ES2201193T3 - Nuevos procolagenos. - Google Patents

Abstract

SE REVELAN UNAS MOLECULAS QUE COMPRENDEN AL MENOS UN PRIMER NUCLEO CON ACTIVIDAD DE UN PROCOLAGENO C-PROPEPTIDO Y UN SEGUNDO NUCLEO SELECCIONADO DE CUALQUIERA DE LOS GRUPOS DE UNA CADENA AL NO PROPIA DE COLAGENO Y DE MATERIALES NO FORMADOS P OR COLAGENO, ESTANDO EL PRIMER NUCLEO ADJUNTO AL SEGUNDO NUCLEO. TAMBIEN SE REVELAN UNAS MOLECULAS DE COLAGENO, FIBRILLAS Y FIBRAS QUE CONTIENEN UNA COMBINACION NO NATURAL DE CADENAS AL DE COLAGENO, EL ADN QUE CODIFICA LAS MISMAS, LOS HUESPEDES DE EXPRESION TRANSFORMADOS O QUE HAN SIDO SOMETIDOS A TRANSFECCION CON ESTE, Y LOS ANIMALES TRANSGENICOS Y METODOS DE PRODUCIR UN COLAGENO NO NATURAL.

Description

Nuevos procolágenos.

La presente invención concierne a nuevas moléculas, en particular nuevas moléculas de procolágeno, junto con moléculas, fibrilas y fibras de colágeno que comprenden una combinación no natural de \alpha-cadenas de colágeno, ADN que codifica las mismas, anfitriones de expresión transformados o transfectados con las mismas, animales transgénicos y métodos para producir un colágeno no natural.

El colágeno (también conocido como molécula de procolágeno procesado y molécula monomérica de procolágeno procesado triple helicoidal) (para reseñas generales véase Kadler, K., 1995, Protein Profile, "Extracellular Matrix 1: fibril-forming collagens", 2: 491-619; Ayad, S. et al., 1994, The Extracellular Matrix Facts Book, Academic Press, Londres, ISBN 0-12- 068910-3 y referencias contenidas en los mismos) es una proteína estructural principal en los animales, en los que éste se produce en la matriz extracelular (ECM) de los tejidos conectivos, la mayoría de las veces en forma de fibrilas (también conocido como colágeno polimérico). Las fibrilas de colágeno (colágeno polimérico) son la principal fuente de resistencia mecánica de los tejidos conectivos, proporcionando un substrato para la fijación de la célula y un andamio para interacciones moleculares dinámicas. La familia de los colágenos comprende proteínas complejas de múltiples dominios que comprenden tres \alpha-cadenas de colágeno enrolladas en una triple hélice. Hasta la fecha han sido descritos al menos veinte tipos de colágeno genéticamente distintos y los mismos pueden ser clasificados en subgrupos sobre la base de la homología del gen y la función de la proteína codificada. Los colágenos formadores de fibrila (tipos I, II, III, V y XI; véase Tabla 1) son sintetizados como procolágenos solubles (también conocidos como cadenas pro\alpha, \alpha-cadenas de procolágeno y cadenas de monómero) y comprende un C-propéptido, una región que contiene una repetición de Gly-X-Y (los cuales, en el caso de cadenas de monómero de colágenos formadores de fibrila comprenden una \alpha-cadena de colágeno ininterrumpida) y un N-propéptido. Las cadenas pro\alpha trimerizan hasta formar moléculas de procolágeno no procesado (también conocidas como moléculas de procolágeno monoméricas y cadenas pro\alpha trimerizadas), ensamblándose en estructuras fibrilares como consecuencia de la escisión enzimática de sus dominios propéptidos N- y C-terminales (los N- y C-propéptidos) (véase Figura 1).

Aunque los genes que codifican las cadenas pro\alpha son extraordinariamente similares, se sabe relativamente poco acerca de los procesos que controlan el doblado y la trimerización de las cadenas pro\alpha (Dion, A.S. y Myers, J.C., 1987, J. Molec. Biol., 193:127-143), y sólo se forma una restringida gama de colágenos. Por ejemplo, los fibroblastos de la piel sintetizan de manera coincidente las seis cadenas pro\alpha altamente homólogas (pro\alpha1(I), pro\alpha1(III), pro\alpha1(V), pro\alpha2(I), pro\alpha2(V) y pro\alpha3(V)). A pesar del gran número de posibles combinaciones de las seis cadenas pro\alpha, sólo se producen combinaciones específicas de cadenas de colágeno - éstas son aquellas que resultan en colágeno de los Tipos I, III y V. El colágeno Tipo I existe como un heterotrímero y se ensambla con la estequiometría de dos cadenas pro\alpha1(I) y una cadena pro\alpha2(I) ([pro\alpha1(I)]_{2} pro\alpha2(I)). No se han detectado homotrímeros de pro\alpha2(I), y por lo tanto la inclusión de esta cadena en un trímero depende de su asociación con cadenas pro\alpha1(I). Los colágenos del Tipo III comprenden un homotrímero ([pro\alpha 1(III)]3), y las cadenas constituyentes no se ensamblan con ninguna de las cadenas de colágeno pro\alpha del Tipo I. El colágeno del Tipo V muestra heterogeneidad respecto a la composición de la cadena, formando tanto homo- ([pro\alpha3(V)]_{3}) como hetero-trímeros ([pro\alpha1(V)]_{2} pro\alpha2(V) y [pro\alpha1(V) pro\alpha2(V) pro\alpha3(V)]).

El C-propéptido es conocido por estar implicado en el ensamblaje de las cadenas de monómero en cadenas pro\alpha trimerizadas (procolágeno no procesado) previamente a la escisión de los N- y C-propéptidos y la formación de colágeno en forma de cadenas pro\alpha formadoras de fibrila. El ensamblaje de las tres cadenas de monómero en cadenas pro\alpha trimerizadas se inicia por la asociación de los C-propéptidos. Esta asociación puede estar dividida en dos etapas: un acto de reconocimiento inicial entre las cadenas pro\alpha, el cual determina la selección de la cadena, y luego un acto de registro, el cual conduce a una alineación y doblado correctos de la triple hélice. Una comparación (Figura 2) de las secuencias del aminoácido de los C-propéptidos de las cadenas pro\alpha 1(1), pro\alpha2(I) y pro\alpha 1(III) pro\alpha, las cuales se ensamblan para formar colágeno de los Tipos I y III, demuestra el sorprendente nivel de similitud de la secuencia entre estas cadenas pro\alpha y sin embargo, a pesar de la homología, las mismas se ensamblan y doblan invariablemente de una manera específica del tipo de colágeno.

