JP2001513633A

JP2001513633A - プロコラーゲンの組立て

Info

Publication number: JP2001513633A
Application number: JP53740798A
Authority: JP
Inventors: ブレイド，ニール・ジョン
Original assignee: ザ・ビクトリア・ユニバーシティ・オブ・マンチェスター
Priority date: 1997-03-01
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2001-09-04
Also published as: ATE507294T1; AU749709B2; EP0972031A1; EP0972031B1; US20050149995A1; AU6299498A; CA2282719C; GB9704305D0; CA2282719A1; DE69842239D1; WO1998038303A1

Abstract

(57)【要約】少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を共発現して組み立てるシステムにおいて所望のプロコラーゲンまたはその誘導体を生産する方法。所望のプロコラーゲンを組立てるためのプロ−α鎖またはその誘導体を発現する遺伝子が、天然のプロ−α鎖から外因的に選択されるか、またはＣ−末端プロペプチドドメインの活性を有するが、該少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を組立てて形成する、プロ−α鎖またはその誘導体のＣ−末端プロペプチドと共組立てされないドメインをもつ該プロ−α鎖またはその誘導体を発現するように人工的に工作される遺伝子であることを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】プロコラーゲンの組立て本発明は、プロコラーゲンおよびその誘導体の組立てを調節する方法に関する。単細胞有機体あるいはヒト組織の細胞のいずれであれ、ほとんどの細胞は、細胞外マトリックスとして知られ、種々のタンパク質および多糖類を含む、巨大分子の複雑な網状組織で囲まれている。このマトリックスの主なタンパク質成分は、哺乳類における総タンパク質のおよそ２５％を占めると考えられている、コラーゲンと呼ばれる関連タンパク質のファミリーである。コラーゲン分子には少なくとも２０の遺伝的に異なるタイプがあり、それらのうちの幾つかは、長さがマイロメーターであって電子顕微鏡によって見ることができる、コラーゲン原線維として知られる大きな線維を典型的に形成するので、原線維コラーゲン（コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＸＩ型コラーゲン）として知られている。コラーゲン原線維は、コラーゲン分子のポリマーを含み、プロコラーゲンからコラーゲン分子への変換に続いて該ポリマーを形成する組立てが起こるというプロセスによって産生される。プロコラーゲンは、分子の中央に三重らせんドメインを有し、アミノ末端（Ｎ−末端プロペプチドとして知られる）およびカルボキシ末端（Ｃ−末端プロペプチドとして知られる）に非らせん領域をもつ。三本鎖らせんドメインは、α鎖として知られる３本のポリペプチドからなる。プロコラーゲンは、細胞内では、膜結合リボソーム上のプロ−α鎖（Ｎ−およびＣ−末端プロペプチドドメインをもつα鎖）から合成され、プロ−α鎖は細胞質内細網内へ挿入される。細胞質内細網内で、プロ−α鎖はプロコラーゲン分子へ組立てられる。この組立ては２つの段階に分けられる：鎖を選択的に決定するプロ−α鎖間の最初の認識イベント、次いで三重らせんの正確なアラインメントを導く整合イベント。プロコラーゲンの組立ては、各プロ−α鎖のＣ−末端プロペプチドドメインの会合によって開始され、Ｃ−末端プロペプチドが形成される。次いで、三重らせんドメインの組立てが、Ｃ−からＮ−への方向で進行し、Ｎ−末端プロペプチドの形成によって完成する。成熟プロコラーゲン分子は、最終的に、細胞外環境内へ分泌され、そこでプロコラーゲンＮ−プロテイナーゼ（Ｎ−末端プロペプチドを切断する）およびプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ（Ｃ−末端プロペプチドを切断する）によってコラーゲンに変換される。プロペプチドが除去されるやいなや、かくして形成されたコラーゲン分子は、同時に集合してコラーゲン原線維を形成することができる。コラーゲンは、工業上の用途を多数もっている。たとえば、コラーゲンゲルは、コラーゲン原線維からインビトロにて形成され、細胞の接着を補助するのに用いることができる。このようなゲルは、軟骨から外植片化された軟骨細胞などの特定の細胞の表現型を維持するための細胞培養において使用される。コラーゲンは、外科処置において“詰め物”またはパッキング剤としても使用され、たとえば唇の見た目を大きくするといったような美容外科処置における使用が特に知られている。インビボにおいては、コラーゲンは、細胞外マトリックスの主な成分であり、いくつもの役割をはたしている。コラーゲン合成および調節の異常がかかわる多くの疾患が知られている。プロコラーゲンおよびその誘導体は、このような疾患の治療に用いることができる（あるいは可能性としての使用）。増加する工業的需要に応じるために、大量のプロコラーゲンまたはその誘導体を合成する必要がある。プロコラーゲンまたはその誘導体の簡便な手段は、外因性のプロ−α鎖を宿主内で発現させ、そのプロ−α鎖をプロコラーゲンまたはその誘導体に組立てることである。これを行うには、どの宿主細胞を用いても、それが、プロ−α鎖からプロコラーゲンを組立てるのに要求される、必須の翻訳後の能力をもつことを確実にすることが必要である。これは、正常にプロコラーゲンを合成する細胞内で発現させることによって達成できる。しかし、このようなシステムにおける１つの問題は、外因的に発現されたプロ−α鎖は、外因的に導入されたプロ−α鎖と共組立てしうるために、望ましくないハイブリッド分子が形成されることである。他の状況においては、宿主細胞内で外因性の異なるプロ−α鎖から２種またはそれ以上のプロコラーゲンを生産することが望ましく、この場合、プロ−α鎖が共組立てされて望ましくないハイブリッド分子が形成されないようにすることが必要である。プロコラーゲンがインビトロにて無細胞システムにおいて組立てられることが必要であることもまた想像できるが、この場合もまたプロ−α鎖が共組立てされて望まないハイブリッド分子が形成されるのを回避することが必要である。本発明の目的は、プロ−α鎖が他のプロ−α鎖と望ましくない共組立てをすることなく、プロ−α鎖またはその誘導体から所望のプロコラーゲンまたはその誘導体を組み立てる方法を提供することである。本発明は、少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を共発現して組み立てるシステムにおいて、所望のプロコラーゲンまたはその誘導体を生産する方法であって、所望のプロコラーゲンを組立てるためのプロ−α鎖またはその誘導体を発現する遺伝子が、天然のプロ−α鎖から外因的に選択されるか、またはＣ−末端プロペプチドドメインの活性を有するが、該少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を組立てて形成する、プロ−α鎖またはその誘導体のＣ−末端プロペプチドと共組立てされないドメインをもつ該プロ−α鎖またはその誘導体を発現するように外因的に工作されることを特徴とする方法を提供する。 “プロコラーゲンまたはその誘導体”および“プロ−α鎖またはその誘導体” とは、それぞれ、タンパク質またはその誘導体である、天然に見出されるものと同じかまたは人工の誘導体である、プロコラーゲンまたはプロ−α鎖の分子を意味する。もし人工の誘導体が、Ｃ−末端プロペプチドドメインの活性を有するが、少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を組立てて形成する、プロ−α鎖またはその誘導体のＣ−末端プロペプチドドメインと共組立てされないドメインを含むものであるならば、該誘導体は、非タンパク質ドメインを有していてもよく、あるいは完全に非タンパク質であってもよい。好ましいプロ−α鎖誘導体は、Ｃ−末端プロペプチドドメインの活性をもつドメインおよび少なくとも部分的に三重らせんを形成する能力をもつドメインを含む。したがって、外因的に選択されるか、または外因的に工作された遺伝子は、トリマーに組立てられてプロコラーゲン分子またはその誘導体を形成するプロ−α 鎖またはその誘導体を発現し、次いで該プロ−α鎖またはその誘導体を、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼおよびプロコラーゲンＮ−プロテイナーゼ（それぞれ、プロコラーゲン分子からＣ−およびＮ−末端プロペプチドを切断して、モノマーを形成するが、これは同時に集合してコラーゲンポリマーを形成する）に曝すとコラーゲンポリマーが形成される。コラーゲンポリマーは、原線維コラーゲンが好ましい。