KR101700970B1 - 지혈 활성을 가지고 혈소판 응집을 유도할 수 있는 재조합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈소판 응집 (platelet aggregation)을 유도할 수 있는 재조합 단백질, 및 그의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 혈소판 콜라겐 수용체 (platelet collagen receptors)와 상호작용하는 것으로 기재된 펩타이드 서열들의 조립 (assembly)으로 구성된 재조합 단백질들에 관한 것이다. 이들 단백질은 삼중 나선 (triple helix)의 형성과는 독립적인 프로-응집 (pro-aggregating) 활성을 가진다. 그들은 박테리아 및 포유동물 세포에서 생산될 수 있다.
콜라겐 (collagens)은 모든 다세포 생물의 세포외 기질 (extracellular matrix)의 주요한 구조 성분이다. 그들은 발생기 (development) 동안 또한 조직 항상성 (tissue homeostasis)에서 역할을 수행하는 서로 다른 28가지의 타입으로 구성된 단백질 패밀리이다. 그들은 원섬유 (fibrils), 미세원섬유 (microfibrils) 또는 네트워크 (network) 형태로 다양한 초분자적인 구조 (supramolecular structure) 내로 조립될 수 있다.
콜라겐은 함께 꼬여있는 세 가지의 폴리펩타이드 사슬, 또는 α 사슬로 형성된 삼중 나선 구조 (triple helix structure)를 가지는 하나 이상의 도메인을 포함하는 공통적인 특징을 갖는다. 이러한 특징은 세 개 모두가 아미노산인 반복된 G-X-Y 서열로 이루어진 나선형 (helicoidal) 모티브에서의 글리신 존재에 의해 가능해지는데, 여기에서 X는 종종 프롤린 (proline)이고 Y는 하이드록시프롤린 (hydroxyproline)이다. 본 하이드록시프롤린은 삼중 나선의 안정화 (stabilisation)에 필수적이면서 콜라겐의 특징이 된다. 프롤린 잔기는 프로릴-4-하이드록시라제 (prolyl-4-hydroxylase, P-4-H)에 의해 4-하이드록시프롤린으로 일차적으로 수산화된다 (hydroxylated). 두 번째 하이드록시라제로는 프로릴-3-하이드록시라제가 있고, 이는 P-4-H 에 의해 수산화된 프롤린이 이미 Y 위치에 존재하고 프롤린은 X 위치에 있을 때, 프롤린의 수산화 (hydroxylation)를 가능하게 한다. 콜라겐 분자에서, 알파 사슬은 동일하거나 다를 수 있다.
콜라겐 분자는 N- 및 C-프로펩타이드 (propetides)라고 불리는 비-나선형 도메인)에 의해 측면 분리된 (flanked) 나선형 도메인 (helicoidal domains) (또는 콜라겐성 도메인)으로 형성된다. 분자를 형성하는 세 가지 α 사슬의 인식 및 그들 조립의 시작이 C-말단 끝 (C-프로펩타이드)의 조절 하에 있다. 이 과정은 내세포질 망상체 (endoplasmic reticulum)에서 수행된다. 이와 연속해서, N- 및 C-프로펩타이드는 콜라겐이 성숙되는 동안 짧은 비-나선형 서열인 텔로펩타이드 (telopeptides)를 남기면서 절단된다.
콜라겐은 혈관벽에서 그들의 통합성 (integrity) 및 탄력성 (elasticity)을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 이러한 벽은 원섬유로 된 타입-I 콜라겐 및 타입-III 콜라겐으로 그리고 네트워크 형태인 타입-IV 콜라겐으로 형성된다. 타입-III 콜라겐도 역시 죽상판 (atheromatous plaques)에서 강하게 발현되는 점을 주목해야 한다. 또한, 콜라겐은 특이한 세포 수용체와 직접적인 상호작용에 의해 소정의 세포의 기능을 조정할 수 있다. 따라서, 주로 타입 I 및 III인 콜라겐은 혈소판 기능의 강력한 활성인자 (activators)이다.
타입-III 콜라겐은 삼중 나선으로 배열된 세 가지의 α1 사슬로 구성된 호모삼중머 (homotrimer)이다. α1 사슬의 C-말단 끝에 존재하는 두 개의 G-P-P 삼중자 (triplets)(잠재적으로 수산화됨)는 다시 핵내화 (nucleation) 및 삼중 나선의 접힘 (folding)에 충분하기도 하고 필요하기도 하다 (Bulleid et al ., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701). 반면, 이들 두 개의 삼중자는 세 가지 사슬의 초기 결합을 가능하게 하지는 못한다. 불레이드 등 (Bulleid et al ., 1997)이 세 개의 삼중자가 유지될 때 삼중 나선 형성의 더 큰 효율을 관찰하였고, 이 효율이 야생형 분자의 경우보다 훨씬 더 큰 점도 확인한 것은 흥미롭다. 몇 가지의 단백질은 모노머 사슬의 조립 과정에 관여한다: HSP47 (열 충격 단백질) 및 PDI (단백질 디설파이드 이소머라제). 모노머 사슬의 C-말단 끝에 위치하는 C-프로펩타이드는 α 사슬의 정렬 및 단백질의 안정화에 필요한 디설파이드 연결 (disulfide bridges)의 형성에 관여하는 것으로 보인다 (Bulleid et al ., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701). 따라서 본 C-프로펩타이드는 모노머 사슬의 조합 (combining)을 보장하기 위해서만 필요하다. 이와 관련하여 다양한 중요한 점을 기억해야 한다:
- 이것은 α1 사슬의 특이한 표준 조립을 결정하는 15개의 아미노산의 불연속적인 서열 (discontinuous sequence)로 이루어진다 (Hulmes D.J., J Struct Biol. 2002 Jan-Feb; 137(1-2): 2-10).
- C-프로펩타이드의 시작점에 위치하는 꼬여진-코일 (coiled-coil) 도메인은 콜라겐 III의 삼중화 (trimerization)에 관여한다 (Bulleid et al ., EMBO J. 1997 Nov 17; 16(22): 6694-701). 이 도메인은 네 개의 헵타펩타이드 (heptapeptides)로 구성된다 (McAlinden et al ., J Biol Chem . 2003 Oct 24; 278(43): 42200-7).
- 이것은 사슬 내- 및 사슬 상호간 (intercatenary) 디설파이드 연결의 형성을 가능하게 하는 여덟 개의 시스테인 잔기를 포함한다.
C-텔로펩타이드 또는 C-프로펩타이드에서 사슬간 디설파이드 연결의 존재가 사슬의 조합 및 삼중 나선의 형성에 필요하지 않다 (Bulleid et al ., Biochem J. 1996 Jul 1; 317(Pt 1): 195-202). 실험이 N-프로펩타이드를 사용하여 착수된 점을 알아야 한다. 트리머 및 알파 삼중 나선의 견해는 역설적으로 독립적이라고 여겨진다. N-프로펩타이드의 부재 시, C-프로펩타이드의 2번 시스테인, 또는 C-텔로펩타이드의 두 개 시스테인의 둘 중 하나를 남기는 것이 올바른 것으로 여겨진다. 크노트 서열 (knot sequence) (GPCCG)이라고 불리는 이러한 후자 모티브는 α1 사슬의 조립 및 접힘의 예비적인 현상을 통해서만 디설파이드 연결의 형성을 가능하게 한다 (Boudko and Engel, J Mol Biol . 2004 Jan 30; 335(5): 1289-97).
동맥의 혈관벽에 미치는 손상은 외상성 기원인지 또는 죽상동맥경화증 (atherosclerosis)의 결과인지 여부로 혈관 내피의 파괴 및 콜라겐과 같은 혈전기원 성분의 노출을 동반한다. 이것은 손상된 부위에서 콜라겐 또는 콜라겐 단편이 풍부한 표면과 접촉하여 혈소판의 부착, 그들의 활성화 및 혈전의 형성으로 이어진다. 본 콜라겐과 접촉한 혈소판의 부착 및 안정화는 혈소판 및 콜라겐의 표면에 존재하는 높은 친화도를 가진 수용체들 간의 다수의 상호작용에 의해 가능해진다. 이러한 부착은 폰 빌레브랜드 인자 (von Willebrand factor, vWF)의 A1 도메인과 A3 도메인에 의해 스스로 콜라겐과 결합하는 당단백질 (glycoproteins, Gp) GpIb-V-IX로 형성된 혈소판 복합체와 결합하는 것에 이어서 간접적으로 또는 혈소판과 콜라겐 간의 직접적인 상호작용에 의해 발생된다. 몇 가지 수용체가 매우 특이적인 펩타이드 서열 즉 인테그린 α2β1에서 콜라겐 분자를 결합시키고, 이는 콜라겐과 접촉하는 혈소판, 및 혈소판 활성화에서 가장 중요한 수용체로 생각되는 GpVI의 안정화에 중요한 역할을 한다. 또 다른 수용체인 TIIICBP (타입-III 콜라겐-결합 단백질)는 콜라겐과 직접 결합할 수 있는 것으로 기술되어 왔다.
혈관 유속은 사용되는 혈소판 콜라겐 수용체의 타입을 정의하는 주요한 결정기 (determinant)이다. 높아진 유속에서, 혈소판은 GpIb 수용체를 통해 vWF 를 통해 콜라겐과 상호작용한 다음 GpVI를 통한 결합에 의해 활성화되고: 인테그린 α2β1은 혈소판-콜라겐 결합의 안정화제로서만 개입한다. 낮은 유속에서, 혈소판은 GpVI에 대한 결합에 이어서 인테그린 α2β1를 통해 콜라겐과 결합하여 그들의 활성화를 유도하며, 이는 혈소판 응집을 준비하는 단계이다. 유사하게, TIIICBP와 같은 다른 혈소판 콜라겐 수용체도 관여한다. 모든 경우에서, GpVI는 혈소판 활성화에 주요한 역할을 담당한다.
