及びほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、ならびにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。

＜ペプチドリンカー＞
本発明は、任意にペプチドリンカーを含有する融合タンパク質を提供する。タンパク質の活性はペプチドリンカーの大きさ及び複雑性によって影響される。通常、ペプチドリンカーは、連結する２つのタンパク質が空間的に機能の発揮に十分な自由度があるように、十分な長さとしなやかさを有する必要がある。同時に、融合タンパク質の安定性への影響を避けるために、ペプチドリンカーにαヘリックス又はβシートなどの形成がないようにする。

連結ペプチドの長さは、一般的に、０－１０アミノ酸、好ましく０－５アミノ酸である。

＜薬物組成物＞
さらに、本発明は薬物組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、安定剤及び／又は増稠剤を含有し、凍結乾燥粉末、錠剤、カプセル、シロップ、溶液又は懸濁液のような剤形として製造することができる。

「薬学的に許容される担体又は賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」とは、ヒトに適用でき、かつ十分な純度及び充分に低い毒性を持たなければならない、１つ又は複数の相溶性固体又は液体フィラー又はゲル物質をいう。「相溶性」とは、組成物における各成分が本発明の活性成分と、またその同士の間で配合することができ、活性成分の効果を顕著に低下させないことをいう。

組成物は液体でも固体でもよく、例えば粉末、ゲル又はペースト剤でもよい。好適に、組成物は液体、好ましくは注射可能な液体である。適切な賦形剤は当業者に既知のものである。

薬学的に許容される担体の例の一部として、セルロース及びその誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースナトリウム、セルロースアセテートなど）、ゼラチン、タルク、固体潤滑剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム）、硫酸カルシウム、植物油（例えば大豆油、ゴマ油、落花生油、オリーブオイルなど）、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなど）、乳化剤（例えばツイン（登録商標））、湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、着色剤、調味剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、発熱性物質除去蒸留水などがある。

組成物は、生理的に許容される無菌の水含有又は無水溶液、分散液、懸濁液や乳液、及び再溶解して無菌の注射可能な溶液又は分散液にするための無菌粉末を含んでもよい。適切な水含有又は非水性担体、希釈剤、溶媒又は賦形剤は、水、エタノール、多価アルコール及びその適切な混合物を含む。

通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質及び治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５～８程度、好ましくは６～８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。前記薬物組成物は、 （ａ） 腫瘍の治療又は予防、（ｂ） Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用の増強、（ｃ） 腫瘍の生長の抑制、（ｄ） Ｔ細胞のアポトーシスの抑制、（ｅ） Ｔ細胞のＩＬ－２を分泌するレベルの増加に使用される。（ａ） ＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用の増強、（ｂ） ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現レベルの増加、（ｃ） ＮＫ細胞のパーフォリン、グランザイムの分泌の増加、（ｄ） ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αの分泌の増加、（ａ） Ｍ細胞の貪食機能の増強、（ｂ） Ｍ細胞の腫瘍細胞に対する貪食殺傷作用の増強、（ｃ） Ｍ細胞のＮＯ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの分泌の増強。

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率及び部は重量百分率及び重量部である。

特に説明しない限り、本発明の実施例における試薬及び材料はいずれも市販品である。

＜実施例１：組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びその製造方法＞

本発明の組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質は、グリシン及びセリンでＴＡＴ膜透過ペプチドとＮ－ＳＨ２を連結したもので（ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２）、連結形態がＴＡＴ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ Ｎ－ＳＨ２で、アミノ酸配列が配列番号４で示される。

当該組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質のヌクレオチド配列は、ＢａｍＨＩ酵素切断部位でＴＡＴ膜透過ペプチドとＳＨＰ２のＮ末端のＳＨ２ドメインを連結したヌクレオチド配列で、５’末端にＮｄｅＩ酵素切断部位、３’末端に終止コドンＴＧＡ及びＳａｌＩ酵素切断部位が加わっており、連結形態がＮｄｅＩ酵素切断部位－ＴＡＴ遺伝子－ＢａｍＨＩ酵素切断部位－Ｎ－ＳＨ２遺伝子－ＴＧＡ－ＳａｌＩ酵素切断部位で、ヌクレオチド配列が配列番号９で示される。

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質のヌクレオチドは発現ベクター又は組み換えプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２において構築され、前記のｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２はＮｄｅＩ酵素切断部位及びＳａｌＩ酵素切断部位でプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）と請求項３に記載の組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質のヌクレオチドを二重酵素切断して連結する。

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の製造方法は以下の工程によって行われる。

１．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の遺伝子の発現ベクター又は組み換えプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２の構築

１）ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２の設計と合成
大腸菌に好適なコドンで、ＴＡＴ及びＮ－ＳＨ２のアミノ酸配列を遺伝子配列に変換し、ＢａｍＨＩ酵素切断部位でＴＡＴとＮ－ＳＨ２の遺伝子配列を連結し、さらに５’末端にＮｄｅＩ酵素切断部位、３’末端に終止コドンＴＧＡ及びＳａｌＩ酵素切断部位を加え、ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２遺伝子を合成したが、そのヌクレオチド配列は以下に示される。

