DE10053870A1

DE10053870A1 - Procollagen (III)-Propeptide und verwandte Substanzen zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen

Info

Publication number: DE10053870A1
Application number: DE10053870A
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2002-05-08
Also published as: WO2002036154A9; EP1343522A2; US20050282737A1; WO2002036154A3; WO2002036154A2; US20030199441A1; AU2002215995A1; US7498299B2

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Procollagen(III)-Propeptiden und verwandten Substanzen zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung und Renaturierung von rekombinantem N- und/oder C-terminalem Procollagen(III)-Propeptid. Die Procollagen(III)-Propeptide und verwandte Substanzen sind zur Behandlung von Fibrosen jeder Genese und Organmanifestitation geeignet. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von renaturiertem N-terminalen Procollagen(III)-Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen(III)-Propeptid.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Procollagen(III)-Propeptiden und verwandten Substanzen zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung und Renaturierung von rekombinantem N- und/oder C-terminalem Procollagen(III)-Propeptid. Die Procollagen(III)-Propeptide und verwandte Substanzen sind zur Behandlung von Fibrosen jeder Genese und Organmanifestation geeignet. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von renaturiertem N-terminalen Procollagen(III)-Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen(III)-Propeptid.

Stand der Technik Collagenbiosynthese

Die Collagene vom Typ I und III werden als Präpropetide synthetisiert und werden umfangreich posttranlationell modifiziert. Die intrazellulären Modifikationen umfassen u. a. Glycosylierungen, und enzymatische Hydroxylierungsreaktionen, die Lysin- Aminosäurereste und Prolin-Aminosäurereste in den Positionen 3 und 4 des Imidazolrings betreffen. Die modifizierten Propeptide lagern sich im Falle des Collagens Typ III spontan zu (α₁(III))₃ Homotrimern zusammen. Beim Collagen Typ I bilden sich vor allem (α₁(I))₂α₂(I) Heterotrimere aus und in geringerem Umfang auch (α₁(III))₃ Homotrimere. Nach Exocytose werden die Propeptide durch spezifische Endoproteasen zuerst C-terminal und dann N-terminal am naszierenden Collagen abgespalten. Die Spaltung des C-terminalen Procollagen(III)-Propeptids (PIIICP) erfolgt durch die Procollagen-C-Proteinase, die mit Bone Morphogenetic Protein-1 (BMP-1) identisch ist (Kessler 1996). Es wurden gewebsspezifische Expressionsmuster unterschiedlicher Splicevarianten des BMP-1-Proteins gefunden (Janitz 1998). Das N-terminale Procollagen-Propeptid des Collagens I (PINP) wird von dergleichen N-Proteinase geschnitten, die auch das N-terminale Procollagen-Propeptid des Collagens vom Typ II abdaut. Dagegen ist für die Hydrolyse des N-terminalen Procollagen(III)-Propeptids (PIIINP) eine von der von der N-Proteinase (I und II) separate enzymatische Aktivität verantwortlich. Das dafür verantwortliche Enzym wird als Procollagen-N-Proteinase vom Typ (III) bezeichnet.

Stand der Technik PIIICP

PIIICP kommt als Trimer vor, das aus drei identischen monomeren PIIICP- Untereinheiten besteht. Die Untereinheiten sind miteinander durch intermolekulare Disulfidbrücken verbunden. Theoretische strukturelle Überlegungen und zielgerichtete Mutageneseexperimente mit sogenannten Collagen-Minigenen haben gezeigt, daß wenigstens 4 und wahrscheinlich sogar 6 der 8 Cysteinreste einer monomeren PIIICP- Untereinheit an der Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken beteiligt sind. Wahrscheinlich sind nur die Cysteinreste in den Positionen 51 und 68 an der Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken beteiligt. Allerdings wurde beobachtet, daß die Region um diese beiden Cysteinreste auch für die korrekte Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken kritisch ist, weil Cys → Ser-Mutationen in dieser Region zu einer gestörten Ausbildung dieser Disulfidbrücken führen. Andererseits wurde beschrieben, daß die Trimerisierung von Procollagen des Typs III auch dann stattfindet, wenn die Ausbildung von intermolkularen Disulfidbrücken durch eine Cys → Ser-Mutation in der Position 51 unmöglich gemacht wurde.

Bisher wurden keine Methoden zur Quantifizierung von PIIICP beschrieben, außer in der Patentanmeldung: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1).

Pharmakokinetische Untersuchungen liegen für PIIICP nicht vor. Lediglich für PICP wurden Untersuchungen zur Clearance und zum Eliminationsmechanismus durchgeführt. Für ¹²⁵I-markiertes PICP wurde durch Kompetitionsexperimente eine Elimination aus dem Serum durch den Mannose-6-Phosphat-Rezeptor beschrieben (Smedsrød 1990). Möglich wäre eine Endocytose unter Vermittlung dieses Rezeptors auch bei PIIICP, da PIIICP bei Asn173 eine Glykosylierungsstelle aufweist (Dion 1987). Allerdings kann dieser Mechanismus für rekombinantes PIIICP aus E. coli ausgeschlossen werden, weil das Protein aufgrund der Expression in diesem Wirt ohne Glykosylierungen vorliegt.

Bezüglich der physiologischen Rolle von PIIICP gibt es in der Literatur keine Informationen. Zur biologischen Wirksamkeit des C-terminalen Propeptids von Collagen Typ I wurden in der Literatur unterschiedliche Effekte beschrieben.

Die Nucleotidsequenz des humanen PIIICP's ist in der Genebank (Accession No. X14420, Ala-Kokko 1989, und X01742, Loidl 1984) hinterlegt. Beispielhaft wird die Aminosäuresequenzen dieses Propeptids in Fig. 1 (I) angegeben. Die Propeptidsequenz ist in der Anlage in der Gesamtsequenz der entsprechenden Procollagensequenzen C-terminal von der Procollagen-C-Proteinase-Schnittstelle kenntlich gemacht worden.

In Fibroblastenzellkultur wurde unter Verwendung von 40 nM intaktem PICP eine Reduktion der Collagenbiosynthese um 80% gemessen, bei 10 nM noch um 30% (Wu 1986). Allerdings korrelierten diese Änderungen der Proteinbiosynthese sehr gut mit gemessenen Änderungen auf Transkriptionsebene. Infolgedessen wurde für PICP über eine regulatorische inhibierende Wirkung auf transkriptioneller Ebene spekuliert.

Für natürliches intaktes Ratten-PICP, isoliert aus Fibroblasten, wurde auch in Zellkulturen mit hepatischen Sternzellen eine Inhibition der Collagenbiosynthese gezeigt (Ma 1997). In Konzentrationen von 33.3 nM wurde eine 66%ige Inhibitionswirkung gemessen, die bei einer Konzentration von 133.2 nM auf 83% anstieg. Die mRNA- Konzentrationsveränderungen unter PICP-Einfluß wurden nicht untersucht. Allerdings wurde in diesen Experimenten gezeigt, daß die inhibitorische Wirkung stark von der Struktur des Proteins abhängt. Eine kovalente Modifizierung von PICP durch Acetaldehyd schwächte die Wirkung auf die Biosyntheserate deutlich ab.

Bei der Verwendung überlappender synthetischer Polypeptide von PICP im Fibroblastenzellkulturmodell sind die Literaturdaten widersprüchlich.

Eine inhibitorische Wirkung auf Ebene der Biosyntheserate wurde mit einem Polypeptid bestehend aus 22 Aminosäureresten (Aminosäurereste 225-246) festgestellt (Katayama 1991).

Hingegen zeigten Untersuchungen eines weiteren synthetischen Polypeptids bestehend aus 45 Aminosäureresten (Aminosäurereste 197-242) - im Gegensatz zu allen bisherigen Ergebnissen - eine Steigerung der Biosyntheseraten der Collagene Typ I und Typ III, sowie von Fibronectin (Katayama 1991). Bei einer Konzentration von 45 µM erfolgte in humanen Lungenfibroblasten nach 4 h eine Steigerung der Collagenbiosynthese um das 3,3-fache und der Fibronectinbiosynthese um das 6,1- fache. Nach 8 h wurde eine maximale Stimulation der Collagenbiosynthese um das 6- bis 8-fache gemessen.

Die stimulierende Wirkung hing jedoch in hohem Maße vom Konfluenzgrad der Zellen ab. Während bei subkonfluenten Fibroblastenzellen eine Wirkung gezeigt werden konnte, war diese bei konfluenten Zellen nicht mehr nachweisbar. Die Wirkungen waren weder zelltypen- noch speziesspezifisch. Bei weitergehenden Untersuchungen konnte die für die Stimulation der Collagenbiosyntheserate notwendige Polypeptidsequenz auf ein Pentapeptid (Aminosäurereste 212-216) reduziert werden, wobei 80% der ursprünglichen Maximalstimulation auftraten (Katayama 1993). Es zeigte sich allerdings bei Fibronectin mit Faktor 5-11 im Vergleich zu Collagen Typ I (Faktor 4-7) eine deutlich stärkere Stimulation der Syntheserate. Neben der Untersuchung der Änderungen auf Proteinebene wurden parallel die mRNA-Konzentrationen der betroffenen Gene untersucht. Sowohl bei den Collagenen als auch bei Fibronectin wurden keine Konzentrationsänderungen auf mRNA-Ebene gemessen (Katayama 1991). Der Einfluß der synthetischen Polypeptide auf die Stimulation der Collagenbiosynthese erfolgte demnach auf posttranskriptioneller Ebene.

Über in vivo-Untersuchungen mit PIIICP oder verwandten Substanzen wurde bisher in der Literatur nicht berichtet.

Stand der Technik PIIINP

PIIINP kommt als Trimer vor, das aus drei identischen monomeren PIIINP Untereinheiten besteht, die untereinander durch intermolekulare Disulfidbrücken verbunden sind. Das PIIINP-Molekül wird strukturell in drei Domänen gegliedert. Die am weitesten N-terminal gelegene Domäne (Col 1) hat eine globuläre Struktur und enthält mehrere intramolekulare Cysteinbrücken. Die sich nach C-terminal anschließende sogenannte Col3-Domäne weist eine collagenartige Struktur auf, die periodisch wiederkehrende Gly- und Pro-Reste enthält. Sie bildet eine charakteristische Collagen- Tripelhelixstruktur aus. Die Col 2-Domäne enthält diejenigen Teile der Procollagen- Telopeptidregion, die sich N-terminal der Schnittstelle der N-Proteinase (III) befinden. In dieser Region sind die monomeren PIIINP-Stränge parallel zueinander angeordnet.