혈소판 부착 (platelet adhesion)은 현재 혈소판 활성화로부터 분리된 과정이다. 따라서, 콜라겐의 짧은 펩타이드 모티브에 해당하는 많은 펩타이드는 그들의 활성화를 유발시키지 않고 혈소판의 부착을 유도할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 펩타이드 몇 가지는 혈소판 활성화를 유도할 수 있는 능력을 가지고 소위 전-응집 (pro-aggregating) 활성을 나타낸다. 그들의 삼중 나선 구조는 이러한 활성에 대한 필수적인 선결요건인 것으로 보인다. 이들 펩타이드의 몇 가지는 모노머 형태로 남아있을 때, 여전히 확인되어야 할 것이지만 자연 그대로의 콜라겐이 사용가능하지 않은 부위를 채택할 수 있는 기작에 의해 항-응집 활성을 나타내는 것을 주목해야 한다.
타입-III 콜라겐을 사용하여 혈소판의 부착에 관여하는 펩타이드 서열을 확인하는 것을 목적으로 하는 연구의 대부분은 가장 높은 응집 활성을 나타내는 CNBr에 의한 소화 단편 (digestion fragment)에 해당하는 단편 α1(III)CB4을 사용한다.
다양한 펩타이드 모티브가 지난 몇 년 동안 혈소판을 결합시키고 활성화할 수 있는 것으로 기술되어 왔다. 그들은 두 가지 가능한 본성의 펩타이드 형태에서 테스트되었다:
- 콜라겐과 유사하고, n번 반복되어 있는 보존된 (conserved) GPO 모티브의 반복에 의해 형성되고, 타입-III 콜라겐의 자연 그대로의 서열에는 존재하지 않으며;
- 또는 α1(III)CB4 서열에서 존재하는 펩타이드 모티브로 형성된 펩타이드에 해당하고 기본적으로 화학적 합성에 의해 획득된다 (Farndale et al ., Biochem Soc Trans . 2008 Apr; 36(Pt 2): 241-50).
인테그린 α2β1은 내피세포 및 혈소판을 포함하는 다양한 세포 타입에서 콜라겐, 라미닌 (laminin) 및 기타 리간드에 대한 수용체이다. α2β1은 콜라겐을 원섬유 콜라겐의 서열에 존재하는 펩타이드 모티브에서 그의 도메인 I을 통해 결합시킨다. 타입-I 콜라겐의 α1 사슬에 존재하는 GFOGER 에 대한 가장 높은 친화도를 가진 다양한 모티브가 기술되어 왔다. 타입-III 콜라겐의 경우, 타입-I 콜라겐과는 반대로, 여러 개의 GXYGER 모티브가 주요한 모티브로서 GLOGER, GMOGER, GROGER 및 GAOGER 와 함께 최적의 결합을 위해 필요한 것으로 여겨진다 (Kim et al ., J Biol Chem . 2005 Sep 16; 280(37): 32512-20). GLOGEN 및 GLKGEN과 같은 다른 모티브가 기술되어 있긴 하지만 α2β1에 대해서는 낮은 친화도를 나타낸다. (Raynal et al ., J Biol Chem . 2006 Feb 17; 281(7): 3821-31). 이들 모티브로부터 합성된 펩타이드 모두가 삼중 나선의 형태로 조성될 (organized) 때 부착 활성 (adhesion activity)을 나타내는 점은 주목해야 한다.
당단백질 VI (GPVI)은 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리에 속하는 60-65 kDa의 타입-I 막통과 당단백질 (transmembrane glycoprotein)이다. 이것은 Ig 수용체에 공통적인 γ 사슬을 가진 비공유 복합체의 형태로 (FcRγ) 혈소판의 표면 상에 전신 발현된다 (constitutively expressed). 본 수용체와 상호작용하는 것으로 기술된 펩타이드는 4개 내지 10개의 GPO 삼중자 (triplets)의 반복으로부터 형성된 콜라겐과 유사한 펩타이드이다 (Morton et al ., Biochem J. 1995 Mar 1; 306(Pt 2): 337-44 및 Smethurst et al ., J Biol Chem . 2007 Jan 12; 282(2): 1296-304). 10% GPO 모티브를 포함하더라도, 이 삼중자의 최대 반복 수는 타입-III 콜라겐의 자연 그대로의 서열에서 3을 넘지 않는다. 또한 여기에서 삼중 나선의 형성 또는 시스테인 또는 라이신 잔기의 변형에 이어서 화학적으로 획득된 폴리머 형태의 형성이 이들 펩타이드 상에 전-응집 활성을 부여하는 데 필수적이다. 또한, 3번 위치에서의 하이드록시프롤린의 존재는 이러한 활성에 필수적이다. 반대로, 그들이 모노머 형태일 때 이들 펩타이드는 항-응집 활성을 나타낸다 (Asselin et al ., Biochem J. 1999 Apr 15; 339(Pt 2): 413-8). 최근에 자비스 (Jarvis) 등은 가장 높은 부착 활성을 나타내는 타입-III 콜라겐 서열에서 펩타이드 모티브를 확인하였다. 이것은 α1(III)CB4의 523번 내지 549번 아미노산에 위치하는 GAOGLRGGAGPOGPEGGKGAAGPOGPO 잔기로 구성된다 (Jarvis et al ., Blood . 2008 May 15; 111(10): 4986-96). 본 펩타이드 모티브는 세 개의 GPO로 구성되고, 이는 연속되지 (consecutive) 않으며 적절히 GpVI과 상호작용하는 데 필요한 최소한의 숫자로 구성된 것으로 여겨진다.
혈소판 수용체 GpIb 및 콜라겐 간의 간접적인 상호작용은 vWF 에 의존적이고, 이는 혈관 손상에 반응하거나 벽쪽 압력 (parietal pressure)에서의 증가에 이어지는 내피세포 및 혈소판에 의해 분비되는 혈장 복수체 단백질 (plasma multimeric protein)이다. 이것은 높아진 유속이 생기기 쉬운 혈관 영역의 손상된 부위에서 혈소판을 채용하는 데 주요한 역할을 담당한다. 이러한 인자는 A1, A2 및 A3로 명명된 세 가지 도메인으로 구성된다. 이것은 그의 A3 도메인을 통해 콜라겐을 결합시키고 그의 A1 도메인에 의해 GpIb 수용체를 결합시킨다. 타입-III 콜라겐은 vWF 의 A3 도메인에 대해 높은 친화도를 가진 단일 부위를 가지는 것으로 여겨지고, 이것도 역시 타입-II 콜라겐에 존재한다. 이 펩타이드 모티브는 403번 및 413번 아미노산 사이에 위치하고 vWF를 결합시키는 데 결정적인 소정의 아미노산을 가진 GPRGQOVMGFO로 구성된다 (Lisman T et al ., Blood . 2006 Dec 1; 108(12): 3753-6). 베르클레이 (Verkleij) 등은 잠재적인 결합 부위로서 GAAGPOGPOGSAGTOGLQ 로 구성된 541번 내지 558번 아미노산을 확인하였다 (Verkleij et al ., Blood . 1998 May 15; 91(10): 3808-16). 이 펩타이드 모티브는 리스만 (Lisman) 등에 의해 기술된 vWF 모티브와 GMOGER 인테그린 α1β2 결합 모티브 사이에 위치한다.
포벨-라페브 (Fauvel-Lafeve) 연구팀은 단편 α1(III)CB4 의 655번 및 662번 아미노산 사이에 위치하는 옥타펩타이드, KOGEOGPK 의 존재를 기술하였다. 본 옥타펩타이드에 의해 인식되는 혈소판 수용체가 확인되었고 TIIICBP (타입-III 콜라겐 결합 단백질)이라고 명명되었다 (Monnet E et al ., J Biol Chem . 2000 Apr 14; 275(15): 10912-7). 본 옥타펩타이드는 정지 및 유동 조건 하에서, 타입-I 콜라겐과는 아니더라도 타입-III 콜라겐과 혈소판의 상호작용을 저해할 수 있다. 보다 최근에는, 파이어 (Pires) 등이 이 옥타펩타이드가 호모트리머 (homotrimer) 형태일 때만 응집에 미치는 저해 활성을 가지는 것을 보여주었다. 반대로, 삼중 나선 형태에서 그의 구조는 이들 끝에 시스테인 및 GPP 를 첨가하는 것에 의해 그들에게 전-응집 활성을 부여한다 (Pires et al ., Eur J Med Chem . 2007 May; 42(5): 694-701).
콜라겐의 생물학적 및 초구조적인 특성, 그리고 명확히 막 수용체에 결합하는 그들의 능력은 조직에서의 그들의 다수 역할 때문에 넓은 적용 분야 (field of applications)를 열어준다. 그러나, 이들 적용은 이들 콜라겐의 균질한 제조물을 재생 가능한 방식으로 대량으로 얻을 수 있는 경우에만 의미를 가진다.
두 가지 생산 방법이 본 목적에 사용되었다. 일반적으로 이들 두 분야에서 수행된 연구 및 개발은 주어진 적용을 목표로 삼고 있다. 화학적 합성은 관심을 가진 일반적인 펩타이드 모티브에서 단백질의 작은 부분만을 표현하는 짧은 펩타이드를 생산할 수 있다. 그의 기본적인 적용은 지혈에 관한 것이고, 보다 상세하게는 콜라겐과 혈소판 간의 결합의 조정에 관한 것이다.
