JP4003836B2 - 新規プロコラーゲン - Google Patents
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Description
コラーゲン(プロセシングされたプロコラーゲン分子または三重螺旋のプロセシングしたプロコラーゲン単量体分子としても知られる)(概説には、カドラー(Kadler, K.)、1995、Protein Profile、"Extracellular Matrix 1:fibril-forming collagens"、2:491−619;アヤド(Ayad, S.)ら1994、ザ・エクストラセルラー・マトリックス・ファクツ・ブック(The Extracellurar Matrix Facts Book)、アカデミック・プレス(Academic Press)、ロンドン、ISBN 0−12−068910−3および参考文献として本明細書に引用するものを参照)は殆ど細繊維の形態で結合組織の細胞外マトリクス(ECM)に存在する動物中の主要構造タンパク質である。該コラーゲン細繊維(多量体コラーゲン)は結合組織の機械的な強度の主要起原であり、細胞接着のための土台および動的分子相互作用の足場を提供する。コラーゲンファミリーは三重螺旋に巻き込んだ3本のコラーゲンα−鎖を含む複雑なマルチドメインタンパク質を含む。少なくとも20の遺伝的に特徴的であるコラーゲンのタイプが明らかにされるべく記載され、該コラーゲンは、コードされるタンパク質の遺伝子ホモロジーおよび機能に基づいてサブグループに分類されることができる。細繊維形成コラーゲン(I、II、III、VおよびXI型:表1参照)を可溶性プロコラーゲン(プロα鎖、プロコラーゲンα−鎖および単量体鎖としても知られる)として合成され、C−プロペプチド、Gly−X−Y繰り返し含有領域(細繊維形成コラーゲン単量体鎖の場合には阻止されていない(uninterrupted)コラーゲンα−鎖を含む)およびN−プロペプチドを含む。該プロα鎖は三量体化して非プロセシングプロコラーゲン分子(単量体プロコラーゲン分子および三量体化したプロα鎖としても知られる)を形成し、N−末端プロペプチドドメインおよびC−末端プロペプチドドメイン(N−プロペプチドおよびC−プロペプチド)の酵素的開裂により細繊維構造へ集合する(図1参照)。
該プロα鎖をコードする遺伝子は非常に似通っているが、該プロα鎖の折り畳みおよび三量体化をコントロールするプロセスについては比較的殆ど知られておらず(ディオン(Dion, A.S.)およびマイヤーズ(Myers, J.C.)、1987、J. Molec. Biol.、193:127−143)およびコラーゲンの僅かに限られた範囲が形成される。例えば、皮膚繊維芽細胞は同時に6つの非常に類似のプロα鎖を合成する(プロα1(I)、プロα1(III)、プロα1(V)、プロα2(I)、プロα2(V)およびプロα3(V))。該6つのプロα鎖の組合せの可能性が非常に多数であるにもかかわらず、コラーゲン鎖の特別な組合せのみが存在する−これらはI、IIIおよびV型コラーゲンを産み出すものである。I型コラーゲンはヘテロダイマーとして存在し、2つのプロα1(I)鎖および1つのプロα2(I)鎖の化学量論([プロα1(I)]2プロα2(I))と共に集める。プロα2(I)のホモ三量体は検出されず、従って、三量体におけるこの鎖の含有はプロα1(I)鎖との関連に依存する。III型コラーゲンはホモ三量体([プロα1(III)]3)を含み、組成の鎖はI型コラーゲンプロα鎖のいずれかを集めない。V型コラーゲンは鎖の組成に関する不均一性(heterogeneity)を示し、ホモ−([プロα3(V)]3)およびヘテロ三量体([プロα1(V)]2プロα2(V)および[プロα1(V)プロα2(V)プロα3(V)])の両方を形成する。
C−プロペプチドはN−およびC−プロペプチドの開裂および細繊維形成プロα鎖におけるコラーゲンの形成の前に三量体化したプロα鎖(プロセシングしていないプロコラーゲン)へのモノマー鎖の集合に関係すると知られている。三量体化したプロα鎖になる3つのモノマー鎖の集合は、C−プロペプチドの会合によって開始する。この会合は2段階に分けられる:最初に鎖の選択を決定するプロα鎖間の認識事象が起こり、ついで正しい三重螺旋のアラインメントおよび折り畳みへと導く登録(registration)事象が起こる。プロα1(I)、プロα2(I)およびプロα1(III)プロα鎖(集合してコラーゲンI型およびIII型を形成する)のC−プロペプチドのアミノ酸配列の比較(図2)は、これらのプロα鎖間の配列の顕著なレベルの類似性を示すが、そのホモロジーにもかかわらず、常にコラーゲンの型特異的様式で集合し折り畳まれる。
C−プロペプチド、および特にそれらのある配列は必要であるだけでなく、結合する残基の型特異的集合を決定するのに十分であることが現在わかっている。これらのある配列の存在のため、該C−プロペプチドは結合残基(特に外在性のコラーゲンα−鎖であるかもしれない)の集合を自律的に指示することができる。本発明者らは、鎖の選択事象を定義するが、後の折り畳みに影響を及ぼさないC−プロペプチドの領域を単離し特徴付けた。これにより新規三量体化した新規三量体プロα鎖およびコラーゲンを形成する新規のプロα鎖の合成ができる。いまやプロα鎖間の鎖選択相互作用を制御できるので、既存のおよび新規なプロα鎖およびC−プロペプチドを用い、多大な範囲の新規な三量体分子、特にコラーゲンを合成できる。これらの新規の分子は選択された生物学的および物理的特性を有することができ、広範囲の用途を有する。例えば、新規のコラーゲンはコラーゲンが製造物または製造工程の一部として使用される産業において使用できる。そのようなコラーゲンおよび使用は例えば:食品、食品加工および写真術において使用するための新規のゼラチン;醸造工程の間の酵母を除去するための新規な清澄剤;食品梱包産業のための新規ゼラチン;テキスタイルの製造のための新規なポリマー;建造、建設および製造において使用する新規の接着剤;錠剤のための新規のコーティング;ヒトまたは動物の体に使用する新規接着剤;生体移植として使用するための新規コラーゲン;アジュバントとしての新規コラーゲンおよびプロコラーゲン;医薬および製薬剤のための分子担体としてのプロコラーゲン;および例えば傷の治癒および線維症における使用のためのコラーゲン細繊維形成のモジュレーターとしての例が含まれる。
本発明により、少なくとも第1残基がプロコラーゲンC−プロペプチドの活性を有し、第2残基が外在性(alien)コラーゲンα−鎖および非コラーゲン物質の群の任意の1つから選択され、第1残基が第2残基に結合したものを含む分子を提供する。