上記TAT-N-SH2遺伝子の合成を他社に依頼した。

２）発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２の同定
組み換えプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２でＢＬ２１感受性細胞を形質転換させ、３７℃のインキュベーターで１２ｈ培養した後、単一クローンの集落を選んで１００ ｍｇ／Ｌアンピシリン含有ＬＢ培養液に接種し、シェーカーにおいて３７℃で培養した後、菌を回収してプラスミドを抽出し、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで二重酵素切断を行い、アガロースゲル電気泳動によって同定したところ、予想された大きさ３４２ｂｐの挿入断片を得たが（図１）、ＤＮＡシークエンシング結果（図２）から、合成された配列と合致し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２組み換えプラスミドの構築に成功したことが示された。

Ｎｄｅ Ｉ及びＳａｌ Ｉ酵素で得られた組み換えプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２に対して二重酵素切断を行った後、アガロースゲル電気泳動を行ったが、赤色の矢印は目的断片である。

２．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の発現

組み換えプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２で大腸菌ＢＬ２１の感受性細胞を形質転換させ、３７℃のインキュベーターで１２ｈ培養した後、周縁が揃い、生長状態が良好な集落を選び、１００ ｍｇ／Ｌアンピシリン含有ＬＢ培養液に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。翌日に、１：１００の比率で新鮮な１００ ｍｇ／Ｌアンピシリン含有ＬＢ培養液に接種し、３７℃で続いて細菌の密度がＯＤ６００ ＝ ０．４～０．６になるまで培養し、０．０１～０．１ ｍＭ ＩＰＴＧを入れて４ ｈ誘導した後、１２０００ ｒｐｍで２０ ｍｉｎ延伸して菌を回収し、－２０℃で保存した。

３．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の精製

１）菌液を秤量し、１：７の比率でｐＨ ６．５のＰＢ分解緩衝液を入れ、４℃の冷蔵庫で溶解するまで均一に撹拌した。出力３００ Ｗ、稼働時間５ ｓ、間隔時間１０ ｓで、氷浴において超音波で２０ ｍｉｎ処理した。４℃、１２０００ ｒｐｍで２０ ｍｉｎ遠心し、上清を収集した。

２）２５ ｍＬの菌分解上清を事前に用意された透析バッグに取り、３０倍体積の平衡Ａ液（２０ ｍＭ ｐＨ ６．５，ＰＢ）を外液とし、４℃で撹拌して一晩透析し、４℃、１２０００ ｒｐｍで２０ ｍｉｎ遠心し、上清を収集して０．２２ μｍのろ膜を通させ、体積を記録した。事前に用意された２５ ｍＬＳＰ－陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを取り、平衡Ａ液でカラムをベースラインが安定するまで平衡化し、ゼロを校正し、１ ｍＬ／ｍｉｎの流速で仕込み、通過ピークを収集し、ベースラインが安定するとピークの収集を停止した。流速１．５ ｍＬ／ｍｉｎで、平衡Ａ液及び溶離Ｂ液（２０ ｍＭ ｐＨ（５．４，６．５，７．４）ＰＢ，１ Ｍ ＮａＣｌ）で０～１００％の線形溶離を行い、そして溶離ピーク４を収集した。３０倍体積のＰＢＳで目的タンパク質の溶離ピークに対して透析を行った。透析後、０．２２ μｍろ膜でろ過して菌を除去し、目的タンパク質であるＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質を得た。

４．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の誘導発現及び精製結果の同定

１）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって目的タンパク質の発現量を分析し（図３に示す）、未誘導群と比較し、誘導群ではいずれも特異的なタンパク質のバンドがあり、大きさが理論分子量（１２．８７０ ＫＤ）に合致する。

超音波で菌を分解させた後、それぞれ上清及び沈殿を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって目的タンパク質が上清で発現されるか検出した結果、図４に示すように、菌分解上清及び菌分解沈殿のいずれにも目的タンパク質があったが、菌分解上清と比べ、菌分解沈殿の量がわずかで、無視できる程度であった。そのため、後の実験において、いずれも菌分解上清を原料として精密に分離した。

菌分解・粗抽出を経た分解上清は、透析、遠心した後、さらにＳＰ－陽イオン交換クロマトグラフィーカラムによって分離し、異なる検出波長においてピーク液を収集し、最後に２１５ｎｍの波長においてしか目的タンパク質が検出されず、全部で１つの通過ピーク及び４つの溶離ピークが得られ、それぞれ通過ピーク、ＳＰピーク１、ＳＰピーク２、ＳＰピーク３、ＳＰピーク４であった（図５に示す）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって各ピークを分析したところ、目的タンパク質が存在するピークがＳＰ４であった（図６に示す）。