그러나 이들 펩타이드는 일반적으로 탐구되는 활성의 단 하나를 가지며, 이것은 펩타이드의 또한 명확히 삼중 나선 형성의 삼차원적 입체 형태 (conformation)에 의존할 수 있다. 따라서, 높은 생산성을 제공하는 생물학적 시스템에 의해 생산될 수 있는 기능화된 재조합 콜라겐 단백질의 개발을 위한 중대한 필요성이 있다. 주요한 장애요인은 이들 콜라겐 유래 단백질이 응집되고 부착되는 경향 때문에 생산 및 정제의 어려움이 있는 것이다.
지금까지 짧은 펩타이드 서열 (50개의 아미노산보다 적음)은 모두 화학적 합성에 의해 생산되어 왔고, 세포적 생산 시스템에 의해서는 아니었다 (Farndale et al., Biochem Soc Trans . 2008 Apr; 36(Pt 2): 241-50). 또한, 이들 모티브는 분리된 (isolated) 방식으로 합성되어 왔다. 반대로, 혈소판 결합 활성을 나타내는 재조합 타입-III 콜라겐의 합성은 세포적 생산 시스템에 의해 수행되어 왔으며, 그것은 서열, 예를 들어 프로α1(III)의 전체 (totality)이면서 이것이 사용되어 왔다. 탐구의 목표는 삼중 나선으로 조성될 수 있는 전체 프로콜라겐의 합성이다 (국제특허출원 제 WO 9, 307 889호). 이들 재조합 콜라겐은 기본적인 다수의 적용에서, 즉 완벽한 콜라겐 서열의 것을 가진다.
따라서 이것은 생산의 관점에서 보다 덜 어렵지만 자연 그대로의 단백질의 관심을 가진 생물학적 활성을 보존하는 더욱 단순한 구조의 더욱 작은 단백질을 합성하는 문제이다.
따라서 본 발명은 전-응집 활성 (pro-aggregating activity)을 획득하는 데 필요한 모티브를 소유하면서, 삼중 나선의 형태로 구조화될 수 없는 모노머의 형태로 합성되는 재조합 단백질에 관한 것이다. 본 삼중 나선을 형성하는 것의 불가능성은: I) 그들 간의 α사슬 인식 모티브, II) 비-나선형 콜라겐의 N- 및 C- 말단 도메인 또한 III) 삼중 나선의 감작 (priming)에 필요한 두 가지의 GPO 삼중자의 부재의 결과이다. 놀랍게도, 전-응집 활성은 삼중 나선 형성의 부재 시 획득된다.
본 출원인은 놀라운 방식으로 전-응집 활성을 가지는 단일한 모노머 단백질 내에 세 가지 타입의 펩타이드 서열을 합치는 것이 가능한 것을 보여주었다.
따라서 본 발명의 재조합 단백질은:
- 적어도 하나의 네 개 GPO 삼중자의 반복을 가진 펩타이드 모티브,
- 자연 그대로의 콜라겐 서열에 존재하는 다양한 혈소판 수용체에 대해 결합 활성을 가지는 것으로 기술된 펩타이드 서열,
- GXY 삼중자의 반복으로 형성된 이들 모티브 간의 결합 서열,
을 다같이 모아놓고 있다.
이들 단백질의 박테리아 및 포유동물 세포에 의한 생산은 이들 새로운-세대 재조합 콜라겐인 콜라겐과 유사한 펩타이드 서열 및 콜라겐의 자연 그대로 형태에 존재하는 서열의 조합의 결과물을 대량으로 얻는 것을 가능하게 한다. 이들 타입의 단백질은 이러한 생산을 위해 숙주세포로서 콜라겐을 전신적으로는 생산하지 않는 선호되는 세포를 필요로 하지 않는다. 따라서, 그들의 서열은 다양한 자연 그대로 콜라겐의 알파 사슬의 인식을 허용하지 않는다. 반대로, 프롤릴-4-하이드록시라제 (P4H) 및 HSP47과 같은 콜라겐 성숙의 중요한 효소를 발현하는 콜라겐-생산 세포를 선호하는 것이 필요하다. 반대로 현재의 재조합 콜라겐 생산 시스템은 자연적으로 콜라겐을 생산하지 못하는 세포를 사용하고 있다 (Olsen et al ., Adv Drug Deliv Rev . 2003 Nov 28; 55(12): 1547-67; Ruggiero 및 Koch, Methods . 2008 May; 45(1): 75-85). 이것에는 P4H 와 같은 효소를 코딩하는 유전자를 공형질전환 (cotransfecting)하는 것이 관여한다.
Asselin et al., Biochem J. 1999 Apr 15; 339(Pt 2): 413-8
Born et al., Nature 1962 June, 194: 927-9
Boudko and Engel, J Mol Biol. 2004 Jan 30; 335(5): 1289-97
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Pires et al., Eur J Med Chem. 2007 May; 42(5): 694-701
Raynal et al., J Biol Chem. 2006 Feb 17; 281(7): 3821-31
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Smethurst et al., J Biol Chem. 2007 Jan 12; 282(2): 1296-304
Verkleij et al., Blood. 1998 May 15; 91(10): 3808-16
본 발명에 따른 재조합 단백질은:
- 세포적 생산 시스템을 사용하여 생산하는 데 더욱 용이한 작은 단백질 내에 관심을 가진 모티브를 합치는 것,
- 삼중 나선 구조의 부재 시의 전-응집 활성,
- 콜라게나제 인식 부위 (collagenase recognition sites)의 서열은 부재하지만, 콜라겐-생산 세포에 의한 그들의 생산을 허용하는 HSP47 인식 부위는 존재,
- 현재의 항혈소판 처리를 감시하고 혈소판 기능을 탐색하는 데 사용되는 기준 테스트 (혈소판 응집 테스트)에 의해 나타나는 그들의 생물학적 활성,
을 포함하는 많은 장점을 가진다.
본 발명에 따른 재조합 단백질의 생물학적 특성은 많은 적용을 착상하는 것을 가능하게 한다.
첫 번째 적용은 이들 단백질을 혈전성 질환의 탐색에서 진단적 도구로서 사용하는 용도에 관한 것이다: 혈소판 응집 테스트, 시험관내 (in vitro) 혈전증 (thrombosis) 모델 또한 현재 항혈소판 치료 [아스피린, 클로피도그렐 (clopidogrel)] 및 향후 치료의 효율성 평가. 생산된 단백질은 인간 단백질로부터 유래하고 혈소판 부착 및 활성화에서 그들의 역할에 대해 기술되어 있는 소정의 혈소판 수용체에 대한 결합 부위를 그들의 서열에 가진다. 현재의 테스트는 그의 서열이 인간의 것과 완벽한 상동성 (homology)을 가지지 않는 동물 기원의 콜라겐을 사용한다. 또한, 다양한 단백질들 간의 혈소판 수용체 상호작용 부위의 숫자와 위치의 다양성은 보다 적절한 표적 평가 테스트 (target validation test)를 제안하는 것을 가능하게 한다. 각 혈소판 수용체에 더욱 특이적으로 작용하는 것을 가능하게 하는 펩타이드 단편이 존재하지만, 그들의 생산 방법은 본 발명의 것과 화학적 합성 대 세포에 의한 자연적 생산으로 서로 다르다 [해독후 변형 (post-translational modification)의 중요성].
본 발명은 출혈의 위험성 (외과적 맥락)을 예방하기 위하여 지혈 붕대 (haemostatic bandages)의 [따라서 혈관 손상의 경우에 혈소판의 해당 부위 채용 (on-site recruitment)을 강화시키는 것] 또는 지혈성 부착제 (haemostatic adhesives)의 조성물에서 부분적으로 역할을 담당할 수 있다 . 제품이 현재 시판되고는 있으나, 동물 기원의 콜라겐으로 된 것이다.
또 다른 적용은 반흔 형성 (cicatrisation)을 활성화하기 위한 이들 단백질의 용도이다. 소정의 상처의 반흔 형성은 혈소판을 포함하는 소정의 세포 집단의 해당 부위 이동 (on-site migration), 부착 및 분화를 필요로 한다. 이들 과정은 이들 세포의 표면 인테그린 (surface integrins)에 의존적이다. 본 발명적 단백질의 구조에 존재하는 소정의 펩타이드 모티브는 따라서 반흔 형성을 촉진하는 것에 의해 이들 인테그린과 상호작용할 수 있다.
매우 밀접한 분야로는, 이들 재조합 단백질은 소정의 피부학적 크림의 조성물에서 제안될 수 있다.
혈소판 기능을 저해하는 단백질의 또 다른 적용은 죽상혈전증 (atherothrombosis)의 치료이다. 혈소판 수용체는 죽상혈전성 질환의 합병증과 싸워야 하는 미래를 가진 치료적 표적이다. 지금까지 내피하 (subendothelium)에서의 혈소판 부착의 초기 단계 (initial phase)를 차단할 수 있는 분자는 전혀 없다. 본 발명적 단백질의 다양한 단백질 구조는 혈소판 항-부착 효과 (부위 차단) 및/또는 혈소판 전-부착 효과를 유도하는 이들 수용체와 그들의 상호작용을 가능하게 한다. 다양한 효과가 그의 물리화학적 특성을 조정하는 것에 의해 동일한 단백질을 사용하여 획득될 수 있다.
