CN102056619A - 产生和使用原胶原的方法 - Google Patents

Abstract

提供了促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的方法。该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的原胶原，从而在受试者中促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生。

Description

产生和使用原胶原的方法

发明领域和背景

本发明在其一些实施方案中涉及包括原胶原的组合物，及其在促进伤口愈合、治疗纤维化和促进血管发生中的用途。

哺乳动物身体起始愈合应答以预防威胁生命的出血和感染的快速应答已进行进化以确保存活，通常以受损组织的有效再生为代价。伤口愈合过程需要不同阶段，一些是顺次的，而其他的是伴随的。然而，所有阶段在受损组织部位处小心地配合，以再生具有正常功能性的组织。事件顺序涉及凝固、炎症、组织沉积(迁移和增殖)和最终组织重建。

在组织损伤时，血液从受损血管中释放，从而导致具有血小板陷入其内的血纤蛋白纤维网格形成。网格充当被募集的细胞朝向其和遍及其移动的支架。活化的血小板脱粒且释放趋化试剂，包括细胞因子和生长因子例如转化生长因子-β1(TGF-β1)，从而导致成纤维细胞和角质形成细胞的募集。在损伤后几天，通过沉积新胶原基质，成纤维细胞开始代替受损组织。胶原纤维在厚度中逐步增加，并且沿着伤口的应激线(stress line)排成一行。在正常瘢痕形成中，胶原纤维一般与表皮平行排列。通过肌成纤维细胞，这个新形成的肉芽组织最终组构且收缩成更致密的结构。

瘢痕通常由于伤口愈合应答的正常进展形成，并且由在愈合过程期间沉积的结缔组织组成。大多数瘢痕显示一定程度的异常组构(如皮肤瘢痕中可见)和结缔组织的量(如中枢神经系统瘢痕中可见)。然而，正常组织生产级联中的改变导致小于最佳的伤口愈合，伴随瘢痕形成组织的过量沉积，导致瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成，也称为纤维化。肥厚性瘢痕的特征在于过量胶原沉积，改变的胶原重建和收缩，并且不同于瘢痕疙瘩瘢痕之处在于它们限定在伤口部位的边界内。

转化生长因子-β1(TGF-β1)在这些愈合过程中起重要作用，并且已报告介导成纤维细胞转变为肌成纤维细胞。这个成纤维细胞亚型的特征在于α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达，并且与伤口收缩有关。TGF-β1通过上调原胶原的mRNA稳定性和表达来诱导胶原沉积。此外，它通过抑制基质金属蛋白酶(MMPs)表达，同时诱导组织金属蛋白酶(TIMPs)抑制剂表达来减少胶原降解率。

除MMP/TIPMP平衡外，胶原分子对此种酶促活性的可接近性也是决定胶原降解率中的重要因素。这种可接近性主要由胶原的组构状态(螺旋单体与组构成原纤维的单体比较)和胶原三股螺旋之间的交联程度决定。

I和III型胶原是原纤维形成性胶原，其构成大量皮细胞外基质。胶原作为原胶原前体合成，其中3个胶原多肽卷曲到彼此内，形成三股螺旋。这些螺旋随后在胶原原纤维生物合成的最后一个步骤时连接在一起。I型原胶原由2条α1胶原链和单条α2链组成。III型由3条α1链构成。

在所有纤维胶原分子中，3条多肽链由重复Gly-X-Y三联体构成，其中X和Y可以是任何氨基酸，但通常是亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸。原纤维形成性胶原的重要特征是它们作为包含球形N和C末端延伸前肽的前体原胶原合成。

每个原胶原分子在粗面内质网内由其3条组成成分多肽链装配。当多肽链共翻译地转运越过内质网膜时，在Gly-X-Y重复区内发生脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化。一旦多肽链完全转运到内质网的腔内，3条前α链就经由其C前肽结合以形成三聚分子，从而允许Gly-X-Y重复区在其C末端上形成成核点，确保链的正确排列。Gly-X-Y区随后以C至N方向折叠以形成三股螺旋。

C-前肽以及在较少程度上的N-前肽在其离开细胞的过程中维持原胶原可溶性[Bulleid等人，Biochem Soc Trans.2000；28(4)：350-3]。在原胶原分子分泌到细胞外基质后或在该过程中，前肽一般通过原胶原N和C蛋白酶切割，从而触发胶原分子自发自装配成原纤维[Hulmes，2002 J Struct Biol.137(1-2)：2-10]。

前肽通过原胶原N和C蛋白酶的去除急剧降低原胶原的可溶性，并且是起始胶原在37℃自装配成纤维所必需的。对于这个装配过程关键的是称为端肽的短的非三股螺旋肽，其是N和C末端前肽在用N/C蛋白酶消化后的残留部分。通过降低对于自装配所必需的临界浓度，这些肽作用于确保胶原分子在原纤维结构内经由其可交联醛的正确共价对准(Bulleid等人，2000，同上)。

迄今为止，动物衍生的胶原是用于医学应用的胶原的主要来源。动物纯化的胶原是完全加工的包含交联的端肽，这使得其高度不可溶。动物纯化的胶原的增溶作用一般使用提取法来实现，所述提取法涉及用蛋白水解酶例如胰蛋白酶蛋白水解去除端肽区，从而产生可以增溶的去端肽胶原(atelocollagen)(关于用于制备纯化的可溶性胶原的一般方法，参见美国专利号3,934,852；3,121,049；3,131,130；3,314,861；3,530,037；3,949,073；4,233,360和4,488,911)。去端肽胶原在生理条件下经历原纤维生成，以形成纤维。此种纤维是相对稳定的结构，对通过MMPs的蛋白水解有抵抗力。然而，这些纤维缺乏在原胶原中发现的分子结构域，其对于天然伤口愈合过程和胶原结构的天然形成是必需的。

如提及的，在伤口愈合过程期间正常组织生产级联中的改变可导致瘢痕形成组织的过量沉积，导致纤维化。

美国专利号6,448,278和其中的参考文献描述了用于治疗与未调节的胶原生产相关的各种医学状况的特异性原胶原C-蛋白酶(PCP)抑制剂，包括病理学纤维化或疤痕形成。

Zhang Y等人，1999，13(1)：51-4教导了通过施用血小板衍生的伤口愈合因子(PDWHF)直接刺激原胶原I(α1)基因表达。

Saggers等人，[Wounds 13(2)：66-71，2001]报告了从大鼠尾腱中分离的酸溶性胶原抑制在胶原包被的皿上生长的人皮成纤维细胞中的I和III型原胶原mRNA表达。促蛋白合成类固醇——氧雄龙，拮抗原胶原mRNA表达的此种胶原底物抑制。这些发现暗示氧雄龙可通过增加与类似于愈合伤口的胶原基质相关的成纤维细胞中的原胶原mRNA表达直接增强伤口愈合。

美国专利申请号20030199441和20050282737教导了用于治疗或预防纤维化疾病的药物。它们描述了具有抗纤维化活性的(多)肽应用，包括至少一种N末端原胶原(III)前肽和C末端原胶原(III)前肽、或(多)肽片段。

发明概述

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的方法，其包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的原胶原，从而促进受试者中的伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了原胶原用于促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的用途。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了制造物品，其包括包装材料，所述包装材料包装作为活性成分的原胶原和用于促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的试剂。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了药物组合物，其包括作为活性成分的原胶原和药学上可接受的载体。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了纯化原胶原的方法，该方法包括：

(a)提供原胶原制剂；和

(b)由原胶原制剂纯化原胶原。

根据本发明的一些实施方案，纯化通过选自下述的方法实现：凝胶过滤、盐析和阴离子交换层析。

根据本发明的一些实施方案，包装材料包括分别包装原胶原和用于促进伤口愈合和/或治疗纤维化的试剂的至少2个分开的容器。

根据本发明的一些实施方案，制造物品进一步包括关于在促进伤口愈合和/或治疗纤维化中使用的说明书。

根据本发明的一些实施方案，施用实现到包括伤口或纤维化组织的组织区域内。

根据本发明的一些实施方案，施用在成纤维细胞募集至伤口前实现。

根据本发明的一些实施方案，原胶原包括人原胶原。

根据本发明的一些实施方案，原胶原衍生自I型或III型胶原。

根据本发明的一些实施方案，原胶原在植物细胞中产生。

根据本发明的一些实施方案，原胶原可通过胶原酶降解。

根据本发明的一些实施方案，伤口涉及选自下述的纤维化状况：全身性或局部性硬皮病、肝纤维化、酒精性硬化、胆汁性肝硬化、肝炎、静脉闭塞性疾病、特发性间质性纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺纤维化、急性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、肌肉周(perimuscular)纤维化、中心周围纤维化、皮肤纤维瘤、肾纤维化、糖尿病肾病、肾小球肾炎、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、关节粘连、关节病、骨髓纤维化、角膜瘢痕形成、囊性纤维化、肌肉纤维化、杜兴氏(Duchenne′s)肌营养不良、食管狭窄、腹后(retroabdominal)瘢痕形成、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化改变、肺动脉高压、动脉和静脉血管病、大血管动脉瘤，或通过下述诱导或起始：瘢痕校正、整形外科、青光眼、白内障纤维化、角膜瘢痕形成、移植物抗宿主病、腱外科手术、神经受累(entrapment)、Dupuytren氏挛缩、OB/GYN粘连、骨盆粘连、硬膜外纤维化、甲状腺或甲状旁腺疾病、转移性骨病、多发性骨髓瘤和再狭窄。

根据本发明的一些实施方案，伤口是急性伤口。

根据本发明的一些实施方案，伤口是慢性伤口。

根据本发明的一些实施方案，伤口由糖尿病造成。

根据本发明的一些实施方案，伤口选自溃疡、灼伤和外科手术伤口。

根据本发明的一些实施方案，原胶原包括单体原胶原。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与由本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的方法和材料可以在本发明的实施方案的实践或测试中使用，但下文描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明性的，并且不预期必定是限制性的。

附图简述

专利或申请文件包含至少一个以彩色制成的附图。具有一个或多个彩色附图的这个专利或专利申请公开文本的拷贝将在申请和支付必要费用后由专利局提供。

本发明的一些实施方案在本文中仅作为例子参考附图进行描述。现在详细地具体参考附图，应强调所示细节作为例子且用于本发明的实施方案的举例说明讨论目的。在这方面，与附图一起进行的描述使得本发明的实施方案可以如何实践对于本领域技术人员是显而易见的。

在附图中：

图1A-D是用于产生本发明一些实施方案的烟草植物的DNA构建体的示意表示。

图2A-B是考马斯蓝染色的SDS PAGE(图2A)和蛋白质印迹分析(图2B)的图像，显示从CP A3-29转基因烟草植物(批次#CP C-18)逐步纯化原胶原。泳道代表在匀浆后-(泳道A)；在离心和用15％AMS饱和后(泳道B)；在离心和用25％AMS饱和后(泳道C)；和在25％AMS沉淀重悬浮后(泳道D)，从野生型(WT)或CP A3-29植物品系中分离的蛋白质样品。“M”指示其中装载分子量标记的泳道。

图3A-B是在8％SDS-PAGE上分离的阴离子交换级分#9-20的蛋白质印迹分析图像。标记为“浓缩的沉淀”的泳道与在10倍浓缩的25％硫酸铵沉淀内的蛋白质对应。标记为“总计”的泳道与在柱上分离前的蛋白质样品对应。

图4是包括原胶原的合并的阴离子交换级分的凝胶过滤层析谱。吸光度在226nm下测量。

图5A-B是在8％SDS-PAGE上分离的凝胶过滤级分的银染色剂图像。样品与分子量蛋白质标记(M)和先前未过滤的样品(总计)平行运行。上部箭标：原胶原α₁。下部箭标：原胶原α₂。

图6A-B是凝胶过滤级分的蛋白质印迹分析图像，其在8％SDS-PAGE上分离，并且与分子量蛋白质标记(M)和先前未过滤的样品(总计)平行运行。

图7A-B是在与蛋白质分子量标记(左泳道)平行运行的10倍浓缩步骤后，在级分3和4中的蛋白质分离后的instant blue染色的12％凝胶的扫描。图7B是图7A上部的放大。

图8是在乙醇沉淀透析和离心(spin down)后，AMS沉淀的含阴离子交换原胶原级分样品的instant blue染色的SDS-PAGE分离的扫描(泳道2)。泳道3包括通过0.2μm滤器过滤后的相同样品。泳道4-7用与泳道3中相同的样品装载，其在4℃下温育24小时(泳道4)或72小时(泳道5)后，在2个冷冻和融化循环后(泳道6)，或在冻干且于DDW中重悬浮后(泳道7)。

发明实施方案描述

本发明在其一些实施方案中涉及用于在伤口愈合和纤维化治疗中使用的组合物和方法。

应当理解本发明不一定使其应用限制于下述说明书中阐述或由实施例例示的细节。本发明能够具有其他实施方案或以各种方式实践或执行。

尽管胶原原纤维的形成是成年人中的形态发生以及伤口和骨折愈合所必需的，但纤维胶原ECM的过量形成引起一般群体中的许多发病。这些状况包括瘢痕疙瘩(过量皮肤瘢痕形成)，外科手术粘连和器官包括肺、肝和肾的深层纤维化。深层纤维化是特别不祥的，因为实质组织由基本上由纤维胶原ECM组成的瘢痕组织代替破坏了器官功能。

在将本发明付诸实施的时候，本发明人发现与纤维胶原形成鲜明对比，通过重组技术分离或来自动物组织的原胶原以及酸溶性去端肽胶原或含端肽胶原，可以有利地用于促进伤口愈合且预防瘢痕形成。

与胶原相比较，由于本文称为前肽的C和N末端延伸的存在，原胶原是非纤维性的高度可溶的物质。在成纤维细胞大量募集前，在伤口愈合过程中早期原胶原的供应提供了伤口部位中已存在的胶原酶的可容易获得的可溶性底物，从而导致趋化性胶原片段的产生，这又募集增强愈合过程的成纤维细胞。