該分子は他の類似の分子に結合することができる。該分子は、他の類似の分子と三量体化することができる。
第1残基は一般に第2残基のC−末端に結合するが、間に遮るアミノ酸残基が存在してもよい。
第1残基はプロα鎖C−プロペプチドまたはその部分的に修飾した形態またはそのアナログ(analogue)を含み、プロα鎖のC−末端領域を形成する際には該分子が類似の他の分子に結合することを可能にする。プロα鎖のC−プロペプチド領域は、プロα鎖のC−プロテイナーゼ切断から生み出されるC−末端断片であってもよい。
C−プロテイナーゼは、配列FAPYYGD(配列番号2の残基376−382)、YYRAD(配列番号:14の残基1−5)またはFYRAD(配列番号:1の284−288残基)(図2)またはそのアナログにおいて、残基GとDの間またはAとDの間およびそのアナログで開裂することができる。
分子に対する修飾には残基の付加、欠失、置換を含む。置換は保存的置換であってよい。修飾された分子は実質的に、該分子が由来する分子と同様の特性および特徴を有することができる。それらは例えば、少なくとも40%のホモロジーを、例えば50%、60%、70%、80%、90%または95%のホモロジーを有することができる。
本発明者らは結合する残基の型特異的集合を決定するのに必要でありかつ十分である配列を含むプロコラーゲンC−プロペプチド中の部位(認識部位)を単離および同定した(実験セクション参照)。認識部位は、他のC−プロペプチドに対するC−プロペプチドのアラインメントプロット(alignment plot)中で、接続点BおよびG(図2)間の領域中の配列に対応する配列(認識配列)を含むC−プロペプチドの一部であると定義される。アラインメントプロットは英国、ダレスベリー・ラボラトリーズ(Daresbury Laboratories)にてSEQNET上のPILE−UPプログラムを用いて行う。認識配列で置換されており、その結果、異なる特性または特徴を有する既存のプロα鎖は、プロα−鎖C−プロペプチドおよび外在性コラーゲンを含む分子であると考えられ、C−プロペプチドは新規であるので、すべてのコラーゲンα−鎖はそれゆえ該C−プロペプチドに対し外在性である。
図2に見られるように、認識配列は類似のアミノ酸の領域を含む。保存された残基に対する置換は(「実験」セクション、以下、参照)鎖の選択を崩壊させないし、また正確に並んだ螺旋の形成を妨げるものではないので、鎖の選択に保存された残基は関係ないと思われる。従って、該認識配列は約23アミノ酸の連続した配列を含むが、不連続な可変配列内に含まれる鎖の選択特性を有すると考えられる。例えば、α1(III)(配列番号:6)の認識配列において、不連続な可変配列は1−12および21−23の残基を含むと考えられる。
C−プロペプチドおよび/または認識配列は細繊維プロα鎖の配列であってよい。より一般的には、C−プロペプチドは現存するC−プロペプチド、例えば、天然に見いだされるC−プロペプチドまたは、現存するプロα鎖C−プロペプチドアナログ(すなわち実質的に同一の特性および特徴を持つが、しかし異なる配列を持つ)の部分的に修飾した形態であってよいか、または新規のC−プロペプチド(すなわち、他のC−プロペプチドに対して優位に異なる特性または特徴を有するC−プロペプチド)を含んでよい。
現存するC−プロペプチドはプロα1(I)、プロα2(I)、プロ1(II)、プロα1(I)、プロα2(I)、プロ1(II)、プロα1(III)、プロα1(V)、プロα2(V)、プロα3(V)、プロα1(XI)、プロα2(XII)およびプロα3(XI)プロα鎖C−プロペプチド、またはその部分的に修飾した形態またはそのアナログの群のいずれか1つから選択されることができる。プロコラーゲンC−プロペプチドの部分的に修飾した形態にはC−プロペプチドの認識配列、例えばそれらが由来するC−プロペプチドに関連する付随の図面の図面3に同定されるものが含まれる。
該C−プロペプチドは現存するC−プロペプチドまたはその部分的に修飾した形態または認識部位で置換したそのアナログを含むかもしれない。該C−プロペプチドは例えば異なるC−プロペプチドの認識配列などの現存するC−プロペプチドの認識配列で認識部位を置換することができる。例えば、プロα1(III)、プロα1(I)、プロα2(I)、プロα1(II)、プロα1(V)、プロα2(V)、プロα1(XI)、プロα2(XI)およびプロα3(XI)プロα鎖の群のいずれか1つのC−プロペプチドの認識配列で認識部位を置換することができる。配列番号:6−13の群のいずれか1つの配列を有する認識配列で認識部位を置換する。アミノ酸残基の付加、欠失または置換による例を修飾したC−プロペプチドの認識配列は実質的に同一の特性および/または特徴を有するものであるが、現存するC−プロペプチドのものと本質的にみなされる。一般に認識配列は該配列が由来する配列に少なくとも40%類似であり、または少なくとも50、60、70、80、90または95%類似であり得る。
そのような該認識部位での置換は該C−プロペプチドの特性または特徴に有意に影響を及ぼす。
代わりに、該認識配列は新規であってよい。そのような新規の認識配列は、例えば第1残基に新規の動力学または第1残基に対する特異性、または第1残基の新規の組合せを与えることができる。
第2残基は第1残基に結合した任意の分子要素である。例えばこれには外在性コラーゲンα−鎖分子または他のタンパク質またはタンパク質の断片、抗体またはその抗原結合断片またはその組合せなどを含む。第2残基を構成するまたは貢献するタンパク質はグリコシル化されてよく、またさもなければ翻訳後に修飾する。「外在性コラーゲンα−鎖」とは天然のC−プロペプチドを有するプロα鎖の一部を形成しないコラーゲンα鎖を意味する;コラーゲンα鎖は三重螺旋形成ドメインを含み、N−プロペプチド配列もまた存在することができる。同種由来の他のコラーゲンα−鎖ならびに他の種からのそれが使用されるかもしれない。天然に存在するC−プロペプチドを有するプロα鎖の一部を形成しないコラーゲンα鎖として含まれるので部分的に修飾した形態であり、天然に存在するC−プロペプチドを有するプロα鎖の一部を形成する現存するコラーゲンα−鎖のアナログおよび結合特異性などのプロコラーゲン分子の適切な特性または特徴またはコラーゲンα−鎖に有意には影響を及ぼさないものである。コラーゲンα鎖の部分的に修飾した形態およびアナログは、C−プロペプチドまたはコラーゲンα鎖の適切な特性または特徴に有意には影響を及ぼさない例えば、付加、欠失または置換を有することができる。