５．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の特異性及び純度の同定

ウェスタンブロットによって目的タンパク質を定性的に検出したところ、ウサギ抗ヒトＳＨＰ２ポリクローナル抗体は特異的に目的タンパク質と結合することができたことが見出され（図７に示す）、精製で得られたのは目的タンパク質であることが証明された。

精製で得られた融合タンパク質をＨＰＬＣによって検出したが、２０ μＬのサンプルを取って仕込み、稼働時間２０ ｍｉｎ、流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２８０ ｎｍで、主ピークの面積からサンプルの純度を判定した。結果から、当該融合タンパク質の純度は９５．９２％であった（図８）。

＜実施例２：４種のＴＡＴ膜透過ペプチドとＳＨＰ２のＣ末端ＳＨ２ドメインのＩＴＩＭモチーフ結合領域の融合ポリペプチド＞

１．ＴＡＴ膜透過ペプチドとＳＨＰ２のＣ末端ＳＨ２ドメインのＩＴＩＭモチーフ結合領域の融合ポリペプチドであって、２つのプロリンでＴＡＴ膜透過ペプチドとＣ－ＳＨ２のＩＴＩＭモチーフ結合領域を連結したもので（ＴＡＴ－Ｃ－ＳＨ２）、連結形態がＴＡＴ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｃ－ＳＨ２で、アミノ酸配列が以下の通りであることを特徴とするもの。
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ－ＰＰ－ＶＲＥＳＱＳＨＰＧＤＦＶＬ （配列番号５）

全部Ｌ型アミノ酸を使用し、上記ＴＡＴ－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド（Ｌ１と名付けた）の合成を他社に依頼した。ポリペプチドＬ１の配列を参照とし、それぞれＬ１のリバース配列、Ｄ型アミノ酸を使用したＬ１配列、Ｄ型アミノ酸を使用したＬ１リバース配列を合成し、それぞれＬ２、Ｄ１、Ｄ２と名付けた。そのアミノ酸配列は以下の通りである。

１）リバースＬ型ポリペプチド（Ｌ２）： ＬＶＦＤＧＰＨＳＱＳＥＲＶＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＹ （配列番号６）
２）Ｄ型ポリペプチド（Ｄ１）：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＶＲＥＳＱＳＨＰＧＤＦＶＬ （配列番号７）
３）リバースＤ型ポリペプチド（Ｄ１）：ＬＶＦＤＧＰＨＳＱＳＥＲＶＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧＹ （配列番号８）
全部化学合成で他社に依頼した。

２．ポリペプチドの同定
ＨＰＬＣによって合成されたポリペプチドの純度を分析したが、２０μＬのサンプルを取って仕込み、稼働時間２０ ｍｉｎ、流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍ、主ピークの面積からサンプルの純度を判定した。結果から、Ｌ１ポリペプチドの純度は９６．７４％（図９Ａ）、Ｌ２ポリペプチドの純度は９８．１％（図９Ｂ）、Ｄ１ポリペプチドの純度は９９．２７％（図９Ｃ）、Ｄ２ポリペプチドの純度は９６．６６％（図９Ｄ）であった。

質量分析によって合成されたポリペプチドの分子量を検出した。結果から、Ｌ１ポリペプチドの分子量は３２０６（図１０Ａ）、Ｌ２ポリペプチドの分子量は３２０６．６７（図１０Ｂ）、Ｄ１ポリペプチドの分子量は３２０６．６３（図１０Ｃ）、Ｄ２ポリペプチドの分子量は３２０６．７９（図１０Ｄ）で、理論分子量に一致した。

結果から、ポリペプチドの合成に成功し、さらなる体内外実験の研究に使用できることが示された。

＜実施例３：膜透過ペプチドＴＡＴの組み換え融合タンパク質及びポリペプチドのＴ細胞への進入に対する協力＞

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びポリペプチドのＴ細胞内への進入はその細胞膜における阻害受容体の細胞内領域のＩＴＩＭと結合して作用を発揮する前提条件である。膜透過ペプチドＴＡＴは正電荷を帯びた短鎖ペプチドで、多くの物質の膜透過及びその生物学的機能の発揮を協力することができる。ＴＡＴ膜透過配列を含む融合タンパク質及びポリペプチドがＴ細胞に進入できるか検出するため、ＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質、Ｌ１ポリペプチド及び対照ペプチドに対してＦＩＴＣ標識を行い、共焦点顕微鏡でＴ細胞への進入の様子を観察し、作用時間は０、０．５、４、２４、７２、９６、１２０及び１４４ ｈであった（図１１）。結果、ＴＡＴ膜透過配列を持つ融合タンパク質が２４ ｈで多くＴ細胞に入り、１２０ ｈで段々減少していったことがわかる（図１１ｃ）。一方、ＴＡＴ膜透過配列を持つＬ１ポリペプチドが０．５ ｈで既に多くＴ細胞に入り、７２ ｈで段々減少していったことがわかる（図１１ｂ）。ＴＡＴ膜透過配列のない対照ペプチドはＴ細胞に入ることができなかったことがわかる（図１１ａ）。この結果から、ＴＡＴ膜透過配列は融合タンパク質及びポリペプチドの目的細胞への進入を協力することができることが示され、そしてポリペプチドと融合タンパク質はＴ細胞に入る時間が異なり、これは分子量の大きさに関連する可能性がある。