本発明は、プロコラーゲンの組立てにおける重大な時期は、プロ−α鎖がタイプ特異的な作法で組み立てられることを確実にする、プロ−α鎖間の最初の認識段階であるという発明者らの認識に基づいている。この認識段階は、プロ−α鎖のＣ−末端プロペプチドドメインにある認識配列が関与している。たとえば、ひとつの細胞は、数個のタイプのコラーゲン、すなわち数種の異なるプロ−α鎖を合成することができ、さらに、これらのプロ−α鎖は、Ｃ−末端プロペプチドドメインを識別して、タイプ特異的組立てを確実にすることができる。この識別の１つの例を、Ｉ型およびＩＩＩ型のプロコラーゲンの両方を発現している細胞において見出すことができる。ここでは、proα1(I)、proα2(I)およびproα1(III )と称される、少なくとも３種のプロ−α鎖が合成される。しかし、形成されるプロコラーゲンは、[proα1(I)]₂proα2(I)ヘテロトリマーおよび[proα1(III)]₃ ホモトリマーのみである。プロ−α鎖の他の組み合わせはプロコラーゲンへ組立てられない。ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１２２（ＷＯ−Ａ−９７／０８３１１）（本明細書の参考文献である）に、我々は、Ｃ−末端プロペプチド内の特定の領域が、プロコラーゲン形成中プロ−α鎖のＣ−末端プロペプチドドメイン間の会合特異性に関与する認識配列であることを開示している。これらの認識配列は、それぞれのプロ−α鎖にたいして次のアミノ酸配列をもつことが同定された：これらの認識配列がプロ−α鎖会合の選択性および特異性を付与する。本発明にしたがって、我々は、望ましくない共組立て産物であるハイブリッド分子を作成することなく、少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体のプロ−α鎖またはその誘導体を共発現し、組み立てるシステムにおいて、所望のプロ−α鎖またはその誘導体を発現させ、プロコラーゲンまたはその誘導体へ組立てることができる方法を発明した。これは、外因的に工作されるかまたは選択された遺伝子から発現される、所望のプロ−α鎖またはその誘導体のＣ−末端プロペプチド活性を有するドメインが、少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体のプロ−α鎖またはその誘導体のＣ−末端プロペプチド活性を有するドメインと会合しないように、これらのプロ−α鎖またはその誘導体をコードする遺伝子を外因的に工作するかまたは選択することによって達成される。別の言い方をすれば、該工作するかまたは選択することによって発現されるプロ −α鎖またはその誘導体のＣ−末端プロペプチド活性を有するドメインは、このような遺伝子から発現されるプロ−α鎖間の会合と別のプロコラーゲンまたはその誘導体から形成される少なくとも１つのプロ−α鎖との会合が相互に排他的であるようなドメインである。このように、本発明にしたがって、所望のプロコラーゲンを組み立てるためのプロ−α鎖またはその誘導体を発現する遺伝子は、(ｉ)少なくとも第１のタイプのプロ−α鎖のＣ末端プロペプチドドメインの認識配列を含む第１部分、および (ii)所望のプロコラーゲンを組み立てる第１部分に結合する第２部分、を含むプロ−α鎖またはその誘導体を発現するように、外因的に選択されるかまたは構築される。該第２部分は、少なくとも部分的にトリマーを形成して三重らせんを形成することが可能であるものが好ましい。第２部分は、他のプロ−α鎖またはその誘導体とトリマーを形成することができる、少なくとも数個のアミノ酸を含むのが、より好ましい。発現した分子は、望ましくないハイブリッド分子が形成されることなく、少なくとも１つの別のタイプのプロ−α鎖を共発現し、組み立てるシステムにおいて、発現し、組み立てるように“工作された”分子である。外因的に選択されるかまたは修飾された遺伝子によって発現されるＣ−末端プロペプチド活性を有するドメインは、上記列挙した認識配列を含む。該ドメインは、このような認識配列に、Ｃ−末端プロペプチド活性を保持したまま、修飾（置換または欠失によるなど）を行うことができる。本発明で使用する外因的に修飾された遺伝子を作製するために、所望の認識配列をコードするＤＮＡを、天然または人工的に構築されたプロ−α鎖遺伝子に見られる認識配列をコードするＤＮＡで置換して、本発明方法で使用する外因的に修飾された遺伝子を形成してもよい。天然のプロ−α鎖をコードするＤＮＡ、特にｃＤＮＡは、当業界では公知であり、入手可能である。たとえば、ＷＯ−Ａ−９３０７８８９、ＷＯ−Ａ−９４１６５７０およびこれらの両方の参考文献に、その詳細が記載されている。このようなＤＮＡを、本発明で用いるための外因的に修飾された遺伝子をコードするＤＮＡ分子を作製するための簡便な出発材料として用いてもよい。ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ、全ゲノム配列およびミニ遺伝子（全長遺伝子に存在するイントロンの幾つか（全部ではない）を含むゲノム配列）を、組換え法によって天然のプロ−α鎖をコードするＤＮＡ配列（前記出発材料ＤＮＡなど）に挿入し、本発明の第１の態様において使用するための外因的に工作された遺伝子をコードするＤＮＡ分子を形成してもよい。一般に非常に多数のイントロンがコラーゲン遺伝子に存在するので、実際に実験に用いるのは、通常、ｃＤＮＡを用いるのが好ましく、場合によってはミニ遺伝子が都合がよい。挿入されたＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ、全長ゲノム配列またはミニ遺伝子は、少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を組み立てるプロ−α鎖またはその誘導体のＣ−末端プロペプチドドメインと共組立てされないＣ−末端プロペプチドドメインをもつプロ−α鎖またはその誘導体にリスクを付与するアミノ酸をコードする。好ましい遺伝子の外因的工作は、工作された遺伝子から発現するいずれかのプロ−α鎖またはその誘導体が、外因的に工作された遺伝子が導入される宿主細胞から発現するプロ−α鎖と、望ましくない共組立てを行わないという、プロ−α 鎖の選択的会合を導くＣ−末端プロペプチドドメイン内の認識配列の変換である。我々の先の出願、ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１２２（ＷＯ−Ａ−９７／０８３１１）において、我々は、天然のＣ−末端プロペプチドまたは異種のα鎖（あるいは非コラーゲン成分）をもつ新規なＣ−末端プロペプチドドメインの組み合わせを特徴とする新規な分子を開示した。ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１２２は、このような分子をコードするＤＮＡも開示している。これらのＤＮＡ分子を本発明に用いてもよい。ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１２２に開示した、このような分子は、本発明に包含される。別法として、これらの認識配列のいずれか１つをコードするＤＮＡ内に、欠失、付加または置換といったような突然変異を作成して、プロ−α鎖会合の選択性および特異性を変化させることもできる。他の好ましい遺伝子の外因的にの工作は、少なくとも２つの異なるプロ−α鎖の遺伝暗号から形成される、キメラプロ−α鎖またはその誘導体をコードする遺伝子構築物の構築である。該キメラプロ−α鎖またはその誘導体が、１つのタイプのプロ−α鎖のＣ−末端プロペプチドドメイン由来の認識配列および別のタイプのプロ−α鎖由来のα鎖ドメインを含むのが特に好ましい。好ましいキメラプロ−α鎖またはその誘導体には、proα1(I)、proα2(I)、proα1(II)、proα1(I II)、proα1(V)、proα2(V)、proα1(XI)またはproα2(XI)プロ−α鎖の認識配列およびこれらのプロ−α鎖の異なる１つから選ばれるα鎖ドメインが含まれる。キメラプロ−α鎖またはその誘導体を作成するのに最も好ましいプロ−α鎖は、コラーゲンＩおよびＩＩＩからのものであり、proα2(I)およびproα1(III)が特に好ましい。特に好ましいキメラプロ−α鎖またはその誘導体は、実施例に開示する。本発明の方法における遺伝子の好ましい外因的にの工作では、proα2(I)鎖遺伝子の認識配列をコードするＤＮＡを、proα1(III)鎖遺伝子の認識配列をコードする対応するＤＮＡと交換することができ、この工作をされた遺伝子は、発現して、proα2(I)ホモトリマーであるプロコラーゲンを（これらの認識配列を含むプロ−α鎖から通常形成されるproα1(III)ホモトリマーの代りに）組み立てることができる。このように、本発明にしたがって、発現が起こる、天然の認識配列を有する細胞に内在するproα2(I)鎖とは共組立てされない、外因性源由来のproα2(I)ホモトリマー形成することができる。もうひとつの本発明の方法における遺伝子の好ましい外因的工作では、工作された遺伝子は、少なくとも、プロコラーゲンＣ−プロペプチド（すなわち、プロ −α鎖のＣ−末端プロペプチドドメイン）の活性を有する第１の部分および異種コラーゲンα鎖および非コラーゲン成分のいずれか１つから選ばれる第２の部分（第１の部分は第２の部分に結合する）を含む分子をコードする。