此外，加入伤口部位的原胶原应由天然伤口愈合元件例如C-前肽蛋白酶和N-前肽蛋白酶容易地识别，从而产生含端肽胶原。含端肽胶原可以通过天然组织形成机制容易地掺入组织内，所述天然组织形成机制需要端肽区的存在，以产生正确组构的胶原沉积。在创伤组织中通过天然元件产生的含端肽胶原可能形成纤维定向更贴近地类似完整组织的组织，并且因此预防或减少瘢痕组织形成。此外，释放的N和C-前肽可能作用于调节原胶原的从头合成，从而预防纤维化和瘢痕形成。

因此，根据本发明的一个方面，提供了促进伤口愈合的方法。该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的原胶原，从而促进受试者中的伤口愈合。

如本文使用的，术语“伤口”泛指以多种方法中的任何一种(例如，来自长期卧床休息的褥疮、外伤诱导的伤口、外科手术相关的伤口等)起始且具有各种特征的，对于皮肤、皮下组织、骨和深部位器官或结缔组织的损伤。

如本文使用的，“伤口愈合”或“组织再生”指功能性组织的重构(例如，皮肤组织、骨组织或粘膜)，伴随能够危害组织功能性的纤维组织的最低限度存在或完全不存在。

其为本文教导主题的伤口的例子包括但不限于，青肿、擦伤、灼伤伤口、晒伤伤口、切开伤口、切除伤口、外科手术伤口、坏死性筋膜炎、溃疡、静脉停滞性溃疡、糖尿病性溃疡、褥疮、口疮性溃疡、瘢痕、斑秃、皮炎、变应性接触性皮炎、特应性皮炎、香料皮炎、尿布皮炎、出汗障碍性皮炎、银屑病、湿疹、红斑、疣、肛门疣、血管瘤、樱桃状血管瘤、脚癣、非典型胎块、基底细胞癌、Bateman氏紫癜、大疱性类天疱疮、假丝酵母属、耳轮软骨皮炎、Clark氏痣、感冒疮、湿疣、囊肿、Darier氏病、皮肤纤维瘤、盘状红斑狼疮、钱币形湿疹、特应性湿疹、汗疱、手部湿疹、多形性结节红斑、Fordyce氏状况、项瘢痕疙瘩性毛囊炎、毛囊炎、环形肉芽肿、Grover氏病、热疹、单纯疱疹、带状疱疹(带状疱疹(shingles))、化脓性汗腺炎、荨麻疹、多汗症、鱼鳞癣、脓疱病、毛发角化病、瘢痕疙瘩、角化棘皮瘤、扁平苔癣、扁平苔癣样角化病、慢性单纯性苔癣、硬化性苔癣、淋巴瘤样丘疹病、皮肤狼疮、Lyme病、线状苔癣、粘液样囊肿、蕈样真菌病、触染性软疣、胎块、指甲真菌、糖尿病脂性渐进性坏死、钱币形皮炎、甲剥离、甲癣、苔癣样糠疹、玫瑰糠疹、毛发红糠疹、足底疣、毒常春藤、毒橡树、汗疱、须部假毛囊炎、肛门瘙痒和白色糠疹。

依赖于伤口深度，伤口一般分类为4个级别之一：(i)I级：限于上皮的伤口；(ii)II级：延伸到真皮内的伤口；(iii)III级：延伸到皮下组织内的伤口；和(iv)IV级，也称为全层(full-thickness)伤口：其中骨暴露的伤口(例如，骨压点例如大转子或骶骨)。

术语“部分皮层(partial thickness)伤口”在本文中用于指包括I-III级的伤口；部分皮层伤口的例子包括灼伤伤口、褥疮、静脉停滞性溃疡和糖尿病性溃疡。

术语“全层伤口”在本文中用于意欲包括III级和IV级伤口。

术语“慢性伤口”在本文中用于指已停止且在30天内仍未愈合的伤口。

如所述的，本发明的原胶原可以用于治疗骨中的伤口。然而，将认识到原胶原也可以用于治疗其他骨病症，包括但不限于骨质疏松症(包括闭经后骨质疏松症、男性和女性老年性骨质疏松症和皮质类固醇诱导的骨质疏松症)、骨关节炎、Paget氏病、骨软化、长时间卧床休息、肢体长期不用、食欲缺乏、微重力、外源和内源性生殖腺机能不全、骨折、不结合(non-union)、缺陷、假体植入等。

如背景部分中详细解释的，纤维化组织形成是伤口愈合的必备部分。然而，在一些情况下，在愈合过程期间或在具有纤维化状况或疾病的患者中，胶原生产可以在质量上改变或错误定位(mislocalize)至细胞外间隙。在此种疾病中，纤维化组织变得刚性、坚硬和无弹性。

因此，根据本发明的这个方面的进一步实施方案，提供了治疗纤维化的方法。

如本文使用的，术语“治疗”包括取消、基本上抑制、减慢或逆转状况的进展，基本上改善状况的临床或美学症状，或基本上预防状况的临床或美学症状出现。

如本文使用的，短语“与纤维化相关的医学状况”指起因于纤维化或其中在疾病或综合征进展过程中出现纤维化的医学状况。

纤维化疾病通过下述诱导或起始：瘢痕校正、整形外科、青光眼、白内障纤维化、角膜瘢痕形成、移植物抗宿主病、腱外科手术、神经受累、Dupuytren氏挛缩、OB/GYN粘连、骨盆粘连、不育、硬膜外纤维化、甲状腺或甲状旁腺疾病、转移性骨病、多发性骨髓瘤或再狭窄。

与纤维化相关的医学状况的具体例子包括但不限于，全身性或局部性硬皮病、各种病因学的肝纤维化、酒精性硬化例如酒精性肝硬化、胆汁性硬化、病毒或其他起源的肝炎、静脉闭塞性疾病、特发性间质性纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺纤维化、急性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、肌肉周纤维化、中心周围纤维化、皮肤纤维瘤、肾纤维化、糖尿病肾病、肾小球肾炎、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、关节粘连、关节病、骨髓纤维化、角膜瘢痕形成、囊性纤维化、肌肉纤维化、杜兴氏肌营养不良、食管狭窄、腹后瘢痕形成、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化改变、肺动脉高压、动脉和静脉血管病、大血管动脉瘤。

本发明的原胶原也可以用于促进血管发生(例如，在伤口部位处、在组织重建过程中、在缺血性中风、缺血性心脏病和胃肠道损害后)。

如本文使用的，术语“血管发生”指脉管例如起于血管发生的那种以及起于现有脉管、毛细血管和小静脉的分支和萌发的那些的从头形成。

如本文使用的，术语“原胶原”指包括N末端前肽、C末端前肽或两者的胶原分子(例如，人)。示例性人原胶原氨基酸序列由SEQ ID NOs：1、2、7、8和12和13显示。

原胶原可以包括任何原纤维形成性胶原(I、II、III、V和XI型)、网络形成性胶原(IV、VIII和X型)、与原纤维表面相关的胶原(IX、XII和XIV型)、作为跨膜蛋白质存在的胶原(XIII和XVII型)、或形成11-nm周期性串珠状丝的胶原(VI型)的多肽。根据本发明的这个方面的实施方案，原胶原包括I型胶原的α1和/或2链{例如，[α₁(I)]₂α₂(I)；[α₁(I)]₃)}或胶原(III)同三聚体[α₁(III)]₃。

根据本发明的这个方面的一些实施方案，原胶原以单体形式提供(由于前肽形成的位阻，并且本身是原胶原分子的固有性质)。

尽管胶原酶催化的原胶原片段的使用作为用于发信号的来源是有利的，但在尝试将成纤维细胞募集到特定组织或确立功能性组织构造时，基因修饰形式的原胶原的应用可以是优选的。更具体而言，胶原酶抗性胶原等对于此种目的可以是优选的[Wu等人，Proc Natl.Acad Sci，第87卷，第5888-5892页，1990]。

重组人原胶原可以在任何细胞中表达，包括但不限于原核细胞(例如，细菌)、植物细胞和其他真核细胞例如酵母和真菌，只要不对原胶原实施N和/或C蛋白酶活性。

原胶原在酵母中的重组合成已在美国专利号5,593,859中描述，所述美国专利在此整体引入作为参考。

原胶原在植物中的重组合成已在美国专利号6,617,431中描述，所述美国专利在此整体引入作为参考。

其中可以产生(即，表达)人原胶原的植物可以是任何低等(例如，藓类和藻类)或高等(维管)植物，并且可以包括组织或分离的细胞及其提取物(例如，细胞悬浮液的)。优选植物是能够累积大量胶原链、胶原和/或本文下文描述的底物结合酶的那些。此种植物也可以根据其对应激条件的抗性和可以提取所表达的组分或装配的胶原的容易程度进行选择。人原胶原可以在其中表达的植物的例子包括但不限于烟草、玉蜀黍、苜蓿、稻、马铃薯、大豆、番茄、小麦、大麦、低芥酸菜子、胡萝卜、莴苣和棉花。

重组人原胶原的生产一般通过用编码人原胶原的外源多核苷酸序列稳定或瞬时转化来实现。

编码人原胶原的示例性多核苷酸序列由SEQ ID NOs：3和4显示。

胶原的三股螺旋结构的稳定性要求通过脯氨酰-4-羟化酶(P4H)的脯氨酸羟基化，以在胶原链内形成羟脯氨酸残基。尽管植物能够合成含羟脯氨酸的蛋白质，但与哺乳动物P4H相比较，负责植物细胞中的羟脯氨酸合成的脯氨酰羟化酶显示出相对松散的底物序列特异性，并且因此，仅在Gly-X-Y三联体的Y位置上具有羟脯氨酸的胶原生产要求胶原和人或哺乳动物P4H基因的共表达。

因此，根据一个实施方案，原胶原在缺乏内源P4H活性的植物亚细胞区室中表达，以便避免其的不正确羟基化。如本文使用的，短语“缺乏内源P4H活性的亚细胞区室”指不包括植物P4H或具有植物样P4H活性的酶的细胞的任何区室化区域。根据一个实施方案，亚细胞区室是液泡。

所表达的原胶原在缺乏内源P4H活性的亚细胞区室中的累积可以经由几种方法中的任何一种来实现。

例如，所表达的原胶原可以包括用于将所表达的蛋白质靶向亚细胞区室例如质外体或细胞器(例如，叶绿体)的信号序列。合适信号序列的例子包括叶绿体转运肽(在Swiss-Prot条目P07689中包括，氨基酸1-57，SEQ ID NO：10)和线粒体转运肽(在Swiss-Prot条目P46643中包括，氨基酸1-28，SEQ ID NO：11)。

可替代地，当在植物中表达时，原胶原的序列可以以改变原胶原的细胞定位的方式进行修饰。

因此，本发明的一些实施方案预期能够使一条或多条原胶原α链正确羟基化[即仅使Gly-X-Y三联体的脯氨酸(Y)位置羟基化]的，共表达人原胶原和P4H的基因修饰细胞。P4H是由如Genbank号P07237和P13674中所示的2个亚单位α和β组成的酶。需要两者以形成活性酶，而β亚单位还具有蛋白伴侣和蛋白质二硫键异构酶功能。

由本发明基因修饰细胞表达的P4H优选是由例如SEQ ID NOs：5和6编码的人P4H。此外，还可以使用显示增强的底物特异性的P4H突变体，或P4H同源物。合适的P4H同源物通过由NCBI登记NP_179363鉴定的鼠耳芥氧化还原酶例示。

因为要求P4H与所表达的原胶原链共累积，所以其编码序列优选进行相应修饰(例如，通过例如用于液泡靶向的信号序列的添加或缺失)。

在哺乳动物细胞中，胶原还通过赖氨酰羟化酶、半乳糖基转移酶和葡糖基转移酶进行修饰。这些酶将在特定位置上的赖氨酰残基顺次修饰成羟赖氨酰、半乳糖基羟赖氨酰和葡糖基半乳糖基羟赖氨酰残基。如Genbank号O60568中所示的单种人酶赖氨酰羟化酶3(LH3)可以催化羟赖氨酸连接的碳水化合物形成中的所有3个连续步骤[Wang等人Matrix Biol.2002Nov；21(7)：559-66]。

因此，本发明的基因修饰细胞还可以表达哺乳动物LH3。LH3编码序列例如由SEQ ID NO：9显示的那种可以用于此种目的。

上文描述的一种或多种原胶原和修饰酶可以由稳定整合或瞬时表达的核酸构建体表达，所述核酸构建体包括编码位于功能性启动子转录控制下的原胶原α链和/或修饰酶(例如P4H和LH3)的多核苷酸序列。此种核酸构建体(本文也称为表达构建体)可以配置为用于遍及整个生物例如植物、限定的组织或限定的细胞、或在生物的限定发育阶段时表达。此种构建体也可以包括选择标记(例如，抗生素抗性)、增强子元件和用于细菌复制的复制起点。

将认识到包括2个可表达插入片段(例如，2个α原胶原链类型、或α链和P4H)的构建体优选包括用于每个插入片段的个别启动子，或备选地此种构建体可以表达包括来自单一启动子的2种插入片段序列的单一转录物嵌合体。在此种情况下，嵌合转录物可以包括在2个插入片段序列之间的IRES序列，从而使得下游插入片段可以由其翻译。

可以是组织特异性、发育特异性、组成型或诱导型的众多功能性表达启动子和增强子可以由本发明的构建体利用，一些例子在下文提供。

如本文在说明书中使用的，短语“植物启动子”或“启动子”包括可以指导在植物、真菌和酵母细胞(包括含DNA的细胞器)中的基因表达的启动子。此种启动子可以衍生自植物、细菌、病毒、真菌或动物起源。此种启动子可以是组成型的，即能够指导在多种组织中的高水平基因表达，组织特异性的，即能够指导在一种或多种特定组织中的基因表达，诱导型的，即能够指导在刺激下的基因表达，或嵌合的，即由至少2种不同启动子的部分形成。