従って、本発明により、新規コラーゲンが製造されることができる。そのような新規コラーゲンは天然のC−プロペプチドの集合指示効果(assembly-directing effect)のために天然には見られないα−鎖の組合せを有する。本発明はタンパク質技術によって天然に存在しないα−鎖の組合せを有する新規のコラーゲンを構築することができる。従って、本発明は天然に存在しないα−鎖の組合せを含むプロコラーゲン分子に拡張する。天然に不在のプロコラーゲンホモ三量体およびヘテロ三量体には表1には記載されていないすべての可能性のある三量体を含み、これらは本発明の範囲に含まれる。
第2残基は少なくともコラーゲンα−鎖を含むことができる。コラーゲンα鎖はプロα1(I)鎖、プロα2(I)鎖、プロα1(II)鎖、プロα1(III)鎖、プロα1(V)鎖、プロα2(V)鎖、プロα3(V)鎖、プロα1(XI)鎖、プロα2(XI)鎖およびプロα3(XI)鎖コラーゲンα鎖のうちのいずれか1つから選択することができる。
第2残基はまたプロα鎖N−プロペプチドをも含むことができる。N−プロペプチドはプロα1(I)、プロα2(I)、プロα1(II)、プロα1(III)、プロα1(V)、プロα2(V)、プロα3(V)、プロα1(XI)、プロα2(XI)およびプロα3(XI)プロα鎖N−プロペプチドの群のいずれか1つから選択することができる。
第2残基は天然に結合する(例えばプロα2(I)鎖の)コラーゲンα−鎖およびN−プロペプチドを含むことができるかまたはコラーゲンα鎖およびN−プロペプチドの天然に不在の組合せを含むことができるかもしれない。本発明の分子を発現させたい宿主の器官に依存して、該N−末端プロペプチドは発現系において分泌を促進するかまたは他の操作またはプロセシングに置換または適応させることができる。
該分子はコラーゲンα−鎖およびプロα2(I)鎖のN−プロペプチドの活性を含む第2残基に結合するプロα1(III)C−プロペプチドを有する第1残基を含むことができる。該分子は配列番号:4の配列を有することができる。
イン・ビボでのコラーゲン分子の天然の形成において、N−およびC−プロペプチドはポリマーコラーゲンの形成の間にコラーゲン分子を産生するためプロコラーゲン分子で開裂される。結果的に、本発明はその範囲内にα−鎖の天然に不在の組合せを含むコレーゲン分子を含む。天然に不在のコラーゲンホモ三量体およびヘテロ三量体(表1に挙げていない可能性のあるすべてのコラーゲン三量体を含む)は、本発明の範囲内である。(何らかの理由のため、C−プロペプチドを持つがN−プロペプチドを持たない天然に不在のコラーゲン分子またはその逆を所望する場合、選択した発現系においてプロセシングを担う酵素は、操作されるかまたは適宜に選択されるか、または適当に酵素的なプロセシングを受け易くするよう修飾された分子の配列であってよい。)
コラーゲン分子は本来、自己集合(self-assemble)してコラーゲン細繊維となり、次々と集合してコラーゲン繊維を形成する。コラーゲン細繊維およびコラーゲン繊維は上記のコラーゲン分子を含み、ゆえに本発明によりまた、考慮される。
本発明の第1の側面の分子はペプチドライゲーションおよび完全な合成を含む任意の便利な方法によって調製されることができる。しかしながら、該分子は組換えDNA系からの発現によって調製されるのが好ましい。この目的および本発明の第2側面により、上記の分子およびコードする組換えまたは単離された形態であるDNA分子を提供する(特に天然に不在のプロコラーゲンα−鎖)。
本発明の組換えDNAはベクターの形態であってよい。該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージであってよい。ベクターはしばしば1またはそれ以上の選択可能なマーカーを含み、それらでトランスフェクション(または形質転換:該語は本明細書中では交換可能に使用される)した細胞を選択可能にし、好ましくは異種DNAを含むベクターを有する細胞の選択を可能にする。適当な開始および終結シグナルが存在するであろう。該ベクターは発現させる調節配列を有する発現ベクターであってよい。調節配列を含まないベクターは、クローニングベクターとして有用である;および勿論、発現ベクターもまた、クローニングベクターとしても有用である。
クローニングベクターは、その操作を容易にする大腸菌または適切な宿主に導入することができる。本発明の他の態様により、従って上記のDNAでトランスフェクションまたは形質転換する宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は原核生物または真核生物細胞であってよい。真核宿主細胞には、酵母、昆虫および哺乳動物細胞株を含む。発現宿主は安定して形質転換することができる。不安定および無細胞発現系は適当な環境において使用することができるが、それらは現在の技術状態では大きな産物には都合よくないようである。
本発明のDNAはトランスジェニック植物または好ましくは動物における発現のために設計されたトランスジーン構築物の形態、または好ましくは動物であってもよい。原則として、本発明は家禽などの鳥類、爬虫類種および魚類など含むすべての動物に適応可能である。該タンパク質は体液または他の生体産物(適当なところでは卵)から回収することができる。実際には哺乳動物(非ヒト動物)、特に胎性哺乳動物には、多大な市販されていて有用な適用性は現在予見されており、乳腺における発現として、ミルクからの発現産物の連続した、ときおりの回収が証明され、好ましい技術である。本発明が最も有用なのは、有蹄類、特に経済的に重要であるウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダおよびブタなどの有蹄類であう。そのような哺乳動物トランスジェニック乳発現系の産生および有用性が両者とも一般的に、ある例においては特異的にWO−A−8800239およびWO−9005188に開示されている。β−ラクトグロブリンプロモーターは特に、トランスジェニック乳発現系における使用に好ましい。WO−A−9416570はトランスジェニック動物の乳におけるヒト組換えコラーゲンの産物を開示すると主張しているが、そのように行われた産物の実験的詳細発現は含まれていない。
発現宿主、特にトランスジェニック動物は本発明の分子の生合成の発現、集合、分泌および他の側面を容易にする外在性DNAを含むかもしれない。例えば、発現宿主はプロリル4−ヒドロキシラーゼ、WO−9307889号に開示されるようにプロコラーゲンの天然での生合成において重要である翻訳後酵素(post-translational enzyme)である、共発現するかもしれない。