Charakteristisch für die Col2-Domäne ist das Vorkommen zweier Cysteinreste, die beide intermolekulare Disulfidbrücken ausbilden und die für den Zusammenhalt des trimeren PIIINP's von entscheidender Bedeutung sind. In der Nähe der N-Proteinase(III)- Schnittstelle befindet sich eine Oligosaccharid-Glykosylierungsstelle. Acht Aminosäurereste C-terminal von der Propeptidspaltungsstelle ist einer der vier Lysinreste lokalisiert, die vor der kovalenten Quervernetzung der Collagene durch die Lysyloxidase oxidativ zu Aldehyden desaminiert werden.

Eine Besonderheit des Collagens vom Typ III ist, daß ein Teil der N-terminalen Propeptide bei den Procollagenen nicht abgespalten wird. Dieses sogenannte pN- Collagen Typ III wird dennoch in Fibrillen eingebaut (Fessler 1979). Die Form der Fibrillen wird unterschiedlich beschrieben: als dünne mit Collagen Typ I assoziierte Fibrillen (Keene 1987) oder als dünne perlenschnurartige Fibrillen, die zu netzwerkartigen Strukturen assoziieren (Amenta 1986). Bei elektronenmikroskopischer Betrachtung hat das pN-Collagen Typ III aufgrund des noch vorhandenen PIIINP's das Aussehen eines 'barbed wire' (Davis 1987). Die Anwesenheit von pN-Collagen Typ III auf der Außenseite von Collagenfibrillen könnte eine Rolle bei der Regulation der Fibrillendurchmesser spielen (Schuppan 1991).

Bezüglich der Stabilität des PIIINP-Proteins im Organismus wird über Halbwertszeiten zwischen 2 min und 239 min berichtet (z. B. Smedsrød 1988; Jensen 1989, dazwischen liegende Werte sind von Brocks 1993, und von Melkko 1994, berichtet worden). Die ermittelten Werte unterschieden sich stark je nach Modell und/oder Markierung des Antigens. In Ratten wurde eine Clearance der N-terminalen Propeptide der Collagene Typ III und Typ I aus dem Serum - unabhängig von der Antigenspezies - durch den Scavenger-Rezeptor der Leberendothelzellen beschrieben (Melkko 1994). Die Endocytose erfolgte bei beiden Proteinen unter Vermittlung desselben Rezeptors.

Die Aminosäuresequenz des humanen PIIINP's ist in der Genebank-Datenbank mit der Zugangsnummer X14420 (Ala-Kokko 1989) hinterlegt. Beispielhaft wird die Aminosäuresequenzen dieses Propeptids in Fig. 1 (II) angegeben. Die Propeptidsequenz ist in der Anlage in der Gesamtsequenz der entsprechenden PIIINP- Sequenz N-terminal in der Nähe der Procollagen-N-Proteinase-Schnittstelle vom Typ III kenntlich gemacht worden.

Für PIIINP wurden Untersuchungen zu ihrer Rolle als Feedbackinhibitoren der Collagenbiosynthese in Zellkultursystemen und in zellfreien Lysaten veröffentlicht. Für die N-terminalen Propeptide der Collagene Typ I und Typ III sowie der Col 1-Domäne des PINP wurde zellspezifisch im Fibroblasten-Zellkultursystem eine konzentrationsabhängige Inhibition der Collagenproduktion der α₁(I)- und α₂(I)-Ketten gemessen (Kühn 1982). Verwendet wurden Proteinkonzentrationen von 0,5 M bis 6 µM. Die Inhibition lag im Bereich von 30% bis 50% im Vergleich zu Kontrollexperimenten. Hierbei wurde eine Beeinflussung der Translationsrate durch die Propeptide und deren Fragmente nachgewiesen. Gestützt wurden die Befunde durch die Lokalisation der internalisierten Proteine in der Nähe des endoplasmatischen Reticulums.

Untersuchungen mit den Col 1-Domänen der beiden N-terminalen Propeptide wurden zudem im zellfreien Reticulozytensystem durchgeführt (Paglia 1979). Verwendet wurden Proteinkonzentrationen von 0,4 bis 3,2 µM. Es wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition der Collagen (I)-Synthese gemessen. In beiden Fällen wurde auf der Ebene der Translation eine Inhibition zwischen 38% und 71% im Vergleich zu Kontrollexperimenten gemessen. Bei der Verwendung sehr hoher Konzentrationen an Proteinen (8 µM) wurde gezeigt, daß die inhibitorische Wirkung auf die Collagentranslation in diesem System nicht weiter gesteigert werden konnte.

Bei der Untersuchung des Wirkmechanismus von PINP wurde auch ein System zur rekombinanten cytosolischen Expression von PINP in Fibroblastenzellkultur untersucht (Fouser 1991). Während keine Veränderungen der Collagen (I) mRNA-Konzentrationen gemessen wurden, zeigte sich eine verringerte Biosyntheserate des entsprechenden Proteins und somit eine Regulation auf posttranskriptioneller Ebene.

Gestützt werden die Ergebnisse für PINP durch Experimente mit Hautfibroblasten aus homozygoten dermatosparaktischen Schafen (Kühn 1982). Bei der homologen humanen Erkrankung, dem Ehlers-Danlos-Syndrom Typ VIIa oder VIIb, liegt eine Mutation in der N-Proteinaseschnittstelle des Procollagens Typ I vor, PINP kann demzufolge nicht abgespalten werden (Byers 1997). In Zellkultur wiesen diese Zellen ohne PINP-Feedbackmechanismus im Vergleich zu heterozygoten Kontrollfibroblasten, einen Anteil der Collagenbiosynthese an der gesamten zellulären Biosynthese von 15-20% auf (Kontrollfibroblasten 2 bis 4%).

Stand der Technik Rekombinante Produktion von Procollagen(III)-Propeptiden

Die rekombinante Produktion von Procollagen(III)-Propeptiden wurde in einer Reihe von Publikationen beschrieben. Lee, 1990, beschreibt die rekombinante Produktion einer Collagen α₂(I)-Mutante in sogenannten A2-Zellen, die von der epithelialen Leberzellinie W8 abgeleitet sind, die ihrerseits in Bezug auf die Produktion von Collagen α₂(I) defizient ist. In zwei neueren Publikationen wird die rekombinante Expression von Collagen α₁(III) Minigenen beschrieben (Lees 1994; Bulleid 1996).

In einer neueren Arbeit wird die Gewinnung von PIIICP in Zf9-Zellen als trimeres Protein beschrieben (Zafarullah 1997). Allerdings konnte rekombinantes Procollagen nur in sehr kleinen Mengen für Analysezwecke hergestellt werden. Die rekombinante Expression von PIIICP in E. coli wurde in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide. (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1) und in Burchardt, 1998, beschrieben. Die Ausbeuten lagen bei diesem Expressionsverfahren bei mehr als 20 mg/l Flüssigkulturmedium. Allerdings lagen die rekombinanten Proteine in E. coli fast ausschließlich als Inclusion Body-Protein vor und mußten mit denaturierenden Aufschlußmethoden aufgereinigt werden. Außerdem enthielten die exprimierten Proteine einen N-terminalen His-Tag, so daß sie auch in denaturienden Lösungsmitteln über eine Ni-NTA-Säule aufgereinigt werden konnten. Für chronische in vivo-Anwendungen waren diese Proteine weniger geeignet, weil der His-Tag potentiell immunogen ist und die biologische Halbwertszeit des rekombinanten Proteins aus diesem Grund verkürzt sein kann. Sie lagen unter den in dieser Anmeldung angegebenen Methoden überwiegend in monomerer Form vor, und ihre Löslichkeit in wässrigen Lösungen war zu gering für die meisten therapeutischen Anwendungen. Überschreiten von Konzentrationen von ca. 10 µg/ml führte zum Ausfallen des rekombinanten PIIICP's aus wässrigen Lösungen.

Die rekombinante Expression von humanem PIIINP in E. coli wurde in der Patentanmeldung: Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP (WO 09961477 A2) und die von murinem PIIINP in Kauschke, 1999, beschrieben. Die Ausbeuten lagen bei diesem Expressionsverfahren jeweils bei ca. 5 mg/l Flüssigkulturmedium. Außerdem enthielten auch diese Proteine einen N-terminalen His- Tag, so daß sie in denaturienden Lösungsmitteln über eine Ni-NTA-Säule aufgereinigt werden konnten. Für chronische in vivo-Anwendungen waren auch diese Proteine weniger geeignet, weil der His-Tag potentiell immunogen ist und die biologische Halbwertszeit dieser Proteine aus diesem Grund verkürzt sein kann. Die Löslichkeit von PIIINP in wässrigen Lösungen war zu gering für die meisten therapeutischen Anwendungen.

Stand der Technik Fibrotische Erkrankungen

Unter fibrotischen Erkrankungen versteht man eine diverse Gruppe von Krankheiten, die mit einer qualitativ veränderten Collagenproduktion oder mit einer verstärkten Ablagerung von Collagen im Extracellulärraum einhergehen. Zu dieser Gruppe von Erkrankungen gehören u. a. die systemische oder lokale Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z. B. alkoholische Leberzirrhose, biliäre Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, die sogenannte veno-occlusive diesease, idiopathische interstitielle Fibrosen, idiopathische Lungenfibrosen, akute pulmonale Fibrosen, das "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskuläre Fibrosen, perizentrale Fibrosen, Dermatofibrome, Nierenfibrosen, die diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloide, die hypertrophe Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, die cystische Fibrose, muskuläre Fibrosen, die Duchenne'sche Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonale Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen, Aneurysmen der großen Gefäße.

Weitere fibrotische Erkrankungen können initiiert oder hervorgerufen werden durch chirurgische Narbenrevisionen, plastisch-chirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrosen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen. Bei vielen dieser Erkrankungen ist eine Therapie bislang nicht erfolgreich gewesen. Bei anderen besteht Bedarf zu verbesserten Ansätzen oder zur Reduktion von Nebenwirkungen.

Aus Vorgenanntem ergibt sich, daß es weiteren Bedarf gibt, wirksame Arzneimittel gegen fibrotische Erkrankungen bereitzustellen. Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die in den Beispielen gekennzeichnete Ausführungsformen erreicht.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, vorzugsweise ein Arzneimittel enthaltend (a) ein (Poly)peptid, das das N-terminale Procollagen(III)- Propeptid und/oder das C-terminale Procollagen(III)-Propeptid umfaßt oder (b) ein Fragment oder Derivat davon mit im wesentlichen der antifibrotischen Aktivität des (Poly)peptids (a) und/oder (c) ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen- C-Protease vom Typ III und/oder ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen-N-Proteinase vom Typ III umfaßt, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

Der Begriff "ein (Poly)peptid, das das N-terminale Procollagen(III)-Propeptid und/oder das C-terminale Procollagen(III)-Propeptid umfaßt" bedeutet im Sinne der Erfindung, daß das (Poly)peptid das N-terminale oder das C-terminale Procollagen(III)-Propeptid umfaßt an die sich gegebenenfalls weitere Aminosäuresequenzen N-terminal oder C- terminal anschließen können, so daß sich ein längeres (Poly)peptid ergibt. Die zusätzlichen Sequenzen können vom Procollagen stammen oder heterologe oder artifizielle Sequenzen sein. Bevorzugt sind (Poly)peptide, die zusätzlich zur (humanen) PIIICP- bzw. PIIINP-Aminosäuresequenz auch mögliche Procollagen-C- bzw. Procollagen-N-Proteinase-Schnittstellen-Erkennungssequenzen aufweisen.