Ahora se ha descubierto que los C-propéptidos, y más particularmente ciertas secuencias dentro de los mismos, no sólo son necesarios sino que también son suficientes para determinar el ensamblaje específico de tipo de las mitades a las cuales están fijados. Debido a la presencia de estas ciertas secuencias, los C-propéptidos son capaces de dirigir de manera autónoma el ensamblaje de las mitades fijadas, las cuales en particular pueden ser una \alpha-cadena de colágeno extraña. Los presentes inventores han aislado y caracterizado una región del C-propéptido, la cual define el acto de selección de la cadena pero la cual no afecta al doblado subsiguiente. Esto ha permitido la síntesis de nuevas cadenas pro\alpha, las cuales han formado nuevas cadenas pro\alpha trimerizadas y colágeno. Ahora que las interacciones en la selección de cadena entre las cadenas pro\alpha pueden ser controladas, se puede sintetizar a voluntad una vasta gama de nuevas moléculas triméricas, en particular colágenos, usando cadenas pro\alpha y C-propéptidos existentes y nuevas. Éstas nuevas moléculas pueden poseer propiedades biológicas y físicas seleccionadas y tener una amplia gama de usos. Por ejemplo, se pueden usar nuevos colágenos en industrias las cuales usan colágeno ya sea como un producto o como parte de un proceso. Tales colágenos y usos pueden incluir, por ejemplo: nuevas gelatinas para ser usadas en alimentación, procesado de alimentos y fotografía; nuevos afinadores para retirar la levadura durante al proceso de elaboración; nuevas gelatinas para la industria del envasado de alimentos; nuevos polímeros para la fabricación de artículos textiles; nuevos adhesivos para ser usados en la construcción, edificación y manufacturación; nuevos recubrimientos para tabletas; nuevos adhesivos para ser usados con el cuerpo humano o animal; nuevos colágenos para ser usados como implantes corporales; nuevos colágenos y procolágenos como adyuvantes; nuevos colágenos y procolágenos como vehículos de soporte molecular para medicamentos y productos farmacéuticos; y como moduladores de la formación de fibrila de colágeno para ser usada en, por ejemplo, cicatrización de heridas y fibrosis.

De acuerdo con la presente invención, se aporta una molécula que comprende al menos una primera mitad que tiene la actividad de un C-propéptido procolágeno y una segunda mitad seleccionada a partir de un miembro cualquiera del grupo formado por materiales de \alpha-cadena de colágeno extraña y no-colágeno, estando la primera mitad fijada a la segunda mitad.

La molécula puede ser capaz de ligarse a otras moléculas similares. Ésta puede trimerizar con otras moléculas similares.

La primera mitad generalmente se fijará al extremo C-terminal de la segunda mitad, aunque pueden estar presentes residuos de aminoácido que intervienen.

La primera mitad puede comprender un C-propéptido de cadena pro\alpha o una forma parcialmente modificada de la misma o un análogo de la misma, y cuando forma la región C-terminal de una cadena pro\alpha, puede permitir que la molécula se una a otras moléculas similares. La región C-propéptido de un cadena pro\alpha puede ser el fragmento
C-terminal que resulta de la escisión de la C-proteinasa de un cadena pro\alpha. La C-proteinasa puede escindirse entre los residuos G y D o A y D o un análogo de los mismos en la secuencia FAPYYGD (residuos 376-382 de la SEQ ID NO: 2), YYRAD (residuos 1-5 de la SEQ ID NO: 14) o FYRAD (residuos 284-288 de la SEQ ID NO: 1) (Figura 2) o un análogo de la misma.

Las modificaciones de las moléculas pueden incluir la adición, eliminación o sustitución de residuos. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservativas. Las moléculas modificadas pueden tener substancialmente las mismas propiedades y características que las moléculas a partir de las cuales las mismas están derivadas. Las moléculas modificadas pueden ser homólogas de las moléculas a partir de las cuales las mismas están derivadas. Pueden, por ejemplo, tener al menos un 40% de homología, por ejemplo un 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 95% de homología.

Los presentes inventores han aislado e identificado (véase la sección "Experimental") un sitio - el sitio de reconocimiento - en el C-propéptido de procolágeno, el cual contiene una secuencia la cual es necesaria y suficiente para determinar el ensamblaje específico de tipo de las mitades a las cuales el mismo está fijado. El sitio de reconocimiento está definido como la parte del C-propéptido que contiene la secuencia (la secuencia de reconocimiento) la cual, en un gráfico de alineación del C-propéptido frente a otros C-propéptidos, corresponde a la secuencia en la región entre los puntos de unión B y G (Figura 2). Los gráficos de alineación pueden estar hechos usando el programa PILE-UP sobre SEQNET en los Daresbury Laboratories, UK. Una cadena pro\alpha existente, la cual ha sido sustituida en la secuencia de reconocimiento, y que como resultado tiene diferentes propiedades o características, se considera que es una molécula que comprende un C-propéptido de cadena pro\alpha y una \alpha-cadena de colágeno extraña, puesto que el C-propéptido es nuevo, siendo todas las \alpha-cadenas de colágeno de la misma extrañas a ésta.

Tal como puede verse a partir de la Figura 2, las secuencias de reconocimiento contienen una región de aminoácidos homólogos. La sustitución de los residuos conservados (véase la sección "Experimental" de más abajo) no tiene alterada la selección de cadena ni la misma ha impedido la formación de una hélice alineada correctamente, y por lo tanto parece que los residuos conservados no están implicados en la selección de cadena. De ahí que la secuencia de reconocimiento, aunque comprende una secuencia continua de cerca de 23 aminoácidos, se pueda considerar que tiene las propiedades de selección de cadena contenidas dentro de una secuencia variable discontinua. Por ejemplo, en la secuencia de reconocimiento de alfa 1(III) (SEQ ID NO: 6) la secuencia variable discontinua se puede considerar que comprende residuos 1-12 y 21-23.

El C-propéptido y/o la secuencia de reconocimiento puede ser la de una cadena pro\alpha fibrilar. Más generalmente, el C-propéptido puede ser un C-propéptido existente, por ejemplo un C-propéptido encontrado en la naturaleza, o puede ser una forma parcialmente modificada, o un análogo (es decir, que posee substancialmente las mismas propiedades y características pero que tiene una secuencia diferente), de una cadena pro\alpha de C-propéptido existente, o puede comprender un nuevo C-propéptido (es decir un C-propéptido que tiene propiedades o características significativamente diferente a las de otros C-propéptidos) y puede, por ejemplo, tener diferentes propiedades de cinética de enlace o de selección de \alpha-cadena.

El C-propéptido existente puede ser seleccionado a partir de un miembro cualquiera del grupo de los C-propéptidos de cadena pro\alpha pro\alpha1(I), pro\alpha2(I), pro\alpha1(II), pro\alpha1(III), pro\alpha1(V), pro\alpha2(V), pro\alpha3(V), pro\alpha1(XI), pro\alpha2(XI), y pro\alpha3(XI) o una forma parcialmente modificada de los mismos, o un análogo de los mismos. Las formas parcialmente modificadas de los C-propéptidos de procolágeno incluyen las secuencias de reconocimiento de los C-propéptidos, por ejemplo aquellas identificadas en la Figura 3 de los dibujos adjuntos en relación con los C-propéptidos de los cuales están derivadas. En algunos ejemplos de realización de la invención, tales formas modificadas pueden ser los únicos, o substancialmente los únicos, elementos derivados de un C-propéptido, en otras palabras, no es necesario que estén presentes otras secuencias de derivados de C-propéptido. Sin embargo, éste no va a ser siempre el caso, puesto que la invención también abarca la presencia de otras partes del C-propéptido que incluyen, por supuesto, el equilibrio de éste.

El C-propéptido puede comprender un C-propéptido existente o un forma parcialmente modificada del mismo o un análogo del mismo sustituido en el sitio de reconocimiento. El C-propéptido puede ser sustituido en el sitio de reconocimiento con la secuencia de reconocimiento de un C-propéptido existente, por ejemplo aquella de un C-propéptido diferente. Por ejemplo, puede ser sustituido en el sitio de reconocimiento con la secuencia de reconocimiento del
C-propéptido de un miembro cualquiera del grupo formado por las cadenas pro\alpha pro\alpha1(III), pro\alpha1(I), pro\alpha2(I), pro\alpha1(II), pro\alpha1(V), pro\alpha2(V), pro\alpha1(XI), pro\alpha2(XI) y pro\alpha3(XI). El mismo puede ser sustituido en el sitio de reconocimiento con una secuencia de reconocimiento que tiene la secuencia de un miembro cualquiera del grupo formado por la SEQ ID NOS: 6-13. La secuencia de reconocimiento de un C-propéptido, la cual ha sido modificada, por ejemplo, por adición, eliminación o sustitución de residuos de aminoácido, pero la cual tiene substancialmente las mismas propiedades y/o características se considera que es esencialmente la de un C-propéptido existente. La secuencia de reconocimiento puede ser generalmente al menos un 40% homóloga, o incluso al menos un 50, 60, 70, 80, 90 ó 95% homóloga respecto a la secuencia a partir de la cual fue derivada.