非コラーゲン成分の第２の部分をコードする遺伝子（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１２２で開示したような）は、本発明で使用するプロ−α鎖誘導体の例である。別法として、選択された遺伝子から発現するいずれかのプロ−α鎖が、該遺伝子が導入される宿主細胞から発現するプロ−α鎖と、望ましくない共組立てを行わないような、プロ−α鎖の選択的会合を導くＣ−末端プロペプチドドメイン内の認識配列の遺伝子を、天然の遺伝子から選択することができる。外因的に選択または修飾された遺伝子を、適当なベクターに組み込んで組換えベクターを作成する。ベクターは、プラスミド、コスミドまたはファージなどである。このようなベクターには、ベクターにトランスフェクトされた細胞の選択を可能にするための、好ましくは、外因的に修飾された組換えベクターを内包する細胞の選択を可能にするための１つまたはそれ以上の選択可能なマーカーを含むことが多い。プロ−α鎖またはその誘導体を発現するには、ベクターは発現ベクターであり、外因的に修飾された遺伝子の発現を作動させための調節配列を含むべきである。このような調節配列を含まないベクターは、外因的に修飾された遺伝子の調製に用いることができ、外因的に修飾された遺伝子の複製に用いるクローニングベクターとして有用である。このようなベクターを用いる場合、外因的に修飾された遺伝子は、プロ−α鎖またはその誘導体の産生に用いる適当な発現ベクターへトランスファーされることが最終的に必要となる。本発明の外因的に選択されたプロ−α鎖または外因的に工作された遺伝子がプロコラーゲンまたはその誘導体を発現し、組み立てるシステムは、無細胞インビトロシステムであってもよい。しかし、本発明の第２の態様においては、システムがＤＮＡ分子でトランスフェクトされる宿主細胞であるのが好ましい。このような宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。真核宿主とは、酵母、昆虫および哺乳類細胞などである。ＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現に用いる宿主は、不安定に形質転換された（遷移）宿主の使用が除外されることはないが、理想的には安定に形質転換された宿主である。別法として、宿主細胞システムは、トランスジェニック植物または好ましくはトランスジェニック動物において発現されるトランスジーン構築物へ組み込まれるＤＮＡ分子を含むことができる。このようなトランスジーン構築物の発現にとって安定なように作製されるトランスジェニック動物には、家禽などのトリ、両生類および魚類などが含まれる。トランスジェニック動植物から形成されたプロコラーゲンまたはその誘導体および／またはコラーゲンポリマーは、体液または他の体からの産物（卵など）から収穫することができる。好ましいトランスジェニック動物は、（ヒト以外の）哺乳動物、特に胎盤性動物である。本発明のＤＮＡ分子の発現産物は、このような動物の乳腺において発現し、該発現産物は、乳から回収することができる。有蹄類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダおよびブタなどの特に経済的に重要な有蹄類が、本発明のトランスジェニック動物として用いるのに最も適当な胎盤性動物である。体内におけるプロ−α鎖またはその誘導体の発現が遺伝子療法を有効にする適当な手段でありうるようなヒトの場合に、トランスジェニック動物は同様にヒトであってもよい。宿主細胞、特にトランスジェニック植物または動物は、他の外因性ＤＮＡを含むことができ、その発現は、プロコラーゲンおよびその誘導体の生合成における発現、組立て、分泌または他の態様を促進し、該プロコラーゲンおよびその誘導体から形成されたコラーゲンポリマーの合成さえも促進する。たとえば、ＷＯ− Ａ−９３０７８８９に開示しているように、宿主細胞およびトランスジェニック植物または動物を工作して、プロコラーゲンの天然の生合成において重要な翻訳後酵素であるプロリル４−ヒドロキシラーゼを共発現するようにしてもよい。本発明方法は、プロ−α鎖の望ましくない共組立てまたはハイブリッド形成が行われる従来のシステムにおいて所望のプロコラーゲンまたはその誘導体の発現および組立てを可能にする。本発明方法は、外因的に発現されたプロ−α鎖と共組立てされることに関連する問題を起こすことなく、広範囲の細胞系またはトランスジェニック生物由来のプロコラーゲンまたはその誘導体を発現させるのに特に適している。好ましい本発明方法の使用は、細胞系における組換えプロコラーゲンの産生である。使用しうる細胞系は、線維芽細胞またはそれから誘導された細胞系である。ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、マウス３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）およびＣＯＳ細胞が使用できる。本発明方法は、の所望のプロコラーゲンまたはその誘導体の生産、特にバイオテクノロジーの手段による大規模な工業的生産の改良された方法として特に有用である。本発明方法は、骨形成不全症、幾つかの種類のエーレルス−ダンロー症候群、またはある種の軟骨形成異常などの疾患に罹っている患者の遺伝子療法による治療にも有用である。ほとんどの場合、これらの疾患の激烈な影響は、三重らせんドメイン内のグリシンが、プロ−α鎖においてより大きな側鎖をもつアミノ酸と置換されることによるものである。この置換によって、プロコラーゲンの形成中に、プロコラーゲンの分泌が劇的に低下するという、分泌が妨げられている、あるいは遅らせられているという三重らせん折りたたみ状態になる。悪い状態で折りたたまれたタンパク質が細胞内、おそらく細胞室内細網に保持され、そこで分解される。さらに、Ｃ−末端プロペプチドドメインの折りたたみは、これらの三重らせんドメイン内の突然変異によって影響されないので、細胞内に正常な鎖および変異したプロ−α鎖が保持された結果、正常な鎖および変異した鎖のＣ−末端プロペプチドドメインが会合することになる。変異した鎖との相互作用による正常な鎖の保持および分解は、突然変異の影響を増幅し、“プロコラーゲン自殺 ”と称されている。おそらく、この現象によるタンパク質の大きな損失が、なぜこのような突然変異が致死効果を生み出すかを実証するものと思われる。発明者らによる、プロ−α鎖間の会合を最初に指示する認識配列の同定から、コラーゲン蓄積を調節あるいは阻止するといった治療的干渉のための標的が提供される。したがって、本発明方法は、変異プロ−α鎖と共組立てを起こさないＣ−末端プロペプチドドメインをもつプロ−α鎖をコードするように野生型遺伝子が外因的に工作されている、野生型遺伝子のコピーを、三重らせんドメインに変異を有する個体へトランスファーする遺伝子療法として利用することができる。治療の結果、患者は変異鎖を発現する細胞内で真正なコラーゲン鎖を分泌する能力をもつようになる。本発明を実施例および図面によってさらに実証する。図１は、正常なプロコラーゲン組立て（Ａ）の段階および本発明のひとつの具体例におけるプロコラーゲン組立ての段階（Ｂ）の模式的表現である。図２は、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンのプロ−α鎖のＣ−末端プロペプチドドメインのアラインメントプロットを示す。アラインメントは、同一のアミノ酸（＃）または保存されているアミノ酸（〜）を示す。保存されたシステイン残基は、１から８個であり、文字Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇは、実施例のproα1(III) 鎖とproα2(I)鎖間のジャンクションの最初のアミノ酸を示す。図３は、実施例に記載されたキメラproα1鎖の模式的表現である。図４は、Ｃ−末端プロペプチドドメインが交換されたキメラ遺伝子構築物におけるジスルフィド結合形成を表す、実施例で行った下記の親およびキメラ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。各レーンは次のとおり：proα1(III)Δ１[ α1(III)]、proα2(I)Δ１[α2(I)]（親分子）およびproα2(I):(III)CP[α2:CP ]proα１(III):(I)CP[α1:CP]（ハイブリッド鎖）。これらの分子は、半透過性（ＳＰ）細胞ＨＴ１０８０細胞の存在下、ウサギ赤血球ライセートに発現した。その後、ＳＰ細胞を遠心分離により単離し、可溶化し、７．５％ゲルを用いて還元（レーン１〜４）または非還元条件下（レーン５〜８）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて翻訳産物を分離した。図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンは、特定の温度における proα２(I):(III)CP三重らせんの熱変性による影響を表す。サンプルは、次の作法で調製した。:proα２(I):(III)CPＲＮＡをＳＰ細胞の存在下で翻訳し、その後、ＳＰ細胞を遠心分離により単離し、可溶化し、ペプシン（１００μｇ／ｍｌ）で処理した。