따라서 본 발명은 키트의 조성에서 일부 역할을 담당할 수 있는: 혈소판 기능을 평가하기 위하여, 혈액학적 기능이상을 진단하는 데 세포 분화를 활성화하기 위하여, 섬유화증 영역을 영상화하는 것에 의해 검출하기 위하여 많은 적용을 가진 생물학적 반응용액 (biological reagents)을 제공한다. 본 발명은 또한 혈소판의 해당 부위 채용 (혈관 손상의 경우에서)을 위한 지혈 붕대, 출혈의 위험성을 예방하기 위한 지혈 부착제, 또는 피부학적 크림의 조성물에도 들어갈 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 25번 위치 내지 152번 위치의 폴리펩타이드의 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 25번 위치 내지 152번 위치의 폴리펩타이드와 그의 전장 (entire length)을 통해 적어도 70%의 일치도를 가지고, 인간 혈액 혈소판의 응집을 혈소판 응집측정기 (platelet aggregometer)로 37℃에서 1,000 rpm으로 저어주어 30% 이상 유도할 수 있는 분리된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 이들 폴리펩타이드는 하기 펩타이드 모티프를 포함한다:
- GX1X2GER 여기에서 X1 및 X2는 독립적으로 A, R, N, D, Q, E, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V 및 O 로부터 선택되는 아미노산을 나타내고;
- 4와 10 사이의 n 을 가지고 X3 는 P 또는 O 를 나타내는 (GPX3)n;
- GPRGQX4GVMGFX5 여기에서 X4 및 X5 는 독립적으로 P 또는 O 를 나타낸다. P 는 프롤린이고 O는 하이드록시프롤린이다.
또 다른 구현예에서, 이들 폴리펩타이드는 하기 펩타이드 모티프를 포함한다:
- GAPGER,
- KPGEPGPK,
- 4와 10 사이의 n 을 가지는 (GPP)n
- RGD.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 가진다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
또한 본 발명은:
- 숙주 생물에서의 기능적 프로모터,
- 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드,
- 동일한 숙주 생물에서의 기능적 종결 서열,
을 전사 방향 (direction of transcription)으로 포함하는 발현 카세트 (expression cassette)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 발현 카세트 및/또는 본 발명에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 생물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 발현 카세트, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 숙주 생물을 포함하는 약물로서의 용도를 위한 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 혈전성 질환 (thrombotic diseases)의 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 지혈 장애 (disorders of haemostasis)의 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 반흔 형성 제제 (cicatrisation agent)로서의 이들 조성물의 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 25번 위치 내지 152번 위치의 폴리펩타이드의 서열을 가지는 분리된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
서열번호 1의 1번 위치 내지 24번 위치의 펩타이드는 숙주 세포에 의한 재조합 단백질의 분비를 가능하게 하는 시그널 펩타이드 (signal peptide)에 해당한다. 본 시그널 펩타이드는 존재하지 않거나 당업자라면 잘 알고 있는 기법에 따라 다른 시그널 펩타이드로 대체될 수 있다. 당업자라면 다양한 원핵세포 또는 진핵세포 발현 시스템에서 본 발명의 폴리펩타이드의 발현 및 분비에 적합한 동종유래 (homologous) 또는 이종유래 (heterologous)의 시그널 펩타이드를 선택할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 진핵 세포 또는 생물에서, 상세하게는 포유동물 세포에서 생산된다. 본 발명의 상세한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 세포외 배지 (extracellular medium)에 그들의 분비를 가능하게 하는 시그널 펩타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 시그널 펩타이드의 절단 이후에 획득되는 성숙한 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 생물학적 활성을 가지며, 명확히 표준 기법에 따라 (Born, 1962) 혈소판 응집측정기 (platelet aggregometer)(레귤레스트, 플로란지, 프랑스)를 사용하여 검출되는 인간 혈액 혈소판 상에 전-응집 활성을 가진다. 혈소판-풍부 혈장 (PRP)은 작동제 (290 μl PRP 에서 10 μl)와 반응하도록 도입되고, 배지의 투명도 (clearing)(튜브의 바닥에 떨어지는 응집의 형성과 관련됨)가 실시간으로 감시된다 (응집 곡선). 혈장 응집이 없을 때는, 신호가 편평하게 유지된다 (안정한 혼탁 배지). 측정의 마지막 시점에 튜브를 조사하여 응집의 부재 또는 존재를 확인하는 것이 가능하다. 혈소판 응집 테스트 반응의 측정은 지속적으로 저어주면서 (1000 rpm) 37℃에서 수행된다. 장치는 하기와 같이 맞추어진다: 혈소판-풍부 혈장 (저속 원심분리에 의해 획득된 제조물)을 사용한 0% 응집 및 혈소판-결핍 혈장 (고속 원심분리에 의해 획득된 제조물)을 사용한 100% 응집. 혈소판 제조물의 품질은 항혈소판 치료제의 개발에 사용된 기준 작동제 (5 μM ADP 및 1 μg/ml의 콜라겐)에 대한 반응을 확인하여 측정되었다. 단백질은 비가역적인 방식으로 30% 이상 응집을 유도할 수 있을 때, 전-응집하는 것으로 판단된다.
많은 세포 타입의 표면 상에 발현되는 수용체 인식 펩타이드 모티브는 하기 타입의 폴리펩타이드 활성에 작용한다:
- 세포 부착,
- 세포 채용.
삼중 나선 구조와는 독립적으로 폴리펩타이드의 전-응집 효과는 혈소판 표면 상에 존재하는 하나 이상의 수용체 (α1β2, TIIICBP 및 GPVI)의 활성화의 결과이다. 또한 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 보존하는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 단편에 관한 것이다. 용어 폴리펩타이드의 "단편 (fragment)"는 그것이 유래된 폴리펩타이드의 전체가 아닌 일부분을 포함하는 폴리펩타이드를 가르킨다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 적어도 100개, 110개, 120개, 140개 또는 150개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
서열번호 1의 폴리펩타이드의 이들 단편은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 활성의 적어도 하나를, 상세하게는 인간 혈액 혈소판에 대한 전-응집 활성을 보존한다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 가진 단편에 관한 것이다. 용어 "생물학적 활성을 가진 단편 (biologically active fragment)"는 그것이 유래된 폴리펩타이드의 기능을 보존하는 폴리펩타이드의 단편을 가르킨다. 서열번호 1의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 가진 단편은 따라서 본 폴리펩타이드의 기능의 적어도 하나를 보존하고, 바람직하게는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 모든 생물학적 활성을 보존한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 측정하는 기법뿐만 아니라 폴리펩타이드의 단편을 제조하는 방법은 당업자라면 잘 알고 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 활성의 적어도 하나를 가지고 서열번호 1의 폴리펩타이드와 적어도 70% 일치하는 아미노산을 사용하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 바람직하게는, 이들 폴리펩타이드가 서열번호 1의 폴리펩타이드와 동일한 특성, 또한 명확히 동일한 생물학적 활성을 가진다. 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99% 일치하는 아미노산을 가지는 폴리펩타이드에 관한 것이다. "일치하는 아미노산 (identical amino acids)"은 두 가지 서열들 간 변화되지 않거나 (invariant) 교환되지 않은 (unchanged) 아미노산을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substitution)을 가질 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리펩타이드에 관한 것이다. "상동성 (homology)"은 단백질 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트 (percentage of identities) 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
서열번호 1의 폴리펩타이드와 소정의 상동성 또는 일치도의 정도를 가진 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 100개 또는 150개의 아미노산을 포함한다.
폴리펩타이드들 간 일치도의 정도 및 상동성의 정도를 측정하고 확인하는 방법은 당업자라면 잘 알고 있다. 벡터 NTi 9.1.0 소프트웨어 패키지 (인비트로겐사 인포맥스, http://www.invitrogen.com)의 얼라인X 정렬 도구 (AlignX alignment tool)[크러스탈 W 알고리즘 (Clustal W algorithm)]가 예를 들어 사용될 수 있고, 바람직하게는 디폴트 세팅을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 그들의 자연적 환경으로부터 분리되거나 정제된다. 본 폴리펩타이드는 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이들 방법은 명확히 적합한 숙주세포에 의한 재조합 폴리펩타이드의 생산 및 이에 이어지는 그들의 정제, 화학적 합성에 의한 생산 또는 마지막으로 이들 다양한 접근법의 조합이다. 당업자라면 이들 다양한 생산 방법을 잘 알고 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 재조합 원핵 또는 진핵세포에 의해 생산된다. 따라서 본 발명의 폴리펩타이드는 박테리아에서 또는 포유동물 세포에서 생산될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 단백질 또는 키메라 단백질 (chimeric proteins)에 관한 것이다. 용어 "폴리펩타이드 (polypeptides)"는 변형된 폴리펩타이드 뿐만 아니라 단백질을 가르킨다.
본 발명의 한 가지 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 당화되어 (glycosylated) 있다. 서열번호 1의 폴리펩타이드는 명확히 10번 및 141번 위치 (GXY 삼중자의 3번 위치에서)에 존재하는 라이신 아미노산 상에 O-당화 (O-glycosylation) 부위를 가진다. 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 93번 위치에서의 아스파라진 잔기는 당화되어 있다.
또한 본 발명은 상기에서 정의된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)"는 단일-가닥 뉴클레오타이드 사슬 또는 그의 DNA 또는 RNA 보체 (complement), 또는 게놈 DNA에 상보적일 수 있는 이중-가닥 뉴클레오타이드 사슬을 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA, 상세하게는 이중-가닥 DNA 이다. 또한 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 변형된 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 그들의 자연적 환경으로부터 분리되거나 정제된다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 샘브룩 (Sambrook) 등에 의해 기술된 바와 같은 고전적인 분자생물학 기법에 의해 [분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 1989] 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
첫 번째 구현예에서, 본 발명은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 두 번째 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1의 73번 위치와 459번 위치 사이에 그의 서열이 존재하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 상기에서 정의된 폴리펩타이드를 코딩한다.
또한 본 발명은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드와 또는 서열번호 2의 73번 위치와 459번 위치 사이에 그의 서열이 존재하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 일치도를 가지는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 서열번호 1의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보존하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
"일치하는 뉴클레오타이드 (identical nucleotides)"는 두 가지 서열들 간 변화되지 않거나 교환되지 않은 뉴클레오타이드를 의미한다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 기준 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드와 또는 서열번호 2의 73번 위치와 459번 위치 사이에 그의 서열이 존재하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또한 바람직하게는 적어도 99%의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 서열번호 1의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보존하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
"상동성 (homology)"은 핵산 서열들 간 유사도의 측정을 의미한다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 기준 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 가질 수 있다. 점수로 매겨진 두 가지 서열들 간 상동성의 정도는 일치도의 퍼센트 및/또는 서열의 치환을 보존하는 것에 근거한다.