Tal sustitución en el sitio de reconocimiento puede afectar significativamente las propiedades o características del C-propéptido.

Alternativamente, la secuencia de reconocimiento puede ser nueva. Una tal nueva secuencia de reconocimiento puede dar, por ejemplo, la nueva cinética de enlace o especificidad de la primera mitad para una nueva primera mitad o un nuevo conjunto de primeras mitades.

La segunda mitad es un componente molecular el cual puede ser cualquier cosa ligada a la primera mitad. Ésta puede incluir, por ejemplo, moléculas de \alpha-cadena de colágeno extrañas, u otras proteínas o fragmentos de proteínas, tales como anticuerpos o fragmentos antígenos de enlace de los mismos, o combinaciones de los mismos. Las proteínas que constituyen o contribuyen a la segunda mitad pueden ser glicosiladas o modificadas post-translacionalmente de otra manera. Por "\alpha-cadena de colágeno extraña" se entiende una \alpha-cadena de colágeno la cual no forma parte de una cadena pro\alpha con el C-propéptido en la naturaleza; también pueden estar presentes las \alpha-cadenas de colágeno que comprenden un dominio formando una triple helicoidal, y un N-propéptido. Se pueden usar otras \alpha-cadenas de colágeno procedentes de las mismas especies, así como aquellas procedentes de especies diferentes. Incluidas como \alpha-cadenas de colágeno, las cuales no forman parte de una cadena pro\alpha con el C-propéptido en la naturaleza, se encuentran formas parcialmente modificadas y análogas de \alpha-cadenas de colágeno existentes, las cuales forman parte de una cadena pro\alpha con el C-propéptido en la naturaleza y las cuales no afectan significativamente las propiedades relevantes o características de la molécula de procolágeno, tal como la especificidad de enlace. Las formas parcialmente modificadas y análogas de \alpha-cadenas de colágeno pueden tener, por ejemplo, adiciones, eliminaciones o sustituciones las cuales no afectan significativamente las propiedades relevantes o características del C-propéptido o \alpha-cadena de colágeno.

Por consiguiente, por medio de la invención se pueden producir nuevos colágenos. Tales nuevos colágenos tienen combinaciones de \alpha-cadenas las cuales no se ven en la naturaleza debido al efecto director del ensamblaje de los C- propéptidos naturales. La invención permite al ingeniero en proteínas construir nuevos colágenos que no tienen una combinación natural de \alpha-cadenas. La invención se extiende, por consiguiente, a una molécula de procolágeno que comprende una combinación no natural de \alpha-cadenas. Los homotrímeros y heterotrímeros de procolágeno no naturales, que incluyen todos los trímeros posibles no mencionados en la Tabla 1, están dentro del alcance de la invención.

La segunda mitad puede comprender al menos una \alpha-cadena de colágeno. Una \alpha-cadena de colágeno puede ser seleccionada a partir de un miembro cualquiera del grupo que comprende las \alpha-cadenas de colágeno cadena pro\alpha1(I), cadena pro\alpha2(I), cadena pro\alpha1(II), cadena pro\alpha1(III), cadena pro\alpha1(V), cadena pro\alpha2(V), cadena pro\alpha3(V), cadena pro\alpha1(XI), cadena pro\alpha2(XI), y cadena pro\alpha3(XI).

La segunda mitad puede también comprender un N-propéptido de cadena pro\alpha. Un N-propéptido puede ser seleccionado a partir de un miembro cualquiera del grupo que comprende los N-propéptidos de cadena pro\alpha pro\alpha 1(1), pro\alpha2(I), pro\alpha 1(II), pro\alpha1(III), pro\alpha1(V), pro\alpha2(V), pro\alpha3(V), pro\alpha1(XI), pro\alpha2(XI), y pro\alpha3(XI).

La segunda mitad puede comprender una \alpha-cadena de colágeno y un N-propéptido, los cuales están asociados naturalmente (por ejemplo, aquellos de la cadena pro\alpha2(I)), o puede comprender una combinación de \alpha-cadena de colágeno y N-propéptido no natural. Dependiendo del organismo huésped en el cual puede desearse expresar las moléculas de la invención, el propéptido N-terminal puede ser reemplazado o adaptado para facilitar la secreción u otra manipulación o procesado en el sistema de expresión.

La molécula puede comprender una primera mitad que tiene la actividad del C-propéptido de pro\alpha1 (III) fijada a una segunda mitad que comprende la \alpha-cadena de colágeno y el N-propéptido de la cadena pro\alpha2(I). La molécula puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

En la formación natural de una molécula de colágeno in vivo, los N- y C-propéptidos son escindidos y separados de la molécula de procolágeno para producir una molécula de colágeno durante la formación de colágeno polimérico. En consecuencia, la invención incluye dentro de su alcance una molécula de colágeno que comprende una combinación no natural de \alpha-cadenas. Los homotrímeros y heterotrímeros de colágeno no naturales, que incluyen todos los trímeros de colágeno posibles no mencionados en la Tabla 1, están dentro del alcance de la invención. (Si por cualquier razón se desea tener una molécula de colágeno no natural con un C-propéptido pero no un N-propéptido, o viceversa, las enzimas responsables para el procesado en el sistema de expresión escogido pueden ser manipulados o seleccionados en concordancia o la secuencia de la molécula puede ser modificada para hacerla susceptible a un procesado enzimático, como sea apropiado).

Las moléculas de colágeno se auto-ensamblan naturalmente en fibrilas de colágeno, las cuales a su vez se agregan para formar una fibra de colágeno. Las fibrilas de colágeno y fibras de colágeno que comprenden moléculas de colágeno como las descritas más arriba están también, por consiguiente, contempladas por la invención.

Las moléculas del primer aspecto de la invención pueden ser preparadas por cualquier método conveniente, que incluye ligado de péptidos y síntesis completa. Se prefiere, sin embargo, que las moléculas sean preparadas por expresión a partir de un sistema de ADN recombinante. Para este propósito, y de acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se aporta una molécula de ADN, la cual puede ser en forma recombinante o aislada, que codifica una molécula como la descrita más arriba (particularmente una \alpha-cadena de procolágeno no natural).

El ADN recombinante de acuerdo con la invención puede ser en la forma de un vector. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un cósmido o un fago. Los vectores frecuentemente incluirán uno o más marcadores seleccionables para permitir la selección de células transfectadas (o transformadas: los términos son usados de manera intercambiable en esta memoria) con los mismos y, preferiblemente, para permitir la selección de células que albergan vectores que incorporan ADN heterólogo. Pueden estar presentes unas señales de arranque y detención apropiadas. El vector puede ser un vector de expresión que tiene secuencias reguladoras para accionar la expresión. Los vectores que no incluye secuencias reguladoras son útiles como vectores de clonado; y, por supuesto, los vectores de expresión pueden ser útiles también como vectores de clonado.