天然のプロコラーゲン鎖をコードするDNA、特にcDNAは公知であり、かつ当該技術分野においては使用可能である。例えば、WO−A−9307889、WO−A−9416570および両方に引用される参考文献は詳細を与える。そのようなDNAは、本発明のDNAの便利な開始点を形成し、それから組換え技術によって調製することができる。C−プロペプチド(またはそれからの最小必須領域)をコードするDNAの一般的観点が外在性コラーゲン三重螺旋ドメイン(通常N−プロペプチドに一致するものをコードするDNAに結合する)をコードするDNAに単にライゲーションするかもしれないが、実際、正確なライゲーションに影響を及ぼすためのPCRに基づいた技術を利用するのは有用である。例えば、C−プロペプチドと三重螺旋ドメインの間の接合領域をブランキングするPCR産物を調製することができ、ついで組み合わせることができる;ついで重複拡張反応(overlap extension reaction)が行われ、1つのプロコラーゲン鎖のC−プロペプチドをコードするDNAと他のプロコラーゲン鎖の三重螺旋ドメインをコードするDNA(およびN−プロペプチド、通常)間のハイブリッドであるPCR産物を産生する。
原則として、本発明は合成DNA配列、cDNAs、全長ゲノム配列および「微小遺伝子(minigenes)」(全長遺伝子に存在する介在配列の全てではないにせよいくつかを含む部分的なゲノム配列をいう)の使用を適応させることができる。一般的に、コラーゲン遺伝子中に介在配列が多数存在するので、しかし実験的な実用性は通常cDNAまたは幾つかの状況においては微小遺伝子の使用が都合よい。
本発明のDNAは原則として、引き続きのヌクレオチドとともに結合する任意の便利な方法、および/まだはイン・ビトロ工程を含み、オリゴ−および/またはポリヌクレオチドをライゲーションすることに関するが、選択の方法を形成する組換えDNA技術が形成する。
本発明の分子はヒトまたは動物体の治療または診断の方法において有用であるかもしれない。該分子は接着剤または移植物としての使用であってよい。本発明は、それゆえ、恐怖が低減した傷または繊維障害の治癒を促進するのに使用できる。慢性傷の治癒を促進することにおいての使用であってよい。「傷または線維障害」なる語は、瘢(scar)組織の形成が可能な任意の状態を意味する。特に、これは皮膚の傷の治癒、腱の傷害の修復、圧潰(crush)傷の治癒、中枢神経系(CNS)傷害の治癒、CNS中の瘢組織の形成を起こす状態、発作由来の瘢組織形成および組織接着、例えば、傷または外科手術などの結果であるが、これらを含む(これは例えば、腱の治癒および腹部構造および接着に応用できる)。繊維の障害の例には肺線維症、糸球体腎炎、肝硬変および増殖性硝子体網膜症を含む。
例えば、線維症の抑制において、新規のコラーゲン分子またはプロα鎖は傷または線維症、コラーゲン細繊維形成を抑制する新規のコラーゲン(またはプロα鎖)およびよって線維症の部位に応用することができる。新規のコラーゲン、またはプロα鎖は例えば短くしたα−鎖を有することができる。
本発明のDNAは適当な構築物において、遺伝子療法において有用であり得る。骨形成不全(OI)、エーレルス・ダンロー症候群(EDS)、スティックラー症候群(Stickler Syndrome)、脊椎骨形成異常、低軟骨形成または大動脈瘤の治療における使用のためであってよい。コラーゲン遺伝子内の変異はOIのたいていの形態の、EDSおよびいくつかの軟骨形成不全の形態の原因である。たいていの場合、該疾患の破壊的効果は一層大きな側鎖を有するアミノ酸のGly−X−Y繰り返し含有領域−の三重螺旋内のグリシンの置換による。これは、トリマー化したプロα鎖の分泌において劇的な減少がみられる結果で三重螺旋の折り畳みが妨害または遅延される。誤って折り畳まれたタンパク質は、使い切られた後、分解され、細胞内に、恐らくER(小胞体)内に保有されるであろう。C−プロペプチドの折り畳みが、三重螺旋ドメイン内の変異によって影響されず、野生型ならびに変異鎖由来のC−プロペプチドは結合し、かつ細胞内に保有されることができる。野生型鎖の保有および分解は変異の効果を増幅する変異鎖との相互作用により、「プロコラーゲン自殺」と称す。この現象によるタンパク質の多量の損失は、そのような変異の最も有力な致死的効果を説明することができる。変化した鎖の選択性を有するプロα鎖を操作することによって、プロα鎖はおそらく変異鎖と結合させないで処理し、従って、折り畳まれ、通常で選択するであろう。そのように操作されたプロα鎖は野生型のコラーゲンα鎖を含むことができ、それによって変異コラーゲンα−鎖によって引き起こされる欠点を埋め合わせる。発現したタンパク質は、いくつかの状況において、疾患の治療および遺伝子療法による一層基本的なレベルで明確にする状態においても有用である。
本発明はまた、写真術、醸造、食料品、テキスタイルまたは接着剤においても有用である。
本発明により、本発明の分子の使用を含むヒトまたは動物体の治療または診断の方法をもまた提供する。
本発明はさらに以下の図面および実験の記載を含む実施例から明らかである:
図1は、プロコラーゲンの細胞内折り畳み、集合(assembly)の修飾の最初の段階を示す。段階1で同時翻訳転座(co-translational translocation)およびシグナルペプチド開裂が起こることが見られる。ついで、分子内ジスルフィド結合形成外在ならびにN−結合グリコシル化、プロリン異性化およびプロリンヒドロキシル化が第2段階で起こる。ついでトリマー化および分子内ジスルフィド結合形成によるプロα鎖の3型特異的な集合が続く。最終的に第4段階にて、三重螺旋の形成がカルボキシからアミノ酸方向へと続いてトリマー化したプロα鎖を得る;
図2は、デフォルト設定を用いて、英国、ダレスベリー・ラボラトリーズにてSEQNET上のPILE−UPプログラムを用いて行ったI型およびIII型プロコラーゲンのプロα鎖のC−プロペプチドのアラインメントプロットを示す。α1(I)は配列番号:14;α2(I)は配列番号:1の残基番号284−534である;およびα1(III)は配列番号:2の残基番号379−626である。C−プロテイナーゼ開裂部位(CPと記す)はAとD(α1(I))、AとD(α2(I))およびGとD(α1(III))間である。結合点A、F、B、CおよびGは以下に示す。数字は保存されたシステイン残基をも示す。#は同一のアミノ酸を示し、および〜は保存された側鎖を有するアミノ酸を示す;