反応混合物を中和し、キモトリプシン／トリプシン消化緩衝液で希釈し、アリコートに分けた。各アリコートはトリプシン（１００μｇ／ｍｌ）およびキモトリプシン（２５０μｇ／ｍｌ）の混合物で消化する前に１セットの温度に加熱しておいた。１２．５％ゲルを用いて還元条件下（レーン１〜１０）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分析した。図６は、キメラプロコラーゲン鎖におけるトリマー化および三重らせん形成を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。サンプルは、親鎖であるproα 1(III)Δ１、proα2(I)Δ１から調製し、ハイブリッドproα2(I):(III)CP，Ａ, Ｆ,Ｆ^S-C、proα1(III):(I)C[α2CP，Ａ,Ｆ,Ｆ^S-C,Ｂ^S-C,Ｃ^S-C，α１C]を作製した。ハイブリッドを、ＳＰ細胞の存在下、ウサギ赤血球ライセート中で翻訳した。その後、ＳＰ細胞を遠心分離により単離し、可溶化し、７．５％ゲルを用いて非還元条件下（レーン１〜９）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて翻訳産物の一部を分離した。図７は、キメラプロコラーゲン鎖におけるトリマー化および三重らせん形成を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンは、図６のゲルで泳動したサンプルの残りのサンプルを示す。サンプルは、ペプシン（１００μｇ／ｍｌ）で処理した。その後、中和し、トリプシン（１００μｇ／ｍｌ）およびキモトリプシン（２５０μｇ／ｍｌ）の混合物で消化し、タンパク質分解消化産物を、１２．５％ゲルを用いて還元条件下（レーン１〜９）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図８は、２３アミノ酸Ｂ−Ｇモチーフをもつ鎖におけるトリマー化および三重らせん形成を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンは、組換えプロコラーゲン鎖であるproα2(III):(I)CP，proα２(I):(III)CPおよびproα２(I): (III)ＢＧＲ^S-Cを示す。これらを、ＳＰ細胞とともに、ウサギ赤血球ライセート中で発現させた。その後、ＳＰ細胞を遠心分離により単離し、可溶化し、７．５％ゲルを用いて還元（レーン１〜３）または非還元条件下（レーン４〜５）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて翻訳産物の一部を分離した。図９は、２３アミノ酸Ｂ−Ｇモチーフをもつ鎖におけるトリマー化および三重らせん形成を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンは、図８のゲルで泳動したサンプルの残りのサンプルを示す。サンプルは、ペプシン（１００μ ｇ／ｍｌ）で処理した。その後、中和し、トリプシン（１００μｇ／ｍｌ）およびキモトリプシン（２５０μｇ／ｍｌ）の混合物で消化し、タンパク質分解消化産物を、１２．５％ゲルを用いて還元条件下（レーン１〜３）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図１０は、proα２(I):(III)ＢＧＲ鎖の組立てにおけるCys−Ser転換およびLe u−Met突然変異の影響を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンは、組換えプロコラーゲン鎖であるproα２(I):(III)ＢＧＲ^S-C,proα2(I):(III)ＢＧＲ^C-S,proα２(I):(III)ＢＧＲ^1-mを示す。これらを、ＳＰ細胞とともに、ウサギ赤血球ライセート中で翻訳した。その後、ＳＰ細胞を遠心分離により単離し、可溶化し、７．５％ゲルを用いて還元（レーン１〜３）または非還元条件下（レーン４〜６）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて翻訳産物の一部を分離した。図１１は、proα２(I):(III)ＢＧＲ鎖の組立てにおけるCys−Ser転換およびLe u−Met突然変異の影響を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンは、図１０のゲルで泳動したサンプルの残りのサンプルを示す。サンプルは、ペプシン（１００μｇ／ｍｌ）で処理した。その後、中和し、トリプシン（１００μｇ／ｍｌ）およびキモトリプシン（２５０μｇ／ｍｌ）の混合物で消化し、タンパク質分解消化産物を、１２．５％ゲルを用いて還元条件下（レーン１〜３）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図１２は、proα２(I):(III)ＢＧＲのＣ−末端プロペプチド間の鎖間ジスルフィド結合を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーンは、組換えプロα 鎖であるproα２(I):(III)1およびproα２(I):(III)ＢＧＲを示す。これらを、ＳＰ細胞とともに、ウサギ赤血球ライセート中で翻訳した。その後、ＳＰ細胞を遠心分離により単離し、可溶化し、１．５ユニットの細菌コラゲナーゼで消化した。消化産物を１０％ゲルを用いて還元（レーン２および３）または非還元条件下（レーン４および）で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。図１３は、他の原線維プロコラーゲンにおける鎖選択性認識ドメインの配列アラインメントの模式的表現である。２３残基Ｂ−Ｇモチーフ内の配列相同性が描かれており、枠囲みされた領域は、プロ−α鎖の識別を指示する独特の４５残基サブドメインの位置を示している。図１は、細胞の細胞質内細網においてプロコラーゲンがどのように組み立てられるかを示すものである。通常、組立ては、相補的プロ−α鎖（１）のＣ−末端プロペプチドドメインのタイプ特異的会合によって開始されてプロコラーゲン（２）が形成される。合成された細胞内からプロコラーゲンが分泌され、次いで、Ｎ−末端プロペプチドおよびＣ−末端プロペプチドをそれぞれ切断する、プロコラーゲンＮプロテイナーゼおよびプロコラーゲンＣプロテイナーゼによって影響を及ぼされて、コラーゲン分子（３）が得られる。次いで、コラーゲン分子は同時に集合してコラーゲン原線維を形成する。非相補的Ｃ−末端プロペプチドドメインをもつプロ−α鎖（４）は会合せず、プロコラーゲンを形成しない。外因的プロ−α鎖（５）が細胞内に導入される場合、それらは、Ｃ−末端プロペプチドドメインと相補的である内因的プロ−α鎖（６）と共組立てを行って望ましくないハイブリッド（７）を形成する。本発明にしたがって、内因的プロ−α鎖（６）のＣ−末端プロペプチドドメインとはもはや相補的ではないＣ−末端プロペプチドドメインを持つ外因的に工作されたプロ−α鎖（８）を作成し、内因的プロ −α鎖（６）との共組立てを起こすことなく、プロコラーゲン（９）、次いでコラーゲン分子（１０）を形成する。実施例本発明者らは、本発明方法に使用しうるＤＮＡ分子を作成した。これらのＤＮＡ分子を用いて、プロ−α鎖組立てに対する改変された選択性をもつプロ−α鎖を発現させた。実験方策は、ホモトリマーproα1(III)鎖からproα2(I)分子へのＣ−末端プロペプチドドメイン（またはＣ−プロペプチドの配列）のトランスファーによって、自己会合が指示され、proα2(I)のホモトリマーが組み立てられるという仮定に基づいて作成した。本発明者らは、正確に整列された三重らせんの組立てを確実にするのに必要な翻訳時および翻訳後修飾を行うことが知られている半透過可能化された細胞の存在下、無細胞翻訳システムにおいて特定のＲＮＡを発現することによって、プロコラーゲンの組立ての開始段階を再構築した。 proα1(III)のＣ−末端プロペプチドドメインの特定の領域が、proα2(I)鎖間の対応する領域と交換されている一連のキメラプロ−α鎖から形成されるプロコラーゲンの折りたたみおよび組立てパターンを分析することによって、逆に、発明者は、プロコラーゲンの自己会合を指示する、proα1(III)Ｃ−末端プロペプチド内の１５アミノ酸からなる短い不連続配列を同定した。したがって、この配列が、開始認識イベントの原因であり、選択的鎖会合に必要なものである。１．材料および方法１．１組換えプラスミドの構築 pα1(III)Δ1およびｐα2(I)Δ1は、端を切りつめたα鎖ドメインをもつ組換えプロ−α鎖であることが、に記載されている（LeeおよびBulleid（１９９４）J. Biol.Chem.２６９、ｐ２４３５４−２３６０）。Horton（１９９３）Methodsin Molecular Bioloby、Vol１５、２５章、Humana Press Inc.、Totowa、ＮＪによって略述されている原理を用いるＰＣＲオーバーラップ伸長によってキメラ分子を作成した。