Los vectores de clonado pueden ser introducidos en E. coli u otro huésped adecuado, el cual facilita su manipulación. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se aporta, por consiguiente, una célula huésped transfectada o transformada con ADN tal como se ha descrito más arriba. Tales células huésped pueden ser procarióticas o eucarióticas. Los anfitriones eucarióticos pueden incluir líneas de células de levaduras, insectos y mamíferos. Los anfitriones de expresión pueden ser transformados de manera estable. En circunstancias apropiadas se pueden usar sistemas de expresión inestables y libres de células, pero es improbable que los mismos vayan a ser favorecidos, en el presente estado de la tecnología, para producción en masa.

El ADN de la invención también puede ser en la forma de una construcción transgénica diseñada para su expresión en una planta o, preferiblemente, un animal transgénico. En principio, la invención es aplicable a todos los animales, incluyendo pájaros, tales como el conjunto de aves de corral, especies anfibias y especies de peces. La proteína puede ser recolectada a partir de fluidos corporales u otros productos corporales (tales como huevos, cuando sea apropiado). En la práctica, será a los mamíferos (no humanos), particularmente a los mamíferos placentarios, a los que actualmente estará dirigida la mayor aplicabilidad de utilidad comercial, puesto que la expresión en la glándula mamaria, con una subsiguiente recuperación opcional del producto de expresión a partir de la leche, es una tecnología probada y preferida. Es con los ungulados, particularmente con ungulados económicamente importantes tales como el ganado vacuno, ovejas, cabras, búfalos de agua, camellos y cerdos que la invención tiene la probabilidad de ser más útil. La generación y utilidad de tales sistemas de expresión mamaria de mamíferos transgénicos está expuesta tanto en general, como en ciertos aspectos de manera específica, en las solicitudes de patente WO-A-8800239 y WO-9005188. El promotor de la \beta-lactoglobulina es especialmente preferido para ser usado en sistemas de expresión mamaria transgénicos. La solicitud de patente WO-A-9416570 pretende dar a conocer la producción de colágeno recombinante humano en la leche de animales transgénicos pero no contiene detalles experimentales acerca de que tal producción haya tenido lugar.

Los anfitriones de expresión, particularmente animales transgénicos, pueden contener otros ADN exógenos para facilitar la expresión, ensamblaje, secreción y otros aspectos de la biosíntesis de moléculas de la invención. Por ejemplo, anfitriones de expresión pueden expresar conjuntamente prolil 4-hidroxilasa, la cual es una enzima post-translacional importante en la biosíntesis natural de procolágenos, tal como está expuesto en la solicitud de patente WO-9307889.

El ADN, particularmente el ADNc, que codifica las procadenas de colágeno naturales, es conocido y está disponible en la técnica del sector. Por ejemplo, las solicitudes de patente WO-A-9307889, WO-A-9416570, y la referencias citadas en ambas, dan detalles. Tal ADN forma un punto de partida conveniente para el ADN de la presente invención, el cual puede ser preparado por técnicas de recombinación a partir de éste. Aunque en términos generales el ADN que codifica un C-propéptido (o una región esencial mínima del mismo) puede ser simplemente ligado a un ADN que codifica un dominio de colágeno de triple helicoidal extraño (usualmente fijado a un ADN que codifica el N-propéptido correspondiente), en la práctica es útil usar técnicas basadas en PCR para efectuar el ligado preciso. Por ejemplo, los productos de PCR que flanquean la región de unión entre el C-propéptido y el dominio de triple helicoidal pueden ser preparados y combinados; entonces se puede llevar a cabo una reacción de extensión de solapamiento para producir un producto de PCR, el cual es un híbrido entre el ADN que codifica el C-propéptido de una cadena de procolágeno y el ADN que codifica el dominio de triple helicoidal (y, usualmente, el N-propéptido) de otra cadena de procolágeno.

La invención es en principio capaz de acomodar el uso de secuencias de ADN sintético, ADNc, secuencias genómicas completas y "minigenes", lo que equivale a decir secuencias genómicas parciales que contienen algunos, pero no todos, de los intrones presentes en el gen de longitud completa. Debido al gran número de intrones presentes en los genes del colágeno en general, sin embargo, las prácticas experimentales usualmente favorecerán el uso de ADNc o, en algunas circunstancias, minigenes.

El ADN de acuerdo con la invención puede ser preparado, en principio, por cualquier método conveniente que implique acoplar entre sí sucesivos nucleótidos, y/o ligar oligo-y/o poli-nucleótidos, incluyendo procesos in vitro, pero la tecnología de recombinación del ADN constituye el método escogido.

Las moléculas de la invención pueden ser útiles en un método de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal. La invención se extiende, por consiguiente, a moléculas tales como las descritas más arriba para ser usadas en medicina.

La molécula puede ser destinada a ser usada como un adhesivo o implante. La misma puede ser destinada a ser usada en el fomento de la curación de heridas o afecciones fibróticas con cicatrización reducida. La misma puede ser destinada a ser usada en el fomento de la curación de heridas crónicas. Por "heridas o afecciones fibróticas" se entiende cualquier estado el cual puede dar como resultado la formación de tejido cicatrizante. En particular, esto incluye la curación de heridas de la piel, la reparación de daños en los tendones, la curación de lesiones por aplastamiento, la curación de lesiones en el sistema nervioso central (SNC), condiciones que resultan en la formación de tejido cicatrizante en el SNC, formación de tejido cicatrizante que es resultado de derrames cerebrales, y adhesión de tejidos, por ejemplo, como resultado de una lesión o de cirugía (esto se puede aplicar por ejemplo a la curación de tendones y estricciones y adhesiones abdominales). Los ejemplos de afecciones fibróticas incluyen fibrosis pulmonar, glomerulonefritis, cirrosis del hígado, y vitreoretinopatía proliferativa.

Por ejemplo en la inhibición de la fibrosis, se puede aplicar una nueva molécula de colágeno o cadena pro\alpha a un sitio de herida o fibrosis, inhibiendo el nuevo colágeno (o cadena pro\alpha) la formación de fibrila de colágeno y así la fibrosis. El nuevo colágeno o cadena pro\alpha puede, por ejemplo, tener una \alpha-cadena acortada.

El ADN de la invención puede ser útil, en construcciones apropiadas, en un método de terapia de gen. El mismo puede ser destinado a ser usado en el tratamiento de la Osteogenesis Imperfecta (OI), el Síndrome de Ehlers-Danlos (EDS), el Síndrome de Stickler, la displasia Espondiloepifisial, Hipocondriogenesis o Aneurismos Aórticos. Las mutaciones dentro de los genes del colágeno son la causa de la mayoría de formas de la OI, algunas formas del EDS y de algunas condrodisplasias. En la mayoría de los cases, los efectos devastadores de la enfermedad son debidos a sustituciones de glicina dentro del dominio de triple helicoidal - la región que contiene una repetición de Gly-X-Y - para aminoácidos con cadenas laterales más voluminosas. Esto da como resultado el impedimento o el retardo en el doblado de la triple hélice con la consecuencia que se produce una drástica reducción en la secreción de cadenas pro\alpha trimerizadas. Las proteínas mal dobladas pueden ser retenidas dentro de la célula, probablemente dentro de la RE (retícula endoplásmica), donde las mismas son degradadas. Como el doblado del C-propéptido no se ve afectado por estas mutaciones dentro del dominio de triple helicoidal, los C-propéptidos procedentes del tipo salvaje así como las cadenas mutantes se asocian y pueden ser retenidas dentro de la célula. La retención y degradación de las cadenas de tipo salvaje debida a su interacción con las cadenas mutantes amplifica el efecto de la mutación y ha sido denominada "suicidio del procolágeno". La pérdida masiva de proteínas debida a este fenómeno puede explicar los efectos letales dominantes de tales mutaciones. Por un diseño de ingeniería de las cadenas pro\alpha que tienen alterada la selectividad de cadena, se pueden producir cadenas pro\alpha las cuales no se asocian con las cadenas mutantes, y por consiguiente se doblarán y serán secretadas normalmente. Tales cadenas pro\alpha diseñadas por ingeniería pueden contener la \alpha-cadena de colágeno de tipo salvaje, compensando con ello el déficit causado por la \alpha-cadena de colágeno mutante. La proteína expresada también puede ser útil, en algunas circunstancias, en el tratamiento de enfermedades y estados los cuales podrían ser tratados a un nivel más fundamental por terapia genética.