핵산 서열들 간 일치도의 정도 및 상동성의 정도를 측정하고 확인하는 방법은 당업자라면 잘 알고 있다. 벡터 NTi 9.1.0 소프트웨어 패키지 (인비트로겐사 인포맥스, http://www.invitrogen.com)의 얼라인X 정렬 도구 (크러스탈 W 알고리즘)가 예를 들어 사용될 수 있고, 바람직하게는 디폴트 세팅을 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드와 또는 서열번호 2의 73번 위치와 459번 위치 사이에 그의 서열이 존재하는 폴리뉴클레오타이드와 선택적으로 하이브리드화 (hybridising) 할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게, 선택적인 하이브리드화 (selective hybridisation)는 중간 엄격도 (stringency)의 조건 하에서, 바람직하게는 높은 엄격도의 조건 하에서 수행된다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 서열번호 1의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩한다. "선택적으로 하이브리드화 할 수 있는 서열 (sequence capable of hybridizing selectively)"은 본 발명에 따르면 기본 노이즈 (background noise)보다 유의하게 높은 수준에서 기준 서열과 하이브리드화 하는 서열을 의미한다. 선택적으로 하이브리드화 할 수 있는 서열과 기준 서열 간의 상호작용에 의해 생성되는 시그널 수준은 일반적으로 10배 더 강력하고, 바람직하게는 기본 노이즈를 생성하는 다른 DNA 서열의 상호작용의 것보다 100배 더 강력하다. 선택적인 하이브리드화를 가능하게 하는 엄격한 하이브리드화 (stringent hybridization) 조건은 당업자라면 잘 알고 있다. 일반적으로, 하이브리드화 및 세척 온도는 주어진 pH 에서 주어진 이온 강도 (inonic strength)에 대해 기준 서열의 Tm 보다 적어도 5℃ 더 낮다. 전형적으로, 하이브리드화 온도는 15개 내지 50개 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 30℃이고, 50개 이상의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드의 경우 적어도 60℃이다. 예를 들어, 하이브리드화는 하기 완충용액에서 수행된다: 6X SSC, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜 (Ficoll), 0.02% BSA, 500 μg/ml 변성된 연어 정자 DNA. 예를 들어, 세척은 낮은 엄격도로 2X SSC, 0.1% SDS 완충용액에서, 중간 엄격도로 0.5X SSC, 0.1% SDS 완충용액에서 그리고 높은 엄격도로 0.1X SSC, 0.1% SDS 완충용액에서 연속하여 수행된다. 당연히 하이브리드화는 당업자라면 잘 알고 있는 다른 공통적인 방법에 따라 수행될 수도 있다 (상세하게는, 샘브룩 등, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼, 1989 참조). 바람직하게, 기준 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 기준 서열의 기능을 보존한다.
본 발명은 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 유전적 코드의 반복성 (degeneration)으로 인해, 서로 다른 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
"특이적으로 결합하는 (binding specifically)"는 이들 항체가 서열번호 1의 폴리펩타이드에만 결합하는 것을 의미한다. 상세하게는, 본 항체는 다른 항원에 결합하지 못하며, 명확히 다른 콜라겐성 단백질 (collagenous proteins)에는 결합하지 못한다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 특이적 모노클론 항체이고, 명확히 마우스 기원의 것, 당업자라면 잘 알고 있는 표준 방법에 따라 획득될 수 있을 키메라 또는 인간화된 것이다.
일반적으로, 모노클론 항체 또는 그들의 기능적 단편, 명확히 마우스 기원의 것을 제조하는 기법은 상세하게 항체 핸드북 [할로우 및 레인, 항체: 실험실 매뉴얼 (Antibodies: A Laboratory Manual), 콜드 스프링 하버 연구소, 콜드 스프링 하버 NY, p. 726, 1988] 또는 당업자라면 잘 알고 있는 하이브리도마-기초한 제조 기법 (hybridoma-based preparation technique)에 기술되어 있는 기법으로부터 선택될 수 있다. "항체"도 역시 키메라 (chimeric) 또는 인간화된 (humanized) 항체를 의미한다.
또한 본 발명은:
- 숙주 생물에서의 기능적 프로모터,
- 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드,
- 동일한 숙주 생물에서의 기능적 종결 서열,
을 전사 방향으로 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
본 발명의 한 가지 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당업자라면 잘 알고 있는 클로닝 기법을 사용하여 발현 카세트에 삽입된다. 본 발현 카세트는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 서열의 전사 및 해독에 필요한 요소 (elements)를 포함한다.
유익하게는, 본 발현 카세트는 동시에 숙주세포가 폴리펩타이드를 생산하도록 유도하는 요소 및 및 본 발현의 조절에 필요한 요소를 포함할 수 있다. 어떠한 타입의 프로모터 서열이라도 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용될 수 있다. 프로모터의 선택은 명확히 관심을 가진 유전자의 발현을 위해 선택된 숙주 생물에 의존적일 것이다. 소정의 프로모터는 전신 발현 (constitutive expression)을 가능하게 하는 한편 다른 프로모터는 반대로 유도가능하다 (inducible). 박테리아에서의 기능적 프로모터 중에서, 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제의 프로모터가 구체적으로 인용될 수 있다. 효모 (yeasts)에서의 기능적 프로모터 중에서는, GAL1 유전자 프로모터 또는 S. 세레비시애 (S. cerevisiae)의 GAL4 및 ADH 프로모터가 인용될 수 있다. 고등한 진핵세포에서 명확히 포유동물세포에서의 기능적 프로모터 중에서는, CMV (사이토메갈로바이러스), SV40, RSV (라우 사코마 바이러스), 인간 또는 닭의 베타-액틴, 베타-글로빈, PGK (포스포글리세레이트 키나제), EF1알파, 티미딘 키나제, 및 MMTV (마우스 유선종양 바이러스)가 인용될 수 있다. 이들 프로모터 모두는 참고문헌에 기술되어 있고 당업자라면 잘 알고 있다.
본 발명에 따른 발현 카세트는 더 나아가 예를 들어 조절 요소 (regulation elements) 또는 숙주 생물에 의해 생산된 폴리펩타이드의 분비를 가능하게 하는 시그널 서열과 같은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 필요한 어떠한 다른 서열이라도 모두 포함할 수 있다. 명확히 발현 카세트에 삽입되는 코딩 서열의 발현 수준을 증가시키는 어떠한 조절 서열이라도 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 명확히 전사 활성인자 (transcription activators)["인핸서 (enhancers)"]와 같은 프로모터와 코딩 서열 사이에 위치하는 기타 조절 서열은 프로모터 조절 서열과 조합하여 사용될 수 있다.
매우 다양한 종결 서열 (termination sequences)이 본 발명에 따른 발현 카세트에 사용될 수 있다; 이들 서열은 전사의 종결 및 mRNA 폴리아데닐화를 가능하게 한다. 선택된 숙주 생물에서의 어떠한 기능적 종결 서열이라도 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 유익하게 본 발명에 따른 발현 카세트는 벡터에 삽입된다.
따라서 본 발명은 또한 숙주 생물의 형질전환에 사용되는 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트를 포함하는 복제 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 벡터는 명확히 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드 (plasmid), 코스미드 (cosmid), 박테리오파지 (bacteriopharge) 또는 바이러스에 해당된다. 이들 벡터를 제작하고 이들 벡터에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 삽입하는 기법은 당업자라면 잘 알고 있다. 일반적으로, 명확히 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 유도하기 위하여유지될 수 있거나, 자가 복제할 수 있거나 숙주 세포에서 증식될 수 있는 어떠한 벡터라도 사용될 수 있다. 당업자라면 형질전환되는 숙주 생물에 따른, 또한 사용되는 형질전환 기법에 따른 적합한 벡터를 선택할 것이다.
본 발명의 벡터는 명확히 숙주 생물에서 본 발명에 따른 벡터의 복제 및/또는 폴리펩타이드의 발현의 관점으로 숙주 생물을 형질전환시키는 데 사용된다.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다:
- 숙주 생물은 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터로 및/또는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드로 형질전환되고,
- 숙주 생물에 의해 생산된 폴리펩타이드는 분리된다.
