CN107916294B

CN107916294B - 一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN107916294B
Application number: CN201711158684.8A
Authority: CN
Inventors: 邓益琴; 冯娟; 苏友禄; 刘婵; 吴金军; 郭志勋
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: CN107916294A

Abstract

本发明公开了一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组，所述引物组包括8个引物对，每个引物对包括上游引物和下游引物，各引物的核苷酸序列如表1所示。还公开了含有上述引物组的用于检测哈维弧菌毒力基因的多重PCR检测试剂盒。以及上述引物组及试剂盒在检测环境样本中哈维弧菌污染中的应用。本发明针对已知8种哈维弧菌的毒力基因设计特异性引物，通过单管反应，一次性快速高效的检测8种基因而得知待检样品中是否含有携带毒力基因、具有潜在致病能力的哈维弧菌，其检测覆盖面广，可大大提高哈维弧菌致病性评价的准确性。

Description

一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于哈维弧菌技术领域，具体涉及一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

哈维弧菌(V.harveyi)又称哈维氏弧菌，是一种革兰氏阴性细菌，兼性厌氧，呼吸和发酵代谢，具有发光特性。该菌广泛分布于海洋环境及海洋生物中，能引起海水鱼类及其它养殖动物发病，是世界上许多国家和地区养殖对虾和鱼类的致病菌，也是中国海产经济鱼类弧菌病的主要病原菌之一。近年来，中国南海主要养殖鱼类的弧菌病病原出现以溶藻弧菌为主逐渐演替为哈维弧菌为主的优势种群替代现象，给海水养殖业造成了巨大的经济损失。

弧菌病一旦暴发便很难控制，因此，在水产养殖产业中，我们采用预防为主的防治措施，需要对养殖水体进行长期的实时监测。常规的检测哈维弧菌的方法费时费力，要经过菌株的扩增、选择性培养、理化鉴定和血清学反应等一系列复杂的过程，操作十分繁琐，而且检出率不高，不利于及时准确诊断哈维弧菌病。为了弥补哈维弧菌常规检测方法的不足，有必要建立一种高效、快速、简便的检测技术。目前报道的弧菌检测方法主要有免疫荧光技术和酶联免疫吸附法，但是采用这些方法需要有昂贵的仪器设备，而且ELISA法还需要制备特异性抗血清，不易于普及应用。随着分子生物学技术的发展和哈维弧菌全基因组序列测定的完成，人们对哈维弧菌的毒力基因和致病机制有了更加深入细致的了解，为从分子水平上鉴定哈维弧菌和确定菌株的毒力提供了理论依据和技术支撑。

目前已经报道的用于检测、鉴定哈维弧菌方法有很多，大多是用PCR(聚合酶链式反应)技术，扩增哈维弧菌的一段保守基因或一种特征性毒力基因，如：根据哈维弧菌溶血素基因vhh、外膜蛋白OmpK基因以及丝氨酸蛋白酶Serine protease基因的基因序列的特异性，设计相关的特异性较高的引物序列，对其进行PCR检测。但是，在哈维弧菌的致病性检测方面，这些方法的缺陷在于：检测内容过于单一，不能全面反应菌株的潜在致病力。

现有研究认为与哈维弧菌致病力相关的主要毒力因子有溶血素Vhh；蛋白酶类，包括丝氨酸蛋白酶Serine protease，金属蛋白酶VhpA等；以及群感效应蛋白，如AphA，LuxR等。自然情况下，绝大多数哈维弧菌属于水产动物体内和体表的正常菌群，只有极少数带有特定毒力基因的菌株才具有致病性。然而，由于毒力基因种类的多样性、分布的差异性，不同的致病菌株往往携带不同种的毒力基因。因此，在做致病性评估时，如何更快速准确对哈维弧菌(V.harveyi)的致病性进行评估是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组，该引物组对哈维弧菌的特异性好、灵敏度高，能用于检测哈维弧菌多重毒力基因。

本发明的目的还在于提供包含上述引物组的用于检测哈维弧菌毒力基因的多重PCR检测试剂盒。

本发明的最后一个目的在于提供上述引物组或试剂盒在检测环境样本中哈维弧菌污染中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案实现的：一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组，所述引物组包括8个引物对，每个引物对包括上游引物和下游引物，各引物的核苷酸序列如下表1所示：