ＰＣＲ（１００μｌ）は、１０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのトリス− ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｍＭのＭｇＳＯ₄０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、３００μＭの各ｄＮＴＰ中、テンプレートＤＮＡ（５００ｎｇ）、オリゴヌクレオチドプライマー（それぞれ１００ｐｍｏｌ）であった。１ユニットのVentＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ、ＭＡ）の存在下、増幅を１０ラウンド行った。ｐα2(I)Δ1のＳｆｉｌサイトから７０ｂｐ上流の配列に相補的な５’オリゴヌクレオチドプライマー（ 5'AGATGGTCGCACTGGACATC 3' ）およびpα1(III)Δ1の停止コドンから１００ｂｐ下流の領域に相補的な３’オリゴヌクレオチドプライマー（ 5'TC GCAGGGATCCGTCGGTCACTTGCACTGGTT 3' ）を用いて組換え体ｐα2(I)Δ1：(III )CP,A,F,S^S-C,C^S-Cを作成した。このプライマーにＢａｍＨＩサイトを導入して続いて起こるサブクローニングステップを促進した。図および３に描かれているような正確なジャンクションをもつ分子を生成するように、ひとつのオリゴヌクレオチドに２０のヌクレオチドオーバーラップを包含する内部オリゴヌクレオチド対を設計した。オーバーラップ伸長によって、〜９９０ｂｐの産物が得られ、これを精製し、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩで切断し、ｐα2(I)Δ1にライゲートし、これから１０８０ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを削った。同様の方法で、pα1(III)Δ1のＸｈｏＩサイトから１００ｂｐ上流の配列に相補的な５’ オリゴヌクレオチドプライマー（ 5’AATGGAGCTCCTGGACCCATG 3’ ）およびpα2(I)Δ1の停止コドンから１００ｂｐ下流の領域に相補的であり、ＫｐｎＩサイトを含む３’オリゴヌクレオチドプライマー（ 5'CTGCTAGGTACCAAATGGAA GGATTCAGCTTT 3' ）を用いて組換え体pα1(III)Δ1：(I)CP,Cを合成した。オーバーラップ伸長により、得られた１００ｂｐのフラグメントをＸｈｏＩおよびＫｐｎＩで切断し、pα1(III)Δ1にライゲートし、これから１８６０ｂｐのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを削除した。proα2(I)Δ1：(III)シリーズのキメラを合成するのに用いた同様の増幅プライマーおよびＫｐｎＩの代りにＢａｍＨＩサイトを含む以外は（両者とも pα2(I)Δ1に相補的である）ｐα1(III)Δ1：(I)CP,C構築物を作成するのに用いたものと同じ３’オリゴヌクレオチドを用いて、組換え体proα2(I)：(III)BGR を構築した。第１の増幅産物は、ジャンクションを決定する内部オリゴヌクレオチドとともにpα2(I)Δ1：(III)B^S-Cおよびpα2(I)Δ1から生成した。オーバーラップ伸長によって、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで切断され、pα2(I)Δ1にライゲートされるフラグメントを作成した。１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよび１μｇのＴ４遺伝子３２タンパク質（ベーリンガー、Lewes、ＵＫ）の存在下で伸長反応を行う以外は、本質的にKunnkelらの記載（Kunnkelら（１９８７）、Methods in Enzymol.、１５４、ｐ３６７−３８８２）にしたがって部位指定突然変異誘発を行った。１．２インビトロにおける転写 Gurevichら（１９８７）（Gurevichら（１９９１）、Anal.Biochem.、１９５、ｐ２０７−２１３を参照せよ）の記載にしたがって転写反応を行った。組換えプラスミドpα1(III)Δ1,pα1(III)Δ1：(I)CP,Cおよび、pα2(I)Δ1,pα2(I)Δ 1：(III)CP,A,F,S^S-C,B^S-C,C^S-C（１０μｇ）を直線化し、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ、サザンプトン、ＵＫ）をそれぞれ用いて、転写した。反応物（１００μｌ）を３７℃で４時間インキュベートした。ＲＮeasyカラム（キアゲン、ドーキング、ＵＫ）にて精製を行った後、１ｍＭのＤＴＴおよび４０ユニットのＲＮasin（プロメガ、サザンプトン、ＵＫ）を含む１００μｌのＲＮアーゼフリー水にＲＮＡを再懸濁した。１．３インビトロにおける翻訳ウサギ赤血球ライヤート（フレキシライセート、プロメガ、サザンプトン）を用いて３０℃にて２時間、外因性ＤＴＴの不在下でＲＮＡを翻訳した。翻訳反応物（２５μｌ）に、１７μｌの赤血球ライセート、１μｌの１ｍＭアミノ酸（マウスメチオニン）、０．４５μｌの１００ｍＭＫＣｌ、０．２５μｌのアスコルビン酸（５ｍｇ／ｍｌ）、１５μＣｉの[Ｌ−³⁵Ｓ]メチオニン（アマーシャム・インターナショナル、バックス、ＵＫ）、１μｌの転写されたＲＮＡおよび Wilsonら（１９９５）、Biochem.J.、３０７、ｐ６７９−６８７の記載にしたがって調製した１μｌの（〜２×１０⁵）半透過性細胞（ＳＰ細胞）を加えた。翻訳後、最終濃度が２０ｍＭとなるようにＮ−エチルマレイミドを加えた。１０００ｇ、５分間の遠心分離によってＳＰ細胞を単離し、次に続く酵素消化またはゲル電気泳動のためにペレットを適当な緩衝液に再懸濁した。１．４細菌コラゲナーゼ消化５ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、５ｍＭのＮ−エチルマレイミドおよび１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にＳＰ細胞を再懸濁し、３ユニットのIII型コラゲナーゼ（アドバンス・バイオファクチャー、リンブルック、ＮＪ）とともに３７℃で１時間インキュベートする。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加えて反応を停止する。１．５タンパク質分解的消化０．５％（ｖ／ｖ）酢酸、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００に単離したＳＰ細胞を再懸濁し、ペプシン（１００μｇ／ｍｌ）とともに２０℃で２時間または４℃で１６時間インキュベートした。トリス−塩基（１００ｍＭ）で中和して反応を停止した。次いで、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の存在下、キモトリプシン（２５０μｇ／ｍｌ）およびトリプシン（１００μｇ／ｍｌ）（シグマ、Poole、ドーセット、ＵＫ）の組み合わせでサンプルを室温にて２時間消化した。最終濃度を５００μ ｇ／ｍｌにした大豆トリプシンインヒビター（シグマ、Poole、ドーセット、ＵＫ）および沸騰したＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を加えて反応を停止した。次いで、サンプルを５分間した。１．６熱変性ペプシン処理したサンプルを０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、アリコートを熱循環器に置く。温度を３１℃から４０℃まで１℃ずつ２分間ごとに上昇させた。各時限ごとにサンプルを上記キモトリプシンの組み合わせ液で処理した。１．７ＳＤＳ−ＰＡＧＥ５０ｍＭのＤＴＴの存在または不在下に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（０．０６２５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、ＳＤＳ（２％ｗ／ｖ）、グリセロール（１０％ｖ／ｖ）およびブロモフェノールブルー）にサンプルを再懸濁し、５分間煮沸する。レムリ（１９７０）、Nature、２２７、ｐ６８０−６８５の方法を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後、ゲルをオートラジオグラフィーで処理し、コダックＸ−ＯマットＡＲフィルムで撮影するかまたは燐光イメージ分析によってイメージを定量する。２．結果２．１ proα1(III)Ｃ−末端プロペプチドのproα2(I)へのトランスファーは、自己組立てを指令するための十分条件である。実験方策は、ホモトリマーproα1(III)鎖からproα2(I)分子へのＣ−末端プロペプチドドメインのトランスファーによって、自己会合が指示され、ホモトリマーが組み立てられるという仮定に基づいて作成した。したがって、proα1(III) Ｃ−末端プロペプチドドメイン内の異なる領域とproα2(I)鎖の対応する配列とを交換することによって、三次構造の折りたたみを指示し、分泌（すなわち、プロ−α鎖の認識）プロセスに関与する配列を区別することを意図とした。