또한 본 발명은 상기 언급된 숙주 생물에 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트 또는 벡터를 도입하는 것에 의해 숙주 생물을 형질전환시키는 방법에 관한 것이다. 본 폴리뉴클레오타이드는 숙주 생물의 게놈에 도입되거나 숙주 생물에 적합한 방식으로 복제될 수 있다. 숙주 생물을 형질전환시키는 방법은 당업자라면 잘 알고 있으며 참고문헌에 널리 기술되어 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 따른 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트 또는 벡터로 형질전환된 숙주 생물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 "숙주 생물 (host organism)"은 상세하게 단세포성 (unicellular) 또는 다세포성 (multicellular), 하등 또는 고등 생물, 상세하게는 박테리아, 효모 및 고등 진핵생물의 세포로부터 선택되며, 상세하게는 CHO (Chinese hamster ovary 세포), BHK (baby hamster kidney), HEK-293 (인간 배아 신장 세포주), NSO (마우스 마이엘로마 세포주), Per.C6 (Crucell), 및 YB2/0 (ATCC 기탁번호 제 CRL 1662호)와 같은 포유동물 세포 모두를 의미한다. "숙주 생물"은 비인간 생물을 의미한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 발현 카세트, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 숙주 생물을 포함하는 약물로서의 용도를 위한 조성물에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 발현 카세트, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 숙주 생물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 혈전증 (thromboses)의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 지혈 장애 (disorders of haemostasis)의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 반흔 형성 제제 (cicatrisation agent)로서의 용도를 위한 상기 조성물에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명적 조성물은:
- 하기를 검출하는 진단적 반응용액:
● 소정의 혈소판 기능 이상
● 혈액학적 질환
- 피부학적 및 화장품 크림의 조성물에서 지혈 붕대 및 부착제의 활성 성분
으로도 역시 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 발현 카세트, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 숙주 생물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 혈전증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
마지막으로 본 발명은 약물의 제조를 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 형질전환된 숙주 생물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에서 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 형질전환된 숙주 생물 그리고 적합한 약제학적 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 섭생 용량 (dosing regimen)은 문제가 되는 치료 및 질환에 따라 달라진다. 상기 조성물은 이러한 방식으로 제조되어 소화적 (digestive) 또는 비경구적 (parenteral) 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 경구적 (oral), 설하 (sublingual), 피하적 (subcutaneous), 근육내 (intramuscular), 정맥내 (intravenous), 경피적 (transdermal), 국소적 (local) 또는 직장 (rectal) 투여를 위한 약제학적 조성물에서, 활성 성분은 전통적인 약제학적 담체와 혼합되어 유닛 투여 형태로 동물 또는 인간에게 투여될 수 있다. 투여에 관한 적합한 유닛 형태는 정제, 젤라틴 캡슐, 파우더, 입자 및 경구적 용액 또는 현탁액; 설하 및 구강 투여 형태; 피하, 근육하, 정맥내, 비강내 또는 안구내 투여 형태; 또한 직장 투여 형태를 포함한다.
정제 형태로 고형 조성물이 제조될 때, 주요 활성 성분은 젤라틴, 전분, 락토스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 아라비아 검 또는 유사물질과 같은 약제학적 부형제와 혼합된다. 정제는 사카로스 또는 기타 적합한 물질로 코팅될 수 있고 그들이 연장되거나 지연된 활성을 가지도록 또한 미리 정해진 양의 활성을 지속적으로 방출할 수 있도록 처리될 수 있다.
젤라틴 캡슐로의 제조물은 활성 성분을 희석제와 혼합하고 획득된 혼합물을 부드러운 또는 딱딱한 젤라틴 캡슐 내에 붓는 것에 의해 획득된다.
시럽 또는 엘리시르 형태에서의 제조물은 향미제 (flavoring agent) 및 적합한 색상제 (colorant)뿐만 아니라 감미료 (sweetner), 방부제와 함께 활성 성분을 포함할 수 있다.
물-분산가능한 파우더 또는 입자는 미각 교정인자 또는 감미료뿐만 아니라 분산 또는 습윤 제제, 또는 분산 제제와 혼합하여 활성 성분을 포함할 수 있다.
이들 조성물은 또한 피부학에서 고전적으로 사용된 에몰리엔트 (emollients), 수화 (hydrating) 활성 성분, 피부막 (cutaneous barrier) 재생 제제, 항-자극제 (anti-irritants), 및 안정제 (soothing agents)와 같은 활성 성분을 포함한다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 국소적 적용에 적합한 다양한 제조물 형태로 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면 다양한 제조물은 국소적 적용에 적합하며, 크림 에멀젼, 밀크 (milks), 포마드 (pomades), 로션, 오일, 수성 또는 하이드로-알코올 또는 글리콜 용액, 파우더, 스프레이, 젤리, 젤, 하이드로젤 또는 기타 다른 외부 적용을 위한 제품을 포함한다. 또한 이들 화장품 조성물은 항산화제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 본 발명은 더 나아가 본 발명에 따른 조성물을 적용하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 화장품 치료, 위생 관리, 또는 장식 (embellishment)의 방법, 및/또는 본질적인, 외부적인 또는 호르몬적인 노화와 관련되거나, 외인성 공격 (오염물질, UV, 스트레스 등)과 관련되거나, 알레르기 성향과 관련되거나, 색소침착 질환과 관련된 불균형을 가진, 점막 및/또는 정상적, 건조한, 기름진, 복합성, 탈수화된, 노화된, 민감한, 자극된, 안정되지 못한, 내성이 없는 피부를 향수 처리하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 일시적인 방식 (transitory fashion)으로 형질전환된 부착하는 CHO-S 세포에서 단백질을 코딩하는 메신저 RNA의 발현을 나타낸 것이다.
도 2는 에피네프린 (epinephrine)의 존재 시 또는 부재 시, 일시적인 방식으로 형질전환된 부착하는 CHO-S 세포의 조정된 배지 (conditioned medium)에 의해 유도되는 혈소판 응집을 나타낸 것이다.
도 3은 안정한 세포 클론에서 단백질을 코딩하는 메신저 RNA의 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 정제 이후에 획득된 다양한 박테리아 분획에서 단백질-6X-히스티딘의 존재 여부의 웨스턴 블럿팅에 의한 검출을 나타낸 것이다.
도 5는 박테리아에서 생산된 단백질에 의해 유도된 혈소판 응집을 나타낸 것이다.
도 6은 면역화 89일 이후에 획득된 토끼 혈청의 특이도의 웨스턴 블럿팅에 의한 평가를 나타낸 것이다.
도 2는 에피네프린 (epinephrine)의 존재 시 또는 부재 시, 일시적인 방식으로 형질전환된 부착하는 CHO-S 세포의 조정된 배지 (conditioned medium)에 의해 유도되는 혈소판 응집을 나타낸 것이다.
도 3은 안정한 세포 클론에서 단백질을 코딩하는 메신저 RNA의 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 정제 이후에 획득된 다양한 박테리아 분획에서 단백질-6X-히스티딘의 존재 여부의 웨스턴 블럿팅에 의한 검출을 나타낸 것이다.
도 5는 박테리아에서 생산된 단백질에 의해 유도된 혈소판 응집을 나타낸 것이다.
도 6은 면역화 89일 이후에 획득된 토끼 혈청의 특이도의 웨스턴 블럿팅에 의한 평가를 나타낸 것이다.
실시예
A. 포유동물 세포에 의한 일시적인 생산
1. 벡터 제작
플라스미드 1 (
NVH001
-A)
플라스미드 NVH001 -A 는 하기 요소들을 포함한다:
- 플라스미드 pCIneo (프로메가사: pCIneo 포유동물 발현 벡터)로부터 얻은 인트론
- 벡터 pUC57-NVH001 [진큐스트 (GeneCust)로부터 주문됨]로부터 얻고 타입 -III 콜라겐 시그널 펩타이드를 포함하는 본 발명적 단백질 NVH001 (NP_000081)
- hGH mRNA 로부터 얻은 폴리A 테일 (NM_000515)
- pCDF1-MCS1-EF1-copGFP [시스템 바이오사이언스 (System Biosciences): pCDF cDNA 클로닝 및 발현 렌티벡터 (Lentivectors)]로부터 얻은 CMV 프로모터.
플라스미드 2 (
NVH001
-B1), 3 (
NVH001
-B2), 4 (
NVH001
-
C1
) 및 5 (
NVH001
-
C2
)
플라스미드 NVH001 -B1 및 NVH001 - C1 는 하기 요소 (elements)를 포함한다:
- 플라스미드 pSV2-Neo로부터 유래한 SV40 기원점 (ori SV40: ATCC 37149 벡터에서의 1-989 위치)
- 분자적 클로닝 (Molecular Cloning)에 기술된 내용의 하나일 수 있는 프로모터/인핸서: 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼: 제 3판, 샘브룩 (Sambrook) 및 러셀 (Russel), 2001, 콜드 스프링 하버 연구소 출판사
- pMono-hygro-mcs (인비트로겐사)로부터 얻은 하이그로마이신 카세트
- 벡터 pUC57-NVH001 [진큐스트 (GeneCust)로부터 주문됨]로부터 얻고 타입 -III 콜라겐 시그널 펩타이드를 포함하는 본 발명적 단백질 NVH001 (NP_000081)
- 플라스미드 pUC57-NVH001 (진큐스트로부터 주문됨)으로부터 얻은 C-프로펩타이드
- hGH mRNA 로부터 얻은 폴리A 테일 (NM_000515)
플라스미드 NVH001 -B2 및 NVH001 - C2 는 플라스미드 NVH001 -B1 및 C1 와 C-프로펩타이드를 제외하고는 동일한 요소를 포함한다.
모든 최종적인 플라스미드는 돌연변이가 관심을 가진 단백질의 DNA 에 또한 제공된 요소에 전혀 도입되지 않았던 점을 확인하기 위하여 시퀀싱된다.
2. 포유동물 세포의 형질전환
플라스미드 1 (
NVH001
-A)
1. 벡터 NVH001-A가 일시적인 방식으로 부착되도록 만들어진 CHO-S 세포에 형질전환되고, 인비트로겐사로부터 구입한 리포펙타민 2000 키트 (Lipofectamine 2000 kit)를 사용하여 5% 우태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 배양된다.
2. 배양 상청액은 3일 및 4일째에 수집되고, 생산된 단백질은 정제된 다음 그들의 혈소판 결합 활성 (platelet binding activity)이 응집측정기를 사용하여 테스트된다.
플라스미드 2 (
NVH001
-B1), 3 (
NVH001
-B2), 4 (
NVH001
-
C1
) 및 5 (
NVH001
-
C2
)
1. 벡터 NVH001 -B1, NVH001 -B2, NVH001 - C1 및 NVH001 - C2 가 일시적인 방식으로 부착되도록 만들어진 CHO-S 세포에 형질전환되고, 인비트로겐사로부터 구입한 리포펙타민 2000 키트를 사용하여 5% 우태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 배양된다.
