CN101712964B - 抑制破骨细胞形成的融合蛋白、其制备方法及药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的编码基因、所述基因编码的抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG(SEQ ID NO：2)及其制备方法，并提供所述方法中涉及的合成引物、质粒和宿主细胞，及包含所述融合蛋白RIG的药物组合物。本发明的融合蛋白RIG组成成份全部来源于人源性免疫球蛋白和RANKL，因此没有任何异体蛋白的免疫源性。该融合蛋白的C区可灵活转动，可将RANKL和Fc_γ1交联在一起，诱发细胞内的抑制信号，抑制破骨细胞的形成。本发明提供的融合蛋白RIG能够在骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收疾病的治疗中发挥重要作用。

Description

抑制破骨细胞形成的融合蛋白、其制备方法及药物组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白制备的生物技术，更具体地涉及用于治疗骨质疏松症和肿瘤引起的骨吸收的融合蛋白及其药物组合物。

背景技术

骨形成和骨吸收是正常骨新陈代谢过程中密切相关的两个过程。骨质疏松症患者因破骨细胞活性增加，骨吸收率超过骨形成率，导致骨质疾病，其中并无骨矿物质缺陷。骨骼也是通常的肿瘤转移侵袭部位，多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌都常转移至骨骼。肿瘤细胞和成骨细胞相互作用，从而刺激骨髓内前体细胞分化成破骨细胞，因此，骨骼内肿瘤转移部位常见破骨细胞数量增加，破骨细胞性的骨吸收也相应地增加。总体上，破骨细胞(Osteoclast)的过多形成是造成骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收(Bone resorption)的主要原因。人体破骨细胞来自于分化的单核细胞(Monocyte)/巨噬细胞(Macrophage)。骨质疏松容易导致骨折，根据中国2000年第五次人口普查骨质疏松症的结果及预测，中国60岁以上的老人在2050年将达到4.1亿，占中国总人口的27.4％。随着老年人口的迅速增加，骨质疏松易患人群也迅速增加。美国有2,800万骨质疏松病人，其中150万人因为骨质疏松而发生骨折(70万人脊椎骨折，25万人胯骨骨折)。世界卫生组织将2000年至2010年列为“骨与关节疾病十年”。根据世界卫生组织资料，近年来全世界因为骨质疏松而引起的骨折增加了4倍，肿瘤转移致使破骨细胞活跃而引起的溶骨病变也不断增加。美国有50万病人因肿瘤转移引起骨吸收而造成骨折，最常见的是多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等引起的骨破坏。不管是妇女停经后引起的绝经期骨质疏松，还是肿瘤转移引起的骨吸收，原因都是人体内的破骨细胞过多而形成骨质疏松。为了解决骨质疏松的病理状况，全世界生物医学界都在寻找一种有效的方法去抑制破骨细胞形成和其活性。美国辉瑞(Pfizer Inc.)正在申求美国食品和药品管理局批准其用以治疗绝经后女性患者骨质疏松症新药Fablyn的上市，Fablyn工作机理与荷尔蒙雌性激素类似，这类药物被称作选择性雌激素受体调节剂。2005、2006年，美国食品和药品管理局两次拒绝辉瑞申求的理由都是担心该药存在导致患者罹患子宫内膜癌的风险。辉瑞在2007年底再次递交了Fablyn作为骨质疏松症治疗药物的上市请求，并提交了全新的数据。美国Amgen生物医药公司正在开发骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)的蛋白药物来抑制核因子κB受体配体活化剂(Receptor Activator forNuclear FactorκB Ligand)(RANKL)的活性，以期控制破骨细胞的过量形成。同时，美国洛杉矶的骨髓瘤/骨肿瘤研究所也正在研究发展一种减少破骨细胞形成的生物制剂-肿瘤坏死因子受体关联因子6(tumor necrosis factorreceptor-associated factor(TRAF)6)抑制性多肽(TRAF6dn)。