図3は、それぞれ配列番号:7、8、9、6、10、11、12および13を有するプロα1(I)、プロα2(I)、プロα1(II)、プロα1(III)、プロα1(V)、プロα2(V)、プロα1(XI)およびプロα2(XI)プロα鎖の認識配列を示し、図2の結合点BとGの間の配列に対応するような他のC−プロペプチド(特に図2のC−ペプチド)に対するC−プロペプチドのアラインメントプロットによって同定される。
図4は、翻訳されたプロコラーゲン構築物のSDS−PAGEゲルを示す。レーンは以下の通りである:1−分子量マーカー;2および6−プロα1(III)Δ1;3および7−プロα2(I)Δ1;4および8−プロα2(I):(III)CP;5および9−プロα1(III):(I)CP;
図5は、翻訳されたプロコラーゲン構築物のSDS−PAGEゲルを示す。レーンは以下の通りである:1−分子量マーカー;2および7−A−結合;3および8−F−結合;4および9−B−結合;5および10−C−結合;6および11−recip−C−結合;
図6は、α,α'−ジピリジルの存在下(レーン3、5および7)および不在下(レーン2、4および6)の翻訳されたプロコラーゲンを示す。レーンは以下の通りである:2および3−プロα2(I):(III)CP;4および5−BGR;6および7−プロα1(III):(I)CP;
図7は、還元条件(レーン1−3)および非還元条件(レーン4−6)下での翻訳されたプロコラーゲン構築物のSDS−PAGEゲルを示す。レーンは以下の通りである:1および4−BGRS-C;2および5−BGR;3および6−BGRL-M;および
図8は、翻訳されたプロコラーゲン構築物のSDS−PAGEゲルを示す。レーンは以下の通りである:1−分子量マーカー;2−BGRS-C;3−BGR;4−BGRL-M。
実 験
切断された形態の(truncated)プロα2(I)鎖(プロα2(I)Δ1;配列番号:1;核酸コード配列−配列番号:19)をコードするcDNAクローンは、pBluescriptSK+のEcoRI部位にサブクローニングした2つの部分的なcDNAクローンpHf1131およびpHp2010(クイバニエミ(Kuivaniemi, H.)ら、1988、Biochem. J.、252:633−640)から構築された。ベクターと該遺伝子の5'−末端の0.5kbを含む3.4kbのPstI断片を、pHp2010から単離し、3'末端をコードするpHf1131由来の1.4kbPstI断片にライゲーションする。得られた組換えプロα2(I)Δ1はコーディング配列において2.2kbの欠失を有する(リーズ(Lees)およびブレイド(Bulleid)、1994、J. Biol. Chem.、269:24354−24360)。
この構築物はウィルソン(Wilson)らによって記載されたような(1995、Biochem J. 307:679−687)半透過化された(semi-permeabilised)(SP)HT1080細胞系を用いて分析した。半透過化細胞をHTl080細胞調製した。75cm2フラスコからの一定の密度に達したHT1080細胞を1回PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で濯ぎ、ついで室温で3分間2.5mg/mlのトリプシンを含むPBS、2mlでインキュベートした。そのフラスコを氷に移し、そこに氷冷したKHM(110mMKOAc、20mM Hepes、pH7.2、2mM MgOAc)8ml(100μg/mlダイズトリプシンインヒビターを含む)を加え、ついで細胞をプレートに撒く。細胞を12,000rpmで3分間ペレット化し、再度40μg/mlのジギトニン(DMSO(ジメチルスルホキシド)中の40mg/mlストックから希釈)を含む6mlのKHMに再懸濁し、ついで氷上で5分間インキュベートする。透過を終結させるため、8mlのKHMを加え、細胞をペレット化して再度50mMHepes、pH7.2、90mM KOAcに再懸濁する。10分後、細胞をペレット化し、100μlのKHM(約2×106細胞)に再懸濁する。CaCl2を1mM加え、スタフィロコッカススクレアーゼを10μg/mlに加えることによって内在性mRNAを除去し、室温で12分間インキュベートする。その反応を4mMまでEGTAを加えて終結させ、ついで細胞をペレッティングする。半透過化細胞を100μlのKHM再懸濁した。RNAを30℃で1時間ウサギ網膜細胞溶解物(フレキシリゼイト(Flexi Lysate)、プロメガ(Promega)、サザンプトン、英国)を用いて翻訳する。その翻訳反応液(25μl)は16μlの網膜細胞溶解物、1μlの1mMアミノ酸(メチオニンは除く)、15μCiL−[35S]メチオニン、1μl転写RNAおよび半透過化した細胞(約1×105)を含む。翻訳後、N−エチルマレイミドを最終濃度20mMにまで加える。ジスルフィド結合の形成を還元条件および非還元条件下で翻訳産物を7.5%ポリアクリルアミドゲル上で相対的にゲル電気泳動することによって確認する。この無細胞系を用いて分析する場合、プロα2(I)Δ1mRNAからの翻訳産物はホモ三量体を形成するように自己結合しないことは最初の認識事象に必要な情報を含まないことを示す(図4、レーン3および7)。
切断された形態のプロα1(III)鎖(プロα1(III)Δ1;配列番号:2;核酸コーディング配列−配列番号:20と称す)cDNAクローンは2つの部分的なcDNAであるpS413およびpS31(アラ−コッコ(Ala-Kokko)ら、1989、Biochem. J. 260:509−516)から構築された全長型IIIプロコラーゲンcDNAから構築する。各cDNAをpBluescript SK-のEcoR I部位にサブクローニングする。ベクターおよび5'末端1.8kbを含む4.7kbのSal I(制限酵素)断片をpS413から単離し、ついでpS31からの3.6kbのSal 1断片にライゲーションしてプロα1(III)を製造する。内部の2.5kbXho I断片をプロα1(III)から切り出し、ついで親のプラスミドを再度ライゲーションしてプロα1(III)Δ1(リーおよびブレイド、1994、J. Biol. Chem.、269:24354−24360)。
プロα1(III)Δ1mRNAは、集合して、半透過化した無細胞翻訳系において翻訳した分子内のジスルフィド結合したダイマーおよび三量体を形成することができる能力によって判断されたホモ三量体を形成することができる。このことはそれが自己集合に必要な情報を含むことを示していた(図4、レーン2および6)。