형질전환된 세포의 RNA는 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일째에 800 μl의 트리졸 (TRIZOL, 인비트로겐사)을 첨가하여 추출된다. 이에 해당하는 cDNA는 역전사 (reverse transcription)에 의해 1μg의 전체 RNA로부터 획득된다. PCR에 의한 증폭은 cDNA 상에서 수행된다. 그 다음 증폭자 (amplicons)는 2% 아가로스 젤 상에125V 에서 30분 동안 전개시킨 이후에 검출된다. 양성 대조군 (형질전환시킨 플라스미드) 및 음성 대조군에 대해서도 역시 수행된다. 분자량 마커 (왼쪽)가 증폭자의 크기를 확인하는 데 사용된다.
본 발명적 단백질을 코딩하는 mRNA 로 형질전환시킨 세포에서 발현은 1일째에 관찰된다. 이 발현은 시간이 갈수록 약간씩 증가하고 5일 이후에는 유지된다. mRNA 발현의 진행 과정은 도 1 에 나타나 있다.
2. 배양 상청액은 3일 및 4일째에 수집되고, 생산된 단백질은 정제된 다음 그들의 혈소판 결합 활성이 응집측정기를 사용하여 테스트된다.
3. 본 발명적 단백질의 생물학적 활성: 혈소판 응집
본 발명적 단백질의 혈소판 결합 활성은 응집측정법 (aggregometry)에 의해 측정된다. 사이트레이트 튜브 (citrate tubes)에서의 혈액 시료는 건강한 지원 공여자로부터 서명으로 동의한 이후에 수집되고, 혈소판-풍부 혈장 (PRP)를 획득하기 위해 150g 에서 15분 동안 원심분리된다. 농축은 300 기가/L (giga/L)로 맞추어 조정된다. 응집 테스트는 레귤레스트® (Regulest®) 혈소판 응집측정기를 사용하여 37℃에서 저어주면서 (1000 rpm) 수행된다. 본 기법은 혈소판 기능 활성인자에 반응하는 혼탁한 배지, PRP의 광 투과 (light transmission)의 진행과정을 측정하는 것으로 구성되는 본 방법 (Born method)에 따른 광도측정법 (photometric reading)을 근거로 한다. 혈소판 응집이 형성되는 경우, 배지는 깨끗해지고 광 투과의 증가가 관찰된다. 30% 이상의 증가가 본 투명도 (clearing)에 해당하는 곡선에서의 단절과 연관된 본 투과에서 관찰될 때 전-응집 활성을 가지는 것으로 판단한다.
도 2는 에피네프린 (epinephrine)의 존재 시 또는 부재 시, 일시적인 방식으로 형질전환된 부착하는 CHO-S 세포의 조정된 배지 (conditioned medium)에 의해 유도되는 혈소판 응집을 나타낸 것이다.
반응 혼합물은 0.1 μM의 에피네프린의 존재 시 또는 부재 시, 30 μl의 조정된 배지가 첨가된 290 μl의 PRP로 구성된다. 혈소판 반응은 10분 동안 측정된다. 자가-응집 (-○-)을 기본선 (baseline)으로 정의한다. 0.1 μM의 에피네프린을 첨가한 것은 10분 동안 안정하게 유지되는, 약간의 기본선의 이동을 유발한다 (-●-). 30 μl의 조정된 배지를 첨가한 것은 2분 이후에 제한된 반응 (18%)을 유발하였다 (-▽-). 이러한 이동은 관찰 10분 동안 안정하게 유지된다. 30 μl의 조정된 배지를 첨가하는 것에 이어서 2분 동안 에피네프린을 첨가한 것은 5분 이후에 전체 혈소판 응집을 유발하였다 (-▼-). 이러한 응집은 가역적이지 않아서 형성된 응집이 안정한 것을 보여준다.
형질전환되지 않은 부착하는 CHO-S 세포의 조정된 배지 30 μl를 첨가하는 것은 응집을 유발하지 못한다 (결과 미도시).
B. 포유동물 세포에 의한 안정한 생산
1. 벡터 제작
플라스미드 1 (
NVH001
-A)
1. 인트론-NVH001-hGHpA 유닛을 일시적 발현을 위해 제작된 벡터로부터 분리하여 pMono-hygro-mcs (인비트로겐사)로부터 얻은 하이그로마이신 (hygromycin) 카세트를 포함하는 생산 벡터에 클론한다.
2. 최종적인 플라스미드는 돌연변이가 관심을 가진 단백질의 DNA 에 또한 제공된 요소에 전혀 도입되지 않았던 점을 확인하기 위하여 시퀀싱된다.
3. 직선화된 벡터 (linearised vector)는 인비트로겐사로부터 구입한 리포펙타민 2000 키트를 사용하여 부착되도록 만들어진 CHO 세포에 안정한 방식으로 형질전환된다. 형질전환된 세포는 하이그로마이신 B의 진보적인 수준에 의해 선택된다.
도 3은 안정한 세포 클론에서 단백질을 코딩하는 메신저 RNA의 발현을 나타낸 것이다.
세포 RNA 는 1일, 2일, 3일 및 4일째에 800 μl의 트리졸 (인비트로겐사)을 첨가하여 추출된다. 이에 해당하는 cDNA는 역전사에 의해 1μg의 전체 RNA 로부터 획득된다. PCR 증폭은 프라이머 5'-AGCTGGCGCGCCGCCACCATG-3' (S) 및 5'-GCTTCCGGGAGGCCCTGGCTTCCCATC-3' (AS)를 사용하여 cDNA 상에서 수행된다. 그 다음 증폭자가 2% 아가로스 젤 상에 125V 에서 30분 동안 전개시킨 이후에 검출된다. 플라스미드 DNA 에 해당하는 양성 대조군이 사용된다. 분자량 마커 (오른쪽)가 증폭자의 크기를 확인하는 데 사용된다. 안정한 발현이 세포 클론에서 관찰된다.
C. 박테리아에서의 생산
1. 제작
관심을 가진 분자의 DNA (NVH001)가 단백질 NVH001의 N-말단 측면 상에 6X-히스티딘 태그를 첨가하는 것을 가능하게 만드는 tagNVH001-센스 프라이머: GCTGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACGGTCGCCCGGGAGCTCCTGGAGAGAGAGGATTG 및 tagNVH001-안티센스 프라이머: GCACGGATCCTATTAGCCAGGGCAAGGTCCAGGGGCTC 를 사용하여 벡터 pUC57-NVH001 상에서 PCR 에 의해 증폭된다. PCR 산물은 박테리아에서 분자의 생산을 가능하게 하는 벡터 pET3d (pET3d-NVH001)에 클론된다 (뉴잉글랜드 바이오랩사).
DNA의 존재 및 정확한 서열은 시퀀싱에 의해 확인된다.
2. 생산
1. 벡터 pET3d-NVH001은 단백질의 대량 생산을 가능하게 하는 BL21 박테리아에 형질전환된다.
2. 박테리아는 1 L 영양 배지에 접종되고 박테리아가 기하급수적 단계에 이르는 OD600nm 가 획득될 때까지 37℃에서 배양된다.
3. 단백질 생산은 IPTG 에 의해 30℃에서 5시간 동안 유도된다.
4. 박테리아는 펠렛으로 만들어지고 용해되며 본 발명적 단백질은 수용성 (상청액) 및 불용성 (봉입체) 박테리아 분획으로 나누어 매처레이-나겔 (Macherey-Nagel) 항-6X-히스티딘 태그 컬럼 상에서 정제된다.
도 4는 정제 이후에 획득된 다양한 박테리아 분획에서 단백질-6X-히스티딘의 존재 여부의 웨스턴 블럿팅에 의한 검출을 나타낸 것이다.
항-6X-히스티딘 태그 컬럼의 용출 이후에, 획득된 40 μl의 각 분획을 16% 폴리아크릴아마이드 젤 상에 올린다. 전기영동 (electrophoresis)은 분자량 마커 (에머샴사)의 존재 하에서 미니-프로테인 3 전개 시스템 (Mini-Protein 3 migration system) (바이오래드사)을 사용하여 전개 완충용액 (migration buffer, 192 Mm 글리신, 25 Mm 트리스-HCl pH 6.8 및 0.1% SDS)으로 18 mA 에서 수행된다. 젤 상에서 분리된 단백질은 PVDF 멤브레인 (바이오래드사) 상에서 60분 동안 70V 로 이동된다. 비-특이적 결합은 37℃에서 120분 동안 5% 스킴 밀크를 포함하는 트리스 + 0.1% 트윈-20의 식염수에서 저어주는 멤브레인의 배양에 의해 차단된다. 그 다음 멤브레인은 TBS-T에서 1/1000으로 희석된 항-6X-히스티딘 태그 모노클론 항체 [셀 시그널링사 (Cell Signaling)]를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 배양된다. TBS-T 로 5분 동안 3번 세척한 이후, 멤브레인은 1/10,000으로 희석된 퍼옥시다제 [잭슨 연구소 (Jackson Laboratories)]와 결합된 항-마우스 항체로 상온에서 60분 동안 배양된다. 막은 다시 TBS로 5분 동안 세 번 세척된다. 그 결과는 ECL 키트 (에머샴사)를 사용하는 화학발광 기법 (chemiluminescence technique)에 의해 영상화된다.
단백질의 존재는 다양한 분획에서 관찰된다. 대략 19 kDa의 분자량으로 확인되는 주요한 밴드는 단백질의 모노머 형태에 해당한다. 또한 밴드는 26 kDa, 43 kDa 및 60 kDa의 분자량을 가진 단백질에 해당하는 소정의 분획에서도 관찰된다.