表1各引物的核苷酸序列

哈维弧菌CAI-1自诱导感应激酶/磷酸酶(CAI-1autoinducer sensor kinase/phosphatase)编码基因cqsS、AI-1感应激酶/磷酸酶(autoinducer 1sensor kinase/phosphatase)编码基因luxN、AI-2结合周质蛋白(autoinducer 2-binding periplasmicprotein)编码基因luxP、PadR家族转录调控蛋白(PadR family transcriptionalregulator protein)编码基因aphA、溶血素(haemolysin)编码基因vhh、丝氨酸蛋白酶(serine protease)编码基因hflK、LuxR家族转录调控子(LuxR family transcriptionalregulator)编码基因luxR、几丁质酶(chitinase)编码基因chiA均被报道为与哈维弧菌致病相关的毒力基因。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：含有上述引物组的用于检测哈维弧菌毒力基因的多重PCR检测试剂盒。

进一步的，该试剂盒还含有PCR反应试剂。

所述PCR反应试剂包括2×Premix Taq^TM。

更进一步的，该试剂盒还含有哈维弧菌阳性对照DNA。

该试剂盒中，引物组中每个引物对的浓度优选为10μM。

其中哈维弧菌阳性对照DNA为同时含有所检测8种毒力基因的哈维弧菌的DNA模板，浓度优选为20ng/μL。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述引物组或试剂盒在检测环境样本中哈维弧菌污染中的应用。

进一步的，该应用包括以下步骤：

(1)提取哈维弧菌的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中的基因组DNA作为模板，用上述的引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR反应产物，同时对阳性对照DNA进行多重PCR扩增，并设置无菌水的多重PCR扩增作为阴性对照；

(3)利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析。

在该应用中：

步骤(2)中进行多重PCR扩增时，PCR反应液体系以50μL计包括：2×PremixTaq^TM38.0μL，引物预混液8.0μL，20ng/μL的模板DNA4.0μL，引物预混液中8个引物对浓度和用量相同，每个引物对中上游引物浓度为10μM，用量为0.5μL，下游引物浓度为10μM，用量为0.5μL，混合均匀为引物预混液

步骤(2)中PCR扩增时，反应程序为：95℃5min；94℃30s、53℃30s、72℃60s，38个循环；72℃10min。

该应用可快速筛查哈维弧菌毒力基因的种类，建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。

本发明建立的哈维弧菌毒力基因多重PCR检测方法，能够实现病原培养学、免疫学等所无法完成的毒力基因检测工作，克服其他分子生物学技术手段鉴定毒力基因的不足之处。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)多重检测：采用本发明中的引物或试剂盒能够在一次PCR反应中同时筛查哈维弧菌的8种毒力基因，判断其致病性，快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本；

(2)特异性高：本发明引物组具有高特异性，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，从而能够确定样品中哈维弧菌各毒力基因的存在情况；

(3)成本较低：本发明中的引物组或试剂盒在操作上降低了人力成本和时间成本，原来单重检测需8次人工和8倍时间，现在使用此方法只需1次人工和1个反应时间，该多重检测方法同时大大节省了重复检测同一个样品的试剂消耗；

(4)本发明的检测操作简单，不需要使用复杂仪器，也不需要特殊试剂，只需常规PCR仪即可，对检测人员的技术素质要求较低，只需进行简单培训即可；

(5)本发明检测试剂盒制备成本低廉，制备工艺简单，容易实现工业化大生产，具有广阔的市场前景；

(6)预防假阴性结果：试剂盒中提供阳性对照DNA，可有效的提示假阴性检测结果；

(7)本发明为哈维弧菌毒力基因的快速筛查提供了完备的解决方案，能够实现疫情爆发后的哈维弧菌致病性的快速筛查，为合理恰当处理疫情提供可靠的依据；

(8)本发明针对已知8种哈维弧菌的毒力基因设计特异性引物，通过单管反应，一次性快速高效的检测8种基因而得知待检样品中是否含有携带毒力基因、具有潜在致病能力的哈维弧菌，其检测覆盖面广，可大大提高哈维弧菌致病性评价的准确性，为哈维弧菌致病性评价提供了更为有效的检测手段，在水产养殖病害检测、流行病学调查、食品中致病菌检测、水产品进出口检测及医院感染监控等方面有着重要的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中准确性分析的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果：

其中：M为100bp ladder DNA marker；1-8分别为阳性对照DNA毒力基因cqsS，luxN，luxP，aphA，vhh，hflK，luxR，chiA的单重PCR结果，9为阴性无菌水8重PCR结果，10为阳性对照DNA8重PCR结果；