＜実施例４：組み換え融合タンパク質及びポリペプチドのＴ細胞の機能に対する影響＞

１．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＴ細胞の増殖に対する影響

組み換えＴＡＴ－ Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２ －Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドがＴ細胞の増殖を向上させるか検出するため、それぞれ使用量が８０ μｇ／ｍＬのＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドでＴ細胞を３ ｄ刺激した後、ＣＦＳＥによって細胞の増殖を検出した結果、対照群のＴ細胞の増殖率は６２．８３％（図１２ａ）、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質群のＴ細胞の増殖率は６１．０５％（図１２ｂ）、Ｌ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチド群のＴ細胞の増殖率は６０．３３％（図１２ｃ）であった。統計結果から、対照群と比較し、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドでは、明らかにＴ細胞の増殖を向上させなかったことが示され（図１２ｄ）、当該結果から、組み換えＴＡＴ－ Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドがＴ細胞の増殖に影響しないことがわかる。

２．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＴ細胞のアポトーシスに対する影響

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドで３ ｄ刺激した後のＴ細胞は、フローサイトメトリーによって各処理群のＴ細胞のアポトーシスの状況を検出した。図１３のａ－ｄはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣによるポリペプチドのＴ細胞のアポトーシスに対する影響の検出を示すが、細胞を再懸濁させて各群に応じて未投与群はＳＨＰ２－ＮＣを、ほかはＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２（８０ μｇ／ｍＬ）、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド（８０ μｇ／ｍＬ）を入れて処理した後、続いてＥＡＳＹ－Ｔで刺激された培養プレートにおいて（細胞混合液を入れる３ ｈ前に５０ｎｇ ＰＤ－Ｌ１抗体を入れて３７℃で２４ウェルプレートをコーティングした）３ ｄ培養し、細胞を収集し、ＦＩＴＣとＰＩで染色した後、フローサイトメーターによって検出した。図１３ｅでは、フローサイトメトリーによる検出結果から、アポトーシス細胞の比率を統計し、対照群と比較し、＊ｐ＜０．０５又は＊＊ｐ＜０．０１である。上記のように、対照群と比較し、組み換えＴＡＴ－ Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドの処理群では、Ｔ細胞のアポトーシスが明らかに低下した。

３．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＴ細胞を介する下流シグナル分子のリン酸化レベルに対する影響

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドで３ ｄ刺激した後のＴ細胞を収集してＥＲＫ、ＡＫＴ及びＪＮＫ分子のリン酸化レベルの変化を検出した結果、未投与群と比較し、ＥＲＫ、ＡＫＴ及びＪＮＫの発現レベルに明らかな変化がなかったが、ＴＡＴ－ＳＨＰ２ －Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質刺激群では、ｐ－ＥＲＫ及びｐ－ＡＫＴの発現レベルの変化が最も明らかで、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド刺激群では、ｐ－ＡＫＴの発現レベルの変化が最も明らかであったことがわかる（図１４ ａ－ｄ）。

４．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＴ細胞が分泌するサイトカインＩＬ－２に対する影響

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドで３ ｄ刺激した後のＴ細胞を収集してそのサイトカインＩＬ－２を分泌するレベルを検出した結果、対照群と比較し、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨポリペプチドで刺激したＴ細胞が分泌するＩＬ－２レベルが顕著に向上したことがわかる（図１５）。

＜実施例５：組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドの腫瘍細胞に対する直接殺傷能力の研究＞

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドが腫瘍細胞に対して直接殺傷作用があるか検出するため、異なる濃度（２０ μｇ／ｍＬ、４０ μｇ／ｍＬ、８０ μｇ／ｍＬ）の組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドを腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＳＷ４８０とともに培養した後、ｚｅｎＣｅｌｌ ｏｗｌ生細胞動的イメージング分析システムによってリアルタイムで腫瘍細胞に対する影響を観察した。実験結果から、未投与群と比較し、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドは腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＳＷ４８０に直接毒性作用がなかったことがわかるが、当該結果から、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドはＴ細胞に作用することによって腫瘍細胞を殺傷する作用を発揮することが示された（図１６）。

＜実施例６：組み換え融合タンパク質及びポリペプチドの体外におけるＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷能力への増強の研究＞

１．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質のＴ細胞の乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び結腸癌細胞ＳＷ４８０を殺傷する作用に対する影響