ハイブリッドcDNAクローンはプロα1(III)Δ1およびプロα2(I)Δ1由来の配列を含み、調製される。プロα1(III)Δ1のC−プロテイナーゼ開裂部位はこれらの実験のため、配列番号:2のAla377とPro378の間で図2に示すように配列番号:2のGly381とAsp382の間のかわりにとられる。これらの構築物の最初に、プロα1(III)Δ1鎖からのC−プロペプチドのためのコーディング配列をプロα2(I)鎖からのC−プロペプチドの配列で置換し、その結果得たキメラをプロα1(III):(I)CP(配列番号:3)と称す。この構築物は、無細胞系で翻訳されると自己結合に失敗する(図4、レーン5および9)。相互構築物をプロα2(I)Δ1からのC−プロペプチドをプロα2(I):(III)CP(配列番号:4)と称されたキメラのプロα1(III)からのC−プロペプチドと置換した。
この構築物は自己結合することができ、ダイマーおよびホモ三量体(図4、レーン4および8)を形成し、そのことは、C−プロペプチド内の選択結合残基に必要であるすべての情報を初めて証明した。プロα1(III):(I)CP構築物は以下に記載するように調製した。他の構築物は同様の方法および公開された配列を用いて製造した。
ハイブリッドcDNAクローンをPCRに基づいた方法を用いて調製した。プロα1(III):(I)CPの構築のため、PCR産物はプライマーを有してプロα1(III)Δ1から調製され、そのプライマーの1つ(配列番号:15;JL−35)は三重螺旋ドメイン内でハイブリダイズし、もう一方はC−プロペプチドで結合点から21ヌクレオチド上流のものとハイブリダイズする。このプライマーはまたプロα2(I)Δ1のC−プロペプチドの最初の21ヌクレオチドに相補的な21ヌクレオチドの重複を含む。これにより0.25kbのPCR産物を得た。
第2PCR産物をプライマー(そのうちの1つは(配列番号:17;JL−31Kpn)3'−未翻訳領域内の翻訳停止コドンの下流ではハイブリダイズした)を用いてプロα2(I)Δ1から調製した。このプライマーはまた、Kpn I部位を含む。他のプライマー(配列番号:18;JL−36)はプロα2(I)Δ1のC−プロペプチドの最初の18ヌクレオチドとハイブリダイズする。
2つのPCR産物を組み合わせて第3のPCR(重複拡張(overlap extension))をプライマー−JL35(配列番号:15)およびJL−31Kpn(配列番号:17)を用いて行い、1.1kbの産物を産生する。これをXho IおよびKpn Iで開裂し、ついでXho IおよびKpn I開裂したプロα1(III)Δ1にサブクローニングしてプロα1(III):(I)CPを産生する。
プロα2(I)Δ1 C−プロペプチド配列の一部がプロα1(III)C−プロペプチドの対応領域で置換されたもので、多様なハイブリッド構築物を調製した。多様な領域をA、F、B、CおよびGと称された結合点で図2において略述した。例えば、A結合分子はプロ1α(III)鎖のC−プロペプチドからの対応領域由来であるもの部分(すなわちEI…)のカルボキシ側のすべての配列を有して、A部分まで、A部分は含まないプロ2α(I)Δ1配列のすべてを含む。プロα1(III)およびプロα2(I)C−プロペプチドはシステイン残基の相補物(およびゆえにジスルフィド結合することができる能力)において、Cys2残基(図2)を欠如するプロα2(I)の代わりにセリン残基を有する点で異なっている。非還元条件下(以下参照)での分析を容易にするために、該F、BおよびC構築物はプロα2(I)鎖のCys2部位にてシステイン変異の代わりにセリンを含む。この変異が鎖の選択に全く役割を果たさないことを確認するために、同様の変異構築物(プロα2(I):(III)BGRS-C−はBGRS-Cという;以下参照)を逆突然変異(back-mutated)した。逆突然変異した構築物(すなわちプロα2(I):(III)BGR−はまたBGRという)はその親分子(プロα2(I):(III)BGRS-C)として同様の鎖の選択性を有する(以下参照)。
A結合、F結合およびB結合キメラは、無細胞系(図5、レーン7、8および9)において翻訳する場合、すべて集合してホモ三量体を形成する。しかしながら、C結合分子は集合せず(図5レーン10)、そのことは集合のための認識部位はB部位のカルボキシ末端およびC部位のアミノ末端配列内にて含まれることを示唆している。C結合分子の集合の欠如は集合のための認識配列内にあるためであるという可能性は排除されなかった。認識部位が分裂させられた証拠は相互構築物が作成された場合に得られる。本構築物は、プロα2(I)C−プロペプチド由来であるC−プロペプチドの残りを有するC−部位までのプロα1(III)Δ1鎖を含む。この構築物(recip−C−結合)から全く集合が見られなかったことは認識部位が分解された(図5、レーン11)ことを示す。
次の構築物はプロα1(III)のC−プロペプチドからの対応領域で置換されたB部位およびG部位(配列番号:6)間の短い23アミノ酸は別として、すべてのプロα2(I)Δ1配列を含む。この構築物は(BGR;配列番号:5と称す)該分子(すなわちシステインが配列番号:5の335番目の残基のセリンで置換されている)のプロα2(I)のCys 2部位でのセリンの代わりのシステインを構築物の変異発生を指示した部位によって変化させられた。その結果得られた分子(プロα2(I):(III)BGRS-Gと称す)無細胞系(図7、レーン4)において翻訳される場合には集合して分子内ジスルフィド結合したホモ三量体を形成し、そのことは短い一連の23アミノ酸はホモ三量体を形成させることを示している。
セリンからシステインへの変異が鎖の選択に影響を及ぼさないことを確認するため、逆突然変異が行われ(すなわちプロα2(I):(III)BGRを得る)、予期されたように、分子内ジスルフィド結合三量体は、本分子が分子内ジスルフィド結合形成に必要であるシステイン残基を含まないので検出されなかった。
キメラプロコラーゲンの翻訳後、安定した三重螺旋が形成されるか否かを決定するため、簡単なプロテアーゼ保護アッセイを行った。これにはタンパク質加水分解酵素(トリプシン、キモトリプシンおよびペプシン)の組合せで翻訳産物を処理することを含む。翻訳後に単離されたSP−細胞を1%(v/v)Triton X−100中の0.5M酢酸に再懸濁し、20℃で2時間ペプシン(100mg/ml)とインキュベートする。1M Tris塩基で中和することによって消化を停止し、タンパク質を最終濃度27%(v/v)でエタノール沈澱する。ペプシン消化物から沈澱したタンパク質を0.15M NaCl、10mM EDTA(エチルジアミンテトラ酢酸および1%Triton X−100を含む50mM Tris−HCl(pH7.4)に再懸濁した。キモトリプシンおよびトリプシンをそれぞれ最終濃度250μg/mlおよび100μg/mlにて添加し、ついでサンプルを室温で2分間インキュベートした。その消化を最終濃度500μg/mlの濃度のダイズトリプシンインヒビターを、5倍量のSDS−PAGE(ズデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)の沸騰したサンプルバッファーに添加し、該サンプルを3分間煮沸することによって停止する。その結果を図6および8に示す。