RANKL属于TNF家族。它的晶体结构显示其分子结构中含有一独特部分，可激活破骨前体细胞表面的受体RANK。RANKL是破骨细胞分化所必需的。当肿瘤细胞转移至骨骼部位后，RANKL是破骨细胞形成的主要生理调节子，可由肿瘤细胞直接分泌，无需基质细胞支持直接刺激破骨细胞形成。RANK受体表达于单核巨噬细胞，软骨细胞和破骨细胞前体，它是调节破骨细胞分化的主要受体。

自从发现RANKL/RANK信号通路，调节破骨细胞形成和激活的分子机理研究取得了快速进展。RANKL与RANK受体结合，使ITAM酪氨酸磷酸化，从而激活DAP12或FcRγ，以及共受体TREM2和OSCAR介导共激活通路。酪氨酸激酶ZAP70或Syk的磷酸化导致PLCγ和钙离子移动，进一步激活NFATc1促使破骨细胞分化。

破骨细胞是由多个单核前体细胞通过胞浆融合而形成的骨吸收细胞。破骨细胞的形成需要RANKL和M-CSF共刺激以及ITAM信号。但是，人单核巨噬细胞也表达一个IgG的抑制受体FcγRIIb，该受体胞浆末端含有ITIM结构，属于抑制性受体超级家族，通过上调胞浆内去磷酸化酶SHP-1，SHP-1进一步下调Syc-BCR阻断PI3K信号通路，实现下调节ITAM和抑制骨吸收。

交联FcγRIIb与含有ITAM的受体可抑制ITAM激活钙离子移动和细胞增生。基于信号传导通路中ITAM和ITIM平衡，本发明者设计一个RANKL-Fcγ融合蛋白用于交联RANK和FcγRIIb受体，诱导ITIM信号，从而抑制破骨细胞形成和骨吸收。

RANKL作为一种细胞因子结合到单核/巨噬细胞上的RANKL受体(RANK)从而激活基于免疫受体酪氨酸的激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activationmotif，ITAM)的信号传导系统。该系统经过一系列活性蛋白的磷酸化，使单核/巨噬细胞分化成破骨细胞。然而，ITAM的信息传导系统受到了基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)的抑制。ITIM作为抑制性信息传导系统通过含SH2域的肌醇多磷酸5’磷酸酶(SHIP)1(SH2domain-containing inositol polyphosphate5’phosphatase)和含SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP1/2)(SH2domain-containing proteintyrosine phosphatase)的激活来平衡ITAM的信息传导系统。本发明者通过基因克隆技术来合成一种RANKL-Fcγ融合蛋白，称之为RIG，该融合蛋白RIG通过激活细胞内ITIM的信息传导系统来抑制ITAM的信息传导，达到减少破骨细胞形成的目的。

因此，本发明的第一个目的是提供一种抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG的编码基因。

本发明的第二个目的是提供抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG。

本发明的第三个目的是提供构建所述编码基因用的合成引物。

本发明的第四个目的是提供制备融合蛋白RIG用的表达质粒。

本发明的第五个目的是提供含上述表达质粒基因工程重组细胞。

本发明的第六个目的是提供融合蛋白RIG的制备方法。

本发明的第七个目的是提供包含融合蛋白RIG的药物组合物。

发明内容

本发明提供的抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG的编码基因具有由1656bp组成的如下核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：