图2为本发明实施例3中特异性分析的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果：

其中：M为100bp ladder DNA marker；1-10分别为大肠杆菌、I a型人源无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、美人鱼发光杆菌、迟缓爱德华氏菌、溶珊瑚弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌8重PCR结果，11为阳性对照DNA8重PCR结果，12为阴性无菌水8重PCR结果；

图3为本发明实施例4中灵敏度分析的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果：

其中：M为100bp ladder DNA marker；1-8分别为阳性对照DNA浓度为20ng/uL，4ng/μL，0.8ng/μL，0.16ng/μL，0.032ng/μL，0.0064ng/μL，0.00128ng/μL，0.000256ng/μL时的8重PCR结果，9为阴性无菌水8重PCR结果；

图4为本发明实施例5中利用该发明的引物组及试剂盒检测待测哈维弧菌菌株的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果：

其中：M为100bp ladder DNA marker；1为阳性对照DNA 8重PCR结果，2-4分别为对养殖水体中分离得到的三株哈维弧菌的检测结果，5为阴性无菌水8重PCR结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1哈维弧菌多重PCR检测方法的准确性检测

1.阳性对照DNA模板提取

选取阳性对照哈维弧菌单克隆过夜培养于合适的培养基，取过夜培养的阳性对照哈维弧菌增菌液1mL，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(广州诺晶生物技术有限公司)提取基因组。

2.选取哈维弧菌8个毒力基因cqsS，luxN，luxP，aphA，vhh，hflK，luxR，chiA对其保守区利用primer-blast进行引物设计，各引物对能分别专一性的鉴别上述细菌毒力基因的特异性，引物序列如下表2所示：

表2各引物序列

3.有效性检测：

(1)合成上述设计的引物组，用引物组的引物分别对提取的阳性对照DNA模板进行单一PCR验证，其中单一PCR反应体系如下：

(2)同时对哈维弧菌8个毒力基因进行多重PCR验证，采用如下多重PCR反应体系：

(3)采用如下PCR反应程序，对上述PCR反应体系进行PCR反应：

1)95℃预变性5min。

2)94℃变性30s。

53℃退火30s。

72℃延伸60s。

共计38个循环。

3)72℃延伸10min。

上述PCR反应结束后，分别取各组PCR反应产物6μL，分别加入到质量浓度为2％的琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁琼脂糖凝胶点样孔中加入6μL100bp ladder DNAMarker作对照，以120V电压进行电泳，75min后于凝胶成像系统下观察结果。

4.检测结果：

检测结果如图1所示，图1中泳道M为100bp ladder DNA marker；泳道1-8分别为阳性对照DNA毒力基因cqsS，luxN，luxP，aphA，vhh，hflK，luxR，chiA的单一PCR的扩增结果，目标扩增片段长度分别为956bp，816bp，690bp，515bp，319bp，232bp，178bp，83bp；泳道9为阴性无菌水8重PCR结果；泳道10为阳性对照DNA 8重PCR结果。

从图1可以看出单一PCR检测相应的单一条带及多重PCR检测相应的8条单一条带，分别与cqsS，luxN，luxP，aphA，vhh，hflK，luxR和chiA基因的扩增片段长度分别为956bp，816bp，690bp，515bp，319bp，232bp，178bp和83bp相吻合，即说明本发明的哈维弧菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出哈维弧菌8种毒力基因。

实施例2用于检测哈维弧菌毒力基因的多重PCR检测试剂盒

本实施例的检测试剂盒可用于多重PCR快速检测样品中哈维弧菌的毒力基因存在情况，该检测试剂盒由哈维弧菌的cqsS，luxN，luxP，aphA，vhh，hflK，luxR和chiA基因检测用引物组、阳性对照品和2×Premix Taq^TM组成，其中：