３つのタンパク質濃度（２０ μｇ／ｍＬ、４０ μｇ／ｍＬ、８０ μｇ／ｍＬ）のＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質を選んでヒトＴ細胞を刺激し、そしてＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性法によって３０：１のエフェクター細胞対標的細胞比でそれぞれ腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＳＷ４８０に対する殺傷作用を検出した。実験結果から、標的細胞が乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１である場合、４０ μｇ／ｍＬ及び８０ μｇ／ｍＬの濃度のＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質群では、いずれも殺傷が対照群よりも顕著に高かったことがわかる（ｐ＝０．０３７９とｐ＝０．０３６７）。標的細胞が結腸癌細胞株ＳＷ４８０である場合、３つの濃度のタンパク質群では、いずれも未投与群よりも明らかに高かったことがわかる（図１７、表１）。ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質はＴ細胞の腫瘍細胞を殺傷する作用を向上させることができ、そして結腸癌に対する殺傷効果が乳癌細胞よりも良いことが示された。

２．Ｌ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＴ細胞の乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び結腸癌細胞ＳＷ４８０を殺傷する作用に対する影響

ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性法によってＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２（２０ μｇ／ｍＬ、４０ μｇ／ｍＬ、８０ μｇ／ｍＬ）でヒトＴ細胞を４ ｄ刺激した後のそれぞれ腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＳＷ４８０に対する殺傷作用を検出した。エフェクター細胞対標的細胞比が３０：１でかつＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドの濃度がそれぞれ４０ μｇ／ｍＬ及び８０ μｇ／ｍＬである場合、対照群と比較し、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドで刺激されたＴ細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＳＷ４８０を殺傷する能力が顕著に向上した（図１８、表２）。

３．Ｌ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドのＴ細胞の肺癌細胞Ｈ４６０を殺傷する作用に対する影響

ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性法によってＬ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチド（４０ μｇ／ｍＬ）でヒトＴ細胞を４ ｄ刺激した後のそれぞれ肺癌細胞Ｈ４６０に対する殺傷作用を検出したところ、エフェクター細胞対標的細胞比が２０：１である場合、未投与群及び対照ペプチドと比較し、Ｌ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドで刺激されたＴ細胞は肺癌細胞Ｈ４６０を殺傷する能力が顕著に向上し、かつＤ２ポリペプチドは効果が最も強かった（図１９、表３）。

＜実施例７：組み換え融合タンパク質及びポリペプチドの体内における抗腫瘍作用の研究＞

１．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質のマウス結腸癌に対する効果の検出

ＭＣ３８結腸癌マウス皮下移植腫瘍モデルを構築し、５０ μｇ／匹のαＰＤ－１抗体投与量を陽性対照薬物とし、濃度が１．２５ μｇ／匹（Ｎ１．２５）、２．５ μｇ／匹（Ｎ２．５）、５ μｇ／匹（Ｎ５）及び１０ μｇ／匹（Ｎ１０）のＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質を腹腔注射によって投与した。８回投与した後、腫瘍担持マウスを解剖して腫瘍重量を秤量したところ、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質では、腫瘍重量が明らかに対照群よりも低く、そしてＮ５群は腫瘍重量がαＰＤ－１抗体群よりも低く（図２０，ａ－ｂ）、Ｎ５群の腫瘍抑制率が最もたく（表４）、８０．９％に達したが、当該結果から、５ μｇ／匹のＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の投与量は結腸癌腫瘍を抑制する効果が最も良いことが示された。

２．Ｌ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのマウス結腸癌に対する腫瘍抑制効果の検出

構築されたＭＣ３８結腸癌マウス皮下腫瘍担持モデルによってＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドのマウスの腫瘍生長に対する影響を評価したが、それぞれ１．２５ μｇ／匹（Ｃ１．２５）、２．５ μｇ／匹（Ｃ２．５）、５ μｇ／匹（Ｃ５）及び１０ μｇ／匹（Ｃ１０）でＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドを腹腔注射によって投与し、同時に５０ μｇ／匹のαＰＤ－１抗体（αＰＤ－１）投与量を陽性対照薬物とし、そしてＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２（５ μｇ／匹）群及び併用群（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＴＡＴ－ＳＨＰ２Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドは５ μｇ／匹ずつ）加え、対照群と比較し、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド群、αＰＤ－１抗体群、ＴＡＴ－ＳＨＰ２ －Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質群及び併用群では、腫瘍重量が明らかに低下したことが見出された。また、併用群では、腫瘍抑制効果が最も良く、次はＮ５群で、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドは投与量が５ μｇ／匹の場合、腫瘍の生長が最も遅かった（図２１，ａ－ｂ）。併用群では、腫瘍抑制率が最も良く、次はＮ５群であったが（表５）、当該結果から、各投与量群では、いずれもマウスの腫瘍生長に抑制作用があり、そのうち、併用群では効果が最も良かったことがわかる。