Der Begriff "ein Fragment oder Derivat davon mit im wesentlichen der antibiotischen Aktivität des (Poly)peptids (a)" bedeutet erfindungsgemäß, daß dieses Fragment oder Derivat mindestens 50%, vorzugsweise 75%, stärker bevorzugt 85%, besonders bevorzugt 90% der antifibrotischen Aktivität des N-terminaien oder C-terminalen Procollagen/-Propeptids aufweist. Derivate des (Poly)peptid können andere als die natürlichen Aminosäuren oder substituierte Aminosäuren enthalten. Derivate können beispielsweise durch Peptidomimetics hergestellt werden.

Wenn die nachstehenden Ausführungsformen üblicherweise im Zusammenhang mit Arzneimitteln diskutiert werden, so treffen diese mutatis mutandis auf die Zusammensetzungen zu.

Der Begriff "(Poly)peptid" betrifft sowohl Polypeptide wie auch Peptide. Ein Peptid umfaßt üblicherweise nicht mehr als 30 Aminosäuren.

Mögliche Procollagen-C-Proteinase-Erkennungssequenzen sind in Fig. 1 (I) kenntlich gemacht worden.

Mögliche Procollagen-N-Proteinase-Erkennungssequenzen sind in bei der PIIINP- Sequenz in Fig. 1 (II) kenntlich gemacht worden.

Beispiele für geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie z. B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmittel oder Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Arzneimittel, die solche Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z. B. intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial, oral oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z. B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z. B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid- Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z. B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z. B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren. Das Arzneimittel kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z. B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Des weiteren können, abhängig von der beabsichtigten spezifischen Verwendung, andere Wirkstoffe wie z. B. Interleukine, Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens enthalten sein.

Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, wie z. B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Körperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung, und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z. B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 1000 µg liegen, wobei Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren, vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Dosis in einem Bereich zwischen 1 µg- und 10 mg-Einheiten pro Tag befinden. Üblicherweise werden die Wirkstoffe in diesen Zubereitungen in einer Konzentration von größer als 10 µg/ml eines physiologischen Puffers vorliegen. Sie können aber auch in fester Form in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein. Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den oder die Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 0,001 bis 100 mg/kg, bevorzugt in Gesamtmengen von etwa 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls als Dauerinfusion oder in Form von mehreren Einzelgaben, zur Erzielung des gewünschten Ergebnisses zu verabreichen. Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht, sollte sich die Dosis in einem Bereich zwischen 1 µg- und 10 mg-Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag befinden. Das Arzneimittel kann lokal oder systemisch verabreicht werden.

Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die obengenannten (Poly)peptide und insbesondere PIIICP in vivo in der Leber aufgenommen wurden und antifibrotische Effekte zeigten. Der in der Patentanmeldung beschriebene Wirkmechanismus von rekombinantem PIIICP durch Herunterregelung der Connective Tissue Growth Factor-mRNA war ebenfalls überraschend und unerwartet. Hier wurde zum ersten Mal die Rolle von PIIICP als natürlichem Feedback-Inhibitor der fibrotischen Matrixdeposition beschrieben.

In vivo-Untersuchungen zur Verringerung von Fibrosen durch Anwendung von rekombinatem PIIINP wurden in der Literatur bisher nicht beschrieben. Aufgrund der fehlenden Glykosylierung von rekombinantem PIIINP aus E. coli war ferner die Verringerung des fibrotischen Areals, die in dieser Patentanmeldung beschrieben wird, völlig überraschend und unerwartet.

In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das (Poly)peptid oder Fragment oder Derivat und/oder das Peptid vom humanen Procollagen (III) oder ist davon abgeleitet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren N-terminal von der Spaltstelle.

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren C-terminal von der Spaltstelle.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das (Poly)peptid ein Fusionsprotein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das (Poly)peptid einen His- Tag. Der His-Tag kann C-terminal oder N-terminal angefügt sein.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist der His-Tag 6 His-Tag und N-terminal angefügt.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines vorstehend beschriebenen (Poly)peptids oder Fragmentes oder Derivates davon zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die fibrotischen Krankheiten ausgewählt aus systemischer oder lokaler Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z. B. alkoholischer Leberzirrhose, biliärer Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, der sogenannten "veno-occlusive disease", idiopathischen interstitiellen Fibrosen, idiopathischen Lungenfibrosen, akuten pulmonalen Fibrosen, dem "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskulären Fibrosen, perizentralen Fibrosen, Dermatofibromen, Nierenfibrosen, der diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloiden, der hypertrophen Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, der cystischen Fibrose, muskulären Fibrosen, der Duchenne'schen Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonaler Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen und Aneurysmen der großen Gefäße oder sind hervorgerufen oder initiiert durch chirurgische Narbenrevisionen, plastisch-chirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrosen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von renaturiertem N-terminalen Procollagen(III)-Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen(III)-Propeptid, wobei man (a) nach üblichen Verfahren mit E. coli rekombinant hergestellte, das/die Propeptid(e) enthaltende Einschlußkörper in einem 0,5 bis 8 M denaturierenden Puffer löst; (b) den Puffer gemäß (a) einem Grenzverdünnungspuffer zutropft, der um einen neutralen pH-Wert herumpuffert, L- Arginin in einer Endkonzentration von 200 bis 1000 mM und ein Disulfidbrücken- reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, bis ein Volumenverhältnis des denaturierenden Puffers zu Grenzverdünnungspuffer von höchstens 1 : 3 erreicht ist; (c) das Puffergemisch gemäß (b) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der L-Arginin in einer Endkonzentration von 50 bis 200 mM und ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert; (d) das Puffergemisch gemäß (c) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert; und (e) das Puffergemisch gemäß (d) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer dialysiert.

Somit enthält der Puffer in Schritt (d) kein Arginin und in Schritt (e) weder Arginin noch das Redoxsystem.

Die Möglichkeit, rekombinantes PIIICP in größeren Konzentrationen als bisher beschrieben in physiologischem Puffer lösen zu können, war völlig überraschend und unerwartet, weil dem Fachmann bekannt ist, daß Collagene in physiologischen Puffern nur schwer löslich sind.

Durch diese Methode wird die therapeutische Anwendung der rekombinanten Procollagen-Propeptide und verwandter Substanzen in therapeutisch relevanten Konzentrationen ermöglicht. Im Beispiel 4 wird die Verwendung von nach diesem Verfahren renaturierten Procollagen-Propeptiden in Tiermodellen der Leberfibrose beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dem Puffer in mindestens einem der Schritte (b) bis (d) ein Chelator zugesetzt.

Vorzugsweise ist der Chelator EDTA, beispielsweise in einer Endkonzentration von 10 mM.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Redoxsystem Glutathion reduziert - Glutathion oxidiert.

Besonders bevorzugt ist, daß die Komponenten des Redoxsystems die in Beispiel 2 angegebenen Konzentrationen aufweisen.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist dem Puffer in mindestens einem der Schritte (b) bis (d) ein weiterer Proteasehemmstoff zugesetzt.

Bevorzugt ist der Proteasehemmstoff Pefabloc SC.

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform ist dem Puffer in einem der Schritte (c) und/oder (d) ein Salz in einer Endkonzentration von etwa 10 mM zugesetzt.

Vorzugsweise ist das Salz NaCl.

Besonders bevorzugt ist, daß die Grenzverdünnungs- und Dialysepuffer die in Beispiel 2 angegebenen Konzentrationen aufweisen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der denaturierende Puffer in Schritt (a) Harnstoff in einer Endkonzentration von 0,5 bis 8 M.

Vorzugsweise enthält der Puffer Harnstoff in einer Endkonzentration von etwa 6 M.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird als Puffermittel Trizma-Base eingesetzt.

In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform werden die Dialyseschritte bei etwa 4°C durchgeführt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dialysiert man in den Schritten (c) bis (e) gegen mindestens das 100-fache Dialysepuffervolumen.

Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei man das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte renaturierte N-terminale Procollagen(III)-Propeptid und/oder C-terminale Procollagen (III)-Propeptid nach üblichen Verfahren einengt oder lyophilisiert und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel versetzt.

Verwendbare pharmazeutische verträgliche Träger und Verdünnungsmittel wurden vorstehend diskutiert.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines N-terminalen Procollagen(III)-Propeptids und/oder eines C-terminalen Procollagen(III)-Propeptids, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.

Die Tabellen zeigen:

Tabelle 1 zeigt das Körpergewicht bei Versuchsende, relatives Lebergewicht, GIDH- Serumaktivitäten, Collagen Typ III- und Typ I- sowie TGFβ₁-mRNA-Konzentrationen nach chronischer Applikation verschiedener Procollagen α₁(III)-Propeptide im Mäuse- CCl₄-Modell. mRNA-Konzentrationsunterschiede nach TaqMan-Analyse sind als -Δct- Werte im Vergleich zur Intaktkontrolle angegeben. (Mittelwert ± SEM)

Tabelle 2 zeigt das Körpergewicht bei Versuchsende, relatives Lebergewicht, GIDH- Serumaktivitäten, Kollagen Typ III- und Typ I- und TGFβ₁-mRNA-Konzentrationen nach chronischer Applikation unterschiedlicher Konzentrationen des PIIICP4.1-Proteins im Mäuse-CCl₄-Modell. mRNA-Konzentrationsunterschiede nach TaqMan-Analyse sind als -Δct-Werte im Vergleich zur Intaktkontrolle. (Mittelwert ± SEM)

Tabelle 1

Tabelle 2

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 (I) zeigt die Aminosäuresequenzen im Bereich des humanen C-terminalen Procollagen(III)-Propeptids (PIIICP). Das N-terminale Ende der Prosequenz wird durch die Procollagen-C-Proteinase-Schnittstelle gebildet (siehe Pfeil). Die eigentliche Propeptidsequenz ist fettgedruckt. Der Sequenzabschnitt, der in der Umgebung der Procollagen-C-Proteinase-Schnittstelle liegt, ist unterstrichen. Abb. 1 (II) zeigt die Aminosäuresequenzen im Bereich des humanen N-terminalen Procollagen(III)- Propeptids (PIIINP). Das N-terminale Ende der Prosequenz grenzt an die Präsequenz. Die Procollagen-N-Proteinase-Schnittstelle ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die eigentliche Propeptidsequenz ist fettgedruckt. Der Sequenzabschnitt, der in der Umgebung der Procollagen-N-Proteinase-Schnittstelle liegt, ist unterstrichen.