1   ATGCGCCGCG CCAGCAGAGA CTACACCAAG TACCTGCGTG GCTCGGAGGA GATGGGCGGC

61  GGCCCCGGAG CCCCGCACGA GGGCCCCCTG CACGCCCCGC CGCCGCCTGC GCCGCACCAG

121 CCCCCCGCCG CCTCCCGCTC CATGTTCGTG GCCCTCCTGG GGCTGGGGCT GGGCCAGGTT

181 GTCTGCAGCG TCGCCCTGTT CTTCTATTTC AGAGCGCAGA TGGATCCTAA TAGAATATCA

241 GAAGATGGCA CTCACTGCAT TTATAGAATT TTGAGACTCC ATGAAAATGC AGATTTTCAA

301 GACACAACTC TGGAGAGTCA AGATACAAAA TTAATACCTG ATTCATGTAG GAGAATTAAA

361 CAGGCCTTTC AAGGAGCTGT GCAAAAGGAA TTACAACATA TCGTTGGATC ACAGCACATC

421 AGAGCAGAGA AAGCGATGGT GGATGGCTCA TGGTTAGATC TGGCCAAGAG GAGCAAGCTT

481 GAAGCTCAGC CTTTTGCTCA TCTCACTATT AATGCCACCG ACATCCCATC TGGTTCCCAT

541 AAAGTGAGTC TGTCCTCTTG GTACCATGATCGGGGTTGGG CCAAGATCTC CAACATGACT

601 TTTAGCAATG GAAAACTAAT AGTTAATCAG GATGGCTTTT ATTACCTGTA TGCCAACATT

661 TGCTTTCGAC ATCATGAAAC TTCAGGAGAC CTAGCTACAG AGTATCTTCA ACTAATGGTG

721  TACGTCACTA AAACCAGCAT CAAAATCCCA AGTTCTCATA CCCTGATGAA AGGAGGAAGC

781  ACCAAGTATT GGTCAGGGAA TTCTGAATTC CATTTTTATT CCATAAACGT TGGTGGATTT

841  TTTAAGTTAC GGTCTGGAGA GGAAATCAGC ATCGAGGTCT CCAACCCCTC CTTACTGGAT

901  CCGGATCAGG ATGCAACATA CTTTGGGGCT TTTAAAGTTC GAGATATAGA TGGATCCGAG

961  CCCAATATTG TGACAAAACT CACACATGCC CACCGCTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG

1021 GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC

1081 CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC

1141 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC

1201 AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC

1261 AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC

1321 TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT

1381 GAGCTGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC

1441 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC

1501 GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG

1561 TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC

1621 ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATAA

本发明所提供的融合蛋白具有如下氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

1   MRRASRDYTK YLRGSEEMGG GPGAPHEGPL HAPPPPAPHQ PPAASRSMFV ALLGLGLGQV

61  VCSVALFFYF RAQMDPNRIS EDGTHCIYRILRLHENADFQ DTTLESQDTK LIPDSCRRIK

121 QAFQGAVQKE LQHIVGSQHIRAEKAMVDGS WLDLAKRSKL EAQPFAHLTINATDIPSGSH

181 KVSLSSWYHD RGWAKISNMT FSNGKLIvNQ DGFYYLYANICFRHHETSGD LATEYLQLMV

241 YVTKTSIKIP SSHTLMKGGS TKYWSGNSEF HFYSINVGGF FKLRSGEEISIEVSNPSLLD

301 PDQDATYFGA FKVRDIDGSE PKSCDKTHTC PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMI SRT

361 PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG

421 KEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD

481 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY

541 TQKSLSLSPG K

RIG的氨基酸残基序列是由551个氨基酸残基组成的蛋白质。RIG的结构如图1所示，它由三部分组成：A区(RANKL)(自氨基端第1-317位氨基酸残基)，B区(Fc-γ)(自氨基端第335-551位氨基酸残基)和C区(hinge)(自氨基端第318-334位氨基酸残基)。其中，A区来源于人的RANKL，具有与RANK结合的部位；B区来源于人的IgG免疫球蛋白，具有与IgG受体FcγRII结合的部位；C区来源于人的免疫球蛋白的绞链区序列，为绞连结构。

本发明所提供的融合蛋白RIG的制备方法包括如下步骤：(1)构建融合蛋白RIG的编码基因(SEQ ID NO：1)；(2)构建质粒pSecTagRIG；(3)将质粒pSecTagRIG转化到SP2/0细胞中；(4)培养阳性克隆并分离纯化RIG蛋白。

本发明首先合成了如下特异性引物(SEQ ID NO：3—SEQ ID NO：6)：

RANKL1(Sfi I)：5’-GGCCCCGAGGGCCATGCGCCGCGCCAGCAGAGAC-3’；

RANKL2(BamH I)：5’-GGATCCGATCTATATCTCGAACTTTAAAAGC-3’；

P3(FcγBamH I)：5’-GGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3’；

P4(FcγNot I)：5’-GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。

选用上述引物对RANKL和Fcγ基因进行RT-PCR扩增，将PCR产物分别克隆至pCR4-TOPO质粒(INVITROGEN，CA)，得到pRANKL和pFc-γ，经序列测定后将RANKL和Fcγ连接到表达载体pSecTag得到质粒pSecTagRIG，将此质粒转染至小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，筛选得到高表达RIG(其氨基酸序列如序列表中的序列2)的克隆，培养阳性克隆并分离纯化RIG蛋白。