La invención también puede ser útil en fotografía, preparación de bebidas, productos alimenticios, textiles o adhesivos.

De acuerdo con la presente invención también se aporta un método de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal que comprende el uso de una molécula de acuerdo con la presente invención.

La invención será más evidente a partir de los ejemplos, los cuales comprenden las siguientes Figuras y descripción de experimentos, de las cuales:

la Figura 1 muestra las etapas iniciales en el doblado, ensamblaje y modificación intracelular de procolágeno. Tal como puede observarse, la transferencia co-translacional y la escisión del péptido de señal se producen en la etapa número 1. Luego tiene lugar la formación del enlace disulfido intramolecular así como la glicosilación N-vinculada, la isomerización de prolina e hidroxilación de prolina en la etapa 2. A continuación sigue luego, en la etapa 3, el ensamblaje de específico de tipo de las cadenas pro\alpha por trimerización y formación de enlace disulfido intermolecular. Finalmente, en la etapa 4, la formación de la triple hélice procede en una dirección carboxi-hasta-amino para dar cadenas pro\alpha trimerizadas;

la Figura 2 muestra un gráfico de alineación realizado usando el programa PILE-UP sobre SEQNET en los Daresbury Laboratories, UK, usando puestas a punto por defecto, de los C-propéptidos de cadenas pro\alpha de procolágeno del tipo I y del tipo III. Alfa 1 (I) es SEQ ID NO: 14; alfa 2(I) son residuos números 284-534 de la SEQ ID NO: 1; y alfa 1 (III) son residuos números 379-626 de la SEQ ID NO: 2. Los sitios de escisión de la C-proteinasa (marcados CP) están entre A y D (alfa 1(I)), A y D (alfa 2(I)) y G y D (alfa 1(III)). Los puntos de unión A, F, B, C y G son tal como se muestran. Los números indican los residuos de cisteína conservados. # indica aminoácidos idénticos y \sim indica aminoácidos con cadenas laterales conservadas;

la Figura 3 muestra secuencias de reconocimiento para las cadenas pro\alpha pro\alpha1(I), pro\alpha2(I), pro\alpha1(II), pro\alpha1(III), pro\alpha1(V), pro\alpha2(V), pro\alpha1(XI) y pro\alpha2(XI) que tiene SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 6, 10, 11, 12, y 13 respectivamente y las cuales fueron identificadas por gráficos de alineación de C-propéptidos frente a otros C-propéptidos (específicamente, aquellos de la Figura 2) como correspondientes con las secuencias en la región entre los puntos de unión B y G de la Figura 2;

la Figura 4 muestra un gel SDS-PAGE de construcciones de procolágeno traducido. Las pistas son como sigue:
1 - marcadores de peso molecular; 2 y 6 - pro\alpha1(III)\Delta1; 3 y 7 - pro\alpha2(I)\Delta1; 4 y 8 - pro\alpha2(I):(III)CP; 5 y 9 - pro\alpha1(III):(I)CP;

la Figura 5 muestra un gel SDS-PAGE de construcciones de procolágeno traducido. Las pistas son como sigue:
1 - marcadores de peso molecular; 2 y 7 - unión A; 3 y 8 - unión F; 4 y 9 - unión B; 5 y 10 - unión C; 6 y 11 - unión recíproca C;

la Figura 6 muestra procolágenos traducidos en presencia (Pistas 3, 5 y 7) y ausencia (Pistas 2, 4 y 6) de
\alpha,\alpha'-dipiridilo. Las pistas son como sigue: 2 y 3 - pro\alpha2(I):(III)CP; 4 y 5 - BGR; 6 y 7 - pro\alpha1(III):(I)CP;

la Figura 7 muestra un gel SDS-PAGE de construcciones de procolágeno traducido bajo condiciones de reducción (Pistas 1-3) y no reducción (Pistas 4-6). Las pistas son como sigue: 1 y 4 – BGR^{S-C}; 2 y 5 - BGR; 3 y 6 – BGR^{L-M}; y

la Figura 8 muestra un gel SDS-PAGE de construcciones de procolágeno traducido. Las pistas son como sigue:
1 - marcadores de peso molecular; 2 – BGR^{S-C}; 3 - BGR; 4 - BGR^{L-M}.

Experimental

Se construyó una codificación de un clon de ADNc para una cadena truncada de pro\alpha2(I) (designada pro\alpha2(I)\Delta1; SEQ ID NO: 1; secuencia de codificación de ácido nucleico - SEQ ID NO: 19) a partir de dos clones parciales de ADNc, pHf1131 y pHp2010 (Kuivaniemi, H. et al., 1988, Biochem. 3., 252: 633-640) los cuales fueron subclonados en el sitio EcoRI de pBluescript SK^{+}. Un fragmento de 3,4 kb de fragmento PstI que contiene el vector y el terminal 5' de 0,5 kb del gen fue aislado a partir de pHp2010 y ligado a un fragmento PstI de 1,4 kb derivado a partir de pHf1131 que codifica el término 3'. El recombinante resultante, pro\alpha2(I)\Delta1, tiene una eliminación de 2,2 kb en la secuencia de codificación (Lees y Bulleid, 1994, J. Biol. Chem., 269: 24354-24360).

Esta construcción fue analizada usando un sistema de célula semipermeabilizado (SP) HT1080 como el descrito por Wilson et al. (1995, Biochem J. 307:679- 687). Las células semipermeabilizadas fueron preparadas a partir de células HT1080. Las células HT1080 confluentes procedentes de un frasco de 75 cm^{2} fueron enjuagadas una vez con PBS (solución salina de fosfato tamponada), luego incubadas con 2 ml de PBS que contenía 2,5 mg/ml de tripsina durante 3 minutos a temperatura ambiente. El frasco fue transferido a hielo donde fueron añadidos 8 ml de KHM helado (110 mM KOAc, 20 mM Hepes, pH 7,2, 2 mM MgOAc) que contenía 100 \mug/ml de inhibidor de la tripsina de la semilla de soja y las células fueron liberadas de la placa. Las células fueron convertidas en bolitas a 12.000 rpm durante 3 minutos y resuspendidas en 6 ml de KHM que contenían 40 \mug/ml de digitonina (diluidos a partir de un material de partida de 40 mg/ml en DMSO (sulfóxido de dimetilo)) e incubadas sobre hielo durante 5 minutos. Para terminar la permeabilización se añadieron 8 ml de KHM y las células fueron convertidas en bolitas y resuspendidas en 50 mM Hepes, pH 7,2, 90 mM KOAc. Después de 10 minutos las células fueron convertidas en bolitas y resuspendidas en 100 \mul de KHM (aproximadamente 2 x 10^{6} células). Se eliminó el mRNA endógeno añadiendo CaCl_{2} hasta 1 mM y nucleasa de Staphylococo hasta 10 \mug/ml e incubando a temperatura ambiente durante 12 minutos. La reacción fue terminada mediante la adición de EGTA hasta 4 mM, y convirtiendo las células en bolitas. Las células semipermeabilizadas fueron resuspendidas en 100 \mul de KHM. El RNA fue traducido usando un lisado de reticulocito de conejo (FlexiLysate, Promega, Southampton, U.K.) durante 1 hora a 30ºC. La reacción de traducción (25 \mul) contenía 16 \mul de lisado de reticulocito, 1 \mul de 1 mM aminoácidos (menos metionina), metionina 15 \muCi L-[^{35}S], 1 \mul de RNA transcrito y células semipermeabilizadas (aprox. 1 x 10^{5}). Después de la traducción, se añadió N-etilmaleimida hasta una concentración final de 20 mM. Se verificó la formación de enlaces de disulfido por electroforesis sobre gel comparativa sobre 7,5% gel de poliacrilamida de productos de traducción llevada a cabo bajo condiciones de reducción y no reducción.