Fig. 2 zeigt den PIIICP-Serumkonzentrationsverlauf im Modell der narkotisierten Ratte. Die terminale Halbwertszeit betrug ca. 80 min. das terminale Verteilungsvolumen lag bei ca. 7,4 l/kg und die Eliminationsrate bei ca. 6,3 l/(h.kg). Für Details siehe Beispiel 3 in der Patentschrift.

Fig. 3 zeigt (A) Gesamtcollagenflächenanteil und (B) CTGF mRNA-Konzentration nach chronischer Applikation verschiedener Procollagen α₁(III)-Propeptide im Mäuse-CCl₄- Modell (Mittelwert ± SEM).

Fig. 4 zeigt (A) Gesamtcollagenflächenanteil und (B) CTGF mRNA-Konzentration nach chronischer Applikation unterschiedlicher Konzentrationen des PIIICP4.1-Proteins im Mäuse-CCl₄-Modell (Mittelwert ± SEM). Für Details siehe Beispiel 4 in der Patentschrift.

Fig. 5 zeigt immunhistochemische Untersuchungen zur Lokalisation des PIIICP- Antigens auf repräsentativen Schnitten aus Rattenlebern. Verwendet wurde der monoklonale anti-PIIICP-Antikörper 48D19. (A) Intaktkontrolle nach siebentägiger Infusion einer Pufferkontrollösung (240-fach); (B) CCl₄-induzierte Leberfibrose nach siebentägiger PIIICP-Proteininfusion (400-fach); (C) CCl₄-induzierte Leberfibrose nach siebentägiger Infusion einer Pufferkontrollösung (Fibrosekontrolle, 320-fach).

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

In den Beispielen bedeutet "v/v" Volumenprozent und "w/v" Gewichtsprozent.

Beispiel 1 Aufreingung von PIIICP aus Inclusion Bodies in E. coli

PIIICP wurde in E. coli in Form von Inclusion Bodies produziert (Burchardt 1998). Die Zellpaste von jeweils drei 200 ml-Kulturen wurde in 24 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 M NaCl, resuspendiert, über Nacht bei -20°C eingefroren und nach dem Auftauen zentrifugiert (5.000 g, 10 min). Der Niederschlag wurde mit 4,8 ml des gleichen Puffers versetzt und 4,8 ml 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mg/ml Lysozym sowie 4,8 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) zugegeben. Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurden die Bakterienzellen mit Ultraschall aufgeschlossen. Anschließend wurden 12 ml 10% Triton- X-100, 1 mM EDTA, gelöst in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), zugegeben und nach 30 min Inkubation abzentrifugiert (5.000 g, 10 min). Die unlösliche Fraktion wurde in 24 ml 5% Triton-X-100, gelöst in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), mit Ultraschall gelöst, nochmals bei 37°C inkubiert und wiederum zentrifugiert (5.000 g, 10 min). Die Tritonextraktion zum Entfernen von Membranlipiden wurde einmal wiederholt. Anschließend wurde das Pellet in 24 ml 1 M Harnstoff, 1 mM EDTA, gelöst in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), mit Ultraschall gelöst und nach 30 min Inkubation erneut abzentrifugiert (5.000 g, 10 min). Das Pellet bestand aus fast reinem PIIICP in Form von Inclusion Bodies. Das Protein ließ sich in 6 M Harnstoff, gelöst in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), lösen. Wurde die Probe 30 min bei 15.800 g zentrifugiert, so blieb das Inclusion Body-Protein im Überstand.

Beispiel 2 Renaturierung von rekombinanten Collagen α₁(III)-Propeptiden

Renaturiert wurde beispielsweise rekombinantes humanes PIIICP4.1, dessen gentechnische Herstellung in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1) beschrieben ist. Des weiteren wurde rekombinantes humanes PIIINP 4.5.2. renaturiert, dessen gentechnische Herstellung in der Patentanmeldung: Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP (WO 09961477 A2) beschrieben ist. Schließlich wurde auch rekombinantes murines PIIINP, dessen gentechnische Herstellung in Kauschke, 1999, beschrieben wird, nach dem unten beschriebenen Verfahren renaturiert.

Das Verfahren ist allerdings keineswegs auf die Renaturierung dieser beispielhaft genannten Propeptide beschränkt, sondern eignet sich für die Renaturierung anderer Procollagen-Propeptide und ähnlicher Verbindungen.

Methode Verwendete Puffer

Dialysepuffer:
300 mM Trizma-Base, pH 7,4
400 mM L-Arginin
10 mM EDTA
0,4 mM Pefabloc SC
1 mM Glutathion reduziert
0,1 mM Glutathion oxidiert
Limited Dilution-Puffer:
50 mM Trizma-Base, pH 7,4
800 mM L-Arginin
10 mM NaCl
10 mM EDTA
0,4 mM Pefabloc SC
1 mM Glutathion reduziert
0,1 mM Glutathion oxidiert

Die Collagen α₁(III)-Propeptide lassen sich in einem 6 M Harnstoffpuffer lösen. Durch einen Limited Dilution-Schritt wurden die Pufferbedingungen der Proteine schlagartig geändert. Ein im Zielpuffer vorhandenes Redoxsystem begünstigte die Ausbildung von Disulfidbrücken. Hierzu wurde die Proteinlösung unter leichten Schüttelbewegungen in einen Überschuß eiskalten Limited Dilution-Puffers getropft. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 4°C gelagert.

Sämtliche Dialyseschritte fanden bei 4°C statt. Bei jedem Schritt wurde mindestens drei Stunden lang gegen das einhundertfache Puffervolumen dialysiert. Der Limited dilution- Ansatz wurde in einen Schlauch geeigneter Porengröße überführt und gegen den Dialysepuffer dialysiert. In den nächsten Dialyseschritten wurde die L- Argininkonzentration auf 100 mM reduziert, anschließend wurde ein Puffer ohne L- Arginin verwendet. Dem vierten Puffer fehlte zusätzlich das Glutathionredoxsystem. Der abschließende Puffer wurde gemäß des geplanten Verwendungszwecks ausgewählt. Für in vivo-Versuche bestand er beispielsweise aus 10 mM Trizma-Base, pH 7,4, 145 mM NaCl. Das Dialysat wurde abschließend bei 4°C gelagert.

Beispiel 3 Messung der Eliminationskinetik von renaturiertem PIIICP in der narkotisierten Ratte Materialien und Methoden PIIICP-Platten-ELISA

Die Bestimmung von PIIICP-Konzentrationen in biologischen Proben wurde in einem Sandwich-ELISA-Assay durchgeführt. Verwendet wurden zwei monoclonale anti-PIIICP-Antikörper (Burchardt 1998).

Als Fängerantikörper wurde der Antikörper 48B14 (Burchardt, 1998) in einer Konzentration von 5 µg/ml auf der Testplatte immobilisiert. Nach einem Blocking freier Bindungsplätze auf der Platte durch Inkubation mit einer 3% (v/v) BSA-Lösung in PBS wurden biologische Proben bzw. Pufferlösungen mit bekannten PIIICP-Konzentrationen gemeinsam mit einer bekannten Konzentration an FITC-markiertem Sekundärantikörper (48D19) (Burchardt, 1998) für 30 min zum immobilisierten Primärantikörper zugesetzt. Nicht gebundenes PIIICP-Antigen und noch ungebundener Sekundärantikörper wurden danach durch Waschschritte entfernt und die Menge an gebundenem, markiertem Sekundärantikörper bestimmt. Die obengenannten Antikörper können durch andere anti- PIIICP-Antikörperpärchen ersetzt werden, die nach üblichen Verfahren hergestellt werden können (Harlow and Lane, 1988).

Die gemessenen in vivo Konzentrationen in menschlichem Serum lagen zum größten Teil unter der Nachweisgrenze (unter 0,5 ng/ml, siehe Patentanmeldung: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 and EP 00988964 A1)). Diese Ergebnisse liegen um fast eine Größenordnung unter den physiologischen PIIINP-Konzentrationen im menschlichem Serum.

Tierversuch

Nüchterne Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von ca. 300 g wurden mit einer intraperitonealen Trapanal-Gabe von 100 mg/kg Körpergewicht betäubt.

Die Gabe von Flüssigkeiten oder Substanzverdünnungen erfolgte über einen Katheder in der Vena jugularis. Die Messung des Blutdrucks sowie die Blutentnahme erfolgte mittels eines Katheders in der Aorta femoralis. Zur Erleichterung der Spontanatmung wurde ein Luftröhrenschnitt durchgeführt. Während des Versuchs erhielten die Tiere Infrarot-Wärmestrahlung. Nach Eröffnung erhielten die Tiere zum Ausgleich des Blutverlustes eine Bolusgabe von 5 ml physiologischer Kochsalzlösung je kg Körpergewicht. Im Anschluß an eine fünfzehnminütige Erholungsphase erfolgte die Gabe der Substanzverdünnungen in physiologischem Pufferlösung (10 mM Trizma- Base, pH 7,4, 145 mM NaCl) durch eine zweistündige Infusion von renaturiertem PIIICP4.1 (Burchardt 1998) mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 µl je kg Körpergewicht und Minute (PIIICP4.1-Konzentration in der Infusionslösung ca. 150 µg/ml). Blutentnahmen erfolgten zu den Zeitpunkten 2 min, 60 min, 115 min, 150 min, 180 min und 225 min nach Start der Infusion parallel zu einer Aufzeichnung des jeweiligen Blutdrucks. Je Zeitpunkt wurden 400 µl Blut entnommen, sofort mit 20 µl Heparin (250 IE/ml) versetzt, scharf abzentrifugiert und das Plasma bis zum Test bei -20°C gelagert. Nach Beendigung des Versuchs wurden die Versuchstiere durch Gabe von KCl-Lösung getötet. Nach den PIIICP-Konzentrationsbestimmungen in den Proben wurden die pharmakokinetischen Parameter ermittelt.

Ergebnisse

Die terminale Halbwertszeit wurde mit ca. 80 min ermittelt. Im terminalen Kurvenbereich lag noch 6,1% der Gesamtfläche unterhalb des Kurvenverlaufs. Das Verteilungsvolumen in der terminalen Phase lag bei ca. 7,4 l/kg, die Eliminationsrate wurde mit ca. 6,3 l/h/kg) bestimmt (siehe Fig. 2).