因此，所采用的植物启动子可以是组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或嵌合启动子。

组成型启动子的例子包括但不限于，CaMV35S和CaMV19S启动子、FMV34S启动子、甘蔗杆状的杆状DNA病毒(badnavirus)启动子、CsVMV启动子、鼠耳芥ACT2/ACT8肌动蛋白启动子、鼠耳芥泛蛋白UBQ1启动子、大麦叶硫素BTH6启动子和稻肌动蛋白启动子。

组织特异性启动子的例子包括但不限于，豆菜豆蛋白贮藏蛋白启动子、DLEC启动子、PHS启动子、玉米醇溶蛋白贮藏蛋白启动子、来自大豆的羽扇豆球蛋白γ启动子、AT2S1基因启动子、来自鼠耳芥的ACT11肌动蛋白启动子、来自欧洲油菜(Brassica napus)的napA启动子和马铃薯patatin基因启动子。

诱导型启动子是通过特定刺激例如应激条件诱导的启动子，所述应激条件包括例如光、温度、化学制品、干旱、高盐度、渗透压休克、氧化条件或病原体相关应激，并且包括但不限于，衍生自豌豆rbcS基因的光诱导型启动子，来自苜蓿rbcS基因的启动子，在干旱中有活性的启动子DRE、MYC和MYB；在高盐度和渗透应激中有活性的启动子INT、INPS、prxEa、Ha hsp17.7G4和RD21，和在病原体应激中有活性的启动子hsr203J和str246C。

在本发明中利用的启动子应优选是强组成型启动子，从而使得在转化后实现构建体插入片段的超表达。

将认识到使用在每种构建体类型中的相同或不同选择标记，在本发明中使用的构建体类型中的任何一种都可以共转化到相同细胞内。可替代地，第一种构建体类型可以引入第一种生物例如植物内，而第二种构建体类型可以引入第二种等基因植物内，这之后可以使由此产生的转基因植物杂交，并且就双重转化体选择后代。可以利用此种后代的进一步自交以产生对2种构建体纯合的品系。

包含组成型或诱导型启动子的许多载体可以用于转化酵母细胞。关于综述，参见Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，1988，编辑Ausubel等人，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，第13章；Grant等人，1987，″Expression and Secretion Vectors for Yeast，″in Methodsin Enzymol.153：516-544；Glover，1986，DNA Cloning，第II卷，IRL Press，Wash.，D.C.，第3章；和Bitter，1987，″Heterologous Gene Expression inYeast，″in Methods in Enzymol.152：673-684。可以使用组成型酵母启动子例如ADH或Leu2，或者诱导型启动子例如GAL(″Cloning in Yeast，″第3章，R.Rothstein In：DNA Cloning，第11卷，A Practical Approach，Ed.D.M.Glover，1986，IRL Press，Wash.D.C.)。可替代地，可以使用促进外来DNA序列整合到酵母染色体内的载体。

存在将核酸构建体引入单子叶和双子叶植物内的各种方法(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42：205-225；Shimamoto等人，Nature(1989)338：274-276)。此种方法依赖于核酸构建体或其部分稳定整合到植物的基因组内，或依赖于核酸构建体的瞬时表达，在这种情况下，这些序列不由植物后代遗传。

此外，存在几种方法，其中核酸构建体可以直接引入含DNA的细胞器例如叶绿体的DNA内。

存在实现外源序列例如在本发明的核酸构建体内包括的那些稳定基因组整合到植物基因组内的2个基本方法：

(i)土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的基因转移：Klee等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38：467-486；Klee和Rogers in Cell Cultureand Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of PlantNuclear Genes，编辑Schell，J.和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第2-25页；Gatenby，in Plant Biotechnology，编辑Kung，S.和Arntzen，C.J.，Butterworth Publishers，Boston，Mass.(1989)第93-112页。

(ii)直接DNA摄取：Paszkowski等人，in Cell Culture and SomaticCell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes编辑Schell，J.和Vasil，L.K.，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第52-68页；包括关于DNA直接摄取到原生质体内的方法，Toriyama，K.等人(1988)Bio/Technology 6：1072-1074。通过植物细胞的短暂电休克诱导的DNA摄取：Zhang等人Plant Cell Rep.(1988)7：379-384.Fromm等人Nature(1986)319：791-793。通过粒子轰击将DNA注射到植物细胞或组织内，Klein等人Bio/Technology(1988)6：559-563；McCabe等人Bio/Technology(1988)6：923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79：206-209；通过使用微量移液管系统：Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.(1987)75：30-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79：213-217；或通过DNA与萌发花粉的直接温育，DeWet等人in Experimental Manipulation of Ovule Tissue，编辑Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)第197-209页；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：715-719。

土壤杆菌属系统包括质粒载体的使用，所述质粒载体包含整合到植物基因组DNA内的限定DNA区段。接种植物组织的方法依赖于植物物种和土壤杆菌属递送系统而改变。广泛使用的方法是叶盘程序，其可以用任何组织外植体执行，所述组织外植体提供用于起始全植物分化的良好来源(Horsch等人in Plant Molecular Biology Manual A5，KluwerAcademic Publishers，Dordrecht(1988)第1-9页)。补充方法采用与真空渗入组合的土壤杆菌属递送系统。土壤杆菌属系统在转基因双子叶植物生成中是特别可行的。

存在直接DNA转移到植物细胞内的各种方法。在电穿孔中，使原生质体短暂暴露于强电场。在显微注射中，使用非常小微量移液管，将DNA直接机械注射入细胞内。在微粒轰击中，使DNA吸附在微粒例如硫酸镁晶体、钨颗粒或金颗粒上，并且使微粒物理加速到细胞或植物组织内。

在转化后，执行植物繁殖。最常见的植物繁殖法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生具有下述缺陷：由于杂合性，在收成中缺乏均匀性，这是因为种子根据由孟德尔规则支配的遗传方差由植物产生。基本上，每粒种子在遗传上不同，并且每粒将伴随其自身特定性状而生长。因此，优选这样产生转化的植物，从而使得再生的植物具有亲本转基因植物的等同性状和特征。因此，优选转化的植物可以通过微繁殖(micropropagation)再生，这提供转化的植物的快速、一致生殖。

可以用于瞬时表达在本发明的核酸构建体内包括的分离核酸的瞬时表达法包括但不限于，如上所述但在有利于瞬时表达的条件下的显微注射和轰击，和病毒介导的表达，其中包括核酸构建体的包装或未包装的重组病毒载体用于感染植物组织或细胞，从而使得其中确立的繁殖重组病毒表达非病毒核酸序列。

已显示对于转化植物宿主有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒的植物转化在美国专利号4,855,237(BGV)、EP-A 67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)；和Gluzman，Y.等人，Communications in MolecularBiology：Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，第172-189页(1988)中描述。用于在许多宿主包括植物中表达外来DNA的假病毒粒子在WO 87/06261中描述。

用于在植物中引入和表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及Dawson，W.O.等人，Virology(1989)172：285-292；Takamatsu等人EMBO J.(1987)6：307-311；French等人Science(1986)231：1294-1297；和Takamatsu等人FEBS Letters(1990)269：73-76证实。

当病毒是DNA病毒时，构建可以对病毒自身进行。可替代地，病毒可以首先克隆到细菌质粒内用于容易用外来DNA构建所需病毒载体。病毒随后可以从质粒中切除。如果病毒是DNA病毒，那么细菌复制起点可以与病毒DNA附着，这随后通过细菌进行复制。这种DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白质，这将对病毒DNA包壳。如果病毒是RNA病毒，那么病毒一般作为cDNA克隆并且插入质粒内。质粒随后用于进行所有构建。RNA病毒随后通过下述来生产：转录质粒的病毒序列和病毒基因翻译以产生对病毒DNA包壳的一种或多种外壳蛋白质。

用于在植物中引入和表达非病毒外源核酸序列(例如本发明的构建体中包括的那些)的植物RNA病毒的构建通过上文参考文献以及在美国专利号5,316,931中证实。

用于将外源核酸序列引入叶绿体基因组的技术是已知的。这种技术涉及如下所述的程序。首先，为了将至少一种外源核酸分子引入叶绿体内，经由粒子轰击将外源核酸引入细胞内。这样选择外源核酸，从而使得它可经由同源重组整合到叶绿体的基因组内，这通过叶绿体固有的酶容易地实现。为此，除目的基因外，外源核酸还包括衍生自叶绿体的基因组的至少一个核酸序列段。此外，外源核酸包括选择标记，其通过顺次选择程序发挥作用，以确定在此种选择后叶绿体基因组的所有或基本上所有拷贝包括外源核酸。关于这种技术的更多细节在美国专利号4,945,050；和5,693,507中发现，所述美国专利号引入本文作为参考。多肽因此可以由叶绿体的蛋白质表达系统产生，并且变得整合到叶绿体的内膜内。

与用于转化的技术无关，一旦鉴定了表达原胶原的后代，此种植物就在使其表达达到最大的条件下进一步培养。通过使用核酸或蛋白质探针(例如抗体)通过验证外源mRNA和/或多肽的存在，可以选择起因于转化的植物的后代。后面一种方法使得能够定位所表达的多肽组分(通过例如探测分级分离的植物提取物)，并且因此也验证用于正确加工和装配的潜力。

在此种植物培养后，一般收获原胶原。优选在成熟时收获植物组织/细胞，并且使用本领域已知的任何生物化学法分离原胶原分子。

因此，本发明的实施方案进一步提供了纯化原胶原的方法。

该方法包括提供原胶原制剂且纯化原胶原。

原胶原可以使用本领域已知的任何方法(例如上文描述的那些)来产生。

原胶原可以使用本领域已知的任何蛋白质纯化技术进行完全纯化或部分纯化。这些方法一般基于大小、电荷或结合亲和力纯化。

根据一个实施方案，原胶原包括在含原胶原的组合物中，其中至少0.1％、至少0.25％、至少0.5％、至少1％、至少2.5％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％是原胶原。原胶原组合物中包括的其他组分可以包括但不限于胶原、透明质酸、藻酸盐、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、氧化纤维素、纤维素须晶和淀粉。

如本文使用的，“纯化”指从其天然环境或在重组宿主内的累积部位分离蛋白质。与小分子分离一般通过透析例如使用纤维素膜来实现。凝胶过滤层析一般用作更有区别力的技术。可替代地或另外地，使用例如用硫酸铵的盐析，所述硫酸铵一般用于蛋白质纯化例如以沉淀血纤蛋白原。再可替代地或另外地，离子交换层析用于基于净电荷分离原胶原。亲和层析是用于分离目的蛋白质的另一种有力方法。更具体而言，可以使用抗体或基于蛋白质对于特定化学基团的天然吸引力的亲和力结合法。

纯化或半纯化本发明的原胶原的示例性方法在下文实施例部分中详细描述。

与生产方法无关，一旦原胶原在手边，它就可以本身或在药物组合物中施用于受试者。

如本文使用的，“药物组合物”指本文描述的活性成分连同其他化学组分例如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进活性成分(例如，原胶原)施用于受试者。

如本文使用的，术语“活性成分”指可负责预期生物效应(即，促进伤口愈合和治疗纤维化)的原胶原。

在下文中，可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指这样的载体或稀释剂，其不对受试者引起显著刺激，并且不取消所施用的活性成分的生物活性和性质。佐剂包括在这些短语下。

此处，术语“赋形剂”指加入药物组合物中以进一步促进本发明的活性成分施用的惰性物质。

用于配制和施用药物的技术可以在引入本文作为参考的“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到。

药物组合物可以配制为单位剂型。在此种形式中，制剂再分成单位剂量，其包含例如用于单次施用的合适量活性成分。单位剂型可以是包装的制剂，含不连续制剂量的包装，例如粘着绷带、非粘着绷带、湿巾(wipe)、婴儿湿巾、纱布、垫和月经垫。

本发明的药物组合物可以以局部方式应用，例如经由将组合物直接施用到受试者的组织区域(例如伤口)上。药物组合物的合适施用途径可以例如包括局部(例如，至角质组织，例如皮肤、毛发、甲、头皮)、皮下、粘膜(例如，口、阴道、眼)、肌内施用。

本发明的药物组合物还可以经由注射包括活性成分和生理学上可接受的载体的组合物进行应用。对于局部施用，组合物可以注射到伤口和/或围绕创伤组织的健康组织(例如皮肤)内，或两者，例如皮下。

本发明的药物组合物可以通过本领域众所周知的方法进行制造，例如借助于常规混合、溶解、粒化、锭剂制备、磨细、乳化、胶囊化、截留或冻干方法。

活性成分也可以为粉末形式，用于在使用前由合适媒介物，例如基于无菌、无致热原水的溶液构建。

用于依照本发明使用的药物组合物因此可以以常规方式进行配制，其中使用一种或多种生理学上可接受的载体，包括赋形剂和助剂，其促进活性成分加工成制剂。正确配制依赖于所选择的施用方法。

治疗有效量的测定完全在本领域技术人员的能力内，特别是按照本文提供的详细公开内容。治疗可以在大量瘢痕组织形成前实现，例如在成纤维细胞募集至受累位点前。然而，本发明还设想了在愈合的任何其他阶段施用原胶原。

对于在本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初由体外测定估计。此外，剂量可以在组织培养系统或动物模型中配制，以达到所需浓度或滴度。可以使用动物模型，以确立用于施用的标准。例如，可以使用糖尿病大鼠或小鼠创伤模型[Galeano等人，Diabetes.(2004)53(9)：2509-17]。可以采用结果测量例如灌注和存活以及组织学和功能标准，以评估不同参数的功效，以接近最佳效率。

此种信息可以用于更精确地测定在人中有用的剂量。

本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过标准药学程序在体外、在细胞培养或实验动物中进行测定。得自这些体外以及细胞培养测定和动物研究的数据可以用于配制用于在人中使用的剂量范围。剂量可以依赖于采用的制剂类型和利用的施用途径而改变。确切制剂、施用途径和剂量可以通过个别医生考虑到患者的状况进行选择(参见例如Fingl，E.等人(1975)，″The Pharmacological Basis of Therapeutics，″第1章，第1页。)。

依赖于状况的严重程度(例如，伤口或瘢痕面积、深度和程度)和皮肤的应答性，给药可以是单次或多次施用，其中治疗过程范围从几天到几周或直至实现治愈或达到状况减少。在示例性实施方案中，本发明的药物组合物每天至少施用1次。