\newpage

Cuando se analizó el producto de traducción procedente de pro\alpha2(I)\Delta1 usando este sistema libre de células, el mRNA no se auto-asoció para formar homotrímeros indicando que el mismo no contenía la información necesaria para el acto de reconocimiento inicial (Figura 4, pistas 3 y 7).

Se construyó una codificación de clon de ADNc para una pro\alpha1(III) cadena truncada (designada pro\alpha1(III)\Delta1; SEQ ID NO: 2; secuencia de codificación de ácido nucleico - SEQ ID NO: 20) a partir de un ADNc de procolágeno de tipo III de longitud completa el cual se construyó a partir de dos ADNc parciales, pS413 y pS31 (Ala-Kokko, et al., 1989, Biochem. J., 260: 509-516). Cada ADNc fue subclonado en el sitio EcoRI del fragmento pBluescript SK. A 4,7 kb Sal I (enzima de restricción) que contenía el vector y el terminal 5' de 1,8 kb fue aislado a partir de pS413 y ligado a un fragmento de 3,6 kb Sal I derivado a partir de pS31 para producir pro\alpha 1(III). Se extirpó un fragmento interno de 2,5 kb XhoI a partir de pro\alpha 1(III) y el plásmido parental religó para crear pro\alpha1(III)\Delta1 (Lees y Bulleid, 1994, J. Biol. Chem., 269: 24354-24360).

El producto de traducción de pro\alpha1(III)\Delta1 mRNA fue capaz de ensamblarse para formar un homotrímero según se juzgó por su capacidad para formar dímeros y trímeros de intercadena ligados por disulfido cuando fue traducido en un sistema de traducción semipermeabilizado libre de células. Esto demostró que contenía la información requerida para el autoensamblaje (Figura 4, pistas 2 y 6).

Se prepararon clones de ADNc híbrido los cuales contenían secuencias derivadas a partir de pro\alpha1(III)\Delta1 y pro\alpha2(I)\Delta1. El sitio de escisión de C-proteinasa de pro\alpha1(III)\Delta1 se tomó, para estos experimentos, para que estuviera entre los Ala 377 y Pro 378 de la SEQ ID NO: 2, en lugar de entre los Gly 381 y Asp 382 de la SEQ ID NO: 2 tal como se muestra en la Figura 2. En la primera de estas construcciones se reemplazó la secuencia de codificación para el C-propéptido procedente de la cadena pro\alpha1(III)\Delta1 por el que era para el C-propéptido procedente de la cadena pro\alpha2(I), siendo designada la quimera resultante pro\alpha1(III):(I)CP (SEQ ID NO: 3). Esta construcción falló en cuanto a auto-asociarse cuando fue traducida en el sistema libre de células (Figura 4, pistas 5 y 9). Se realizó una construcción recíproca donde el C-propéptido procedente de la pro\alpha2(I)\Delta1 fue reemplazado con el C-propéptido procedente de la cadena pro\alpha1(III) con la quimera resultante designada pro\alpha2(I):(III)CP (SEQ ID NO: 4).

Esta construcción fue capaz de auto-aciarse para formar dímeros y homotrímeros (Figura 4, pistas 4 y 8), demostrando directamente por primera vez que toda la información requerida para la asociación selectiva reside dentro del C- propéptido. La construcción pro\alpha1(III):(I)CP fue preparada como se describe más abajo. Otras construcciones fueron producidas usando el mismo enfoque y las mismas secuencias publicadas.

Los clones de ADNc híbrido fueron preparados usando un enfoque basado en PCR. Para la construcción de pro\alpha1(III):(I)CP, se preparó un producto de PCR a partir de pro\alpha1(III)\Delta1 con prímeros, uno de los cuales (SEQ ID NO: 15; JL-35) hibridizó dentro del dominio de triple helicoidal mientras que el otro (SEQ ID NO: 16; JL-32) hibridizó con 21 nucleótidos corriente arriba del punto de unión en el C-propéptido. Este prímero también contenía un solapamiento de 21 nucleótidos los cuales fueron de obsequio respecto a los primeros 21 nucleótidos del C-propéptido de pro\alpha2(I)\Delta1. Esto dio un producto de PCR de 0,25 Kb.

Se preparó un segundo producto de PCR a partir de pro\alpha2(I)\Delta I con prímeros, uno de los cuales (SEQ ID NO: 17; JL-31Kpn) hibridizó corriente abajo del codon de detención para traducción dentro de la región de l 3' no traducido. Este prímero también contenía un sitio KpnI. El otro prímero (SEQ ID NO: 18; JL-36) hibridizó con los primeros 18 nucleótidos del C- propéptido de pro\alpha2(I)\Delta1. Esto dio un producto de PCR de 0,85 Kb.

Se combinaron los dos productos de PCR y se llevó a cabo un tercer PCR (una extensión de solapamiento) con prímeros JL-35 (SEQ ID NO: 15) y JL-31Kpn (SEQ ID NO: 17) para producir un producto de 1,1 Kb. Éste se cortó con XhoI y KpnI y se subclonó en pro\alpha1(III)\Delta1 cortado de XhoI y KpnI para producir pro\alpha1(III):(I)CP.

Luego se preparó una variedad de construcciones híbridas en las cuales se reemplazaron partes de la secuencia de C-propéptido de pro\alpha2(I)\Delta1 con la correspondiente región procedente del C-propéptido de pro\alpha1(III). Las varias regiones están esbozadas en la Figura 2 con los puntos de unión designados como A, F, B, C, y G. De ese modo, por ejemplo, la molécula de unión A contiene toda la secuencia de pro\alpha2(I)\Delta1 hasta, pero sin incluirlo, el sitio A (es decir ... DY), estando toda la secuencia carboxi-hasta este sitio (es decir EI . . . ) derivada a partir de la correspondiente región procedente del C-propéptido de la cadena pro\alpha 1(III). Los C-propéptidos de Pro\alpha1(III) y pro\alpha2(I) difieren en su complemento de residuos de cisteína (e incluso en su capacidad para formar enlaces de disulfido), careciendo la pro\alpha2(I) del residuo Cys 2 (Figura 2), en lugar de tener un residuo de serina. Con el fin de tener una facilidad de análisis bajo unas condiciones de no reducción (véase más abajo) las construcciones F, B y C contenían una mutación de serina a cisteína en el sitio Cys 2 de la cadena pro\alpha2(I). Para asegurar que esta mutación no iba a desempeñar ningún papel en la selección de cadena, una construcción mutada de una manera similar (pro\alpha2(I):(I0II) BGR^{S-C} - a la que también se hace referencia como BGR^{S-C}; véase más abajo) fue retromutada. La construcción retromutada (es decir, la pro\alpha2(I):(III) BGR - a la que también se hace referencia como BGR) tuvo la misma selectividad de cadena que su molécula madre (pro\alpha2(I):(III) BGR^{S-C}) (véase más abajo).