Beispiel 4 Demonstration der biologischen Wirksamkeit von PIIICP und PIIINP

Die biologische Wirksamkeit der Substanzen kann in Zellkulturassays und in vivo demonstriert werden. Nach Applikation der Inhibitoren kann in humanen Zellinien z. B. der Abfall der Konzentration an freiem α₁(III) Propeptid in den Überständen gemessen werden, weil dieses Peptid durch die Aktivität der PCP freigesetzt wird. Zur Messung der PIIICP-Konzentrationen im Überstand kann ein kürzlich etablierter Assay verwendet werden (Burchardt, 1997, und Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-III- C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1)).

In dieser Patentanmeldung wird beispielhaft die biologische Wirksamkeit von PIIICP4.1 (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patenten: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben), PIIINP4.5.2 (Herstellung beschrieben im Patent: Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP (WO 09961477 A2); Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) und von murinem rekombinantem PIIINP (Herstellung beschrieben in Kauschke, 1999; Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) im Modell der CCl₄-induzierten Leberfibrose in der Maus beschrieben.

Für PIIICP wird beipielhaft die antifibrotische Wirkung von 3 verschiedenen Dosen dieser Verbindung in diesem Tiermodell beschrieben.

Je nach Organmanifestation oder Art der fibrotischen Schädigung können auch Tiermodelle für andere Fibrosemanifestationen, z. B. im Herzen, in den Nieren, in den Lungen, in der Haut oder anderen Organen verwendet werden.

Im Beispiel der CCl₄-induzierten Leberfibrose in der Maus wird die Reduktion der Collagenablagerung von PIIICP und PIIINP durch quantitative Morphometrie beschrieben. Sie kann z. B. auch durch die Bestimmung des Hydroxyprolingehalts (Gerling, 1996) der fibrotischen Organe oder durch quantitative Morphometrie erfolgen (Kauschke 1999). Außerdem wird im Beispiel die organprotektive Wirkung von PIIICP und PIIINP durch Verringerung der Zellschädigung beschrieben, die durch die Messung der Aktivitäten von intracellulären Markerenzymen (z. B. GIDH) bestimmt wird. Die Messung der organprotektiven Wirkung kann auch auf andere Weise erfolgen, z. B. durch Messung der Hemmung des Ausmaßes von Apoptosen und Nekrosen oder ähnlichem.

Materialien und Methoden Tierversuche

Den Versuchstieren wurde über den gesamten Versuchszeitraum zweimal pro Woche je 100 g Körpergewicht 0,2 ml einer Mischung aus CCl₄ und Mineralöl im Verhältnis 1 : 8 oral verabreicht. Die Substanzgabe erfolgte durch eine tägliche intraperitoneale Applikation von 0,5 ml einer Substanzverdünnung. Bei den Fibrose- und Intaktkontrollen wurde Pufferkontrollösung ohne Procollagen-Propeptide appliziert. Die Tiere hatten während des gesamten Versuchs freien Zugang zu Standardfutter und Wasser. Das Körpergewicht der Tiere wurde zu Beginn und am Ende des Versuchs gemessen. Bei Beendigung des Versuches wurde das Naßgewicht der Leber bestimmt, die Leber für die anschließenden Untersuchungen portioniert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung bis zur Verwendung erfolgte bei -80°C. Es wurden auch Plasmaproben von den Versuchstieren genommen, um darin klinisch-chemische Parameter zu bestimmen.

Gesamtcollagenfärbung mit Sirius Red/Fast Green

14 µm-Gefrierschnitte wurden über Nacht getrocknet. Nach einer zehnminütigen Behandlung mit einer 10% (v/v) Formaldehydlösung wurden die Schnitte zweimal jeweils fünf Minuten mit H₂O dest. gewaschen. Die Picrosirius Rot-Färbung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur in einer 0,1% (w/v) Sirius Rot-Lösung in gesättigter Pikrinsäure (zusätzlich pro 400 ml eine PBS-Tablette und 10 ml Eisessig) durchgeführt. Die Schnitte wurden erneut zweimal mit H₂O dest. gewaschen und anschließend 30 min in einer 0,1% (w/v) Fast Green-Lösung in gesättigter Pikrinsäure (zusätzlich pro 400 ml eine PBS-Tablette und 10 ml Eisessig) gefärbt. Die Entfärbungs- und Entwässerungsschritte erfolgten durch eine Abfolge von Waschschritten: zehn Sekunden H₂O dest, zehn Sekunden 70% (v/v) Ethanol, je eine Minute 80% (v/v) und 90% (v/v) Ethanol, dreimal je zwei Minuten reines Ethanol. Vor dem abschließenden Eindecken in Leica CV Mount wurden die Schnitte noch dreimal je 5 min lang in Xylol gewaschen.

Gesamt-RNA-Präparation aus Gewebe

Etwa 20 mg Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff gemörsert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Das Gewebepulver wurde mit 600 µl Puffer RLT (mit 0,1% (v/v) β-Mercaptoethanol) versetzt, homogen gemischt und auf eine QIAshredder-Säule aufgetragen. Die Säule wurde 2 min bei 18.000 g und 4°C zentrifugiert. Die zurückgehaltenen festen Bestandteile würden verworfen, der Durchfluß weiterverwendet. Die folgende Aufarbeitung erfolgte mit Hilfe des RNeasy Total RNA Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellervorschrift. Eluiert wurde mit 35 µl RNase-freiem H₂O. Der RNA-Gehalt jeder Präparation wurde direkt im Anschluß an einem Aliquot photometrisch bestimmt, eine weitere Probe wurde mit Hilfe eines RNA-Formaldehyd-Agarosegels auf die Integrität der erhaltenen RNA-Banden hin überprüft. Die Lagerung bis zur Verwendung erfolgte bei -80°C.

cDNA-Synthese aus Gesamt-RNA

Die Synthese der cDNA aus den präparierten Gesamt-RNA-Proben erfolgte in allen Fällen mit Hilfe des SuperScript II Preamplification Systems gemäß Herstellerangaben (Gibco BRL). Sämtliche Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. In allen Fällen wurde mit 1 µg Gesamt-RNA und Master-Mixen gearbeitet. Vor der reversen Transkription wurden eventuell vorhandene Verunreinigungen durch genomische DNA in sämtlichen Proben durch einen DNase I-Verdau beseitigt. Hierzu wurde 1 µg Gesamt-RNA mit RNase-freiem Wasser auf ein Volumen von 8 µl aufgefüllt, mit 1 µl DNase I (Superscript Kit) und 1 µl 10-fach Puffer versetzt und der Verdau 10 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Durch Zugabe von 1 µl 25 mM EDTA-Lösung und anschließender Inkubation (10 min bei 65°C) wurde der DNase I-Verdau gestoppt. Der gesamte Ansatz wurde in die cDNA-Synthese eingesetzt. Im Anschluß an die cDNA-Synthese wurden die Ansätze auf 100 µl Gesamtvolumen mit DNase-freiem Wasser aufgefüllt und bis zum Gebrauch bei -80°C gelagert. Bei allen cDNA-Synthesen wurden stichprobenartig Kontrollen auf Verunreinigungen durch genomische DNA ohne den Zusatz von Reverser Transkriptase durchgeführt.

mRNA-Konzentrationsbestimmungen mit einer TaqMan-PCR-Analyse

Die Bestimmung spezifischer mRNA-Konzentrationen erfolgte durch eine TaqMan-Analyse. Während der PCR-Reaktion werden - durch Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase - spezifische hybridisierende fluoreszenzmarkierte Sonden gespalten und in Echtzeit das resultierende Fluoreszenzsignal gemessen. Hierbei werden Ergebnisse in Form der Zyklenzahl angegeben, an dem die freigesetzte Fluoreszenz erstmals einen vorgegebenen Schwellenwert überschreitet. Der Parameter ct (threshold cycle) gibt die rechnerisch ermittelte Zyklenzahl an, bei der das gemessene Fluoreszenzsignal erstmals einen bestimmten Signalwert über dem Schwellenwert (threshold) liefert. Geringere ct-Werte geben an, daß im Ursprungsansatz eine höhere spezifische mRNA- Konzentration vorlag. Maximal kann bei der PCR-Reaktion eine Produktverdopplung mit jedem Zyklus erreicht werden. Durch Wahl von geeigneten Primern und Sonden, und durch die geringe Größe der amplifizierten Sequenz, kann annähernd eine Produktverdopplung bei jedem PCR-Zyklus während der exponentiellen Phase der Reaktion angenommen werden. Infolgedessen lassen sich aus den gemessenen Unterschieden der ct-Einheiten nach erfolgter Normierung die Unterschiede in den mRNA-Konzentrationen des betrachteten Transkripts in der ursprünglichen Probe berechnen. So bedeutet ein normierter Unterschied von 3 ct-Einheiten, daß sich bei Gültigkeit der Annahme einer Produktverdopplung mit jedem PCR-Zyklus die mRNA- Konzentrationen dieses Transkripts von den Vergleichsproben um den Faktor 8 (= 2³) unterschieden.

Bei der Betrachtung der mRNA-Konzentrationen wurden sämtliche gemessenen mRNA- Konzentrationen auf die jeweilige HPRT mRNA-Konzentration normiert. Für die HPRT mRNA-Konzentration konnte gezeigt werden, daß sich diese im Rahmen einer Fibroseerkrankung nicht ändert und HPRT infolgedessen als Standard, d. h. als Bezugsniveau, dienen kann.

Sämtliche Primer und Sonden wurden in bezug auf ihre Lage auf dem Gen und dem zu erwartenden Amplifikationsprodukt so ausgesucht, daß im Rahmen der TaqMan-PCR- Reaktion in allen Fällen je Zyklus eine Verdopplung der Produktkonzentration zu erwarten war. Diese Annahmen wurden durch Kontrollexperimente im Vorfeld überprüft und bestätigt. Die Primer und die 6-FAM-markierten Sonden lagen sämtlich in Konzentrationen von 100 µM vor. Zur Vermeidung von Variabilitäten zwischen Ansätzen wurde in allen Fällen mit Mastermixen und je Ansatz mindestens mit Doppelbestimmungen gearbeitet. Die Untersuchungen eines einzelnen Transkripts erfolgte für sämtliche Proben gesammelt auf einer Platte. Bei allen Untersuchungen wurden Kontrollen ohne Template bzw. ohne vorangegangene Reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt. Sämtliche Arbeiten fanden unter Eiskühlung statt. Je Ansatz enthielt der Mastermix 12,5 µl des TaqMan Universal PCR Master Mixes (Roche), 7,5 µl eines Primer-Sonden-Mixes (1 µM je Primer und 0,5 µM Sonde in DNase/RNase-freiem Wasser) sowie 3,75 µl DNase/RNase-freies Wasser. Pro Ansatz wurden in 96-Loch-Platten mit optischen Deckeln 2,5 µl cDNA vorgelegt und mit 22,5 µl des Mastermixes gemischt. Die Platte wurde vor der PCR-Reaktion 1 min bei 500 g und 4°C zentrifugiert. Das Programm der TaqMan-PCR-Reaktion umfaßte eine Erwärmungsphase von 2 min bei 50°C, eine zehnminütige Denaturierung bei 95°C sowie im Anschluß 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95°C für 15 Sekunden und einer kombinierten einminütigen Annealing-/Expansionsreaktion bei 60°C. Während der Zyklen wurde automatisch jeweils zum Zeitpunkt der Denaturierung die Fluoreszenz der freigesetzten Sonden gemessen. Die Auswertung erfolgte mit der ABI PRISM Sequence Detection Software. Die Basislinie wurde bei dem Mittel der Zyklen 3 bis 15 festgelegt, der Threshold betrug 0,04.