３．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのマウスの乳癌に対する腫瘍抑制効果の検出

さらに構築されたＥＭＴ乳癌マウス皮下腫瘍担持モデルによってＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドのマウスの腫瘍生長に対する影響を評価したが、それぞれ５ μｇ／匹（Ｃ５）、１０ μｇ／匹（Ｃ１０）、１５ μｇ／匹（Ｃ１５）のＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド及び２ μｇ／匹（Ｎ２）、５ μｇ／匹（Ｎ５）、１０ μｇ／匹（Ｎ１０）、１５ μｇ／匹（Ｎ１５）のＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質で腹腔注射によって投与し、同時に５０ μｇ／匹のαＰＤ－１抗体（αＰＤ－１）の投与量を陽性対照薬物とし、結果から、ＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド群、αＰＤ－１抗体群、ＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質群の各治療群では、腫瘍体積が明らかに対照群よりも小さかったがわかる。ＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質（５ μｇ／匹）及びＴＡＴ－ＳＨＰ２ＳＨＰ２又はＳＨＰ１－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド（５ μｇ／匹）群では、腫瘍重量が最も低く、腫瘍抑制率が最も良かったことがわかる（図２２，ａ－ｂ、表６）。当該結果から、各投与量群では、いずれもマウスの腫瘍生長に抑制作用を示し、そのうち、融合タンパク質及びポリペプチドはいずれも５μｇ／匹の場合、効果が最も良く、結腸癌の腫瘍抑制効果と一致したことがわかる。

４．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのヌードマウスの移植腫瘍に対する腫瘍抑制作用

１）組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＭＣ３８結腸癌ヌードマウスに対する腫瘍抑制作用

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドの腫瘍に対する直接抑制作用を排除するため、免疫不全のヌードマウスを選んでＭＣ３８結腸癌腫瘍を接種し、１４ ｄで腫瘍が形成した後、投与を開始し、４ ｄで腫瘍体積を１回測量し、３０ ｄ後、マウスを殺処分して解剖し、腫瘍重量を測量したところ、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドでは、マウスの腫瘍体積及び腫瘍重量、腫瘍抑制率が対照群と統計学的に有意差がなかったが（図２３，ａ－ｃ、表７）、当該結果から、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドは結腸癌に直接抑制作用がないことが示された。

２）組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＥＭＴ－６乳癌ヌードマウスに対する腫瘍抑制作用

同時に免疫不全のヌードマウスを選んでＥＭＴ－６乳癌腫瘍を接種し、５ ｄで腫瘍が形成した後、ランダムに３群に６匹ずつ分け、投与を開始し、投与量が上記と同様で、１日おきに１回投与し、計８回投与し、４ ｄで腫瘍体積を測量し、生長曲線を作成し、２１ ｄでマウスを殺処分して体重を測量したところ、対照群と比較し、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチド処理群では、腫瘍体積及び腫瘍重量、腫瘍抑制率に明らかな差がなかったことがわかるが、当該結果から、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドは直接腫瘍細胞を抑制することができないが、免疫細胞を介して乳癌の腫瘍生長を抑制する効果を発揮することが示された（図２４，ａ－ｃ、表８）。

５．組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドのＰＤ－Ｌ１ノックアウトマウスの乳癌移植腫瘍に対する腫瘍抑制効果の検出

組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１（ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２）ポリペプチドは阻害受容体のＩＴＩＭモチーフに対するものであるため、単にＰＤ－１という阻害受容体を遮断するＰＤ－１モノクローナル抗体よりも治療範囲が広く、理論上、ＰＤ－１抗体の治療が効かない腫瘍を治療することができる。そのため、ＰＤ－Ｌ１安定ノックアウト乳癌ＥＭＴ－６細胞系（ＰＤ－Ｌ１－ＫＯ－ＥＭＴ６）を構築し、マウスの乳腺の脂肪パッドの下に接種し、それぞれ５ μｇ／匹の組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質（Ｎ５）及びＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド（Ｃ５）を腹腔注射によって投与し、同時に５０ μｇ／匹のαＰＤ－１抗体（αＰＤ－１）の投与量を対照薬物とした。結果から、Ｎ５、Ｃ５はいずれも顕著にＰＤ－Ｌ１－ＫＯ－ＥＭＴ６腫瘍の生長を抑制することができるが、ＰＤ－１抗体による治療は効かなかったことがわかる（図２５，ａ－ｃ、表９）。

６．Ｌ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドのマウスの肺癌に対する腫瘍抑制効果の検出

さらに構築されたマウスＬｅｗｉｓ肺癌移植腫瘍モデルによってＬ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドのマウスの腫瘍生長に対する影響を評価したが、それぞれ５ μｇ／匹のＬ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドを腹腔注射によって投与し、同時に５μｇ／匹の対照ペプチド（Ｒペプチド）の投与量を陰性対照薬物とし、生理食塩水をブランク対照群（ＮＣ）とし、１日置きに１回投与した。計８回投与した。結果から、Ｌ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドはいずれも顕著に腫瘍の生長を抑制することができ、Ｄ２群では腫瘍抑制効果が最も良く、腫瘍抑制率が最も高かったことがわかるが（Ｐ＜０．００１）、体外殺傷実験結果と一致した（図２６，ａ－ｃ、表１０）。