3. 본 발명적 단백질의 생물학적 활성: 혈소판 응집
본 발명적 단백질의 혈소판 결합 활성은 응집측정법에 의해 측정된다. 사이트레이트 튜브에서의 혈액 시료는 건강한 지원 공여자로부터 서명으로 동의한 이후에 수집되고, 혈소판-풍부 혈장 (PRP)를 획득하기 위해 150g 에서 15분 동안 원심분리된다. 농축은 300 기가/L (giga/L)로 맞추어 조정된다. 응집 테스트는 레귤레스트® (Regulest®) 혈소판 응집측정기를 사용하여 37℃에서 저어주면서 (1000 rpm) 수행된다. 본 기법은 혼탁한 배지로 시작하는 PRP를 통하여 혈소판 기능 활성인자에 반응하는 광 투과 (light transmission)의 진행과정을 측정하는 것으로 구성되는 본 방법 (Born method)에 따른 광도측정법 (photometric reading)을 근거로 한다. 혈소판 응집이 형성되는 경우, 배지는 깨끗해지고 광 투과의 증가가 관찰된다. 30% 이상의 증가는 본 투명도 (clearing)에 해당하는 곡선에서의 단절과 연관된 본 투과에서 관찰될 때 전-응집 활성을 가지는 것으로 판단한다.
도 5는 박테리아에서 생산된 단백질에 의해 유도된 혈소판 응집을 나타낸 것이다.
항-6X-히스티딘 태그 컬럼으로부터 용출되고 웨스턴 블럿팅에 의해 검출되는 단백질을 포함하는 다양한 분획이 수집되고 냉동건조물 (lyophilisate)이 원심분리에 의해 획득된다. 이러한 냉동건조물의 일부는 0.25% 글루타르알데하이드의 존 재 하 4℃에서 3시간 동안 배양된 다음 응집측정법에 사용되기 이전에 하룻밤 동안 4℃에서 1X PBS 에 대항하여 투석된다.
반응 혼합물은 30 μl의 단백질을 포함하는 PBS 가 첨가된 290 μl의 PRP 로 구성된다. 혈소판 반응은 25분 동안 측정된다. -○- 및 -▽- 로 표시된 선은 PBS 용액 및 투석된 PBS-글루타르알데하이드 용액을 첨가한 이후에 획득된 반응을 각각 나타낸 것이다: 응집은 전혀 관찰되지 않는다. 글루타르알데하이드에 의해 응집되지 못하거나 (-▼-) 글루타르알데하이드에 의해 응집되고 투석된 (-●-) 단백질을 포함하는 PBS를 첨가한 것은 그들이 첨가되고 10분 이후에 유의한 응집을 보여준다. 이러한 응집은 20분 이후에 각각 90% (-▼-) 및 100% (-●-)에 도달한다.
D. 토끼에서 항-관심을 가진 단백질의 항체의 생산
1. 본 단백질은 이전에 기술된 바와 같이 BL21 박테리아에서 대량으로 생산된다.
2. 두 마리의 토끼가 프런드 아쥬반트 (Freund's adjuvant)가 보충된 (v/v) 정제된 단백질로 3주 간격으로 4번, 다시 말하면 D0, D21, D42 및 D63에 면역화된다.
3. 토끼는 이 프로토콜의 마지막에 D89일째에 희생시키고, 동물의 실혈 (exsanguination) 이후에 혈청을 원심분리에 의해 회수한다.
4. IgG 는 혈장 단백질을 제거하기 위하여 특이적 컬럼 상에서 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography)에 의해 정제된다.
도 6은 면역화 89일 이후에 획득된 토끼 혈청의 특이도 (specificity)의 웨스턴 블럿팅에 의한 평가를 나타낸 것이다.
응집 활성이 응집측정법에 의해 평가되었던 박테리아에서 생산된 단백질의 두 가지 제조물 10 μl가 16% 폴리아크릴아마이드 젤 상에 올려진다. 전기영동은 분자량 마커 (에머샴사)의 존재 하에서 미니-프로테인 3 전개 시스템 (바이오래드사)을 사용하여 전개 완충용액 (192 Mm 글리신, 25 Mm 트리스-HCl pH 6.8 및 0.1% SDS)으로 18 mA 에서 수행된다. 젤 상에서 분리된 단백질은 PVDF 멤브레인 (바이오래드사) 상에서 60분 동안 70V 로 이동된다. 비-특이적 결합은 37℃에서 120분 동안 5% 스킴 밀크를 포함하는 트리스 + 0.1% 트윈-20의 식염수에서 저어주는 멤브레인의 배양에 의해 차단된다. 그 다음 멤브레인은 면역화 프로토콜의 D89일째에서 가져오고 1/100으로 희석된 토끼 혈청 또는 TBS-T에 1/1000으로 희석된 항-6X-히스티딘 태그 모노클론 항체 (셀 시그널링사) 둘 중 하나와 4℃에서 하룻밤 동안 배양된다. TBS-T로 5분 동안 3번 세척한 이후에, 멤브레인은 1/10,000으로 희석된 퍼옥시다제 (잭슨 연구소)와 결합된 항-마우스 항체로 상온에서 60분 동안 배양된다. 막은 다시 TBS 에서 5분 동안 세 번 세척된다. 그 결과는 ECL 키트 (에머샴사)를 사용하는 화학발광 기법에 의해 영상화된다.
영상화 (visulaisation)는 60kDa의 분자량을 가진 두 가지 단백질 제조물 (A, 웰 1 및 2)에 존재하는 이중 밴드의 존재를 보여준다. 이러한 밴드는 항-6X-히스티딘 태그 항체에 의해서도 역시 검출되고, 따라서 이것이 본 발명적 단백질 (B, 웰 1 및 2)인 점을 보여준다. 우리가 박테리아의 정제된 분획 상에서 항-6X-히스티딘 태그 항체에 의해 검출되는 다른 밴드를 더 이상 관찰하지 못한 점을 주목해야 한다. 이러한 결과는 면역화가 단지 본 발명의 단백질의 복수체 형태 (multimeric form)에 대해서만 효과적이라는 점 그리고 본 발명의 단백질이 일단 정제되면 복수체 (multimer)로 조립되는 점을 제시하여 준다.
서열의 기재
서열번호 1: Coll-III-유사 재조합 단백질
서열번호 2: Coll-III-유사 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드
서열번호 3-6: 프라이머들
SEQUENCE LISTING
<110> Centre Hospitalier Universitaire de Dijon
VANDROUX, David
DE MAISTRE, Emmanuel
PROST, Edouard
<120> Recombinant proteins having haemostatic activity and capable of inducing platelet aggregation
<130> D26270
<150> FR 0856423
<151> 2008-09-24
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Coll-III-like recombinant protein
<400> 1
Met Met Ser Phe Val Gln Lys Gly Ser Trp Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
His Pro Thr Ile Ile Leu Ala Gln Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro
35 40 45
Gly Arg Asp Gly Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly
50 55 60
Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser
65 70 75 80
Gln Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro
85 90 95
Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
100 105 110
Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
115 120 125
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Pro Pro
130 135 140
Gly Ala Pro Gly Pro Cys Pro Gly
145 150
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sequence coding for recombinant Coll-III-like protein
<400> 2
atgatgagct tcgtgcagaa ggggagctgg ctgcttctcg ctctgcttca tcctactatt 60
atcctggcac aggggcgccc cggagctcct ggagagagag gattgcctgg acctccaggg 120
cccagaggag ctgctggaga acctggcaga gatggcgtcc ctggaggacc aggaatgagg 180
ggcatgcccg gaagcccagg aggaccagga agcgatggga agccagggcc tcccggaagc 240
cagggagaaa gcggcagacc aggacctcct ggagagaacg gaaagcctgg agaaccaggc 300
ccaaagggag atgccggacc acctggccca ccaggccctc ccggaccacc tggacctcca 360
ggccctcctg gccctcctgg acctcctgga ccacctggac ctccaggccc aagaggcgac 420
aagggacctc ctggagcccc tggaccttgc cctggctaa 459
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sense primer (S)
<400> 3
agctggcgcg ccgccaccat g 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Antisense primer (AS)
<400> 4
gcttccggga ggccctggct tcccatc 27
<210> 5
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> tagNVH001-sense primer
<400> 5
gctgccatgg gcagcagcca tcatcatcat catcacggtc gcccgggagc tcctggagag 60
agaggattg 69
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> tagNVH001-antisense primer
<400> 6
gcacggatcc tattagccag ggcaaggtcc aggggctc 38
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide motif
<400> 7
Gly Ala Pro Gly Glu Arg
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Peptide motif
<400> 8
Lys Pro Gly Glu Pro Gly Pro Lys
1 5
Claims (16)
- 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 25번 위치 내지 152번 위치의 폴리펩타이드의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드.
- 제 1항에 있어서,
인간 혈액 혈소판의 응집을 혈소판 응집측정기로 37℃에서 1,000 rpm으로 저어주어 30% 이상 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩타이드. - 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제 3항에 있어서,
서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오타이드. - 서열번호 1의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
- - 숙주 생물에서의 기능적 프로모터,
- 제 3항에 따른 폴리뉴클레오타이드,
- 동일한 숙주 생물에서의 기능적 종결 서열:
을 전사 방향으로 포함하는 발현 카세트 (expression cassette). - 제 3항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 6항에 따른 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 3항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 6항에 따른 발현 카세트로 형질전환된, 인간을 제외한 숙주 생물.
- 제 7항에 따른 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 숙주 생물.
- 제 1항에 따른 폴리펩타이드, 제 3항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 6항에 따른 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 죽상혈전증 치료, 출혈 치료 또는 반흔 형성 (cicatrisation) 촉진 약물로서 용도를 위한 조성물.
- 제 7항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 죽상혈전증 치료, 출혈 치료 또는 반흔 형성 (cicatrisation) 촉진 약물로서 용도를 위한 조성물.
- 제 8항에 따른 숙주 생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 죽상혈전증 치료, 출혈 치료 또는 반흔 형성 (cicatrisation) 촉진 약물로서 용도를 위한 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.
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