待施用的组合物量当然将依赖于待治疗的受试者、痛苦严重程度、施用方式、开处方医生的判断等。

若需要，则本发明的组合物可以在包装或分配器设备例如FDA批准的试剂盒中呈现，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如泡罩包装(blister pack)。包装或分配器设备可以伴随施用说明书。包装或分配器设备还可以伴随由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定形式的通告，这反映组合物形式由机构批准用于人或兽医学施用。例如，此种通告可以包括由美国食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准用于处方药物的标签或批准的产品插页。也可以制备包括在药学上可接受的载体中配制的本发明制剂的组合物，置于合适容器中，并且标记用于治疗所示状况，如上文进一步详述的。

因为本发明的药物组合物在体内利用，所以组合物优选具有高纯度且基本上不含潜在有害的污染物，例如至少国家食品(National Food)(NF)级别，一般至少分析级别，且优选至少药物级别。就给定化合物必须在使用前合成而言，此种合成或后续纯化应优选导致这样的产物，其基本上不含任何潜在污染性毒性试剂，所述毒性试剂可能已在合成或纯化程序过程中使用。

为了改善治疗功效，可以将另外试剂掺入本发明的药物组合物内。用于促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的试剂可以连同原胶原一起配制在单一组合物中(例如，单个容器)，或需要时，在分开容器中包装并且包括在制造物品中，所述制造物品可以进一步包括使用说明书。此种试剂包括但不限于，细胞外基质组分(例如，玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白)、生长因子(例如FGF 1、FGF 2、IGF 1、IGF 2、PDGF、EGF、KGF、HGF、VEGF、SDF-1、GM-CSF、CSF、G-CSF、TGFα、TGFβ、NGF、PDWHF和ECGF)、低氧诱导因子(例如HIF-1α和β和HIF-2)、激素(例如胰岛素、生长激素(GH)、CRH、瘦蛋白、促乳素、氧雄龙和TSH)、血管生成因子(例如血管生成素和血管形成素(angiopoietin))、凝固和抗凝因子(例如因子I、因子XIII、组织因子、钙、vWF、C蛋白、S蛋白、Z蛋白、纤连蛋白、抗凝血酶、肝素、纤溶酶原、低分子量肝素(Clixan)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、尿激酶、血栓调节蛋白、组织纤溶酶原激活物(tPA)、α2-抗纤溶酶和Z蛋白相关蛋白酶抑制剂(ZPI))、细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IFN-α、IFN、β和IFN-γ)、骨形态发生蛋白(BMPs)、趋化因子(例如MCP-1或CCL2)、酶(例如内切糖苷酶、外切糖苷酶、内切核酸酶、外切核酸酶、肽酶、脂肪酶、氧化酶、脱羧酶、水化酶、软骨素酶、软骨素酶ABC、软骨素酶AC、透明质酸酶、角质素酶(keratanase)、类肝素酶(heparanase)、类肝素酶剪接变异、胶原酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶)、神经递质(例如乙酰胆碱和单胺)、神经肽(例如P物质)、维生素(例如D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、钙盐、吡哆醛HCl、吡哆醇(Pyrodixine)HCl、核黄素、硫胺素HCl、维生素B12、维生素E、维生素C、维生素D、维生素B1-6、维生素K、维生素A和维生素PP)、碳水化合物(例如单/二/多糖包括葡萄糖、甘露糖、麦芽糖和果糖)、离子、螯合剂(例如Fe螯合剂、Ca螯合剂)、抗氧化剂(例如维生素E、槲皮素(Quarcetin)、超氧化物清除剂、超氧化物歧化酶、H₂O₂清除剂、自由基清除剂、Fe清除剂)、脂肪酸(例如甘油三酯、磷脂、胆固醇、游离脂肪酸和非游离脂肪酸、脂肪醇、亚油酸、油酸和硫辛酸)、抗生素(例如，青霉素、头孢菌素和四环素)、止痛剂、麻醉剂、抗细菌剂、抗酵母剂、抗真菌剂、抗病毒剂、益生试剂、抗原虫(anti-protozal)剂、止痒剂、抗皮炎试剂、止吐药、消炎药、抗过度角化(anti-hyperkeratolyic)剂、止汗剂、抗银屑病药、抗皮脂溢剂、抗组胺剂、氨基酸(例如必需和非必需的，特别是谷氨酰胺和精氨酸)、硫酸盐(例如硫酸钙)、类固醇(例如雄激素、雌激素、孕激素、糖皮质激素和盐皮质激素)、儿茶酚胺(例如肾上腺素和去甲肾上腺素)、核苷和核苷酸(例如嘌呤和嘧啶)、前列腺素(例如前列腺素E2)、白三烯(Leucotriens)、促红细胞生成素(例如血小板生成素)、蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素、硫酸角质素)、羟磷灰石(例如羟磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂))、触珠蛋白(Hp1-1、Hp2-2和Hp1-2)、超氧化物歧化酶(例如SOD 1/2/3)、氧化氮、氧化氮供体(例如硝普盐，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA，谷胱甘肽过氧化物酶、水合化合物(例如血管加压素)、细胞(例如血小板)、细胞培养基(例如M199、DMEM/F12、RPMI、Iscovs)、血清(例如人血清、胎小牛血清(fetal calf serum)、胎牛血清)、缓冲液(例如HEPES、碳酸氢钠)、去污剂(例如Tween)、消毒剂、草药、水果提取物、蔬菜提取物(例如甘蓝、黄瓜)、花提取物、植物提取物、黄酮类化合物(flavinoids)(例如石榴汁)、香料、叶(例如绿茶、春黄菊)、多酚(例如红酒)、蜂蜜、凝集素、微粒、纳米颗粒(nanoparticles)(脂质体)、微团、碳酸钙(CaCO₃、例如沉淀的碳酸钙、研磨/粉碎的碳酸钙、albacar、PCC、GCC)、方解石、石灰石、碾碎的大理石、研磨的石灰石、石灰和白垩(例如白粉笔、香槟白垩(Champagne chalk)、滑石粉)。

本发明的组合物还可以包含这样的成分、物质、要素和材料，其包含氢、烷基、芳基、卤基团、羟基、烷氧基、烷氨基、二烷基氨基、酰基、羧基、氨甲酰(carboamido)基、氨磺酰基、氨酰基、酰胺基、胺基、硝基、有机硒化合物、烃和环烃。

本发明的组合物可以与下述物质组合：例如过氧化苯甲酰(benzolperoxide)、血管收缩剂、血管舒张药、水杨酸、视黄酸、壬二酸、乳酸、乙醇酸、pyreuric acid、丹宁、苯亚甲基樟脑(benzlidenecamphor)及其衍生物、alphahydroxyis、表面活性剂。

本发明的上些实施方案的组合物可以与聚乙二醇(例如PEG、SE-PEG)生物缀合(bioconjugate)，这保存活性成分的稳定性(例如，针对蛋白酶活性)和/或可溶性(例如，在生物流体例如血液、消化液内)，同时保存其生物活性且延长其半衰期。

本发明的组合物可以配制为腻子(putty)、软膏、吸入剂、织物/无纺垫、绷带、海绵、凝胶或水凝胶、(与例如明胶(gellatine)、透明质酸一起配制)或基于聚丙烯酸酯或油凝胶(例如由水和Eucerin制成)。

包括水和脂肪相的油凝胶特别基于Eucerinum anhydricum，羊毛蜡醇和石蜡的基底，其中水和基底的百分比可以改变。此外，可以加入用于影响稠度的另外亲脂组分，例如甘油、不同链长的聚乙二醇例如PEG400、植物油例如杏仁油、液体石蜡、中性油等。本发明的水凝胶可以通过使用胶凝剂和水进行生产，其中第一种尤其选自天然产物例如纤维素衍生物，例如纤维素酯和醚，例如羟乙基羟丙基衍生物，例如纤基乙酸钠(tylose)，或也选自合成产物例如聚丙烯酸衍生物，例如卡波泊尔或卡波姆例如P934、P940、P941。它们可以基于已知规则通过加入用于凝胶形成的基质由醇悬浮液进行生产或聚合。

凝胶中的原胶原的示例性量包括0.01-30g/100g凝胶、0.01-10g/100g凝胶、0.01-8g/100g凝胶、0.1-5g/100g凝胶。

此外，本发明的这个方面的药物组合物还包括皮肤病学上可接受的载体。

短语“皮肤病学上可接受的载体”指这样的载体，其适合于局部应用到皮肤即角质组织上，具有良好的美学性质，与本发明的活性剂和任何其他组分相容，并且对于在哺乳动物中使用是安全和无毒的。

为了增强活性剂的经皮吸收，许多试剂中的一种或多种可以加入药物组合物中，包括但不限于二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性剂、氮酮、醇、丙酮、丙二醇和聚乙二醇。

本发明的组合物中利用的载体可以为广泛多样的形式。这些包括乳剂载体，包括但不限于，水包油、油包水、水包油包水和聚硅氧烷包水包油乳剂、乳膏、软膏、水溶液、洗剂、皂、糊剂、乳剂、凝胶、喷雾剂、泡沫或气溶胶。如技术人员将理解的，依赖于组分在组合物中的水溶性/分散性，给定组分将主要分配到水或油/聚硅氧烷相内。

根据本发明的乳剂一般包含药学有效量的本文公开的试剂和脂质或油。脂质和油可以衍生自动物、植物或石油，并且可以是天然或合成的(即，人造的)。合适乳剂的例子在例如1973年8月28日授予Dickert等人的美国专利号3,755,560；1983年12月20日授予Dixon等人的美国专利号4,421,769；和McCutcheon′s Detergents and Emulsifiers，NorthAmerican Edition，pages 317-324(1986)中描述，其各自完全整体引入作为参考。

乳剂还可以包含防泡剂，以使在应用于角质组织后的发泡降到最低。防泡剂包括高分子量聚硅氧烷和本领域众所周知用于此种用途的其他材料。

依赖于所需产物形式，合适乳剂可以具有广泛范围的粘度。

包括水包油乳剂的合适载体的例子在1991年12月17日授予Turner，D.J.等人的美国专利号5,073,371，和1991年12月17日授予Turner，D.J.等人的美国专利号5,073,372中描述，其各自完全整体引入作为参考。包含结构化试剂(structuring agent)、亲水表面活性剂和水的特别优选的水包油乳剂在下文详细描述。

优选的水包油乳剂包括结构化试剂，以帮助形成液体结晶凝胶网络结构。不受理论束缚，认为结构化试剂帮助给组合物提供有助于组合物稳定性的流变特征。结构化试剂还可以充当乳化剂或表面活性剂。

广泛多样的阴离子表面活性剂在本文中也是有用的。参见例如1975年12月30日授予Laughlin等人的美国专利号3,929,678，其完全整体引入作为参考。此外，两性和两性离子表面活性剂在本文中也是有用的。

本发明的药物组合物可以以由药学或化妆品工业为皮肤应用而利用的多种形式中的任何一种进行配制，包括溶液、洗剂、喷雾剂、乳膏、软膏、油膏剂、凝胶、油、洗液(wash)等，如下所述。

本发明的药物或化妆品组合物可以配制为足够粘性的，以便保留在处理的皮肤区域上，不容易蒸发，和/或不易于通过用水漂洗而去除，但是可借助于皂、清洁剂和/或洗发剂去除。

用于制备具有此种性质的组合物的方法是本领域技术人员众所周知的，并且在Remington′s Pharmaceutical Sciences，1990(同上)；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第6版，Williams&Wilkins(1995)中详细描述。

本发明的局部组合物包括但不限于洗剂和乳膏，可以包括皮肤病学上可接受的润滑药。如本文使用的，“润滑药”指对于预防或减轻干燥以及用于保护皮肤有用的材料。广泛多样的合适润滑药是已知的，并且可以在本文中使用。参见例如，Sagarin，Cosmetics，Science and Technology，第2版，第1卷，第3243页(1972)，其包含作为润滑药适合的材料的众多例子并且完全引入本文作为参考。优选润滑药是甘油。

根据本发明的洗剂和乳膏一般包括溶液载体系统和一种或多种润滑药。

本发明的局部应用的药物或化妆品组合物还可以包括另外组分，其被加入例如以使药物或化妆品组合物富含香料(fragrance)和皮肤营养因子。

选择在合理医学判断范围内的此种组分，其适合于在人角质组织上使用，而不诱导毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等。此外，此种任选组分是有用的，只要它不会不可接受地改变本发明的活性化合物的利益。

CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，第二版(1992)描述了在皮肤护理工业中常用的广泛多样的非限制性化妆品成分，其适合于在本发明的组合物中使用。这些成分类别的例子包括：磨料、吸收剂、美学组分例如香料、色素、着色剂/颜料、精油、皮肤感觉剂(sensates)、收敛剂等(例如丁子香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁子香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅蒸馏物)、抗痤疮剂、消结块剂、防泡剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲酸碘丙酯)、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、膨胀剂、螯合剂、化学添加剂、颜料、化妆品收敛剂、化妆品杀生物剂、变性剂、药物收敛剂、外部止痛剂、成膜剂或材料例如聚合物，用于辅助组合物的成膜性质和直接性(例如，二十碳烯和乙烯吡咯烷酮的共聚物)、不透明剂、pH调节剂、推进剂、还原剂、多价螯合剂、皮肤调节剂(例如，湿润剂，包括混杂和闭塞的)、皮肤光滑和/或愈合试剂(例如泛醇和衍生物，例如乙基泛醇)、羊角掌(aloe vera)、泛酸及其衍生物、尿囊素、红没药醇和甘草酸二钾(dipotassium glycyffhizinate)、皮肤处理剂、增稠剂和维生素及其衍生物。

将认识到本发明的原胶原可以掺入由化妆品公司已开发或正在开发的产物内，所述化妆品公司包括但不限于Estee Lauder、HelenaRubinstein和L′Oreal。