(1)哈维弧菌检测用引物组：1管内装哈维弧菌的cqsS基因的上游引物cqsS-F核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1所示；2管内装哈维弧菌的cqsS基因的下游引物cqsS-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2所示；3管内装哈维弧菌的luxN基因的上游引物luxN-F核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3所示；4管内装哈维弧菌的luxN基因的下游引物luxN-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示；5管内装哈维弧菌的luxP基因的上游引物luxP-F核苷酸序列分别如SEQID NO.5所示；6管内装哈维弧菌的luxP基因的下游引物luxP-R核苷酸序列分别如SEQ IDNO.6所示；7管内装哈维弧菌的aphA基因的上游引物aphA-F核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示；8管内装哈维弧菌的aphA基因的下游引物aphA-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8所示；9管内装哈维弧菌的vhh基因的上游引物vhh-F核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9所示；10管内装哈维弧菌的vhh基因的下游引物vhh-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10所示；11管内装哈维弧菌的hflK基因的上游引物hflK-F核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11所示；12管内装哈维弧菌的hflK基因的下游引物hflK-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12所示；13管内装哈维弧菌的luxR基因的上游引物luxR-F核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示；14管内装哈维弧菌的luxR基因的下游引物luxR-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14所示；15管内装哈维弧菌的chiA基因的上游引物chiA-F核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15所示；16管内装哈维弧菌的chiA基因的下游引物chiA-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16所示；以上引物浓度分别为10μM。

(2)制备阳性对照品：提取含有所检测8种毒力基因的哈维弧菌的基因组DNA，将浓度稀释为20ng/μL，置于容器，1管；

(3)2×Premix Taq^TM，置于容器，1管；

(4)一块泡沫板，将上述18个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的检测试剂盒。

本实施例中各试剂管制备后均经过抽样质检，对其质量进行监控。

实施例3利用实施例2制得的试剂盒进行多重PCR特异性试验

分别准备以下样品：样品1含有大肠杆菌，样品2含有I a型人源无乳链球菌，样品3含有金黄色葡萄球菌，样品4含有美人鱼发光杆菌，样品5含有迟缓爱德华氏菌，样品6含有溶珊瑚弧菌，样品7含有副溶血弧菌，样品8含有溶藻弧菌，样品9含有鳗弧菌，样品10含有创伤弧菌。分别以实施例1中的方法进行核酸提取，并对个样品进行多重PCR检测。

检测结果如图2所示，结果表明在阳性对照DNA和阴性无菌水为模板扩增正常的条件下，除溶珊瑚弧菌和副溶血弧菌以外的其他菌均无所检测毒力基因的条带扩增，重复检测结果一致，溶珊瑚弧菌有chiA基因的扩增条带，副溶血弧菌有chiA和vhh基因的扩增条带，说明所检测的哈维弧菌毒力基因可能在其他弧菌中有同源基因，但在其他属中均无扩增，表明该检测方法具有较好的特异性，能够将非目标基因有效区分开。

实施例4利用实施例2制得的试剂盒进行多重PCR灵敏性试验

对初始浓度为20ng/μL的阳性对照哈维弧菌DNA进行5倍的倍比稀释，稀释浓度依次为：4ng/μL，0.8ng/μL，0.16ng/μL，0.032ng/μL，0.0064ng/μL，0.00128ng/μL，0.000256ng/μL。以实施例2中的方法对各浓度模板DNA进行多重PCR检测。

检测结果如图3所示，本发明的检测方法对待检测目标的检测限在0.16ng/μL，重复检测结果一致，表明该方法具有较高的敏感度和重复性。

实施例5引物组及试剂盒检测待测哈维弧菌菌株

通过检测哈维弧菌相关毒力基因中的保守序列，能快速待测哈维弧菌菌株中各毒力基因的存在，其实现的技术方案如下：

1、引物合成

按照表1中的引物序列，在基因合成公司合成所有的核苷酸序列。

2、DNA模板提取

使用水煮法或者商品化试剂盒提取从养殖水体中分离得到的三株哈维弧菌菌株DNA作为检测样品。

3、使用普通PCR平台构建多重PCR检测体系

在确定多重PCR反应体系中的引物序列后，从引物浓度、退火温度、反应体系配置、反应条件等方面进行优化。

多重PCR反应体系及反应条件如下：

50μL多重PCR反应体系为：包括：38.0μL 2×Premix Taq^TM(DNA Polymerase、Buffer、dNTP Mixture的2倍浓度的混合物，含有电泳时所必需的蓝色和黄色色素试剂)，0.5μL引物cqsS-F、0.5μL引物cqsS-R、0.5μL引物luxN-F、0.5μL引物luxN-R、0.5μL引物luxP-F、0.5μL引物luxP-R、0.5μL引物aphA-F、0.5μL引物aphA-R、0.5μL引物vhh-F、0.5μL引物vhh-R、0.5μL引物hflK-F、0.5μL引物hflK-R、0.5μL引物luxR-F、0.5μL引物luxR-R、0.5μL引物chiA-F、0.5μL引物chiA-R，4.0μL(20ng/uL)步骤2得到的样品DNA模板或者试剂盒中提供的阳性对照品或者阴性对照无菌水；反应程序为：95℃5min；94 30s、53℃30s、72℃60s，38个循环；72℃10min。