Ergebnisse Effekte der Infusion von Procollagen(III)-Propeptiden im chronischen i. p.-Versuch im Mäuse-CCl₄-Modell

Zur Untersuchung der Effekte der rekombinant hergestellten Procollagen α₁(III)-Propeptide auf die Ausbildung einer experimentell induzierten Leberfibrose wurden Gruppen von jeweils 10 Mäusen nur mit CCl₄ (Fibrosekontrolle) bzw. zusätzlich mit Proteinlösungen mit Konzentrationen von 500 µg/ml behandelt. Auflerdem wurde eine Gruppe nur mit Pufferkontrollösung behandelt (Intaktkontrolle). Als therapeutische rekombinante Proteine wurden humanes PIIICP4.1 (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben), humanes vollständiges PIIINP 4.5,2 (Herstellung beschrieben im Patent: Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP (WO 09961477 A2); Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) und murines PIIINP mit 18 Aminosäureresten der Prosequenz (als M1 bezeichnet, Herstellung beschrieben in Kauschke, 1999; Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) verwendet.

Am Ende der Behandlung war das gelöste PIIICP in der Infusionslösung in allen Fällen nicht degradiert. Dies wurde mit einem SDS-PAGE-Gel gezeigt.

Bei allen Tieren wurden morphometrisch der Gesamtcollagenflächenanteil in Leberschnitten, die GIDH-Aktivität im Serum sowie die mRNA-Konzentrationen ausgewählter Transkripte mit einer TaqMan-Analyse gemessen.

Die Proteine wurden in der verwendeten Konzentration während des untersuchten Zeitraums von den Tieren gut vertragen. Es zeigten sich keine pathologischen Auffälligkeiten, des weiteren traten keine gehäuften Sterbefälle auf.

Der morphometisch ermittelte Gesamtcollagenflächenanteil, der durch automatisierte Auswertung der Sirius Rot-gefärbten Areale bestimmt wurde, zeigte in der Fibrosekontrollgruppe die höchsten Werte (Kauschke, 1999). In den Behandlungsgruppen waren die Gesamtcollagenflächen in allen Fällen signifikant reduziert (Fig. 3A). Bei PIIICP4.1 auf 71% der Fibrosekontrolle (p < 0,04), bei PIIINP 4.5.2 auf 63% der Fibrosekontrolle (p < 0,01) und bei M1 auf 68% der Fibrosekontrolle (p < 0,02).

Bei der Betrachtung der mRNA-Konzentrationen in den Lebern zeigte sich bei CTGF in allen Behandlungsgruppen im Vergleich zur Fibrosekontrolle eine signifikante Konzentrationsverringerung (Fig. 3B). Die Unterschiede im Vergleich zur Fibrosekontrolle lagen bei +1,9 Δct-Einheiten (PIIICP4.1, p < 0,001), bei +1,5 Δct- Einheiten (PIIINP 4.5.2, p < 0,01) und bei +1,2 Δct-Einheiten (M1, p < 0,02).

Die GIDH-Serumaktivität war ebenfalls bei allen Behandlungsgruppen im Vergleich zur Fibrosekontrolle erniedrigt (Tabelle 1) (Kauschke, 1999). Die Serumaktivitäten lagen um 17% (PIIICP4.1) bzw. um 11% (PIIINP 4.5.2, M1) niedriger als in der Fibrosekontrolle. Aufgrund von individuellen Schwankungen erreichten die Abweichungen jedoch in keinem Fall das Signifikanzniveau (p < 0,05).

Bei allen Tieren mit CCl₄-Applikation zeigte sich eine Reduktion des Körpergewichts (Tabelle 1). Die Behandlungsgruppen zeigten keine Unterschiede zur Fibrosekontrolle.

Das relative Lebergewicht lag in allen CCl₄-Gruppen über den Intaktkontrollen. Die behandelten Tiere wiesen tendenziell ein schwach erhöhtes relatives Lebergewicht gegenüber der Fibrosekontrolle auf. Die absoluten Lebergewichte zwischen den Gruppen waren nicht signifikant unterschiedlich (Tabelle 1).

Die mRNA-Konzentrationen der Transkripte Collagen Typ III und Typ I, TGFβ₁ (Tabelle 1) sowie Lysyloxidase, MMP-1, PAI-1 und Tenascin (Daten nicht gezeigt) zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen der Fibrosekontrollgruppe und den Behandlungsgruppen mit den Procollagen α₁(III)-Propeptidapplikationen.

Genauere Dosis-Wirkungsuntersuchungen der in vivo-Effekte nach PIIICP4.1- Infusion

Genauere Studien der in vivo-Effekte des rekombinant hergestellten PIIICP4.1-Proteins (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiel beschrieben) auf die Ausbildung einer experimentell induzierten Leberfibrose wurden im Mäuse-CCl₄-Modell durchgeführt.

Gruppen von jeweils 8 Mäusen wurden nur mit CCl₄ (Fibrosekontrolle) bzw. zusätzlich mit PIIICP4.1-Proteinlösungen mit Konzentrationen von 50 µg/ml PIIICP4.1, von 150 µg/ml und von 500 µg/ml über einen Zeitraum von 14 Tagen behandelt. Außerdem wurde eine Gruppe nur mit Pufferkontrollösung behandelt (Intaktkontrolle).

Am Ende der Behandlung war das gelöste PIIICP in den Applikationslösungen in allen Fällen nicht degradiert. Dies wurde mit einer SDS-PAGE-Gelanalyse gezeigt.

Bei allen Tieren wurden morphometrisch der Gesamtcollagenflächenanteil in Leberschnitten, die GIDH-Aktivität im Serum sowie die mRNA-Konzentrationen ausgewählter Transkripte mit der TaqMan-Analyse gemessen.

Insgesamt wurde das Protein in allen verwendeten Konzentrationen während des Behandlungszeitraums von den Tieren gut vertragen. Es zeigten sich keine pathologischen Auffälligkeiten, des weiteren traten keine gehäuften Sterbefälle auf.

Sämtliche Tiere mit einer CCl₄-Applikation zeigten im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren bei Beendigung des Versuchs ein geringeres Körpergewicht (s. Tabelle 2). Im Vergleich zur Fibrosekontrolle zeigte sich den PIIICP-Gruppen allerdings keine signifikanten Unterschiede. Lediglich tendenziell wogen die Tiere mit PIIICP-Applikation, unabhängig von der erhaltenen Konzentration, etwas mehr.

Das relative Lebergewicht lag in allen CCl₄-behandelten Gruppen über den Werten der unbehandelten Intaktkontrolle. Es gab keine signifikanten Unterschiede beim Vergleich der einzelnen Behandlungsgruppen mit der Fibrosekontrolle (Tabelle 2).

Bei Betrachtung der morphometrisch ermittelten Gesamtcollagenablagerung, die über eine automatisierte Auswertung der Sirius Rot-gefärbten Areale erfolgte, zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Tiergruppen (Fig. 4A). Nach chronischer Behandlung mit i. p.-applizierter renaturierter PIIICP4.1-Lösung wurde in allen Behandlungsgruppen ein verringerte Gesamtcollagenfläche gemessen. In der Behandlungsgruppe mit der niedrigsten PIIICP-Dosis (50 pg/ml) war die Gesamtcollagenfläche um 32% signifikant gegenüber der Fibrosekontrolle reduziert (p < 0,05). Nach einer Behandlung mit 150 µg/ml PIIICP4.1 betrug die signifikante Reduktion gegenüber der Fibrosekontrolle 44% (p < 0,02). Die Behandlungsgruppe mit der höchsten Proteinkonzentration (500 µg/ml PIIICP4.1) wies deutliche Schwankungen der gemessenen Gesamtcollagenfläche innerhalb der Behandlungsgruppe auf und eine Reduktion der Gesamtcollagenfläche um 31%. Im Vergleich zur Fibrosekontrolle wurde das Signifikanzniveau (p < 0,05) nicht erreicht.

Der parallel im Serum bestimmte klinische Parameter der GIDH-Aktivität als Maß für die Zellschädigung war in den zusätzlich mit PIIICP4.1-Proteinlösung behandelten Gruppen im Vergleich zur Fibrosekontrolle deutlich reduziert (Tabelle 2). Nach einer chronischen Behandlung mit 50 µg/ml PIIICP4.1 wies die GIDH-Serumaktivität 68% der Aktivität der Fibrosekontrolle auf, nach 150 µg/ml PIIICP4.1 bei 60% der Fibrosekontrolle und nach 500 µg/ml PIIICP4.1 bei 67% der Fibrosekontrolle. Lediglich nach Behandlung mit 150 µg/ml PIIICP4.1 war die Reduktion im Vergleich zur Fibrosekontrolle signifikant (p < 0,05). In den beiden anderen Behandlungsgruppen wurde aufgrund der Schwankungen der Resultate von Tier zu Tier das Signifikanzniveau jeweils nicht erreicht.

Nach der Normierung auf HPRT zeigten sich bei allen Transkripten (Collagen Typ I, Collagen Typ III, Tenascin, PAI-1, MMP-1, Lysyloxidase und CTGF) Unterschiede zwischen den Intaktkontrolltieren (ohne CCl₄-Applikation) und den Fibrosekontrollen. Es handelte sich bei allen untersuchten Transkripten um Gene, die an der Synthese der Extrazellulärmatrix beteiligt sind. Infolgedessen lagen die mRNA-Konzentrationen in den Fibrosekontrollen im Durchschnitt um den Faktor 6-10 höher als in den Intaktkontrollen.