本发明的药物或化妆品组合物可以直接应用于皮肤。可替代地，它可以通过各种经皮药物递送系统经由正常皮肤应用递送，所述经皮药物递送系统是本领域已知的，例如以时间释放方式将组合物释放到皮肤内的经皮贴剂。本领域已知的其他药物递送系统包括加压气溶胶瓶、离子电渗疗法或超声透入作用(sonophoresis)。离子电渗疗法用于增加皮肤通透性且促进经皮递送。美国专利号5,667,487和5,658,247公开了适合于超声离子电渗疗法介导的治疗剂越过皮肤转运的离子电渗超声(ionosonic)仪器。可替代地或另外地，脂质体或微团也可以用作递送媒介物。

因为伤口和缺血可能使头皮卷入其中，所以本发明的药物组合物进一步包括润滑药、表面活性剂和/或调节剂，其适合于在头皮皮肤和毛发上使用。

润滑药包括但不限于烃油和蜡，例如矿物油、矿脂等，植物和动物油和脂肪，例如橄榄油、棕榈油、蓖麻油、玉米油、大豆油等，和羊毛脂及其衍生物，例如羊毛脂、羊毛脂油、羊毛脂蜡、羊毛脂醇等。其他润滑药包括具有10-20个碳原子的脂肪酸例如包括肉豆蔻酸、硬脂酸、异硬脂酸、棕榈酸等的酯，例如肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸丙酯、肉豆蔻酸丁酯、硬脂酸丙酯、异硬脂酸丙酯、棕榈酸丙酯等。其他润滑药包括具有10-20个碳原子的脂肪酸，包括硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、异硬脂酸、棕榈酸等。润滑药还包括具有10-20个碳原子的脂肪醇，例如鲸蜡醇、肉豆蔻醇、月桂醇、异十八烷醇、十八烷醇等。

当配制用于在毛发上使用的本发明的药物组合物时，优选利用乳化剂/表面活性剂。

表面活性剂的例子包括但不限于，具有可用于缩合的游离活性氢的疏水烷基、烯或烷基芳族官能团与亲水环氧烷、聚环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷、聚环氧乙烷或聚乙二醇的聚氧化烯氧化物(spolyoxyalkyleneoxide)缩合产物。特别有效的是由Rohm&Haas Company在其商标TRITON

系列产物下销售的，辛基酚与～7至～13摩尔环氧乙烷的缩合产物。

其他成分例如香料、稳定剂、染料、抗微生物剂、抗细菌剂、抗附聚物(antiagglomerates)、紫外线辐射吸收剂等，也包括在配制用于在毛发上使用的本发明的组合物中。

还优选利用对于酸水解稳定的调节剂试剂，例如具有至少一个季铵部分连同乙氧基化monoquat的聚硅氧烷化合物，以稳定和任选增稠配制用于在毛发上使用的本发明的组合物。

还可以包括任选的增稠剂，以改善组合物美学且促进组合物应用于毛发。示例性增稠剂是甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基乙基纤维素和羟乙基纤维素、二(氢化牛脂基)苯二甲酸酰胺、交联马来酐-甲基乙烯基醚共聚物、瓜耳胶、黄原胶和阿拉伯树胶。

调节组合物的载体占优势地是水，但也可以包括有机溶剂，以促进组合物的制造或提供美学性质，例如粘度控制。合适溶剂包括低级醇如乙醇和异丙醇；乙二醇醚，如2-丁氧基乙醇、乙二醇一乙基醚、丙二醇和二乙二醇一乙基醚或一甲基醚及其混合物。可以在不透明调节剂中使用的非限制性调节试剂包括：硬脂酰三甲基氯化铵；二十二烷基三甲基氯化铵；十六烷基三甲基溴化铵；豆油基三甲基氯化铵；牛油基三甲基氯化铵；二氢化牛油基二甲基氯化铵；二十二烷基三甲基甲硫酸铵；Peg-2油基甲基氯化铵；二氢化牛油基二甲基溴化铵；二氢化牛油基二甲基甲硫酸铵；十六烷基三甲基氯化铵；氢化牛油基三甲基氯化铵；氢化牛油基三甲基溴化铵；双十六烷基二甲基氯化铵；二硬脂基二甲基氯化铵；二棕榈基二甲基氯化铵；氢化牛油基三甲基甲硫酸铵；十六烷基三甲基甲苯磺酸铵；二十烷基三甲基氯化铵和二牛油基二甲基氯化铵。

洗发剂制剂有时对于治疗头皮皮肤状况(例如损害、银屑病)是有利的。

需要时，本发明的毛发洗发剂组合物可以以选自下述的任何形式提供：液体、粉末、凝胶和颗粒剂。使用水或低级醇作为溶剂的液体组合物是优选的，其中使用水的液体组合物是尤其优选的。可以根据本发明的教导使用的洗发剂组合物在美国专利号6194363和美国专利号6007802中进一步描述。

将认识到本发明的原胶原可以掺入基于生物相容和/或生物可降解的聚合物的基质内，包括片、薄膜、膜海绵和凝胶。

原胶原可以吸收或被囊化到基于生物相容性聚合物的基质内，或可替代地，通过暴露于紫外线辐射、脱水加热(dehydrothermal)(DHT)技术或经由化学试剂例如零长度1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)交联剂，与此种构建体主动交联(Cornwell KG等人，Biomed Mater Res A.2007 Feb；80(2)：362-71)。本发明的原胶原可以如何掺入胶原基质内的详细规程在本文下文实施例2中提供。

本发明的原胶原可以包括在生物可降解的无细胞基质组分中。无细胞基质组分一般履行结构作用。例如，它可以填充在组织中的缺陷、洞、间隙或腔，并且提供其中注射或植入的细胞可以与基质或周围组织粘附的环境，并且生长且产生起因于新组织生长的其他因子(例如，趋化因子)。在许多情况下，基质的缺口填充功能是暂时的，并且仅持续直至植入的和/或宿主细胞迁移到区域内且形成新组织。优选地，无细胞基质是生物可降解的。基质优选是在生理条件下不溶性的固体或半固体物质。此种组合物适合于注射或植入受试者内，以修复已变性的组织。

如本文使用的，术语“生物可降解的”指并非生物学有害且可以由天然效应物(例如天气、土壤细菌、植物或动物)化学降解或分解的组合物。可以在本发明中使用的基质的例子包括但不限于，包含自体和非自体蛋白质的无细胞基质，和包含生物可降解聚合物的无细胞基质。

本发明的原胶原可以掺入包含非自体蛋白质的许多生物可降解的无细胞基质中的任何一种内。生物可降解的无细胞基质的例子包括这样的基质，其包含任何类型胶原(例如，牛、猪、人或生物工程改造的胶原)，或具有与例如戊二醛交联的糖胺聚糖(GAG)的任何类型胶原。含胶原基质包括但不限于，可吸收的胶原海绵、胶原膜和骨松质。有用类型的胶原包括例如牛胶原、猪胶原、海洋胶原、人尸体胶原生物工程改造的胶原和自体人胶原。

可吸收的胶原海绵可以购自例如Sulzer Calcitek，Inc.(Carlsbad，Calif.)。在名称COLLATAPE^TM、COLLACOTE^TM和COLLAPLUG^TM下销售的这些胶原海绵敷料由从牛深屈肌(Achilles)腱中提取的交联胶原和GAG制备。这些产物是柔软、柔韧、非易碎和无致热原的。超过90％的胶原海绵一般由开孔组成。

原胶原可以掺入其中的生物可降解的无细胞基质可以包含形成例如薄膜的胶原(例如牛或猪胶原I型)。一种此种膜由Sulzer Calcitek制造，并且作为BIOMEND^TM出售。另一种此种膜基质作为BIO-GIDE^TM由Geistlich Sohne AG(Wolhusen，瑞士)出售，并且由猪I型和III型胶原制成。BIO-GIDE^TM具有双层结构，具有多孔且允许细胞向内生长的一个表面，和致密且阻止纤维组织向内生长的第二个表面。

本发明的原胶原可以掺入其中的其他合适的含胶原基质包括由NeuCell，Inc.(Campbell，Calif.)制造的COLLAGRAFT^TM，和由WrightMedical Technology(Arlington，Tenn.)销售的OSTEOSET^TM硫酸钙α半水合物丸。

本发明的原胶原也可以掺入其中的生物可降解的无细胞基质还可以由形成颗粒或块的骨松质制备。这种材料由动物(例如人、非人灵长类动物、牛、绵羊、猪或山羊)骨组成，基本上所有有机材料(例如蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物和小有机分子例如维生素和非蛋白质激素)已从所述骨中去除。这类基质在本文中被称为“无机基质”。作为BIO-OSS^TM松质颗粒和BIO-OSS^TM块出售的一种此种基质由GeistlichSohne AG制造。这个公司还制造块型基质(BIO-OSS^TM胶原)，其包含无机骨且另外包含约10重量％胶原纤维。

脱矿质骨可以与本发明的原胶原组合，以产生以海绵、块或膜形式的基质。由脱矿质人骨制备的示例性基质例如形成小块，并且作为DYNAGRAFT^TM由GenSci Regeneration Laboratories，Inc.(Toronto，Ontario，加拿大)，作为TUTOPLAST^TM由Tutogen Medical，Inc.(Clifton，N.J.)，或作为GRAFTON^TM脱矿质骨基质(Demineralized Bone Matrix)由Osteotech，Inc.(Eatontown，N.J.)出售。原胶原可以掺入其中的其他有用的生物可降解的无细胞基质是包含明胶、肠线、无机骨、珊瑚、糖胺聚糖例如粘多糖或透明质酸或羟磷灰石，或这些物质的混合物的那些。

此外，由一种或多种单体制备的合成聚合物可以用于制备本发明的原胶原可以掺入其中的生物可降解的无细胞基质。此种合成聚合物包括例如聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、和聚(乙醇酸)-聚(乳酸)。合成聚合物也可以与上述物质中的任何一种组合，以形成基质。形成单一基质的不同聚合物可以在分开的区室或层中。例如，W.L.Gore&Associates，Inc.(Flagstaff，Ariz.)制造了多孔生物可降解的无细胞基质(GORERESOLUT XT Regenerative Material)。这种基质由合成的生物可吸收的乙交酯和三亚甲基碳酸酯共聚物纤维组成，细胞可以迁移到其内，与由合成的生物可吸收的乙交酯和丙交酯共聚物构成的封闭膜附着，其不允许细胞向内生长。合适生物可降解基质的其他例子可以例如在美国专利号5,885,829中找到。

将认识到本发明的原胶原可以掺入其中的基质可以用本领域已知的一种或多种附着分子包被，以便增强细胞与生物可降解的无细胞基质附着的能力。这些附着分子包括天然分子(例如，细胞外基质因子例如层粘连蛋白和纤连蛋白)和合成分子(例如包含纤连蛋白和/或层粘连蛋白的结合位点的肽)。有用试剂的例子是但不限于基底膜组分、明胶、阿拉伯树胶、I XII型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、巢蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖及其混合物。其他合适的附着分子包括简单糖、复合糖、脱唾液酸糖蛋白、凝集素、生长因子、低密度脂蛋白、肝素、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、凝血酶、玻连蛋白和血纤蛋白原。附着分子的用途和用于使其与生物可降解的无细胞基质连接的方法在美国专利号6,095,148中描述。

本发明的原胶原也可以包括在生物可降解的无细胞填料材料(即膨胀剂)中。此种组合物可以适合于注射入受试者内，以修复已变性的组织。填料材料一般履行结构功能。例如，它可以填充在组织中的缺陷、洞、间隙或腔，并且提供其中注射的细胞可以与周围组织粘附的环境，并且生长且产生起因于新组织生长的其他因子(例如，趋化因子)。在许多情况下，填料的缺口填充功能是暂时的，并且仅持续直至植入的和/或宿主细胞迁移到区域内且形成新组织。优选地，填料是生物可降解的。填料一般作为粘性溶液或悬浮液提供且使用。

根据一个实施方案，原胶原掺入其中的填料是皮填料。

如本文使用的，术语“皮填料”指在真皮区域中一般使用的组织增加材料类型，例如在表皮下或在皮下组织上，并且因此可以皮下途径、皮下或皮内或一些组合地注射。

众多类型的生物可降解的无细胞可注射填料可以连同本发明的原胶原一起使用。填料可以由自体蛋白质组成，包括得自受试者的任何类型胶原。此种填料的例子是以前由Collagenesis Corp.(Beverly，Mass.)生产的AUTOLOGEN^TM。AUTOLOGEN^TM是来自受试者的自体皮胶原纤维分散体，并且因此当再施用于受试者时，不引发甚至最低限度的免疫应答。为了获得AUTOLOGEN^TM，从受试者获得组织(例如真皮、胎盘或脐带)样品，并且转交给Collagenesis Corp.，在其中它被加工成富含胶原的分散体。约一又二分之一平方英寸的皮组织可以产生一立方厘米(cc)AUTOLOGEN^TM。AUTOLOGEN^TM的浓度可以依赖于在受试者内校正缺陷或增加组织所需的量进行调整。分散体中AUTOLOGEN^TM的浓度可以是例如至少约25mg/L(例如，至少约30mg/L、至少约40mg/L、至少约50mg/L、或至少约100mg/L)。

无细胞可注射填料材料也可以包含非自体蛋白质，包括任何类型胶原，例如本文下文描述的那些。

原胶原可以掺入其中的示例性皮填料基质是由Johnson&Johnson(EVOLENCE^TM)制造的那种，其包括猪衍生的胶原，如美国专利号6,682,760中公开的。

原胶原可以掺入其中的其他示例性皮填料基质是由AllerganMedical制造的那些。这些包括命名为ZYDERM^TM(Collagen Corp.，PaloAlto，California)和ZYPLAST^TM的皮填料，其是牛胶原的可注射制剂，以及命名为Cosmoderm和Cosmoplast的皮填料，其由人胶原组成。ZYDERM^TM由牛皮肤制备，并且由在具有少量局部麻醉剂的盐水中重构的去端肽(atelopeptide)胶原组成。ZYDERM^TM在美国专利号3,949,073中描述。ZYPLAST^TM是牛胶原的轻度交联的制剂，并且通过与0.25％戊二醛交联进行加工，随后为通过细孔的过滤和机械剪切。与这种材料的制备和临床利用有关的方法公开于美国专利号4,582,640和美国专利号4,642,117中。