Las quimeras de la unión A, unión F y unión B se ensamblaron todas para formar homotrímeros cuando fueron traducidas en el sistema libre de células (Figura 5, pistas 7, 8 y 9). Sin embargo, la de molécula unión C no se ensambló (Figura 5, pista 10) sugiriendo que el sitio de reconocimiento para el ensamblaje estaba contenido dentro de la secuencia carboxi-terminal hasta el Sitio B y amino-terminal hasta el Sitio C. La posibilidad de que la falta de ensamblaje de la molécula de unión C fue debida a al hecho de que este sitio estaba dentro de la secuencia de reconocimiento para el ensamblaje no pudo ser descartada. La evidencia de que el sitio de reconocimiento había sido desbaratado se obtuvo cuando se realizó la construcción recíproca. Esta construcción contenía la cadena pro\alpha1(III)\Delta1 hasta el Sitio C, estando el resto del C-propéptido derivado a partir del C-propéptido de pro\alpha2(I). No se produjo un ensamblaje a partir de esta construcción (unión C recíproca) ilustrando que el sitio de reconocimiento había sido desbaratado (Figura 5, pista 11).

La siguiente construcción realizada contenía toda la secuencia de pro\alpha2(I)\Delta1 separada de un corto tramo de 23 aminoácidos entre el Sitio B y el Sitio G (SEQ ID NO: 6) los cuales fueron reemplazados con la correspondiente región del C-propéptido de pro\alpha1(III). Esta construcción (designada BGR; SEQ ID NO: 5) fue alterada por mutagénesis directa de sitio de cisteína por serina en el sitio Cys 2 de la parte pro\alpha2(I) de la molécula (es decir, la cisteína fue sustituida por el residuo 335 de serina de la SEQ ID NO: 5). La molécula resultante (designada pro\alpha2(I):(III) BGR^{S-C} se mostró que se ensamblaba para formar homotrímeros de intercadena enlazados por disulfido cuando fue traducida en el sistema libre de células (Figura 7, pista 4), demostrando que este corto tramo de 23 aminoácidos contenía toda la información para conducir formación del homotrímero.

Para verificar que la mutación de serina a cisteína no afectaba a la selección de cadena, se realizó una retromutación (es decir, para dar pro\alpha2(I):(III) BGR) y se analizó la formación de homotrímero. Tal como se esperaba, no se detectaron trímeros de intercadena enlazados por disulfido (Figura 7, pista 5) puesto que esta molécula no contenía el residuo de cisteína requerido para la formación de enlace de disulfido intercadena.

Para determinar si se formó una triple hélice estable después de la traducción de los procolágenos quiméricos, se llevó a cabo un simple ensayo de protección de proteasa. Éste implicó el tratamiento de los productos de traducción con una combinación de enzimas proteolíticas (tripsina, quimotripsina y pepsina). Se resuspendieron SP-células aisladas a continuación de la traducción en ácido acético 0,5 M en Triton X-100 al 1% (v/v) y se incubaron con pepsina (100 mg/ml) durante 2 horas a 20ºC. Se detuvieron las digestiones por neutralización con una base Tris 1 M y las proteínas se precipitaron con etanol a una concentración final del 27% (v/v). La proteína precipitada a partir de la digestión de la pepsina fue resuspendida en Tris-HC1 50 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 0,15 M, EDTA 10 mM (ácido etilenodiaminatetra-acetica) y Triton X-100 al 1%. La quimotripsina y la tripsina se añadieron hasta una concentración final de 250 \mug/ml y 100 \mug/ml respectivamente y se incubaron unas muestras a temperatura ambiente durante 2 minutos. La digestión fue detenida por la adición de inhibidor de la tripsina de la semilla de soja hasta una concentración final de 500 \mug/ml y 5 volúmenes de un tampón de muestras de SDS-PAGE hirviente (electroforesis sobre gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio) e hirviendo las muestras durante 3 minutos. Los resultados se muestran en las Figuras 6 y 8. La formación de una triple hélice estable se caracteriza por la aparición de un fragmento resistente de proteasa (correspondiente al dominio de la triple helicoidal) después de la digestión. Sólo los productos de la traducción de la pro\alpha2(I):(III)CP (Figura 6, pista 2) y las construcciones de BGR (Figura 6, Pista 4; Figura 8, Pistas 2 y 3) generaron un fragmento de proteasa resistente los cuales sólo se formaron cuando el \alpha,\alpha'-dipiridilo (un inhibidor de la 4- hidroxilasa de prolilo) no estuvo presente durante la traducción (Figura 6). Como que la prolina de hidroxilación es necesaria para la formación de una triple hélice térmicamente estable, esto demostró que con estas construcciones se formó una triple hélice doblada correctamente.

Esto también demostró que aunque el BGR no fue capaz de formar trímeros estabilizados por enlaces de disulfido de intercadena, el mismo fue capaz de trimerizar para formar una triple hélice alineada correctamente.

Un análisis del motivo B-G procedente de las cadenas pro\alpha1(III) y pro\alpha2(I) (Figura 3) muestra que, de los residuos existentes en las secuencias de reconocimiento (Figura 3; SEQ ID NOs: 6 y 8 respectivamente), los residuos 13-20 son idénticos con la excepción del residuo 17 - Leu (L) en la pro\alpha1(III) y Met (M) en la pro\alpha2(I). Con el fin de determinar el papel desempañado por estos residuos en el proceso de selección de cadena, se usó una mutagénesis directa de sitio para sustituir Met por Leu en la secuencia de reconocimiento de pro\alpha1(III) en la construcción de pro\alpha2(I):(III) BGR^{S-C} (designada pro\alpha2(I):(III) BGR^{L-M} - a la que también se hace referencia como BGRL-M), es decir, el residuo Leu 425 de la SEQ ID NO: 5 fue sustituido por el Met, y el residuo Ser 335 fue sustituido por el Cys.

Se realizó el ensamblaje de cadena de pro\alpha2(I):(III) BGR^{L-M} tal como está descrito más arriba y se analizó la movilidad electroforética de la cadenas. Bajo condiciones de no reducción esta construcción formó enlaces de disulfido de intercadena (Figura 7, Pista 6), y formó dominios de triple hélice resistentes a la proteasa (Figura 8, Pista 4). La sustitución de Leu por Met no desbarató, por consiguiente, el proceso de selección de cadena ni impidió la formación de una hélice alineada correctamente.