Signifikante Unterschiede zwischen zusätzlich zur CCl₄-Schädigung mit PIIICP4.1- behandelten Tieren und der Fibrosekontrolle wurden bei den untersuchten Transkripten für das CTGF-Transkript gemessen (Fig. 4B). Bei 50 µg/ml PIIICP4.1 lag der Unterschied bei +0,74 Δct-Einheiten (p < 0,04), bei 150 µg/ml bei +0,75 Δct-Einheiten (p < 0,05) und bei 500 µg/ml PIIICP4.1 bei +1,41 Δct-Einheiten (p < 0,02).

Beispiel 5 Immunhistochemischer Nachweis von PIIICP auf Leberschnitten Material und Methoden Modell der Leberfibrose bei der gallengangsligierten Ratte

Bei nüchternen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten wurde während einer Barbituratnarkose nach medialer Öffnung des Oberbauches der Hauptgallengang isoliert. Mittels eines eingeführten Katheders wurde das Gallengangsystem durch Applikation von ca. 0.1 ml Ethibloc je Tier verschlossen. Der Gallengang wurde anschließend distal und proximal ligiert und durchtrennt. Intaktkontrolltiere wurden ebenfalls operiert, es unterblieb jedoch der Verschluß des Gallengangsystems.

Die PIIICP4.1-Applikation (Herstellung beschrieben in Burchardt, 1998, und in den Patentanmeldungen: An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide (WO 09924835 A2 und EP 00988964 A1); Gewinnung und Renaturierung oben in dieser Patentanmeldung als Beispiele 1 und 2 beschrieben) erfolgte über eine venöse Dauerinfusion mittels eines implantierten Verweilkatheders.

Die Implantation des Vena femoralis-Katheders erfolgte parallel zur Gallengangocclusion. Hierzu wurde die Haut im Bereich der rechten Leiste eröffnet und die Vena femoralis atraumatisch isoliert und durch zwei Ligaturen fixiert. Nach Inzision wurde ein Venenkatheder herzwärts eingeführt und fixiert. Der Katheder wurde anschließend mittels eines Trocars subcutan zum Nacken geführt und die Operationswunde durch eine Hautnaht verschlossen. Über ein Halsband wurde der Venenkatheder durch eine Protektionsspirale an einen Rotationsadapter angeschlossen, der mit einer Infusionspumpe gekoppelt war. Zur Infektionsprophylaxe wurde postoperativ 0,1 ml Tardomyocel subcutan appliziert.

Der Beginn der PIIICP4.1-Infusion mit einer Proteinkonzentration von 300 µg/ml erfolgte 24 h nach der Operation. Intakt- und Fibrosekontrollen bekamen Pufferkontrollinfusionen. Die Infusion erfolgte mit einer Flußrate von 0,2 ml je Stunde über einen Zeitraum von sieben Tagen. Die Infusionslösung wurde während des gesamten Versuchszeitraums gekühlt (ca. 7°C).

Die Ratten verbrachten die Versuchsdauer in einem Rundkäfig mit freiem Zugang zu Standardfutter und Wasser. Das Körpergewicht der Tiere wurde zu Beginn und am Ende gemessen. Bei Beendigung des Versuches wurde die Leber für die anschließenden Untersuchungen portioniert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.

Gewebefixierung für die Immunhistochemie

Die Gewebe für immunhistochemische Untersuchungen wurden 24 h in 3,6% (v/v) Formaldehydlösung fixiert. Nach dem Auswaschen mit destilliertem Wasser wurde das Wasser über eine aufsteigende Reihe mit Ethanol entfernt und die Gewebe in 52°C Paraffin eingebettet.

Immunhistochemie

5 µm Paraffinschnitte wurden entparaffiniert. Hierzu wurden die Schnitte suksessive mit Xylol, mit reinem Ethanol und anschließend über eine Konzentrationsreihe einer Ethanol-Wasser-Mischung (90% (v/v), 80% (v/v), 70% (v/v)) in reines Wasser überführt. Nach fünfminütiger Behandlung mit 3,6% (v/v) H₂O₂ wurde mit destilliertem H₂O gewaschen. Anschließend wurde fünf Minuten mit PBS gewaschen. Geblockt wurde 20 min lang in einer Lösung aus 5% (w/v) Magermilchpulver und 1% (w/v) BSA in PBS. Nach zweimaligem Waschen für jeweils drei min PBS wurde der Primärantikörper (monoklonaler Maus-anti-PIIICP-Antikörper 48D19) in einer Konzentration von 4 µg/ml in PBS zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiteren zwei Waschschritten wurde gemäß des ExtrAvidin Peroxidase Staining Kits (Sigma Aldrich) vorgegangen. Die Schnitte wurden mit biotinylierten Anti-Maus IgG's in einer Verdünnung von 1 : 15 in PBS mit 1% (w/v) BSA 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zwei Waschschritten wurde 20 min bei Raumtemperatur mit einer 1 : 15-Verdünnung der ExtrAvidin-Peroxidase behandelt. Diese Verdünnung wurde mit PBS mit einem Zusatz von 1% (w/v) BSA hergestellt. Im Anschluß an einen zweimaligen Waschvorgang wurden die Gewebeschnitte mit Hilfe des DAB-Systems (je 1 Tablette pro 5 ml Wasser) (Sigma Aldrich) 10 min lang entwickelt. Reste der Färbelösung wurden mit H₂O dest. entfernt. Die Gegenfärbung der Zellkerne wurde mit Hämalaun durchgeführt. Die Gewebeschnitte wurden für 1 min in eine saure Hämalaunlösung nach Mayer (1 : 4 Verdünnung mit dest. H₂O) gelegt, der Farbstoff anschließend mit dest. H₂O ausgewaschen. Die Schnitte wurden durch fünfminütige Behandlung mit Leitungswasser gebläut. Nach einem Waschschritt in H₂O dest. wurden die Schnitte entwässert. Mit Hilfe von wäßrigen Ethanollösungen aufsteigender Konzentration wurde das Wasser entzogen (70% (v/v), 80% (v/v), 90% (v/v), abschließend dreimal reines Ethanol). Die entwässerten Gewebeschnitte wurden dreimal je 5 min lang in Xylol gewaschen und mit dem Kunstharz Leica CV Mount eingedeckt.

Ergebnisse

Fig. 5 zeigt immunhistochemische Untersuchungen mit dem anti-PIIICP-Antikörper 48D19 auf repräsentativen Schnitten aus Rattenlebern. Eine Leberfibrose wurde durch eine Gallengangligatur induziert. Im Anschluß wurde durch einen Dauerkatheder für sieben Tage eine PIIICP-Protein- bzw. eine Pufferkontrollösung infundiert.

Bei der Intaktkontrolle, d. h. Scheinoperation und Infusion einer Pufferkontrollösung, zeigten sich kaum immunhistochemische Anfärbungen mit dem PIIICP-Antikörper (Fig. 5A).

Die Fibrosekontrolle wies eine starke Schädigung der Leber auf (Fig. 5C). Es zeigte sich eine massive Proliferation der Gallengänge bei den geschädigten Lebern. Im Bereich der Sinusoide waren einzelne Zellen, die sich auf Kontrollschnitten als α- Glattmuskelzellaktin-(α-SMA-) positiv erwiesen hatten, stark angefärbt. Es handelte sich um transformierte hepatische Sternzellen, die selektiv angefärbt waren. Die Sinusoiden waren in ihrem Durchleitungsvermögen deutlich eingeschränkt. Eine Anfärbung der Hepatozyten konnte nicht festgestellt werden.

Auf Schnitten von Tieren mit Gallengangligatur und PIIICP-Infusionslösung zeigte sich ebenfalls die starke intrazelluläre Anfärbung von hepatischen Sternzellen (Fig. 5B). Im Gegensatz zur Fibrosekontrolle wiesen diese Zellen jedoch zusätzliche intrazelluläre Anfärbungen in Form von Granula auf. Diese intrazellulären Anfärbungen wurden hier außerdem bei Hepatozyten mit Zugang zu den Sinusoiden festgestellt. Soweit ersichtlich, gab es keine spezifische Immunreaktion im Zellkern. Das Ausmaß der Fibrose war im Vergleich zur Fibrosekontrolle geringer.

Literatur

Ala-Kokko L, Kontusaari S, Baldwin CL, Kuivaniemi H, Prockop DJ (1989) Structure of cDNA clones coding for the entire preproalpha1 (III) chain of human type III collagen. Differences from type I procollagen structure and conservation of codon preferences. Biochemical Journal 260: 509-516
Amenta PS, Gay S, Vaheri A, Martinez-Hernandes A (1986) The extracellular matrix is an integrated unit: Ultrastructural localization of collagen types I, III, IV, VI, fibronectin, and laminin in human term placenta. Collagen Related Research 6: 125-152
Brocks DG, Steinert C, Gerl M, Knolle J, Neubauer HP, Günzler V (1993) A radioimmunoassay for the N-terminal propeptide of rat procollagen type III. Matrix 13: 381-387
Bulleid NJ, Wilson R, Lees JF (1996) Type-III procollagen assembly in semi-intact cells: Chain association, nucleation and triple-helix folding do not require formation of inter chain disulfide bonds but triple-helix nucleation does require hydroxylation. Biochemical Journal 317: 195-202
Burchardt ER et al. Monoclonal antibody and assay for detecting PIIINP. WO 09961477 A2
Burchardt ER et al. An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide. WO 09924835 A2 and EP 00988964 A1
Burchardt ER, Schröder W, Heke M, Kohlmeyer J, Neumann R, Kroll W (1997) Expression cloning of C-terminal procollagen (III) propeptide and its use in a novel serum assay to monitor liver fibrogenesis. Hepatology 26: 487A
Burchardt ER, Heke M, Kauschke SG, Harjes P, Kohlmeyer J, Kroll W, Schauer M, Schroeder W, Voelker M (1998) Epitope-specific monoclonal antibodies against human C-terminal procollagen α₁