COSMODERM^TM和COSMOPLAST^TM是批准用于校正面部皱纹、痤疮瘢痕和其他软组织轮廓缺乏，以及用于恢复唇缘(lip border)的皮填料。COSMODERM^TM和COSMOPLAST^TM中的胶原由在控制条件下生长的人皮组织纯化。

本发明还设想将本发明的原胶原掺入基于小球体的皮填料例如ARTEFILLl^TM。ARTEFILL^TM是在Ultra-Purified Collagen^TM(80％)中均匀悬浮的精确过滤的合成小球体(20％)的独特组合。在注射ARTEFILL^TM后，微观球体刺激身体的自身天然胶原生产，以代替纯化胶原。这种产物基于小球体的技术公开于美国专利号5,344,452中。

ISOLAGEN^TM是可以用于掺入本发明的原胶原的另一种皮填料产物。ISOLAGEN^TM(由Isolagen Inc.制造)包括培养的自体成纤维细胞。这种皮填料公开于美国专利号5,591,444和6,432,710中。

由Albiorex International制造的HUMALLAGEN^TM是衍生自胎盘的人胶原，用于皮填充注射以校正面部皱纹。这种皮填料公开于美国专利号5,002,071中。

本发明的原胶原也可以掺入DERMALOGEN^TM(AngiotechPharmaceuticals)内。这种产物是在去除非胶原蛋白质后衍生自人皮肤的可注射胶原基质，并且用作现用的同种异体植入材料。

本发明的原胶原也可以掺入FASCIAN^TM(Fascian Biosystems)内。这是由筋膜制成的可注射人植入材料。

本发明的原胶原可以掺入其中的有用填料材料的其他例子包括但不限于，增溶明胶、聚乙醇酸(例如，增溶聚乙醇酸或聚乙醇酸粒子)或肠缝线。例如，具体的明胶基质植入物在标记FIBRIL^TM下销售。这种填料包含等体积的(1)在0.9％(按体积计)氯化钠溶液中分散的猪明胶粉末和邻氨基己酸混合物，和(2)来自受试者的血浆的等分试样。作为填料有用的其他物质包括透明质酸酶、透明质酸、restalyn和parleane。

根据另一个实施方案，本发明的原胶原可以掺入基质内用于在脊柱融合手术中使用。脊柱融合手术在脊柱变性椎间盘疾病(spinaldegenerative disc disease)——下腰痛的常见原因的管理中是需要的。

因此，例如，本发明的原胶原可以掺入海绵例如由Medtronic制造的INFUSE^TM(由牛1型胶原制备的海绵)内。对于脊柱融合手术，在植入椎骨之间前，使海绵浸泡在重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)中，并且随后插入笼形设备(INTER FIX和/或INTER FIX RP Threaded FusionDevices)内。

本发明的原胶原可以掺入其中的用于脊柱融合手术的另一种支架是由Stryker制造的命名为OP-1^TM的那种。这种支架由rh-BMP-7和牛胶原组成，其用盐水重构以形成糊剂。

本发明的原胶原可以掺入其中的用于脊柱融合的其他基质是在美国专利号5645084、5776193、5910315、6187047、6425920、6613091、7041309以及美国专利申请号2004/0192658、2002/0082697和2005/0037978中教导的那些。

根据另外一个实施方案，本发明的原胶原可以掺入包括胶原的基质内用于在骨移植物中使用。因此，本发明的原胶原可以掺入在美国专利4789663、5171574、5866113、6077988、6166184、6630153、7172629以及美国专利申请号2002/0082694、2007/0254042和2006/0233853中公开的基质内。

基质可以包埋入陶瓷颗粒例如均由Medtronics制造的MASTERGRAFT^TM Matrix和MASTERGRAFT^TM腻子，和COLLAGRAFT^TM(由Angiotech Pharmaceuticals制造且由Zimmer分配)。后面一种产物基本上由多孔珠混合物组成，所述多孔珠混合物由60％羟磷灰石和40％磷酸三钙陶瓷和纤维胶原构成。预期用于由原胶原掺入的另一种多孔支架是Integra OS^TM支架，其由高度纯化的I型胶原和磷酸三钙制成。类似产物是由Berkeley Advanced Biomaterials制造的BI-OSTETIC FOAM^TM。它是由高度纯化的原纤维I型牛胶原和BI-OSTETIC^TM可再吸收60％羟磷灰石和40％磷酸三钙颗粒组成的无菌骨移植物。

基质可以是可延展或不可延展的。美国专利申请20070178130教导了本发明的原胶原可以掺入其中的示例性可延展基质。

本发明的原胶原可以掺入其中用于骨移植的可延展基质的例子包括本文上文提及的MASTERGRAFT^TM腻子；由Integra制造的MOZAIC^TM腻子；由Integra制造的Integra OS^TM腻子，由Synthes制造的DBX^TM骨腻子和由Biocomposites制造的GENEX^TM腻子，和由Biocomposites制造的GENEX^TM糊剂。GENEX^TM是通过有专利权的方法制造的可再吸收骨移植物材料，所述有专利权的方法给予具有可重现的表面负电荷的产物。由本发明预期的另一种糊剂是BIOSET^TM RTAllograft Paste。这是由RTI biologics制造的，与均匀大小的骨皮质碎片混合的可塑脱矿质骨基质糊剂。

根据一个实施方案，原胶原可以掺入其中用于在骨移植物中使用的胶原基质为柔性条的形式，例如由Integra制造的MOZAIC^TM条，由Johnson and Johnson制造的HEALOS^TM，和由Orthovita制造的VITOSS^TM。

将认识到用于在骨移植物中使用的胶原基质也可以塑造成块和其他形状，例如由Orthovita制造的一些VITOSS^TM产物。VITOSS^TM产物由美国专利号5,939,039涵盖。

本发明还预期将原胶原加入Osteotech支架包括例如MAGNIFUSE^TM中。MAGNIFUSE^TM是在聚合物网格内的同种异体移植骨组合，其提供靶向和包含的递送。聚合物网格由生物可降解缝线材料制成，并且设计用于有效的细胞向内生长，并且在3-6个月内完全再吸收，而不干扰骨再生。

此外，本发明预期将原胶原加入Pioneer Surgical的支架例如FORTROSS^TM和Bioset RTI^TM中，所述FORTROSS^TM是NANOSS^TM羟磷灰石和E-MATRIX^TM支架的骨生长促进的组合。

根据另外一个实施方案，本发明的原胶原可以掺入骨粘固剂例如由Biomet制造的那些内。

用于皮肤替换的许多基于胶原和非胶原产物是商购可得的，本发明的原胶原可以掺入其中。例如，本发明的原胶原可以掺入人造皮肤覆盖物内。人造皮肤覆盖物可以在三度烧伤患者中用作暂时覆盖物，从而避免与人尸体同种异体移植(HCA)相关的传染病危险。因此，本发明预期本发明的原胶原掺入在美国专利号4882162、5273900、5460939、6040493、4837379、5830507、5536656、4060081、5032508、5443950、5837278、5256418、6497875、5266480、5591444、586398、5,489,304、5660850、6855860和国际专利号WO/1997/006837中教导的皮肤产物内。

人造皮肤覆盖物的一个例子是TRANSCYTE^TM，也称为DERMAGRAFT^TM。这是合成表皮层，其是生物相容的并且保护伤口表面不受感染。它是半透性的，允许流体和气体交换。TRANSCYTE^TM的内层通过在硅和尼龙网上培养人新生儿包皮衍生的成纤维细胞进行制备。冷冻程序破坏成纤维细胞，留下生长因子的固体产物，包括已知促进愈合的必需人结构和临时的基质蛋白质、糖胺聚糖和生长因子。包含已知促进灼伤愈合的皮组分的内层与伤口表面快速附着。患者的上皮细胞增殖且迁移越过伤口，从而导致快速伤口愈合。

BIOBRANE^TM(Smith and Nephew，荷兰)是由部分包埋在硅膜中的尼龙织品组成的生物合成的绷扎产物。胶原与三丝线(tri-filamentthread)的复杂三维结构化学结合。血液或血清在尼龙基质中凝结，所述尼龙基质使敷料与伤口粘附，直至发生上皮形成或直至自体移植可能时。

INTEGRA^TM(Integra Artificial Skin Dermal Regeneration Template；Integra LifeSciences Corp，New Jersey，USA)是由合成聚硅氧烷表皮层和皮层组成的双层膜，其由交联胶原纤维的多孔网格组成。皮层是生物可降解模板，其中血液和淋巴管、成纤维细胞和其他细胞从周围健康组织中迁移到网格内。成纤维细胞降解模板且再生成胶原基质。在人造皮肤已应用后7-14天，去除合成表皮层，并且皮肤可以移植在伤口上。

由BioHorizons制造的ALLODERM^TM是具有完整基底膜复合体的非活的免疫惰性同种异体无细胞皮基质。它制备伤口床用于移植，从而允许改善的培养的同种异体移植物‘起作用(take)’且提供完整基底膜。

另一种活的皮肤等价物，复合培养的皮肤(ORCEL^TM，Ortec)，由在牛胶原双层基质的相对侧上接种的同种异体成纤维细胞和角质形成细胞组成。

本发明还预期将本发明的原胶原掺入衍生自猪的敷料材料内：猪小肠粘膜下层无细胞胶原基质(OASIS^TM)和无细胞异种胶原基质(E-Z-DERM^TM)。

Tissue Sciences(Covington，Ga.)出售称为PERMACOL^TM的产物，这由交联的猪真皮组成。DePuy(Warsaw，Ind.)出售由猪小肠粘膜下层制成的RESTORE PATCH^TM。Biomet(Warsaw，Ind.)出售称为CUFFPATCH^TM的产物，另一种猪小肠产物。CUFFPATCH^TM和RESTORE PATCH^TM产物提供用于伤口修复的生物相容性支架，并且也可以由本发明的原胶原掺入。由猪小肠粘膜下层制成此种糊剂在美国专利号4,902,508 Badylak等人和美国专利号5,573,784 Badylak等人中描述。

为了修复皮肤的大撕裂或慢性皮肤伤口(例如糖尿病的足)，希望使用支架或移植物材料以帮助支持损伤组织且指导其修复。

因此，本发明设想了将本发明的原胶原掺入支架内，所述支架例如美国专利号5,336,616；5,024,830；4,865,871中教导的那些。

几类材料已用于此种程序。Wright Medical(Memphis，Tenn.)出售称为GRAFTJACKET^TM的产物，这通过Lifecell Corporation(Branchburg，N.J.)由人尸体皮肤制造。皮肤经历去除表皮和皮细胞的过程。这个过程允许身体接受基质且减少排斥应答。产生GRAFTJACKET^TM Matrix的加工步骤充分保存人皮组织，包括其天然蛋白质、胶原结构、血管通道和必需生物化学组成，以允许通过身体的天然愈合过程的细胞再增殖(repopulation)和血管再通(revascularization)。

在植入后，身体的天然修复过程进行血管再通且用细胞再增殖GRAFTJACKET^TM Matrix，并且允许身体将GRAFTJACKET^TM Matrix转变成活组织例如皮肤。这意味着当身体修复其自身时，其可以使用

Matrix。因此，本发明设想了将本发明的原胶原掺入GRAFTJACKET^TM支架内。

本发明的原胶原可以掺入其中用于治疗深伤口的另一种基质是由Integra Lifesciences生产的INTEGRA Flowable Wound Matrix^TM，其是由粒化交联牛腱胶原和糖胺聚糖组成的高级伤口护理基质。粒化胶原-糖胺聚糖用盐水进行水合，并且困难地应用以接近伤口部位和隧道伤(tunneled wounds)。它提供用于细胞侵入和毛细血管生长的支架。

本发明还预期将本发明的原胶原掺入包括胶原的止血封闭剂产物内，例如在美国专利号4016877、4578067、4606910、5951583、6096309、6596304和美国专利申请号2004/0076647中公开的那些。

由Orthovita生产的VITAGEL^TM Surgical Hemostat是由与自体血液衍生的血浆混合的牛凝血酶和牛胶原组成的可喷雾液体止血产物。Vitagel通过使凝血酶/胶原悬浮液与患者的自身血浆组合起作用，以形成血纤蛋白/胶原凝块。连接的注射器，一个容纳来自患者的血浆(人)，并且另一个容纳牛凝血酶和胶原的水混合物，使这些组分混合用于喷雾到出血伤口上。

由Bard生产的AVITENE Ultrafoam^TM胶原海绵是指示为通过加速血凝块形成在外科手术程序过程中终止出血的另一种胶原止血剂。

来自Johnson&Johnson的INSTAT^TM Collagen Absorbable Hemostat是本发明的原胶原可以掺入其中的另一种示例性止血剂。它可以垫以及粉末形式获得。INSTAT^TM Collagen Absorbable Hemostat由纯化且冻干的牛皮胶原制成。当制备为海绵样垫时，该材料是轻度交联、无菌、无致热原和可吸收的。

尿道膨胀以治疗尿失禁涉及将材料注射在尿道周围。可以实行这点，以封闭尿道中通过其泄漏尿的洞或增大尿道壁的厚度，因此当你阻止尿时，它紧紧地密封。大多数膨胀材料紧在膀胱出口处的尿道肌肉外注射在尿道周围。注射膨胀材料可以通过皮肤、通过尿道或在女性中通过阴道来完成。针放置通过使用插入尿道内的膀胱镜进行指导。用于尿道膨胀的材料一般包括聚四氟乙烯(PTFE)、牛胶原(戊二醛交联的牛胶原)和durasphere。因此，本发明预期将本发明的原胶原掺入用于尿道膨胀的胶原基质内。

因此，本发明的原胶原可以掺入由Bard制造的命名为Contigen^TMBard^TM的胶原植入物或在美国专利号4773393、5385561、5989180和6328687中公开的植入物内。