TABLA 1

Tipo	Cadenas	Moléculas	Distribución
I	\alpha1(I)	principal [\alpha1(I)]_{2} \alpha2(I)	extendida, piel, hueso, tendón, ligamento,
	\alpha2(I)	menor [\alpha1(I)]_{3}	córnea
II	\alpha1(II)	homotrímeros [\alpha1(II)]_{3}	cartílago, notocordio, disco intervertebral,
			oreja, hueso en desarrollo, ojo, córnea
III	\alpha1(III)	homotrímeros [\alpha1(III)3]	extendida, encontrado particularmente con
			el colágeno de tipo I
V	\alpha1(V)	heterotrímeros	extendida, encontrado particularmente en
	\alpha2(V)		la córnea con el colágeno de tipo I
	\alpha3(V)
XI	\alpha1(XI)	heterotrímeros	cartílago, córnea y humor vítreo
	\alpha2(XI)
	\alpha3(XI)
	\alpha3(XI)=\alpha1(II)

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: La Victoria University de Manchester

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(B)

CALLE: Oxford Road

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(C)

CIUDAD: Manchester

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: GB

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): M13 9PL

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\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos Procolágenos

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 20

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(iv)

FORMULARIO LEÍBLE POR ORDENADOR:

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\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: Compatible con PC IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Edición #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD PREVIA:

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\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD; GB 9517773.9

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-AGOSTO-1995

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\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD PREVIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9606152.8

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-MARZO-1996

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD PREVIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9612476.3

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-JUNIO-1996

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 535 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

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\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 626 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

4

5

6

30

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 623 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

7

8

9

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 537 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

11

12

120

13

130

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA;

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 534 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

14

140

15

150

16

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\sa{Gly Asn Pro Glu Leu Pro Glu Asp Val Leu Asp Val Gln Leu Ala Phe}

\sac{Leu Arg Leu Ser Ser Arg}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\sa{Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe}

\sac{Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\sa{Asn Val Glu Gly Val Thr Ser Lys Glu Met Ala Thr Gln Leu Ala Phe}

\sac{Met Arg Leu Leu Ala Asn Tyr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\sa{Gly Asp Asp Asn Leu Ala Pro Asn Thr Ala Asn Val Gln Met Thr Phe}

\sac{Leu Arg Leu Leu Ser Thr Glu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\sa{Val Asp Ala Glu Gly Asn Pro Val Gly Val Val Gln Met Thr Phe Leu}

\sac{Arg Leu Leu Ser Ala Ser}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\sa{Gly Asp His Gln Ser Pro Asn Thr Ala Ile Thr Gln Met Thr Phe Leu}

\sac{Arg Leu Leu Ser Lys Glu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\sa{Leu Asp Val Glu Gly Asn Ser Ile Asn Met Val Gln Met Thr Phe Leu}

\sac{Lys Leu Leu Thr Ala Ser}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\sa{Val Asp Ser Glu Gly Ser Pro Val Gly Val Val Gln Leu Thr Phe Leu}

\sac{Arg Leu Leu Ser Val Ser}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 250 aminoácidos

\vskip0.666000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

17

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

MOLÉCULA TIPO: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPTION: /desc = "Secuencia de prímero PCR"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AATGGAGCTC CTGGACCCAT G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

MOLÉCULA TIPO: otro ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPTION: /desc = "Secuencia de prímero PCR"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGGTGCTGAG CGAGGCTGGT CGGCAAAACC GCCAGCTTTT TC

\hfill

42

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

MOLÉCULA TIPO: otro ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPTION: /desc = "Secuencia de prímero PCR"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTGCTAGGTA CCAAATGGAA GGATTCAGCT TT

\hfill

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

MOLÉCULA TIPO: otro ácido nucleico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPTION: /desc = "Secuencia de prímero PCR"

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACCAGCCTC GCTCAGCA

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1608 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

MOLÉCULA TIPO: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGCTCAGCT TTGTGGATAC GCGGACTTTG TTGCTGCTTG CAGTAACCTT ATGCCTAGCA

\hfill

60

18

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1881 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TRENZADO: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

MOLÉCULA TIPO: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

190

20

200

21

210

Claims (22)

1. Un polipéptido que comprende:

i) una primera mitad que tiene actividad para el ensamblaje en un C-propéptido de procolágeno trimérico, y que procede de un primer tipo de cadena pro-\alpha, donde dicha primera mitad contiene una secuencia de reconocimiento para la selección de cadena, y;

ii) una segunda mitad que contiene un dominio de formación de triple hélice procedente de una cadena pro-\alpha diferente de dicho primer tipo,

estando dicha primera mitad fijada a dicha segunda mitad de manera que dicha secuencia de reconocimiento permite un ensamblaje mutuo de dicho polipéptido con otros polipéptidos que tienen dicha actividad y un dominio de formación de triple hélice.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de reconocimiento está seleccionada a partir del grupo formado por las secuencias de reconocimiento de las cadenas pro\alpha1 (I), pro\alpha2 (I), pro\alpha1 (II), pro\alpha1 (III), pro\alpha1 (V), pro\alpha2 (V), pro\alpha3 (V), pro\alpha1 (XI), pro\alpha2 (XI) y pro\alpha3 (XI).

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de reconocimiento está seleccionada a partir del grupo formado por la secuencia de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:13.

4. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de reconocimiento es aquella de una cadena pro\alpha fibrilar.

5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la segunda mitad comprende al menos una \alpha-cadena de colágeno.

6. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la \alpha-cadena de colágeno está seleccionada a partir del grupo formado por las \alpha-cadenas de colágeno cadenas pro\alpha1 (I), pro\alpha2 (1), pro\alpha1(II), pro\alpha1 (III), pro\alpha1 (V), pro\alpha2 (V), pro\alpha3 (V), pro\alpha1 (XI), pro\alpha2 (XI) y pro\alpha3 (XI).

7. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la segunda mitad comprende además un N-propéptido de cadena pro\alpha.

8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el N-propéptido está seleccionado a partir del grupo formado por los N- propéptidos de las cadenas pro\alpha1 (I), pro\alpha2 (I), pro\alpha1 (II), pro\alpha1 (III), pro\alpha1 (V), pro\alpha2 (V), pro\alpha3 (V), pro\alpha1 (XI), pro\alpha2 (XI) y pro\alpha3 (XI).

9. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha primera mitad contiene la secuencia de reconocimiento del C-propéptido de pro\alpha1 (III) y la segunda mitad contiene el dominio de formación de triple hélice y un N-propéptido procedente de la cadena pro\alpha2 (1).

10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido tiene la secuencia de la SEQ ID NO:4.

11. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas primera y segunda mitades están separadas por residuos de aminoácido que intervienen.

12. Un método para preparar una molécula de procolágeno que comprende ensamblar mutuamente un primer polipéptido como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, con dos polipéptidos adicionales, teniendo cada uno dicha actividad y dominio de formación de triple helicoidal, con lo que dicho primer polipéptido y dichos polipéptidos adicionales se ensamblan mutuamente para producir una molécula que tiene un dominio de triple helicoidal.

13. Un método para producir un colágeno que comprende preparar un procolágeno por el método de la reivindicación 12 y convertir dicho procolágeno en dicho colágeno.

14. Una molécula de colágeno susceptible de ser obtenida por el método de la reivindicación 13.

15. Una fibrila de colágeno que comprende moléculas de colágeno de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Una fibra de colágeno que comprende fibrilas de colágeno de acuerdo con la reivindicación 15.

17. Una molécula de ADN que codifica el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

18. Una célula huésped de expresión transformada o transfectada con la molécula ADN de acuerdo con la reivindicación 17, vinculada de manera operativa a una secuencia reguladora que dirige la expresión.

19. Un método para producir un colágeno, comprendiendo el método cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 18 bajo condiciones tales que se produce un colágeno, recolectar dicho colágeno a partir de dicha célula huésped de expresión y, de manera opcional, purificar subsiguientemente dicho colágeno.

20. Un animal no humano transgénico cuyo genoma comprende un ADN de acuerdo con la reivindicación 17, vinculado operativamente a secuencias reguladoras suficientes para dirigir la expresión.

21. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 20, siendo el animal un mamífero placentario no humano y dirigiendo las secuencias reguladoras la expresión en la leche de una hembra adulta.

22. Un método para producir un colágeno, comprendiendo el método recolectar el colágeno a partir de un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, y, de manera opcional, purificar subsiguientemente el colágeno.