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

図１は、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２の二重酵素切断による同定結果を示す。 図２は、組み換えプラスミドｐＥＴ－２２ｂ（＋）ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２のシーケンシング結果を示す。 図３は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出された目的タンパク質の発現状況を示す。１はマーカーを、２は未誘導を、３はＩＰＴＧ誘導１を、４はＩＰＴＧ誘導２を、赤色矢印は目的タンパク質を指す。 図４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出された目的タンパク質の発現状況を示す。注：１は未誘導、２は誘導、３は菌分解上清、４は分解沈殿である。 図５は、陽イオン交換クロマトグラフィーによる目的タンパク質と不純物タンパク質の分離を示す。注：ＳＰ１－ＳＰ４は溶離ピークで、そのうち、ＳＰ４は目的タンパク質が存在するピークである。 図６は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２の精製効果を示す。注：１は通過、２はＳＰ１、３はＳＰ２、４はＳＰ３、５はＳＰ４（目的タンパク質ピーク）である。 図７は、ウェスタンブロットによるＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２の目的タンパク質の同定を示す。１はＩＰＴＧで誘導されていない組み換え菌、２は１ ｍＭ ＩＰＴＧで誘導された組み換え菌である。 図８は、融合タンパク質のＨＰＬＣ精製クロマトグラフィーによる分析結果を示す。 図９は、ポリペプチドのＨＰＬＣ精製クロマトグラフィーによる分析結果を示す。ＡはＬ１ポリペプチド、ＢはＬ２ポリペプチド、ＣはＤ１ポリペプチド、ＤはＤ２ポリペプチドである。 図１０は、質量分析によって検出されたポリペプチドの分子量を示す。ＡはＬ１ポリペプチド、ＢはＬ２ポリペプチド、ＣはＤ１ポリペプチド、ＤはＤ２ポリペプチドである。 図１１は、レーザー共焦点によって検出された融合タンパク質とポリペプチドのＴ細胞における局在化を示す。ａ． 共焦点顕微鏡において観察されたＴＡＴ膜透過配列を持たない対照ペプチド（２０ μｇ／ｍＬ）の細胞へ入る能力；ｂ． ＴＡＴ配列を持つＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２；ｃ． ＴＡＴ配列を持つＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２；作用時間は０、０．５、４、２４、７２、９６、１２０及び１４４ ｈ（２５ μｍ（×６０））である。 図１２は、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドのＴ細胞の増殖に対する影響を示す。ａ－ｃ ＣＦＳＥ法による各処理群のＴ細胞の増殖に対する影響の検出である。ｄ フローサイトメトリーによる検出結果から、Ｔ細胞の増殖の比率を統計し、対照群と比較し、ｐ＞０．０５は統計学的に有意ではない。 図１３は、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドのＴ細胞のアポトーシスに対する影響を示す。ａ－ｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣによるポリペプチドのＴ細胞のアポトーシスに対する影響の検出で、細胞を再懸濁させて各群に応じて未投与群はＳＨＰ２ －ＮＣを、ほかはＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２（８０μｇ／ｍＬ）、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド（８０μｇ／ｍＬ）を入れて処理した後、続いてＥＡＳＹ－Ｔで刺激された培養プレートにおいて（細胞混合液を入れる３ｈ前に５０ｎｇ ＰＤ－Ｌ１抗体を入れて３７℃で２４ウェルプレートをコーティングした）３ ｄ培養し、細胞を収集し、ＦＩＴＣとＰＩで染色した後、フローサイトメーターによって検出した；ｅ フローサイトメトリーによる検出結果から、アポトーシス細胞の比率を統計し、対照群と比較し、＊ｐ＜０．０５又は＊＊ｐ＜０．０１である。 図１４は、融合タンパク質及びポリペプチドのＴ細胞を介する下流シングル分子のリン酸化レベルに対する影響を示す。ａ． ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質処理群；ｃ． ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチド処理群；ｂ、ｄ． ウェスタンブロットによる結果から、β－アクチンを内部参照とし、Ｔ細胞を介するＪＮＫ、ＡＫＴ、ＥＲＫタンパク質のリン酸化発現のグレースケール分析を行った。対応のないｔ検定で、陰性対照と比較し、＊＊ｐ＜０．０１で、ＮＳは統計学的に有意差がない。 図１５は、Ｔ細胞が分泌するサイトカインＩＬ－２の検出を示す。対応のないｔ検定で、対照と比較し、＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 図１６は、腫瘍を直接殺傷する作用の検出の結果を示す。 図１７は、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質で刺激されたＴ細胞の異なる腫瘍細胞株に対する殺傷作用を示す。未投与群と比較し、＊ｐ＜０．０５又は＊＊ｐ＜０．０１又は＊＊＊ｐ＜０．００１で、ｐ＞０．０５は統計学的に有意ではない。 図１８は、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドで刺激されたＴ細胞の異なる腫瘍細胞株に対する殺傷作用を示す。未投与群と比較し、＊ｐ＜０．０５又は＊＊ｐ＜０．０１又は＊＊＊ｐ＜０．００１で、ｐ＞０．０５は統計学的に有意ではない。 図１９は、Ｌ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドで刺激されたＴ細胞の肺癌細胞Ｈ４６０に対する殺傷作用を示す。対照群と比較し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、 ＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。Ｄ２群と比較し、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１である。 図２０は、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質の結腸癌腫瘍担持マウスに対する腫瘍抑制作用を示す。ａ． ３０ ｄの解剖後の異なる投与量の投与群のマウスの腫瘍重量；ｂ． 腫瘍の大きさ； 対応のないｔ検定で、対照群と比較し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 図２１は、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドの結腸癌腫瘍担持マウスに対する腫瘍抑制作用を示す。ａ． ３０ ｄの解剖後の異なる投与量の投与群のマウスの腫瘍重量；ｂ． 腫瘍の大きさ； 対応のないｔ検定で、対照群と比較し、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 図２２は、ＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＴＡＴ－ＳＨＰ２－Ｃ－ＳＨ２ポリペプチドの乳癌腫瘍担持マウスに対する腫瘍抑制作用を示す。ａ． ２１ ｄの解剖後の異なる投与群のマウスの腫瘍重量；ｂ． 腫瘍の大きさ； 対応のないｔ検定で、対照群と比較し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。 図２３は、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドの結腸癌ヌードマウスに対する腫瘍抑制作用を示す。ａ． ３０ ｄの解剖後のマウスの腫瘍重量；ｂ． 腫瘍の大きさ； ｃ． 腫瘍生長曲線；対応のないｔ検定で、対照群と比較し、ＮＳ：統計学的に有意差がない。 図２４は、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドのヌードマウスの乳癌に対する腫瘍抑制作用を示す。ａ． ２１ ｄの解剖後のマウスの腫瘍重量；ｂ． 腫瘍の大きさ； ｃ． 腫瘍生長曲線；ＮＳ：統計学的に有意差がない。 図２５は、組み換えＴＡＴ－Ｎ－ＳＨ２融合タンパク質及びＬ１ポリペプチドのＰＤ－Ｌ１がノックアウトされた乳癌腫瘍担持マウスに対する腫瘍抑制作用を示す。ａ． ２３ ｄの解剖後のマウスの腫瘍重量；ｂ． 腫瘍の大きさ； ｃ． 腫瘍生長曲線；対応のないｔ検定で、対照群と比較し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。 図２６は、Ｌ１、Ｌ２、Ｄ１、Ｄ２ポリペプチドのマウスの肺癌に対する腫瘍抑制効果の検出を示す。ａ． ２１ ｄの解剖後のマウスの腫瘍重量；ｂ． 腫瘍の大きさ； ｃ． 腫瘍生長曲線；対応のないｔ検定で、対照群と比較し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。