安定な三重螺旋の形成は、消化後のプロテアーゼ耐性断片(三重螺旋ドメインに対応する)の出現によって特徴付けられる。プロα2(I):(III)CP(図6、レーン2)の翻訳産物およびBGR構築物(図6、レーン4;図8、レーン2および3)のみが翻訳の間(図6)、α,α'−ジピリジル(プロリル4−ヒドロキシラーゼ)のインヒビター)が存在しない場合にのみ形成されるプロテアーゼ耐性断片を製造する。プロリンヒドロキシル化は熱に安定である三重螺旋の形成に必要であるので、このことは正確に折り畳まれた三重螺旋がこれらの構築物で形成されることを示す。
このことはまた、BGRは分子内ジスルフィド結合によって安定化された三量体を形成することができなかったが、正確に並んだ三重螺旋を形成するため三量体化することができることを示している。
プロα1(III)およびプロα2(I)鎖(図3)からのB−Gモチーフの分析は、認識配列(図3;それぞれ配列番号:6および8)における残基のモチーフ、残基13−20はプロα1(III)中の残基17−Leu(L)およびプロα2(I)中のMet(M)と同一であることを示した。鎖選択プロセスにおけるこれらの残基によって演じられた役割を決定するため、変異発生を指示した部位をプロα2(I):(III)BGRS-G構築物(プロα2(I):(III)BGRL-Mと称するかまたはBGRL-Mともいう)中のプロα1(III)認識配列中の、LeuのかわりにMetで置換して使用する、すなわち、配列番号:5のLeu425残基でMetを置換し、Ser 335でCysを置換するために使用する。
プロα2(I):(III)BGRL-Mの鎖の集合は上記のように行われ、鎖の電気泳動移動度を分析した。非還元条件下、この構築物は分子内ジスルフィド結合(図7、レーン6)を形成し、ついでプロテアーゼ耐性三重螺旋ドメイン(図8、レーン4)を形成した。MetのかわりのLeuは見られず、それゆえ、鎖の選択を崩壊するか、または正確に並んだ螺旋の形成を妨害するわけではない。
配 列 表
配列番号1
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:535アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号1:
配列番号2
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:626アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:2
配列番号3
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:623塩基対
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:3
配列番号4
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:537アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:4
配列番号5
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:534アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:5
配列番号6
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:23アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述、配列番号:6
配列番号7
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:23アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:7
配列番号8
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:23アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:8
配列番号9
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:23アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:9
配列番号10
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:22アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述、配列番号:10
配列番号11
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:22アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:11
配列番号12
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:22アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:12
配列番号13
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:22アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:13
配列番号14
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:250アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:未知
(xi)配列の記述:配列番号:14
配列番号15