翻訳産物の分析を簡便にするために、２つの親プロコラーゲン‘ミニ鎖’、proα1(III )Δ1およびproα2(I)Δ1からキメラプロコラーゲン分子を構築した。先行文献（ LeesおよびBulleid、１９９４）に記載されているこれらの分子は、Ｎ−およびＣ−末端プロペプチドドメインの両方ならびに先を切った三重らせんドメインを含んでいる。最初の仮定は、ｐｒｏα2(Ｉ)鎖のＣ−末端プロペプチドドメインが、proα1(III)Δ1鎖の対応ドメインと置換されているキメラプロコラーゲン鎖（すなわち、proα2(I):(III)CP）、逆にproα1(III)鎖のＣ−末端プロペプチドがproα2(I)Δ1鎖のものと交換されている場合proα1(I):(III)CP）の折りたたみと組立てを分析することによって試験した（図２および図３を参照せよ）。pr oα2(I)鎖間のＡｌａおよびＡｓｐの間（１１１９−１１２０残基）で起こることがわかっている（Kessler（１９９６）、Science、２７１、ｐ３６０−３６２）プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ（ＰＣＰ）による切断部位によって、Ｃ−末端プロペプチド（ＣＰ）のジャンクションポイントを決定した。pro α1(III)鎖間の切断前の位置に関するデータがないために、本発明者らは、ＡｌａおよびＰｒｏ（１２１７−１２１８残基）の間にジャンクションを置くことを選択した。しかし続いて、Kesslerおよび共同研究者（１９９６）は、ＰＣＰによる切断がＧｌｙとＡｓｐの間（１２２２−１２２３残基）で起こり、さらに組換え体proα2(I):(III)CPにおいて、proα1(III)のＣ−末端テロペプチドから誘導された付加的４残基が含まれるのに対し、proα1(III):(I)CP構築物においてはＣ−末端テロペプチドから同じ４つのアミノ酸が失われていることを明らかにしている。ＲＮＡ転写物はインビトロで転写され、プロコラーゲンの折りたたみ、翻訳後修飾および組立てにおいて開始段階を行うことがすでに明らかにされている（Bulleidら（１９９６）、Biochem.J.、３１７、ｐ１９５−２０２）、ジスルフィド結合の形成に最適化されたウサギ赤血球ライセートとともに半透過性ＨＴ１０８０細胞（ＳＰ細胞）を含む無細胞系で発現された。proα1(III)およびproα2(I)鎖のＣ−末端プロペプチドドメインは両方とも、鎖間ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基を含んでいる。したがって、ジスルフィド結合したトリマーを検出するために、還元および非還元条件下で翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。親分子であるproα1(III)Δ1およびproα2(I)Δ1の翻訳により、それぞれ〜７７ｋＤａおよび６６ｋＤａの主産物（図４のレーン１および２）が得られた。これらのサイズの差は、各分子のＮ−プロペプチドと先を切り取った三重らせんドメインの相対的分子量の違いによるものである（LeesおよびBulleid、１９９４）。翻訳産物のヘテロゲネイティは、三重らせんドメインのプロリン残基のヒドロキシル化によるものであり、このことは、電気泳動の移動性を変化させることになる（Cheahら（１９７９）、Biochem.Biophys.Res.C omm．91、ｐ１０２５−１０３１）。レーン３および７に存在する他の分子量の小さいタンパク質は、おそらく、内部開始コドンでの翻訳開始後に得られた翻訳産物を表すものと思われる。我々は、これまでに、これらのマイナーな翻訳産物は、細胞質内細網へ移動しないことを明らかにしている（LeesおよびBulleid、１９９４）。非還元条件下では存在するが、還元条件下では存在しない高分子量のものは、鎖間ジスルフィド結合形成を示している。非還元条件下での分離によって、proα1(III)Δ1鎖は自己会合してジスルフィド結合したトリマーを形成することができるが、proα2(I)Δ1はそれができないことが明らかになった（図４、レーン５および６）。キメラ鎖proα2(I):(III)CPおよびproα1(III):(I)CPについて同様の実験を行ったところ、proα2(I):(III)CP 鎖のみがジスルフィド結合したホモトリマーを形成しうること（図４、レーン３、４、７および８）が明らかになった。このことから、プロコラーゲン鎖間の最初の会合を作動させるには、III型プロコラーゲンのＣ−末端プロペプチドが必要かつ十分であることが示される。三重らせんプロコラーゲンを特に検出するために用いた標準的アッセイにおいて、ＳＰ細胞の存在下で合成されたproα1(III)Δ1鎖は、ペプシン、キモトリプシンおよびトリプシンに対して耐性があることがすでにわかっている（Bulleid ら、１９９６）本発明者らは、翻訳産物にプロテアーゼ処理を行う前に種々の温度に加熱するという熱変性試験を行うことによって、proα2(I):(III)CP鎖が正確に配列された三重らせんを形成する能力をもつことを確認した（図５）。その結果から、３５℃以下の温度ではプロテアーゼ耐性三重らせんフラグメントが存在するが、３５℃以上の温度では三重らせんが解けてプロテアーゼ感受性になることが示される（図５、レーン１〜１０）。燐光イメージ分析によって定量した後、融点（Ｔｍ）は〜３５．５℃であることが算出された。proα2(I):(III)CP に対して得られたＴｍ値は、proα1(III)Δ1に対して得られた３９．５℃よりも有意に低く（Bulleidら、１９９６）、このことは、おそらく、三重らせんドメインにおける全アミノ酸数に対するヒドロキシプロリン残基のパーセンテージを反映しているものと考えられる（それぞれ１１％および１５％）。これらの結果から、proα1(III)Ｃ−末端プロペプチドのトランスファーによって、正確に配列された三重らせんへ折りたたまれる、proα2(I)鎖を含む完全に新規なプロコラーゲンを作成することができることが示される。２．２キメラＣ−末端プロペプチドをもつ組換えプロコラーゲン鎖 proα2(I):(III)CPハイブリッドプロ−α鎖は自己会合するために必要なすべての情報を含んでいると仮定すると、proα1(III)のＣ−末端プロペプチド配列を連続的に除去し、対応するproα2(I)配列と交換することが、結局、鎖選択メカニズムを分断することになると我々は推論した。逆に、proα1(III)のＣ−末端プロペプチドドメインの配列をproα1(III)：(I)CPキメラ鎖へトランスファーするかまたは連続的に動かすと、自己会合する能力を有する分子が得られることが予測される。キメラＣ−末端プロペプチドドメインをもつ一連のプロコラーゲン鎖を構築し、個々の鎖の、安定な三重らせんドメインをもつホモトリマーを形成する能力を試験した。これらの組換え体の模式的表現を図２に示した。文字Ａ、Ｂ、Ｃ、ＦおよびＧは各ジャンクションの位置を意味する。proα1(III)およびproα2(I)のＣ−末端プロペプチドに関し、proα2(I)においてはCys残基が欠けており、システイン残基の補体において異なることに留意すべきである。我々のこれまでのデータは、III型コラーゲンのＣ−末端プロペプチド内の鎖間ジスルフィド結合が、Cys２と３の間でのみ形成することを示唆している（LeesおよびBulleid、１９９４）。しかし、どちらかのＣ−末端プロペプチドドメインからＣ−末端テロペプチドへの鎖間ジスルフィド結合は、鎖会合および三重らせん形成には不必要であり（Bulleidら、１９９６）、したがって、Ｃ−末端プロペプチドドメインのCys２残基またはＣ−末端テロペプチドのシステイン（proα1( III)の三重らせんドメインにおいてのみ発見されている）のどちらかを欠如しているキメラプロ−α鎖間にホモトリマーを形成することが可能である。しかし、これらの分子は、鎖間ジスルフィド結合を含まず、その結果として非還元条件下での分析後にオリゴマーとして現れないであろう。この問題を避けるために、適当なところで、発明者らは、存在するセリン残基がシステインで置換されていることから、鎖間ジスルフィド結合によって安定化されたトリマーを形成する能力を回復している、組換えpα2(I)Δ1^S-Cハイブリッド鎖を作成した（LeesおよびB ulleid、１９９４）。proα1(III):(I)CPにはCys２が欠けているとはいえ、三重らせんドメインのジャンクションに位置する２つのシステイン残基のおかげで、依然としてジスルフィド結合したトリマーを形成する能力を保持しており、Ｃ− 末端テロペプチド、親鎖であるpα2(I)Δ1およびハイブリッドproα2(I):(III)C P,A,F,S^S-C,B^S-C,C^S-C，proα1(III):(I)Cは、ＳＰ細胞の存在下で翻訳され、翻訳産物は、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された（図６）ことにも留意すべきである。。この結果は、組換え体pα1(III)Δ1，proα2(I):(III)CP,A,F,S^S-C,B^S-C（図６のレーン１、３、４、６および７）が、鎖間ジスルフィド結合したトリマーおよびダイマーを形成することができるのに対し、pα1(III)Δ1，proα2(I):(III )F,C^S-Cおよびpα1(III):(I)C（図６のレーン２、５、８および９）がモノマー性のままであることを実証している。