Claims (10)

1. Ｎ末端からＣ末端の式Ｉ又はＩＩで表される構造を有することを特徴とする融合タンパク質。
   

   

   

   （式中において、Ｚ１はＣＰＰエレメントである。Ｌはなしか、連結エレメントである。Ｚ２はＳＨＰ２及び／又はＳＨＰ１のＳＨ２ドメイン又はその活性断片である。「－」は上記エレメントを連結するペプチド結合又はペプチドリンカーを表す。）
2. 前記Ｚ１、Ｚ２は頭－頭、頭－尾、尾－頭、又は尾－尾の様態で連結していることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記Ｚ１、Ｚ２はＤ型又はＬ型アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 単離されたポリヌクレオチドであって、請求項１に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
5. 請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
6. 請求項５に記載のベクターを含有するか、あるいはゲノムに請求項４に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
7. 請求項１に記載の融合タンパク質を生成する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
   発現に適切な条件において、請求項６に記載の宿主細胞を培養することにより、融合タンパク質を発現させる工程；及び／又は前記融合タンパク質を単離する工程。
8. 請求項１に記載の融合タンパク質及びその薬物学的に許容される担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
9. 請求項１に記載の融合タンパク質、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、請求項６に記載の宿主細胞の使用であって、腫瘍を治療又は予防するための組成物又は製剤の製造に使用されることを特徴とする使用。
10. 体外で非治療的に腫瘍の生長を抑制する方法であって、請求項１に記載の融合タンパク質の存在下において、腫瘍細胞を培養することにより、腫瘍の生長を抑制する工程を含むことを特徴とする方法。

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