本发明还提供一种抑制破骨细胞形成的药物组合物，包含治疗有效量的融合蛋白RIG，及药学上可接受的载体。

所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物组合物可以制成用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂，片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液，膏剂，霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为0.1-5mg/kg体重/周，疗程一般为10至30天。

附图的简要说明

图1为RIG的结构示意图。

图2为RIG的克隆和表达过程示意图。

图3为Fcγ1和RANKL DNA PCR扩增产物电泳图谱。

图4为RIG与RANKL的受体(RANK)结合能力鉴定结果。

图5为RIG与FcγRII受体结合能力鉴定结果。

图6为RIG抑制破骨细胞形成实验结果。

图7为RIG抑制破骨细胞生物学活性实验结果。

实施例

下面用实施例对本发明作进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

实施例1融合蛋白RIG的表达

融合蛋白RIG的表达过程如图1所示，具体包括以下步骤：按照常规方法进行以下操作：从人外周血中分离、纯化T淋巴细胞和B淋巴细胞，提取mRNA。

用特异性引物进行RANKL(T淋巴细胞)和Fcγ(B淋巴细胞)基因的RT-PCR扩增，引物选自：

SEQ ID NO：35’-GGCCCCGAGGGCCATGCGCCGCGCCAGCAGAGAC-3’；

SEQ ID NO：45’-GGATCCGATCTATATCTCGAACTTTAAAAGC-3’；

SEQ ID NO：55’-GGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3’；

SEQ ID NO：65’-GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。

将RANKL和Fc_γ基因的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3所示，RANKL PCR扩增产物为970bp；Fc_γDNA PCR扩增产物为714bp。将PCR产物分别克隆至CR4-TOPO质粒(INVITROGEN，CA)，经连接后，得到pRANKL和pFc-γ，进行核苷酸序列分析；在得到了100％正确的核苷酸序列后，将RANKL和Fcγ基因分别利用Sfi I-BamH I和BamH I-Not I限制性内切酶(NEW ENGLAND BIOLABS)进行酶切，并用相同的限制性内切酶Sfi I-Not I酶切pSecTag(INVITROGEN，CA)表达载体，然后进行连接，得到质粒pSecTagRIG，对质粒pSecTag RIG进行核苷酸序列分析，表明插入的(三个)外源基因序列如序列表中的序列1所示。然后将此质粒利用常规电穿孔法转染至小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，经ZEOCIN抗药性筛选及ELISA鉴定(用鼠抗人RANKL抗体包备ELISA平板，加入标本上清，然后加入羊抗人IgG酶标抗体)，得到高表达RIG(其氨基酸序列如序列表中的序列2)的克隆。

利用RPMI1640(INVITROGEN，CA)培养基，在37℃，5％CO₂培养上述阳性克隆(含有质粒pSecTag RIG的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞)15天，2000rpm离心后，收集上清，再用蛋白A亲和层析柱(PHARMACIA)分离纯化RIG蛋白。

实施例2RIG与RANKL的受体(RANK)结合实验

将1×10⁶单核细胞分别培养于MCSF和RANKL培养基，72小时后与5微克实施例1中纯化的RIG蛋白在4℃反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人RANKL抗体(CALTAG，CA)，用流式细胞仪检测细胞。结果如图4所示，表明RIG蛋白可与RANK结合，THP1细胞呈FITC阳性。图4中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE，FL1-H为FITC。

实施例3RIG与FcγRII受体结合实验

将1×10⁶HMC-1细胞与5微克实施例1中纯化的RIG蛋白在4℃反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人IgG FITC标记抗体(CALTAG，CA)，用流式细胞仪检测细胞。结果如图5所示，表明RIG蛋白可与FcγRII受体结合，HMC-1细胞呈FITC阳性。图5中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE，FL1-H为FITC。