我々は、鎖間ジスルフィド結合が、三重らせんの形成にとって欠くことができないものではなく（Bulleidら、１９９６）、したがってジスルフィド結合したトリマーを形成しえないことが、分子が三重らせんを形成するように組み立てられる可能性を妨げることはないということもすでに示している。キメラ鎖が、正確に配列された三重らせんに折りたたまれる能力を有しているかどうかを確認するために、我々は、翻訳産物をペプシン、キモトリプシンおよびトリプシンで処理し、消化された材料を還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図７に示されるように、組換え体pα1(III)Δ1 ，proα2(I):(III)CP,A,F^S-C,F,B^S-C（図７のレーン１、３、４、５、６および７）のすべてにおいて、プロテアーゼ耐性フラグメントが得られた。サイズの相異は、親の分子それぞれにおける三重らせんドメインの相対的長さを反映している[pα2(I)Δ1185およびpα1(III)Δ1192]。proα2(I):(III)Fの安定な三重らせんを形成する能力は、鎖間ジスルフィド結合が、三重らせん折り畳みに必要ではないことを確認している。したがって、プロペプチド切断部位とＢ−ジャンクションの間のｐｒｏα2のＣ−末端プロペプチドドメインからの配列を含むハイブリッド分子は、安定な三重らせんドメインをもつホモトリマーを形成する能力をもち、それゆえに、鎖の自己組立てを支持するのに必要な情報のすべてを含んでいる。これらの結果から、鎖選択性をコントロールするシグナルが、Ｂ−ジャンクションとＣ−プロペプチドのＣ−末端の間に位置するに違いないということが示される。proα2(I):(III)C^S-Cもproα1(III):(I)Cも三重らせんに折りたたむことはできない。これらの逆構築物が自己会合不能であることは、鎖選択性が、Ｃ−ジャンクションにのびる共同リニア配列または、Ｃ−ジャンクションのいずれかの端に位置する不連続配列ドメインのいずれかによるものであることを示唆している。２．３鎖自己会合に関係するproα1(III)Ｃ−プロペプチドからの配列モチーフの同定プロコラーゲン鎖選択性は、おそらく、Ｃ−末端プロペプチドドメイン内に位置するひとつまたはそれ以上の可変ドメインによって媒介される。Ｂ−およびＣ −ジャンクションの間の配列は、プロコラーゲンＣ−プロペプチドの間に最も少なく保存されたもののひとつであり（図２）、発明者らは、このドメインの内容（Ｃ−ジャンクションの末端のproα1(III)配列の欠如）が、鎖組立てを指示するのに十分ではないことを明らかにしている。鎖認識のための認識配列が、確かにさらなる組換えを妨害していたのかどうかを確認するために、Cys２におけるS er→cys変異およびＣ−ジャンクションのポイントＢからＧにわたるIII型Ｃ−プロペプチド由来の一連の２３アミノ酸[Ｂ−Ｇモチーフ：^b GNPELPEDVLDV ^cQLAFLRL LSSR ^g （下線は最も不一致の残基を示す、図２を参照せよ）]を含むことを別として、proα(I)Δ1配列をすべて含む、proα2(I):(III)BGR^S-C（Ｂ−Ｇ置換）を作成した。置換モチーフにおけるＧ−境界の位置は、Ｃ−ジャンクションの後の最初の非保存残基（ＳＲ）を含めることを考慮した。ＳＰ細胞の存在下に発現した場合、キメラproα2(I):(III)BGR^S-C鎖は、鎖間ジスルフィド結合した分子を形成することができた（図８のレーン６）が、このことは、Ｃ−末端プロペプチドドメインが、自己会合する能力をもっていることを実証している。さらに、プロテアーゼ耐性フラグメントの形成によって判定されたように（図９のレーン３）、このハイブリッドは、折りたたまれて安定な三重らせんを形成することができた。proα2(I):(III)BGR^S-Cは、発明者らがジスルフィド結合したトリマーをアッセイするのを可能にしたSer→Cys置換を含んでいる。これまでのデータから、野生型のpα2(I)Δ1がホモトリマーの形成を請求することは、この置換単独では可能にはならないことが実証された（LeesおよびBulleid、１９９４）。とはいえ、この突然変異が組立てパターンに影響を及ぼす可能性を排除するために、Cys残基の野生型補体を含む復帰proα2(I):(III)BGR^S-Cを作成した。予測されたように、proα2(I):(III)BGR^S-Cは、ジスルフィド結合したトリマーを形成することができなかったが（図１０のレーン５）、プロテアーゼ耐性三重らせんを正確に組立てた（図１１のレーン３）。したがって、２３残基からなるＢ−Ｇモチーフには、プロコラーゲン自己組立てを指示するために必要な情報がすべて含まれている。 proα2(I):(III)BGR^S-C鎖の鎖間ジスルフィド結合形成能力は、この分子がＣ −プロペプチドを介して会合しうることを示唆している。しかし、これが事実であることを確認するために、発明者らは、翻訳産物のコラゲナーゼ消化を行った（図１２）。細菌コラゲナーゼは、Ｎ−およびＣ−プロペプチドを完全なままで残した状態で、三重ドメインを特異的に消化する。両方の鎖のＮ−プロペプチドは、メチオニン残基を含まず、その結果として、消化後に残っている唯一の放射標識された産物はＣ−プロペプチドである。還元および非還元条件下で分離されたサンプルを比較すると、鎖間ジスルフィド結合したトリマーが、pα1(III)Δ1 およびproα2(I):(III)BGR^S-C鎖のＣ−末端プロペプチドドメイン内に形成されることが実証された（図１２のレーン２と４、および３と５）。このことから、これらの鎖が、Ｃ−末端プロペプチドドメインを介して確かに会合することが実証される。２．４ proα2(I):BGRにおけるLeu→Met置換の影響 proα1(III)およびproα2(I)鎖からの２３アミノ酸からなるＢ−Ｇモチーフ（図１３）の分析から、１７位がproα1(III)においてはLeu（Ｌ）であり、proα2 (I)においてはMet（Ｍ）である以外は、１３−２０残基（ＱＬＡＦＬＲＬＬ）が同一であることが示される。部位特異的突然変異誘発を用いて、発明者らは、存在するLeu残基をMetに置換して、proα2(I):(III)BGR^1-mを作成し、鎖組立てにおける突然変異の影響を調べた。組換え体proα2(I):(III)BGR^S-Cおよび、proα 2(I):(III)BGR^1-mを用いて、Leu→Met突然変異誘発を行ったところ、それらは非還元条件下で分析した場合に鎖間ジスルフィド結合した分子を形成することができた（図１０のレーン４および６）。構築物は両方ともプロテアーゼ耐性三重らせんドメインを形成した（図１１のレーン１および３）。したがって、Leu→Met 置換によって、鎖の分泌のプロセスが破壊されることも、正確に配列された三重らせんの形成が妨害されることもなかった。これらの観察結果から、１５アミノ酸からなる不連続配列（ＧＮＰＥＬＰＥＤＶＬＤＶ....ＳＳＲ）に、プロコラーゲン鎖が互いを識別してタイプ特異的作法で組立てられるために必要な情報のすべてが含まれているという結論が導かれる。３．検討緊密に関連のあるプロコラーゲン鎖を互いに識別することができるようにする分子レベルのメカニズムは、組立て経路の中心をなす特徴である。Ｃ−末端プロペプチドドメイン間の開始となる相互作用によって、三重らせんのニュークリイエイション（nucleation）およびＣ−からＮ−方向への伝播前に構成要素である鎖が正確に配列されること、および構成要素である鎖がコラーゲンタイプ特異的作法において会合することの両方が確実になる。その結果として、鎖選択性を決定する認識シグナルが、このドメインの最初の配列内、おそらく遺伝子の多様な領域内に存在すると想定される。親の‘ミニ鎖’proα1(III)Δ1およびproα2(I )Δ1からキメラプロコラーゲン分子を作成することによって、本発明者らは、pr oα1(III)のＣ−末端プロペプチドドメインを天然のヘテロトリマーproα2(I)分子へトランスファーすることが、ホモトリマー形成を指示するのに十分な条件であることを実証している。さらに、proα1(III)およびproα2(I)のＣ−末端プロペプチドドメインの特異的配列が交換されている一連の分子を分析することによって、proα1(III)のＣ−末端プロペプチド内にある１５アミノ酸からなる不連続配列（ＧＮＰＥＬＰＥＤＶＬＤＶ....ＳＳＲ）を本発明者らは同定することができたが、これが、もし、proα1(III)のproα2(I)鎖に対する認識モチーフ内にある対応する領域へトランスファーされるならば、鎖の整列に対して逆効果をもつようにはならず、三重らせんドメインをプロテアーゼ耐性コンホーメーション折りたたませるように作用する。したがって、この配列モチーフは、プロコラーゲン鎖が互いを識別し、タイプ特異的な作法で組立てを行うのを確実にするための必要十分条件である。鎖認識ドメインに対する構造−機能相関関係を確立するために、本発明者らは、２３残基からなるＢ−Ｇ配列：ＧＮＰＥＬＰＥＤＶＬＤＶＱＬＡＦＬＲＬＬＳＳＲのハイドロパシー（hydropathy）プロフィールおよび２次構造ポテンシャルを調べた。