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記述:/desc=”PCRプライマー配列”
(xi)配列の記述:配列番号:15
配列番号16
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:42塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記述:/desc=”PCRプライマー配列”
(xi)配列の記述:配列番号:16
配列番号17
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:32塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記述:/desc=”PCRプライマー配列”
(xi)配列の記述:配列番号:17
配列番号18
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:18塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:他の核酸
(A)記述:/desc=”PCRプライマー配列”
(xi)配列の記述:配列番号18:
配列番号19
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1608塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー;直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列の記述:配列番号:19
配列番号20
(i)配列の特徴
(A)配列の長さ:1881塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:未知
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列の記述:配列番号20:
Claims (22)
- (i)第1残基;該第1残基は、三量体プロコラーゲンC−プロペプチドに集合する活性を有し、第1の型のプロα鎖に由来し、鎖選択のための認識配列を含む、および
(ii)第2残基;該第2残基は、該第1の型とは異なるプロα鎖からの三重螺旋形成ドメインを含む、
を含むポリペプチドであって、その際、該第1残基は該第2残基に結合しており、該認識配列が、該ポリペプチドと該活性および三重螺旋形成ドメインを含む他のポリペプチドとの同時集合を可能とすることを特徴とするポリペプチド。 - 該認識配列がプロα1(I)、プロα2(I)、プロα1(II)、プロα1(III)、プロα1(V)、プロα2(V)、プロα3(V)、プロα1(XI)、プロα2(XI)およびプロα3(XI)鎖認識配列よりなる群から選択される請求項1に記載のポリペプチド。
- 該認識配列が配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12および配列番号:13の配列よりなる群から選択される請求項1に記載のポリペプチド。
- 該認識配列が細繊維プロα鎖の認識配列である請求項1に記載のポリペプチド。
- 該第2残基が少なくともコラーゲンα−鎖を含む請求項1に記載のポリペプチド。
- 該コラーゲンα鎖がプロα1(I)鎖、プロα2(I)鎖、プロα1(II)鎖、プロα1(III)鎖、プロα1(V)鎖、プロα2(V)鎖、プロα3(V)鎖、プロα1(XI)鎖、プロα2(XI)およびプロα3(XI)鎖コラーゲンα−鎖よりなる群から選択される請求項5に記載のポリペプチド。
- 該第2残基がプロα鎖N−プロペプチドをも含む請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチド。
- 該N−プロペプチドがプロα1(I)、プロα2(I)、プロα1(II)、プロα1(III)、プロα1(V)、プロα2(V)、プロα3(V)、プロα1(XI)、プロα2(XI)およびプロα3(XI)α鎖N−プロペプチドよりなる群から選択される請求項7に記載のポリペプチド。
- 該第1残基がプロα1(III)C−プロペプチド認識配列を含み、該第2残基がプロα2(I)鎖からの三重螺旋形成ドメインおよびN−プロペプチドを含む請求項8に記載のポリペプチド。
- 配列番号:4の配列を有する請求項7に記載のポリペプチド。
- アミノ酸残基が介在することによって該第1残基および該第2残基が分離されている請求項1〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の第1のポリペプチドを、それぞれプロコラーゲンC−プロペプチドに集合する活性および三重螺旋形成ドメインを有するさらに2つのポリペプチドと同時集合させ、それによって該第1のポリペプチドおよび該さらなる2つのポリペプチドが同時集合して三重螺旋ドメインを有する分子を形成させることを含む、プロコラーゲン分子の製造法。
- 請求項12に記載の方法によってプロコラーゲン分子を調製し、ついで該プロコラーゲン分子をコラーゲン分子に変えることを含むコラーゲン分子の製造法。
- 請求項13に記載の方法により製造されたコラーゲン分子。
- 請求項14に記載のコラーゲン分子を含むコラーゲン細繊維。
- 請求項15に記載のコラーゲン細繊維を含むコラーゲン繊維。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のポリペプチドをコードするDNA分子。
- 発現を指令する調節配列に作動可能に結合した請求項17に記載のDNA分子で形質転換またはトランスフェクションした発現宿主細胞。
- 請求項18に記載の発現宿主細胞をコラーゲンの産生を可能とする条件下で培養し、該発現宿主細胞から該コラーゲンを回収し、ついで任意に該コラーゲンを精製することを含む、コラーゲンの製造法。
- 発現を指令するのに十分である調節配列に作動可能に結合した請求項17に記載のDNA分子をゲノムが含むトランスジェニック非ヒト動物。
- 非ヒト動物が非ヒト胎性哺乳動物であり、調節配列が成体雌の乳中の発現を指令する請求項20に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項20または21に記載のトランスンジェニック非ヒト動物からコラーゲンを回収し、ついで任意に該コラーゲンを精製することを含むコラーゲンの製造法。
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