4、多重PCR产物分析和结果判定

对步骤3PCR反应结果进行电泳检测，并于凝胶成像系统下观察结果，若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有该毒力基因。

步骤4电泳检测中，分别设置样品孔、阳性对照孔、阴性对照孔和参比孔；样品孔取步骤3样品组PCR反应产物6μL，加入到2％琼脂糖凝胶点样孔中；

阳性对照孔取步骤3阳性对照组PCR反应产物6μL，加入到2％琼脂糖凝胶点样孔中；

阴性对照孔取步骤3阴性对照组PCR反应产物6μL，加入到2％琼脂糖凝胶点样孔中；

参比孔取6μL 100bp ladder DNA Marker加入到2％琼脂糖凝胶点样孔中；以120V电压分别对样品孔、阳性对照孔阴性对照孔和所述参比孔进行电泳75min。

检测结果如图4所示，结果表明在泳道1阳性对照DNA和泳道5阴性无菌水为模板扩增正常的条件下，泳道2和泳道3的待检测哈维弧菌菌株均含有所检测的8种毒力基因，而泳道4的待检测哈维弧菌菌株只含有其中7种毒力基因，不含有毒力基因luxN。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组、试剂盒及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(cqsS-F)

<400> 1

ttgatttctt gggcagtgat ac 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(cqsS-R)

<400> 2

catcactggc atttcgatgt c 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(luxN-F)

<400> 3

ggtatcttta tggcgaagtt tg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(luxN-R)

<400> 4

gcttgtcatt aggaatctgc 20

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(luxP-F)

<400> 5

cgttactatt ttccctgatt tctatgg 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(luxP-R)

<400> 6

ctgattgtag ttcaaagtta tatcacg 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(aphA-F)

<400> 7

accacacgta attctaactg 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(aphA-R)

<400> 8

gttctgttag tacttcttct gc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(vhh-F)

<400> 9

gattgggaat gggcagaaaa 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(vhh-R)

<400> 10

ggaatcgcca ttgtgatgc 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(hflK-F)

<400> 11

tgcacgacca gttgctttag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(hflK-R)

<400> 12

aagtggtcgt cagcaaatcc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(luxR-F)

<400> 13

gtggttcgtc aattctcgaa c 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(luxR-R)

<400> 14

cgaatagtgg ccacacttc 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(chiA-F)

<400> 15

gagctaactt cagcaatcgg 20

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(chiA-R)

<400> 16

aagatgtagt ccatgtactg aac 23

Claims

1.一种用于检测哈维弧菌多重毒力基因的引物组，其特征是：所述引物组包括8个引物对，每个引物对包括上游引物和下游引物，各引物的核苷酸序列如下所示：

；

所述引物组用于检测哈维弧菌多重毒力基因时，包括以下步骤：

(1)提取哈维弧菌的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中的基因组DNA作为模板，用所述的引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR反应产物，同时对阳性对照DNA进行多重PCR扩增，并设置使用无菌水的多重PCR扩增作为阴性对照；

(3)利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析。

2.一种用于检测哈维弧菌毒力基因的多重PCR检测试剂盒，其特征是：含有权利要求1所述引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是：所述试剂盒还含有PCR反应试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是：所述试剂盒还含有哈维弧菌的阳性对照DNA。

5.权利要求1所述的引物组或权利要求2-4任一项所述的试剂盒在检测环境样本中哈维弧菌污染中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是还包括以下步骤：

(1)提取哈维弧菌的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中的基因组DNA作为模板，用权利要求1所述的引物组进行多重PCR扩增，得到多重PCR反应产物，同时对阳性对照DNA进行多重PCR扩增，并设置使用无菌水的多重PCR扩增作为阴性对照；

(3)利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析。

7.根据权利要求6所述的应用，步骤(2)中进行多重PCR扩增时，PCR反应液体系以50μL计，所述PCR反应液体系包括：2×Premix Taq 38.0μL，引物预混液8.0μL，20ng/μL的模板DNA 4.0μL，引物预混液中8个引物对浓度和用量相同，每个引物对中上、下游引物浓度均为10μM，用量均为0.5μL，混合均匀为引物预混液。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征是：进行步骤 (2)中PCR扩增时，反应程序为：95℃ 5min；94℃30s、53℃30s、72℃60s，38个循环；72℃10min。