データは、保存された領域：ＱＬＡＦＬＲＬＬＬが疎水性であるのとは逆に、１５アミノ酸からなる認識モチーフ（ＧＮＰＥＬＰＥＤＶＬＤＶ....ＳＳＲ）が親水性であることを示している。これらの特徴は、プロコラーゲンモノマー間の最初の会合を媒介することにおいての、このモチーフに対する潜在的役割と完全に一致する。他の原線維プロコラーゲンの１５残基からなる認識モチーフを調べることにより、それらがすべて、最初の配列における相異性に関係なく、相対的に親水性であり、おそらく同様の構造コンホーメーションをもつであろうことが予測される（図１３）。それは、おそらく、区別的な鎖会合を確実にするために必要な別の構造的特徴を提供する、アミノ酸の変化の性質であろう。Ｂ− Ｇ配列のアラインメント（図１３）を調べると、１、２、１２および２１番目の残基が３−１１、２２および２３番目の残基よりもしっかりと保存されていることが明らかであり、このことは、後者が、分泌プロセスにおいて決定的な重要性をもつ中心の認識配列を形成することを示唆している。我々は、他の４つの残基が、鎖識別に直接関与するかどうかは、わからないが、これは、部位特異的突然変異誘発によって実験的にテストすることができる。本発明者らは、鎖選択性を決定する機能的ドメインを同定しており、トリマー形成がこれらの同定された認識配列間の相互作用を介して開始されることを明らかにする。しかし、鎖組成を決定する相互作用が、トリマーを生産的に会合させ、安定化させる作用と同じであるかどうかは明らかではない。潜在的安定化相互作用の性質は不明確であるが、過去のデータ（Bulleidら、１９９６）から、少なくともIII型プロコラーゲンについては、鎖間ジスルフィド結合の形成がプロコラーゲンの組立てにおいて直接的な役割を演じないことが示される。原線維コラーゲン、コラーゲンX,VIIIおよびコラーゲン様補体因子Ｃlqに保存されている４つの芳香族残基のクラスターがトリマー形成において方策的な重要事項であることも仮定されている。もともとは、Ｃ−テロペプチドは、プロコラーゲン組立てと鎖識別の両方において役割をもつことが要求されており、後者では、種々のプロコラーゲン鎖間の配列相異性の程度を左右するものとされていた。しかし、本発明者らは、最近、 III型プロコラーゲンのＣ−テロペプチドが三重らせんのニュークリエーションの前には相互作用しないことを実証しており、Ｃ−プロペプチドの最初の会合におけるこのペプチド配列の役割を除外した（Bulleidら、１９９６）。ハイブリッド鎖の組立てから得られたデータは、鎖間を識別する能力は、Ｃ−テロペプチドの種類を区別しないことを示しており、この主張にサポートを与えている。このアプローチを用いて、本発明者らは、３つのproα2(I)Δ1鎖である[proα 2(I)Δ1]₃を特徴とするまったく新規なプロコラーゲン種の合成に成功している。この実験全体において、先を切り取った三重らせんドメインをもつプロコラーゲン‘ミニ鎖’を使用した；しかし、本発明者らは、１５残基からなるproα1(I II)認識配列を含む全長ｐroα2(Ｉ)鎖もまた三重らせんコンホーメーションになるように自己会合することも実証している（データ記載なし）。したがって、鎖認識配列を異なるプロ−α鎖に導入する能力は、はっきりとした鎖組成をもつ新規なコラーゲン分子を設計する手段を提供する。このことから続いて、細胞結合性または接着特性を強化あるいは相異させたものなどの、はつきりとした生物学的特徴をもつコラーゲンマトリックスの生産の可能性が導入される。さらに、プロコラーゲン鎖間の会合の開始を指示する短いペプチド配列を同定することによって、コラーゲン蓄積を調節または阻止する治療的介入のための標的が提供される。上述したキメラ構築物を本発明方法に用いて、どのような細胞系においても、内因的に発現するプロコラーゲンとの共組立てに関連する問題をもたらすことなく、外因的プロコラーゲンを発現させることができる。本発明方法の用途は、培養細胞あるいは身体組織内のいずれかにおいて細胞内にプロコラーゲンを発現させることである。これは、原線維コラーゲンを正常に効率的に合成する線維芽細胞などの細胞系における組換えプロコラーゲンの産生ならびに遺伝子療法によるコラーゲン疾患の治療において特に関連性がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を共発現して組み立てるシステムにおいて所望のプロコラーゲンまたはその誘導体を生産する方法であって、所望のプロコラーゲンを組立てるためのプロ−α鎖またはその誘導体を発現する遺伝子が、天然のプロ−α鎖から外因的に選択されるか、またはＣ− 末端プロペプチドドメインの活性を有するが、該少なくとも１つの別のプロコラーゲンまたはその誘導体を組立てて形成する、プロ−α鎖またはその誘導体のＣ −末端プロペプチドと共組立てされないドメインをもつ該プロ−α鎖またはその誘導体を発現するように人工的に工作される遺伝子であることを特徴とする方法。２．遺伝子の少なくとも一部が、プロ−α鎖からプロコラーゲンへの組立てにおける選択性を付与する認識配列をコードする、請求項１に記載の方法。３．認識配列が、アミノ酸配列 GGQGSDPADV AIQLTFLRLM STE をコードする、請求項２に記載の方法。４．認識配列が、アミノ酸配列 NVEGVTSKEM ATQLAFMRLL ANY をコードする、請求項２に記載の方法。５．認識配列が、アミノ酸配列 GDDNLAPNTA NVQMTFLRLL STE をコードする、請求項２に記載の方法。６．認識配列が、アミノ酸配列 GNPELPEDVL DVQLAFLRLL SSR をコードする、請求項２に記載の方法。７．認識配列が、アミノ酸配列 VDAEGNPVGV.VQMTFLRLL SAS をコードする、請求項２に記載の方法。８．認識配列が、アミノ酸配列 GDHQSPNTAI.TQMTFLRLL SKE をコードする、請求項２に記載の方法。９．認識配列が、アミノ酸配列 LDVEGNSINM.VQMTFLKLL TAS をコードする、請求項２に記載の方法。１０．認識配列が、アミノ酸配列 VDSEGSPVGV.VQLTFLRLL SVS をコードする、請求項２に記載の方法。１１．遺伝子が、１つのプロ−α鎖遺伝子から誘導された認識配列および異なる源から誘導されたα鎖ドメインを含むプロ−α鎖またはその誘導体をコードする、請求項２〜１０に記載の方法。１２．遺伝子が、少なくとも２つの異なるプロ−α鎖のフラグメントから形成されたプロ−α鎖またはその誘導体をコードする、請求項２〜１０に記載の方法。１３．遺伝子が、１つのタイプのプロ−α鎖およびＣ−末端プロペプチドドメインを含むプロ−α鎖またはその誘導体をコードする、請求項１１または１２に記載の方法。１４．ＤＮＡ分子が、proα1(I)、proα1(II)、proα1(III)、proα1(Ｖ)、pr oα2(Ｖ)、proα1(XI)またはproα2(XI)からなるプロ−α鎖のフラグメントの組み合わせから形成されたプロ−α鎖またはその誘導体をコードする、請求項１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。１５．遺伝子が、proα2(I)鎖の認識配列がproα1(III)鎖の認識配列で置換されている修飾proα2(I)をコードする、請求項１４に記載の方法。１６．遺伝子が、プロコラーゲンＣ−末端プロペプチドの活性を有する第１部分および外因的コラーゲンα鎖および非コラーゲン成分のいずれか１つから選択された第２部分を少なくとも含む（第１部分と第２部分は連結している）、プロ −α鎖またはその誘導体をコードする塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。１７．遺伝子がベクターに組み込まれている、前記請求項のいずれかに記載の方法。１８．ベクターがプラスミド、コスミドまたはファージである、請求項１７に記載の方法。１９．システムが遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。２０．宿主細胞が真核細胞である、請求項１９に記載の方法。２１．宿主細胞が酵母、昆虫または哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の方法。２２．宿主細胞が、哺乳動物細胞であり、線維芽細胞または、ベビーハムスター腎臓細胞，マウス３Ｔ３細胞，チャイニーズハムスター卵巣細胞およびＣＯＳ細胞から誘導された細胞系から選ばれる、請求抗２１に記載の方法。２３．システムがトランスジェニック植物または動物である、請求項１〜１９に記載の方法。２４．システムがトランスジェニック動物であり、非ヒト胎盤性哺乳動物である請求項２３に記載の方法。２５．胎盤性哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、水牛、ラクダまたはブタのいずれか１つである、請求項２４に記載の方法。２６．システムがトランスジェニック動物であり、遺伝子療法を必要としているヒトである、請求項１９に記載の方法。２７．遺伝子療法が、骨形成不全症、エーレルス−ダンロー症候群または軟骨形成異常を治療するためのものである、請求項２６に記載の方法。