实施例4RIG抑制破骨细胞形成实验

利用抗CD14微球(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)从多发性骨髓瘤病人的骨髓或PBMC中分离出CD14⁺细胞。用含有50ng/ml RANKL和20ng/ml M-CSF培养基细胞。三天后，将RIG融合蛋白和对照试剂加入到培养基中，14天培养后，收获细胞并固定，进行TRAP染色分析(TRAP-staining kit；Sigma，St Louis，MO，USA)鉴定多核破骨细胞的数量，根据融合指数评价破骨细胞的频率。

本实施例证明RIG可阻断RANKL介导破骨细胞形成，并存在剂量依赖性。

实施例5RIG抑制破骨细胞的生物学活性

通过破骨细胞的骨吸收分析，我们进一步考察RIG对破骨细胞的生物学活性的抑制作用。简要地，用无菌水和超声波清洗直径为6mm、厚度为150um的猛犸象长牙牙质薄片，然后，在70％的乙醇中消毒，紫外照射过夜。从正常人的PBMC或骨髓分离得到CD14+细胞，将分别培养于MCSF和RANKL培养基的CD14+单核细胞(5x10⁴)在上述牙质薄片上利用RIG融合蛋白刺激21天。为了考察骨吸收面积，首先使用蒸馏水洗去薄片上的分化细胞，然后对薄片脱水和风干。用Toluidine蓝染色，利用光学显微镜鉴别吸收坑和图象分析测量每个薄片上的腔隙性吸收面积。

工业实用性

破骨细胞是由多个前体单核细胞融合后得到的骨吸收多核细胞，对骨的再造具有重要意义。RANK是破骨细胞形成、存活和发挥生理功能的主要调节因子。RANKL的产生导致RANK的激活和单核细胞分化形成破骨细胞。在RANK诱导破骨细胞形成中，需要激活ITAM信号。在人的单核细胞和巨噬细胞表面表达有抑制性IgG受体FcrRII，该受体的胞内部分含有ITIM基序，ITIM可以通过SHIP来平衡ITAM的活化。本发明的RIG融合蛋白是一个新的RANK抑制剂，通过ITIM信号的激活来抑制破骨细胞的形成和骨损伤的发生发展。本发明的融合蛋白RIG组成成份全部来源于人源(human)性免疫球蛋白和RANKL，因此，作为一种药物进入人体，没有任何异体蛋白的免疫源性。该融合蛋白的C区(hinge)灵活，可转动，可将RANKL和Fc_γ交联在一起，从而诱发细胞内的抑制信号，抑制RANK-ITAM反应的发生。本发明的RIG融合蛋白通过启动细胞内抑制信号传导系统ITIM，从而强有力地抑制了破骨细胞形成，将在骨质疏松和肿瘤引起的骨吸收的治疗中发挥重要作用。

SEQUENCE LISTING

<110>上海富莼科芯生物技术有限公司

<120>抑制破骨细胞形成的融合蛋白、其制备方法及药物组合物

<130>CN081119

<160>6

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>1656

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

<210>2

<211>551

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

Claims (6)

1.一种抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG的编码基因，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO:1所示序列。

2.一种抑制破骨细胞形成的融合蛋白RIG，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO:2所示序列。

3.一种质粒pSecTagRIG，其特征在于：在质粒pSecTag的Sfi I-Not I酶切位点连接有权利要求1所述RIG的编码基因。

4.一种基因工程重组细胞，包含权利要求3所述的质粒，所述质粒或整合于细胞的染色体中，或游离于染色体外。

5.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）克隆融合蛋白RIG的编码基因；

（2）构建权利要求3所述质粒pSecTagRIG；

（3）将权利要求3所述质粒pSecTagRIG转化到SP2/0细胞中；

（4）培养阳性克隆并分离纯化RIG蛋白。

6.一种抑制破骨细胞形成的药物组合物，包含治疗有效量的权利要求2所述融合蛋白RIG和药学上可接受的载体。

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