大开放性伤口提供关于医院获得性感染(Hospital AcquiredInfection)(HAI)的进入点。伤口不仅由于医学程序而且还由于循环医院空气和皮肤微生物而变得感染。伤口需要保持清洁且不含细菌污染，或应通过应用合适消毒剂减少在伤口内的细菌群体。各种类型的敷料尝试解决生物负荷减少的需要。它们包括干燥敷料、潮湿敷料、藻酸盐敷料、水胶体和水凝胶敷料以及基于胶原的敷料和纱布敷料。此种敷料可以由本发明的原胶原掺入。

本发明的原胶原可以掺入其中的示例性包括胶原的伤口敷料包括在美国专利号4950699、5196185、5676967、5735812、5,836,970、5888987、6087549、7041868以及美国专利申请20040001878、20050260251、20060188486、20070250177、20070255192、20070154530和20080213344中公开的那些。

因此，例如，本发明的原胶原可以掺入Integra的伤口敷料内，包括HELISTAT^TM和HELITENE^TM。HELISTAT^TM由可吸收的胶原止血海绵制成，而HELITENE^TM由原纤维形式的可吸收胶原制成。在2种产物中，胶原都由牛深屈肌腱进行加工。

INTEGRA Bilayer Matrix Wound Dressing^TM是由交联的牛腱胶原和糖胺聚糖和半透性聚硅氧烷(聚硅氧烷(silicone))层的多孔基质组成的高级伤口护理设备。半透性聚硅氧烷膜控制水蒸气损失，提供用于伤口表面的柔性粘附覆盖物，并且给设备添加增加的撕裂强度。胶原-糖胺聚糖生物可降解的基质提供用于细胞侵入和毛细血管生长的支架。

Johnson and Johnson生产许多伤口敷料，所有这些都由本发明预期。示例性伤口敷料包括NU-GEL^TM、FIBRACOLL PLUS^TM、Instat^TM和PROMOGRAN MATRIX^TM。

NU-GEL^TM是在水中保存的聚乙烯吡咯烷酮的无菌水凝胶制剂。凝胶由可熔纤维织品稀松布(scrim)支持，并且在两侧上由聚乙烯薄膜保护。NU-GEL^TM敷料通过再水化和软化坏死组织，同时提供潮湿伤口环境促进天然自溶。它保护不受脱水、细菌污染，并且吸收来自伤口的溢泌物。

将认识到伤口敷料可以由复合材料例如纤维素和胶原或藻酸盐和胶原组成。

PROMOGRAN MATRIX^TM是使氧化再生的纤维素和胶原组合的示例性敷料。

FIBRACOLL PLUS^TM是由90％胶原和10％藻酸盐构成的敷料。这种组合维持有助于肉芽组织形成的上皮形成的潮湿伤口环境，其使得愈合能够最佳进行。

Organogenesis也生产预期由本发明掺入的多种伤口敷料。

因此，例如，本发明预期将原胶原掺入FORTADERM^TM内。这种伤口敷料由猪肠胶原的单层有孔片(fenestrated sheet)组成。

ColActive^TM和ColActive Ag^TM是由Covalon Technologies生产的基于胶原的伤口敷料。ColActive^TM由USP级别的变性猪胶原产生。ColActive^TM还可以用银盐浸渗，以制备抗菌的基于胶原的伤口敷料-ColActive Ag^TM。

BioCore Medical Technologies生产伤口敷料例如MEDIFIL^TM、SKINTEMP^TM和COLLATEK^TM。MEDIFIL^TM颗粒包括牛I型胶原，并且用于引流、逐渐损害的、隧道、感染或污染的深腔伤口。MEDIFIL^TM垫用于深腔引流伤口。SKINTEMP^TM由与非粘附衬垫附着的多孔胶原片组成，并且指示用于干燥浅表引流伤口。COLLATEK^TM包括I型牛胶原。

Southwest Technologies生产命名为STIMULEN^TM的产物，其是无菌初级一次性使用的敷料，由可溶性修饰的牛胶原基质组成。STIMULEN^TM胶原在伤口流体中是可溶的并且作为粉末或凝胶或片提供。

Healthpoint提供命名为OASIS^TM的无菌伤口覆盖物，以支持部分皮层伤口中的组织再生。它提供衍生自猪小肠粘膜下层(SIS)的组织工程改造的胶原基质。OASIS^TM具有一年保存期限，并且可以单一厚度的有孔片获得。

由Medline生产的PURACOL^TM是本发明的原胶原可以掺入其中的另外一种基于胶原的伤口敷料。这种产物包括处于其天然、三股螺旋形式的100％纯的牛衍生胶原。

来自Integra的TENOGLIDE^TM Tendon Protector Sheet是可吸收植入物(设备)，其提供用于受伤腱的非缢缩、保护性外壳。此种产物也设想由本发明的原胶原掺入。TENOGLIDE^TM由交联的牛I型胶原和糖胺聚糖(GAG)的多孔基质组成。TenoGlide Tendon Protector设计为充当腱和周围组织之间的界面。TenoGlide Tendon Protector是设计为容易放置在受伤腱下、周围或其上的易于处理、适合的多孔胶原-GAG片。

GRAFTJACKET^TM再生组织基质也可以用于保护腱。这种产物已在本文上文中得到描述。

硬脑膜的外科手术闭合或硬脑膜成形术是任何开放性神经外科手术程序的必需部分。对于头和脊柱的外伤性损伤通常导致需要外科手术修复的硬脑膜撕裂和裂伤。硬脑膜是坚硬的纤维结缔组织片，其形成包绕脑和脊髓的外部保护膜。硬脑膜是在任何神经外科手术程序中遇到的第一个脑组织。神经外科医师必须切入硬脑膜以允许接近脑。在神经外科手术程序结束时，必须达到硬脑膜的“不透水”修复，以防止来自脑和脊髓组织的支持脑脊液(CSF)的损失。因此，本发明预期将本发明的原胶原掺入用于硬脑膜成形术的基质内。

用于硬脑膜成形术的此种基于胶原的基质公开于美国专利申请号US 20070161109和20030204270中。本发明的原胶原可以掺入其中的示例性产物是Integra Lifesciences的DURAGEN^TM，其包括I型胶原基质。

由于神经损伤、神经再生和修复的高发生率，神经组织工程改造的副学科是致力于开发在损伤后恢复神经功能性的新方法的快速成长领域。本发明设想了将本发明的原胶原掺入设计为帮助神经再生的基于胶原的基质内。

神经包裹物(wrap)公开于美国专利申请号2004/0048796和2003/0072749中。

Collagen Matrix Inc.生产命名为Collagen Nerve Wrap^TM的神经包裹物，这是可再吸收的胶原基质，其提供用于保护神经环境的用于受伤外周神经的非缢缩外壳，并且设计为神经和周围组织之间的界面。

由Integra生产的NeuraWrap^TM是另一种神经保护器，这是可吸收的胶原植入物，其提供用于保护神经环境的用于受伤外周神经的非缢缩外壳。导管的壁具有纵向狭缝，其允许NeuraWrap^TM扩展开用于容易放置在受伤神经上。一旦设备放置在神经周围，胶原导管的回能就允许NeuraWrap恢复且维持关闭。

预期在由本申请成熟的专利的延续时间过程中，将开发许多相关组合物、基质和载体，并且本文提供的术语范围预期先验地包括所有此种新技术。

如本文使用的，术语“约”指±10％。

术语“包含”、“包括”、“具有”及其动词变形式意指“包括但不限于”。这个术语涵盖术语“由......组成”和“基本上由......组成”。

短语“基本上由......组成”意指组合物或方法可以包括另外成分和/或步骤，但只有当另外成分和/或步骤不实质上改变请求保护的组合物或方法的基本和新特征时。

如本文使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

本申请自始至终，本发明的各种实施方案可以以范围形式呈现。应当理解以范围形式的描述仅为了方便和简短起见，并且不应解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应视为已具体公开所有可能子范围以及在那个范围内的个别数值。例如，例如1-6的范围描述应视为已具体公开子范围，例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及在那个范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围宽度怎样，这都适用。

无论何时在本文中指示数字范围时，它意欲包括在所示范围内的任何所述数字(分数或整数)。短语在第一个指示数字和第二个指示数字之间的“范围”，和从第一个指示数字“至”第二个指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且意欲包括第一个和第二个指示数字，以及在中间的所有分数和整数数字。

如本文使用的，术语“方法”指用于实现给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于已知的那些方式、手段、技术和程序，或通过化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域从业者由已知方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。

应认识到为了清楚起见，在分开实施方案背景中描述的本发明的特定特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简短起见，在单个实施方案背景中描述的本发明的各种特征也可以分开或以任何合适亚组合(subcombination)或合适时在本发明的任何其他描述的实施方案中提供。在各种实施方案背景中描述的特定特征不视为那些实施方案的必需特征，除非没有那些要素该实施方案是不起作用的。

如上文描述和如下文权利要求部分中请求保护的本发明的各种实施方案和方面在下述实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考下述实施例，所述实施例连同上述说明书一起以非限制性方式举例说明本发明的一些实施方案。

一般地，本文使用的命名法和在本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此种技术在文献中充分解释。参见例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等人，(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″第I-III卷Ausubel，R.M.，编辑(1994)；Ausubel等人，″Current Protocols in MolecularBiology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等人，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等人(编辑)″Genome Analysis：A Laboratory ManualSeries″，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如下述中所述的方法：美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，第I-III卷Cellis，J.E.，编辑(1994)；″Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique″by Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第3版；″CurrentProtocols in Immunology″第I-III卷Coligan J.E.，编辑(1994)；Stites等人(编辑)，″Basic and Clinical Immunology″(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，″Selected Methodsin Cellular Immunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编辑(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.和Higgins S.J.，编辑(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，编辑(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)和″Methods inEnzymology″第1、2、317卷，Academic Press；″PCR Protocols：A GuideTo Methods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，″Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；所有这些引入作为参考，如同在本文中完全阐述一样。其他一般参考文献在本文件自始至终提供。其中的程序被认为是本领域众所周知的，并且为了读者方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作为参考。

实施例1

烟草植物中的原胶原表达

构建体-所有编码序列就在烟草植物中的表达进行最优化。图1A-D显示编码Col1(人胶原I型α1链，登记号P02452，ER信号缺失；图1A)、Col2(人胶原I型α2链，登记号P08123，ER信号缺失；图1B)、P4Hα(人脯氨酰4-羟化酶α亚单位，登记号P13674，ER信号缺失；图1C)、P4Hβ(人脯氨酰4-羟化酶β亚单位，登记号P07237，ER信号和C′末端KDEL信号缺失)和LH3(人赖氨酰羟化酶同工型3，登记号O60568，ER信号缺失；图1D)的合成基因。所有基因N′末端融合至液泡转运信号MAHARVLLLALAVLATAAVAVASSSSFADSNPIRPVTDRAASTLA(SEQ ID NO：14)。这个序列源于在编码植物液泡巯基蛋白酶的序列内的靶向信号(登记号P05167，GI：113603)。将液泡信号融合的胶原I型α1链和胶原I型α2链克隆到表达盒中，所述表达盒由茼蒿属(Chrysanthemum)rbcS1启动子和5’UTR连同茼蒿属rbcS1 3’UTR和终止子组成(Outchkourov等人，2003)。将完整表达盒克隆到pBINPLUS植物转化载体(van Engelen等人，1995，Transgenic Res.4：288-290)的多克隆位点中。将编码与液泡靶向信号融合的人P4Hβ和人P4Hα的合成基因克隆到表达盒中，所述表达盒由载体pJD330(Galili等人，1987，Nucleic Acids Res 15：3257-3273)携带的CaMV 35S启动子、TMVω序列和土壤杆菌属(Agrobacterium)胭脂氨酸合成酶(NOS)终止子组成。将完整表达盒克隆到pBINPLUS的多克隆位点中。将编码LH3的合成基因克隆到携带P4Hβ表达盒的pBINPLUS载体的多克隆位点中，所述合成基因具有侧接的草莓镶脉病毒(SVBV)启动子(NCBI登记AF331666REGION：623..950版本AF331666.1 GI：13345788)，并且由土壤杆菌属章鱼碱合酶(OCS)终止子(NCBI登记Z37515 REGION：1344..1538版本Z37515.1 GI：886843)终止，且与液泡靶向信号融合。

转化-所有4种表达构建体都通过电穿孔转化至根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(EHA 105)。含Col1-和Col2的土壤杆菌属用于共接种(coinoculate)Samsun NN烟草(Nicotiana tabacum)植物品系，从而生成Col1/Col2亲本系。平行地，包含P4Hα和P4Hβ+LH3表达盒的土壤杆菌属用于共接种Samsun NN烟草植物品系的分开系，从而产生P4Hα/P4Hβ+LH3亲本系。PCR和蛋白质印迹分析用于验证2个亲本系中的基因插入和蛋白质表达。随后通过去除后面一种植物的花药后，将Col1/Col2的花药放置到P4Hα/P4Hβ+LH3花的柱头上，使亲本植物杂交。这个育种过程的祖先通过基因组整合的基因的基于PCR验证进行筛选，其中使用基因特异性引物。此外，执行包含所有基因的亲本植物和祖先植物的DNA印迹分析，以限定每个基因的拷贝数(参见下表1)。假定LH3拷贝数与P4Hβ的那种相同，因为它们在单个启动子下表达。最后，执行蛋白质印迹分析，以验证且定量蛋白质表达。

表1

亲本系2-372、20-279和育种祖先植物A3-29和C2-15的DNA印迹分析

	A3-29	C2-15	2-372	20-279
					P4Hα	2个插入	3个插入		3个插入
P4Hβ	2个插入	2个插入		2个插入
					COL1	3个插入	3个插入	3个插入
COL2	2个插入	2个插入	2个插入

蛋白质印迹-使用AB745(兔多克隆抗人胎盘I型胶原，Millipore)和山羊抗兔碱性磷酸酶(多克隆，AP132A，Millipore)分别作为第一和第二抗体，就Col1和Col2表达筛选植物。使用抗人P4Hα抗体(来自ICN Biomedicals Inc.的#63-163)就P4Hα表达，和用抗人P4Hβ抗体(来自Millipore的#MAB2701)就P4Hβ表达筛选植物。碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠抗体(来自Sigma的#A3688)用作第二抗体用于P4Hα和P4Hβ检测。