(III)-propeptide. Matrix Biology 17: 673-677
Byers PH, Duvic M, Atkinson M, Robinow M, Smith LT, Krane SM, Greally MT, Ludman M, Matalon R, Pauker S, Quanbeck D, Schwarze U (1997) Ehlers-Danlos syndrome type VIIA and VIIB result from splice-junction mutations or genomic deletions that involve exon 6 in the COL1A1 and COL1A2 genes of type I collagen. American Journal of Medical Genetics 72: 94-105
Davis BH, Madri JA (1987) Type I and type III procollagen peptides during hepatic fibrogenesis. An immunohistochemical and ELISA serum study in the CCl₄

rat model. American Journal of Physiology 126: 137-147
Dion AS, Myers JC (1987) COOH-terminal propeptides of the major human procollagens. Journal of Molecular Biology 193: 127-143
Fessler LI, Fessler JH (1979) Characterization of type III procollagen from chick embryo blood vessels. Journal of Biological Chemistry 254: 233-239
Fouser L, Sage EH, Clark J, Bornstein P (1991) Feedback regulation of collagen gene expression: A trojan horse approach. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88: 10158-10162
Gerling B, Becker M, Waldschmidt J, Rehmann M, Schuppan D (1996) Elevated serum aminoterminal procollagen type-III-peptide parallels collagen accumulation in rats with secondary biliary fibrosis. Hepatology 25: 79-84
Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual. CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.
Janitz M, Heiser V, Boettcher U, Landt O, Lauster R (1998) Three alternatively spliced variants of the gene coding for the human bone morphogenetic protein-1. Journal of Molecular Medicine 76: 141-146
Jensen LT, Henriksen JH, Risteli J, Olesen HP, Nielsen MD, Lorenzen I (1989) Fate of circulating amino-terminal propeptide of type III procollagen in conscious pigs. American Journal of Physiology 265: R139-R145
Katayama K, Seyer JM, Raghow R, Kang AH (1991) Regulation of extracellular matrix production by chemically synthesized subfragments of type I collagen carboxy propeptide. Biochemistry 30: 7097-7104
Katayama K, Armendariz-Borunda J, Raghow R, Kang AH, Seyer JM (1993) A pentapeptide from type I procollagen promotes K, Seyer JM, Raghow R extracellular matrix production. Journal of Biological Chemistry 268: 9941-9944
Kauschke SG, Knorr A, Heke M, Kohlmeyer J, Schauer M, Theiss G, Waehler R, Burchardt ER (1999) Two assays for measuring fibrosis: RT-PCR of collagen alpha1 type III is an early predictor of subsequent collagen deposition while a novel N-terminal procollagen (III) propeptide assay reflects manifest fibrosis in CCl₄

-treated rats. Analytical Biochemistry 275: 131-140
Keene DR, Engvall E, Glanville RW (1988) Ultrastructure of type VI collagen in human skin and cartilage suggests an anchoring function for this filamentous network. Journal of Cell Biology 107: 1995-2006
Kessler E, Takahara K, Biniaminov L, Brusel M, Greenspan D (1996) Bone morphogenetic protein-1: The type I procollagen C-proteinase. Science 271: 360-362
Kühn K, Wiestner M, Krieg T, Müller PK (1982) Structure and function of the amino terminal propeptide of type I and III collagen. Connective Tissue Research 10: 43-50
Lee ST, Kessler E, Greenspan DS (1990) Analysis of site-directed mutations in human pro-alpha2(I) collagen which block cleavage by the C-proteinase. Journal of Biological Chemistry 265: 21992-21996
Lees JF, Bulleid NJ (1994) The role of cysteine residues in the folding and association of the COOH-terminal propeptide of types I and III procollagen. Journal of Biological Chemistry 269: 24354-24360.
Loidl HR, Brinker JM, May M, Pihlajaniemi T, Morrow S, Rosenbloom J, Myers C (1984) Molecular cloning and carboxyl-propeptide analysis of human type III procollagen. Nucleic Acids Research 12: 9383-9384
Ma X, Svegliati-Baroni G, Poniachik J, Baraona E, Lieber CS (1997) Collagen synthesis by liver stellate cells is released from its normal feedback regulation by acetaldehyde induced modification of the carboxyl-terminal propeptide of procollagen. Alcoholism: Clinical and Experimental Research 21: 1204-1211
Melkko J, Hellevik T, Risteli L, Risteli J, Smedsrød B (1994) Clearance of NH₂

-terminal propeptides of types I and III procollagen is a physiological function of the scavanger receptor in liver endothelial cells. Journal of Experimental Medicine 179: 405-412.
Paglia L, Wilczek J, de Leon LD, Martin GR, Hörlein D, Müller P (1979) Inhibition of procollagen cell-free synthesis by amino-terminal extension peptides. Biochemistry 18: 5030-5034.
Schuppan D (1991) Connective tissue polypeptides in serum as parameters to monitor antifibrotic treatment in hepatic fibrogenesis. Journal of Hepatology 13: S17-S25.
Smedsrød B (1988) Aminoterminal propeptide of type III procollagen is cleared from the circulation by receptor-mediated endocytosis in liver endothelial cells. Collagen Related Research 8: 375-388
Wu CH, Donovan CB, Wu GY (1986) Evidence for pretranslational regulation of collagen synthesis by procollagen propeptides, Journal of Biological Chemistry 261: 10482-10484
Zafarullah K, Brown EM, Kuivaniemi H, Tromp G, Sieron AL, Fertala A, Prockop DJ (1997) Synthesis and conformational properties of a recombinant C-propeptide of human type III procollagen. Matrix Biology 16: 201-209

Claims

1. Arzneimittel enthaltend

a) ein (Poly)peptid, das das N-terminale Procollagen(III)-Propeptid und/oder das C-terminale Procollagen(III)-Propeptid umfaßt oder
b) ein Fragment oder Derivat davon mit im wesentlichen der antifibrotischen Aktivität des (Poly)peptids (a) und/oder
c) ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen-C-Protease vom Typ III und/oder ein Peptid, das die Erkennungssequenz der Procollagen- N-Proteinase vom Typ III umfaßt,

in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei das (Poly)peptid oder Fragment oder Derivat und/oder das Peptid vom humanen Procollagen (III) stammt oder abgeleitet ist.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren N-terminal von der Spaltstelle umfaßt.

4. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das die Erkennungssequenz umfassende (Poly)peptid 10 bis 15 Aminosäuren C-terminal von der Spaltstelle umfaßt.

5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das (Poly)peptid ein Fusionsprotein ist.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei das (Poly)peptid einen His-Tag enthält.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6, wobei der His-Tag 6 His-Tag ist und N-terminal angefügt ist.

8. Verwendung eines (Poly)peptids oder Fragmentes oder Derivates davon, wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert, zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die fibrotischen Krankheiten ausgewählt sind aus systemischer oder lokaler Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z. B. alkoholischer Leberzirrhose, biliärer Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, der sogenannten "veno-occlusive disease", idiopathischen interstitiellen Fibrosen, idiopathischen Lungenfibrosen, akuten pulmonalen Fibrosen, dem "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskulären Fibrosen, perizentralen Fibrosen, Dermatofibromen, Nierenfibrosen, der diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloiden, der hypertrophen Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, der cystischen Fibrose, muskulären Fibrosen, der Duchenne'schen Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonaler Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen und Aneurysmen der großen Gefäße oder sind hervorgerufen oder initiiert durch chirurgische Narbenrevisionen, plastisch-chirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrosen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.

10. Verfahren zur Herstellung von renaturiertem N-terminalen Procollagen(III)- Propeptid und/oder C-terminalen Procollagen(III)-Propeptid, wobei man

a) nach üblichen Verfahren mit E. coli rekombinant hergestellte, das/die Propeptid(e) enthaltende Einschlußkörper in einem 0,5 bis 8 M denaturierenden Puffer löst;
b) den Puffer gemäß (a) einem Grenzverdünnungspuffer zutropft, der um einen neutralen pH-Wert herumpuffert, L-Arginin in einer Endkonzentration von 200 bis 1000 mM und ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, bis ein Volumenverhältnis des denaturierenden Puffers zu Grenzverdünnungspuffer von höchstens 1 : 3 erreicht ist;
c) das Puffergemisch gemäß (b) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der L-Arginin in einer Endkonzentration von 50 bis 200 mM und ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert;
d) das Puffergemisch gemäß (c) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer, der ein Disulfidbrücken-reduzierendes gekoppeltes Redoxsystem enthält, dialysiert; und
e) das Puffergemisch gemäß (d) mindestens 2 Stunden gegen einen physiologischen Puffer dialysiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei dem Puffer in mindestens einem der Schritte (b) bis (d) ein Chelator zugesetzt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Redoxsystem Glutathion reduziert - Glutathion oxidiert ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei dem Puffer in mindestens einem der Schritte (b) bis (d) ein weiterer Proteasehemmstoff zugesetzt ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei dem Puffer in einem der Schritte (c) und/oder (d) ein Salz in einer Endkonzentration von etwa 10 mM zugesetzt ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei der denaturierende Puffer in Schritt (a) Harnstoff in einer Endkonzentration von 0,5 bis 8 M enthält.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei als Puffermittel Trizma- Base eingesetzt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 10, wobei man die Dialyseschritte bei etwa 4°C durchführt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei man in den Schritten (c) bis (e) gegen mindestens das 100-fache Dialysepuffervolumen dialysiert.

19. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei man das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 hergestellte renaturierte N- terminale Procollagen(III)-Propeptid und/oder C-terminale Procollagen(III)- Propeptid nach üblichen Verfahren einengt oder lyophilisiert und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel versetzt.

20. Verwendung eines N-terminalen Procollagen(III)-Propeptids und/oder eines C- terminalen Procollagen(III)-Propeptids, das nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18 hergestellt wurde, zur Behandlung oder Vorbeugung von fibrotischen Erkrankungen.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die fibrotischen Krankheiten ausgewählt sind aus systemischer oder lokaler Sklerodermie, Leberfibrosen unterschiedlichen Ursprungs, wie z. B. alkoholischer Leberzirrhose, biliärer Zirrhose, Hepatitiden viraler oder anderer Genese, der sogenannten "veno-occlusive disease", idiopathischen interstitiellen Fibrosen, idiopathischen Lungenfibrosen, akuten pulmonalen Fibrosen, dem "acute respiratory distress syndrome" (ARDS), perimuskulären Fibrosen, perizentralen Fibrosen, Dermatofibromen, Nierenfibrosen, der diabetische Nephropathie, Glomerulonephritiden, Keloiden, der hypertrophen Narbenbildung, Gelenkadhäsionen, Arthrosen, Myelofibrosen, Vernarbungen der Cornea, der cystischen Fibrose, muskulären Fibrosen, der Duchenne'schen Muskeldystrophie, Ösophagusstrikturen, Morbus Ormond, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atherosklerotische Veränderungen, pulmonafer Hypertonie, Angiopathien der Arterien und Venen und Aneurysmen der großen Gefäße oder sind hervorgerufen oder initiiert durch chirurgische Narbenrevisionen, plastisch-chirurgische Eingriffe, Glaukome, Kataraktfibrosen, Vernarbungen der Cornea, die sogenannte "graft versus host disease", chirurgische Eingriffe an Sehnen, Nerveneinklemmungssyndrome, die Dupuytren'sche Kontraktur, Adhäsionen infolge gynäkologischer Eingriffe, pelvische Adhäsionen, Infertilität, peridurale Fibrosen, Erkrankungen der Schilddrüse oder der Nebenschilddrüsen, durch metastatischen Knochenbefall, durch das multiple Myelom oder durch Restenosen.