通过组织培养或通过由亲本系扦插产生植物。植物在控制环境中在温室中生长。

从转基因植物中提取和纯化原胶原-用线内IKA Labor Pilot匀浆器执行转基因烟草叶的研磨。简言之，将4L冷提取缓冲液置于匀浆器槽(reservoir)中，其随后在约8000rpm下操作约1分钟。将压碎的叶(1kg)加入槽中。随后使匀浆器速度增至13789rpm进行约2分钟，并且随后减少至约8000rpm。打开下阀以从槽中取出溶液。使提取物在3800g下、在5℃下离心20分钟。最后，使上清液通过4层棉花纱布过滤(样品A，图2A-B)。

对于进一步浓缩，将6.68g炭和16.67g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)加入提取物中，同时搅拌20分钟(5℃，50％刮器速度，或可替代地，用设置在1200rpm下的高架搅拌器搅拌(5℃，20分钟)。随后使溶液饱和至15％硫酸铵(AMS)(w/v)，伴随在5℃下搅拌1小时。这随后为在6880rpm-8000g(5℃，20分钟)下离心，或可替代地，用CepaZ41离心机在26000rpm(4℃，20L/小时)下离心。随后使上清液(样品B，图2A-B)进一步饱和至25％AMS(w/v)，并且搅拌1小时(5℃)。随后使溶液在6880rpm、5℃下再离心30分钟)，或可替代地，用CepaZ41离心机离心(26000rpm，20L/小时，4℃)(样品C，图2A-B)。

所有后续步骤在冰冷环境中用预冷却的溶液完成。使因此形成的沉淀以20ml缓冲液/克AMS饱和沉淀的比率重悬浮于缓冲液(100mM磷酸钠pH 7.65)中。使重悬浮的沉淀离心(13000rpm，10分钟，5℃)，并且收集含原胶原的上清液，并且通过12层纱布过滤以消除大颗粒碎片。其后，用25mM磷酸钠(pH 7.65)使纱布过滤的上清液稀释5倍，并且装载到包含20ml CaptoQ树脂(GE Healthcare)的阴离子交换柱(XK26/20 GE Healthcare)上，并且随后用NaCl梯度(20柱体积，0-50％NaCl，流速20ml/分钟)洗脱。原胶原主要在170-250mM NaCl级分中洗脱。使洗脱的含原胶原级分(图3A-B，级分14-20)合并，并且随后经由下文描述的2种技术之一进一步纯化。用100kDa截止centricone(Vivaspin，Vivascience)浓缩合并的阴离子交换级分。其后将浓缩物装载到Supredex 200GL 10/300凝胶过滤柱(GE healthcare)上。原胶原在8.4-9.6ml之间洗脱(图4-6A-B)，而剩余蛋白质随后洗脱(图4)。以这种方式，分离具有高纯度的完整原胶原，如由图7A-B看明显的。可替代地，合并的阴离子交换级分用25％硫酸铵沉淀，并且离心(8000g，30分钟，5℃)。使沉淀重悬浮于100mM磷酸钠(pH 7.65)中，至离心前(precentrifugation)合并的级分体积的1/15体积。这种溶液随后用100％预冷却的乙醇稀释10倍，并且温育(-20℃，3小时)。在离心(14000g，30分钟，5℃)后，使沉淀重悬浮于100mM磷酸钠(pH7.65)中，至离心前合并的级分体积的1/15体积，针对相同缓冲液透析，离心(20200g，10分钟，5℃)且通过0.2μm滤器过滤(图8)。

结果

通过在分子量＞170kDa和约150kDa处的2个占优势带的存在证实在CP A3-29植物系(批次#CP C-18)中的原胶原表达，如用抗人胎盘I型胶原抗体(图2A-B中的箭标)检测的。相似的带在粗提取物中(图2，泳道A)和在15％AMS中离心后的上清液中(图2，泳道B)是明显的，但在25％AMS中离心后的上清液中(图2，泳道C)未检测出。在25％AMS处理的沉淀(图2，泳道D)中明显达到原胶原富集，如通过SDS PAGE Instant Blue染色进一步证实的。证实增加的相应带强度，以及非胶原、天然烟草相关带尤其是具有低于105kDa分子量的那些的减少。因此，这个添加的基于AMS的沉淀步骤富集原胶原样品纯度。

阴离子交换层析显示大量原胶原在级分14-24(图3A-B)中洗脱，与170-250mM NaCl等价，如通过样品导电性测量的。使含原胶原的级分合并，并且在100kDa截止centricone(Vivaspin，Vivascience)中浓缩，并且装载到凝胶过滤柱上。凝胶过滤层析谱(图4)显示，在蛋白质的剩余部分洗脱前(洗脱峰：10-18ml)，在7.5-9.1ml之间洗脱的分辨率限定的峰。银染色(图5A-B)和蛋白质印迹分析(图6A-B)证实在级分3和4中显著的原胶原洗脱。如通过吸光度曲线与凝胶分析比较测定的，在其下原胶原达到顶点的洗脱体积限定中＜1ml偏差是检测器和收集管之间的管体积的标准结果。级分3和4随后在30kDa截止centricone(Vivaspin，Vivascience)中浓缩10倍，并且通过SDS-PAGE进行分析，这明确证实在高纯度的原胶原分离(图7A-B)。

图8举例说明阴离子交换洗脱物合并级分的基于AMS的沉淀作为原胶原纯化的可替代方法，如上文详细描述的。这个规程中的乙醇沉淀步骤使得能够从样品中去除绿色色素沉着。在4℃中温育、冷冻和融化循环和冻干后，所得到的蛋白质是稳定且可溶的，如通过SDS PAGE分析测定的(图8)。

实施例2

原胶原掺入基于胶原的基质内

胶原通常是充当积存(depot)用于释放治疗活性化合物例如骨形态发生蛋白、生长因子、抗生素等的选择材料[Meaney Murray M.，Rice K.，Wright RJ，Spector M.The effect of selected growth factors on humananterior cruciate ligament cell interactions with a three-dimensionalcollagen-GAG scaffold.J Orthop Res(2003)21(2)：238-44，Qian Y.，Yao G.，Lin Z.，Chen J.，Fan Y.，Davey T.，Xu J.，Zheng M.(2009)Natural bone collagen scaffold combined with OP-1 for bone formationinduction in vivo.J Biomed Mater Res B Appl Biomater Epub.，AdhirajanN.，Shanmugasundaram N.，Shanmuganathan S.，Babu M.Eur J Pharm Sci(2009)36(2-3)：235-45.Functionally modified gelatin microspheresimpregnated collagen scaffold as novel wound dressing to attenuate theproteases and bacterial growth]。胶原可以形成片、薄膜、膜、海绵和凝胶，所有这些都可以在伤口部位处释放活性化合物，以拓宽其治疗应用能力及其药物代谢动力学释放概况。

原胶原可以被动吸收到胶原基质内，或可替代地，通过暴露于紫外线辐射、脱水加热(DHT)技术或经由化学试剂例如零长度1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)交联剂，与此种构建体主动交联(Cornwell KG，Lei P，Andreadis ST，Pins GD.J Crosslinking ofdiscrete self-assembled collagen threads：Effects on mechanical strengthand cell-matrix interactions.Biomed Mater Res A.2007 Feb；80(2)：362-71)。

本实施例描述了可以用于将原胶原掺入胶原基质内的3种规程。

第1规程

通过下述使在10mM HCl中悬浮的可溶性重组或动物衍生的胶原装配成原纤维：使其(9∶1 v/v)与200mM Na₂HPO₄，pH 11.2混合，随后温育(4-16小时，25-37℃)。通过离心使形成的水凝胶浓缩至10-20mg/ml，并且铸到铝模。使模温育(2小时，-30℃)且转移至-80℃进行另外30分钟，随后为24小时冻干步骤。随后使胶原基质浸入(2-6小时，28℃)在90％乙醇中制备的包含10-50mM EDC的交联溶液中。未结合的EDC用DDW冲走3次。用10mM天冬氨酸溶液猝灭对于单一结合的EDC分子的接近。在广泛洗涤后，使样品温育(2小时，-30℃)，并且随后转移至-80℃进行另外30分钟，随后为24小时冻干步骤。胶原基质通过环氧乙烷(ETO)或γ照射进行灭菌。在基质植入前半小时，使基质浸入重组原胶原溶液中，以允许其吸收到基质内。随后使原胶原富集的基质与伤口部位附着。

第2规程

通过使在10mM HCl中悬浮的可溶性重组或动物衍生的胶原与重组原胶原以范围为95∶5至80∶20的比率(w/w)混合和温育(4-16小时，25-37℃，pH 7.4)，装配原纤维基质。通过离心使形成的水凝胶浓缩至10-20mg/ml，并且铸到铝模。使模温育(2小时，-30℃)且转移至-80℃进行另外30分钟，随后为24小时冻干步骤。随后使含原胶原的胶原基质浸入在90％乙醇中制备的包含10-50mM EDC的交联溶液中(2-6小时，28℃)。未结合的EDC用DDW冲走3次。用10mM天冬氨酸溶液猝灭对于单一结合的EDC分子的接近。在广泛洗涤后，使样品温育(2小时，-30℃)，并且转移至-80℃进行另外30分钟，随后为24小时冻干步骤。所得到的原胶原-胶原杂种基质通过ETO或γ照射进行灭菌。

第3规程

通过下述使在10mM HCl中悬浮的可溶性重组或动物衍生的胶原装配成原纤维：使其(9∶1 v/v)与200mM Na₂HPO₄ pH 11.2混合，随后温育(4-16小时，25-37℃)。通过离心使形成的水凝胶浓缩至10-20mg/ml，并且铸到铝模。使模温育(2小时，-30℃)且转移至-80℃进行另外30分钟，随后为24小时冻干步骤。随后使粉末状基质浸入含重组原胶原的溶液中，以允许其吸收到基质内，随后允许所述基质在室温下干燥。随后使原胶原-胶原基质浸入在90％乙醇中制备的10-50mMEDC的交联溶液中(2-6小时，28℃)。未结合的EDC用DDW冲走3次。用10mM天冬氨酸溶液猝灭对于单一结合的EDC分子的接近。在广泛洗涤后，使样品温育(2小时，-30℃)，并且转移至-80℃进行另外30分钟，随后为24小时冻干步骤。原胶原-胶原杂种基质通过ETO或γ照射进行灭菌。

尽管本发明已与其具体实施方案结合进行了描述，但明显的是许多替代方案、修饰和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，它预期包含属于附加权利要求精神和广泛范围的所有此种替代方案、修饰和变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此整体引入说明书内作为参考，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请特别并个别指出引入作为参考相同。此外，本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此种参考文献可用作本发明的现有技术。就使用的部分标题而言，它们不应解释为必定是限制性的。

Claims (20)

1.一种促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的方法，其包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的原胶原，从而促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生。

2.原胶原用于促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的用途。

3.一种制造物品，其包括包装材料，所述包装材料包装作为活性成分的原胶原和用于促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的试剂。

4.一种药物组合物，其包括作为活性成分的原胶原和药学上可接受的载体。

5.一种纯化原胶原的方法，所述方法包括：

(a)提供原胶原制剂；和

(b)由所述原胶原制剂纯化原胶原。

6.权利要求5的方法，其中所述纯化通过选自凝胶过滤、盐析和阴离子交换层析的方法实现。

7.权利要求3的制造物品，其中所述包装材料包括分别包装所述原胶原和用于促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生的所述试剂的至少2个分开的容器。

8.权利要求3的制造物品，其进一步包括关于在促进伤口愈合、治疗纤维化和/或促进血管发生中使用的说明书。

9.权利要求1的方法，其中所述施用实现到包括所述伤口或纤维化组织的组织区域内。

10.权利要求1的方法，其中所述施用在成纤维细胞募集至伤口前实现。

11.权利要求1、2、3、4、5中任一项的方法、用途、药物组合物或制造物品，其中所述原胶原包括人原胶原。

12.权利要求1、2、3、4、5中任一项的方法、用途、药物组合物或制造物品，其中所述原胶原衍生自I型或III型胶原。

13.权利要求11的方法、用途、药物组合物或制造物品，其中所述原胶原在植物细胞中产生。

14.权利要求1、2、3、4、5中任一项的方法、用途、药物组合物或制造物品，其中所述原胶原可通过胶原酶降解。

15.权利要求1或3的方法或用途，其中所述伤口涉及选自下述的纤维化状况：全身性或局部性硬皮病、肝纤维化、酒精性硬化、胆汁性肝硬化、肝炎、静脉闭塞性疾病、特发性间质性纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺纤维化、急性肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、肌肉周纤维化、中心周围纤维化、皮肤纤维瘤、肾纤维化、糖尿病肾病、肾小球肾炎、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、关节粘连、关节病、骨髓纤维化、角膜瘢痕形成、囊性纤维化、肌肉纤维化、杜兴氏肌营养不良、食管狭窄、腹后瘢痕形成、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化改变、肺动脉高压、动脉和静脉血管病、大血管动脉瘤，或通过下述诱导或起始：瘢痕校正、整形外科、青光眼、白内障纤维化、角膜瘢痕形成、移植物抗宿主病、腱外科手术、神经受累、Dupuytren氏挛缩、OB/GYN粘连、骨盆粘连、硬膜外纤维化、甲状腺或甲状旁腺疾病、转移性骨病、多发性骨髓瘤和再狭窄。

16.权利要求1或3的方法或用途，其中所述伤口是急性伤口。

17.权利要求1或3的方法或用途，其中所述伤口是慢性伤口。

18.权利要求1或3的方法或用途，其中所述伤口由糖尿病造成。

19.权利要求1或3的方法或用途，其中所述伤口选自溃疡、灼伤和外科手术伤口。

20.权利要求1、2、3、4、5中任一项的方法、药物组合物、用途或制造物品，其中所述原胶原包括单体原胶原。

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