CN110257409B

CN110257409B - 一种红螯螯虾孵化酶基因及其应用

Info

Publication number: CN110257409B
Application number: CN201810443680.2A
Authority: CN
Inventors: 郑育声; 方哲; 王金龙; 武歆怡; 王一菲; 刘新星
Original assignee: Hainan University; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Hainan University; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2038-05-10
Also published as: CN110257409A

Abstract

本发明公开了红螯螯虾孵化酶astacin基因及其ORF，还公开了一种包含红螯螯虾孵化酶astacin基因全长序列的工程菌的构建方法，包括克隆红螯螯虾孵化酶astacin基因部分片段，以携带有astacin基因部分片段的PMD19‑T质粒为模板，利用RACE技术分别扩增5’RACE序列和3’RACE序列，最终获得astacin基因全长序列。本发明通过末端快速扩增技术(RACE)首次克隆获得红螯螯虾孵化酶基因astacin的全长基因序列，长度744bp，并成功表达astacin蛋白，包含169个氨基酸，最终通过稀释复性法获得的红螯螯虾孵化酶蛋白astacin，具有明胶裂解活性。红螯螯虾孵化酶能够提高红螯螯虾孵化率，且能用于红螯螯虾的大规模养殖。

Description

一种红螯螯虾孵化酶基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种红螯螯虾孵化酶基因及其应用。

背景技术

红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)，原产澳大利亚，外形酷似海中龙虾，是世界最名贵的淡水经济虾种之一，该虾体色褐绿，螯的外侧顶端有一膜质鲜红带，美丽好看，故又被誉为红螯螯虾，红螫螫虾个体一般在50-100克，个别较大者达500～600克，是一种适应性较强的淡水虾类。由于其食性广，生长快，肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，在欧洲、日本和中国受到市场上的欢迎。4月下旬亲虾开始交配产卵，交配前雌虾要进行生殖蜕壳，在雄虾产出精子的12小时内雌虾开始产卵，雌虾产出的卵受精后为深黄色，粘附在腹足以及尾扇向内卷曲形成的空腹内，由于雌虾腹部空间有限，抱卵数量也即为有限，且在自然界受精卵要经过40天才能完全脱离母体。

目前，astacin基因在珍珠贝、蜘蛛、人、马蹄虾等多种物种中被发现。astacin是一种多功能的金属内肽酶。很多研究表明，astacin在多种生物体的新陈代谢过程如细胞的增殖分化、发育以及卵的孵化中发挥重要功能。astacin家族成员有一个共同的特征，在他们的蛋白质序列中，都有高度保守的序列HEXXHXXGXXXH和SXMHY；HEXXHXXGXXH此序列位置为金属离子结合基序；SXMHY被叫做Met-turn。红螯螯虾astacin发挥其多种功能的作用机理尚不清楚，且红螯螯虾孵化成活率受环境影响较大，因此亟需红螯螯虾孵化酶astacin基因用于研究astacin基因的作用机理，进而提高红螯螯虾孵化率。

发明内容

本发明的目的是提供一种红螯螯虾孵化酶基因astacin，及具有明胶裂解活性的红螯螯虾孵化酶蛋白astacin，用于提高红螯螯虾孵化率，实现红螯螯虾的大规模养殖。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

红螯螯虾孵化酶astacin基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

进一步，红螯螯虾孵化酶astacin基因的ORF的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

进一步，红螯螯虾孵化酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述红螯螯虾孵化酶由红螯螯虾孵化酶astacin基因的ORF编码。

进一步，一种包含红螯螯虾孵化酶astacin基因全长序列的工程菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)克隆红螯螯虾孵化酶astacin基因部分片段，转化DH5α感受态细胞，获得携带有astacin基因部分片段的PMD19-T质粒；

(2)以携带有astacin基因部分片段的PMD19-T质粒为模板，利用RACE技术分别扩增5’RACE序列和3’RACE序列，连接PMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取质粒并送测序；

(3)通过测序得到的5’RACE序列和3’RACE序列获得astacin基因全长序列，连接PMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，获得红螯螯虾孵化酶astacin基因的工程菌；从所述工程菌中提取携带有astacin基因全长序列的PMD19-T质粒，测序，获得astacin基因全长序列。

进一步，一种包含红螯螯虾孵化酶astacin基因的工程菌的构建方法，所述工程菌在制备红螯螯虾孵化酶中的应用。

进一步，一种诱导、纯化红螯螯虾孵化酶的方法，具体步骤如下：

(1)根据astacin基因全长序列确定红螯螯虾astacin基因的ORF；

(2)构建重组表达载体pET28b-astacin/ORF，转化DH5α感受态细胞，获得pET28b-astacin/ORF质粒；

(3)将pET28b-astacin/ORF质粒转入E.coli BL21感受态细胞，经IPTG诱导，获得带有astacin/ORF重组蛋白的菌液；

(4)对astacin/ORF重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。

进一步，一种复性异源表达红螯螯虾孵化酶的方法，具体步骤如下：

(1)利用超声波破碎法对astacin/ORF重组蛋白进行纯化；

①将带有astacin/ORF重组蛋白的菌液进行扩培，获得扩培菌液，向扩培菌液中加入IPTG，诱导4-6h，使OD值达到0.6-0.8，10000-12000rpm，离心10-15min，收集菌体；

②用菌体破碎液悬浮菌体沉淀，超声30-40min，10000-12000rpm，离心10-15min，收集沉淀；

③用蛋白洗涤液超声5-10min，悬浮沉淀，10000-12000rpm，离心10-15min，收集沉淀；

④重复步骤③，共洗涤沉淀三次；

⑤用蛋白溶解液1超声5-10min悬浮沉淀后，37℃，孵育30-40min，10000-12000rpm，离心10-15min，收集沉淀；

⑥用蛋白溶解液2超声5-10min悬浮沉淀后，37℃，孵育30min后，10000rpm，离心15min，收集上清即为纯化后的蛋白；

(2)利用稀释复性法对astacin/ORF重组蛋白进行复性，浓缩；

①将纯化后的蛋白稀释于稀释复性液中，使蛋白最终浓度为8-10μg/μl，置于4℃，20-24h；

②取10ml稀释复性液透析于1L透析液1中，置于4℃，10-12h；

③将稀释复性液透析于1L透析液2中，置于4℃，3-4h；

④用浓缩管对稀释复性液进行浓缩，5000-6000rpm，30-40min。

进一步，红螯螯虾孵化酶在提高红螯螯虾孵化率中的应用。

进一步，红螯螯虾孵化酶在大规模养殖中的应用。

本发明的有益效果：本发明通过末端快速扩增技术(RACE)首次克隆获得红螯螯虾孵化酶基因astacin的全长基因序列，长度744bp，并成功表达astacin蛋白，包含169个氨基酸，最终通过稀释复性法获得的红螯螯虾孵化酶蛋白astacin，具有明胶裂解活性。红螯螯虾孵化酶能够提高红螯螯虾孵化率，且能用于红螯螯虾的大规模养殖。

附图说明：

图1为本发明astacin基因在不同组织中的表达水平；

图2为本发明astacin基因部分序列PCR扩增；

M，DNA2000Marker；1，astacin基因部分片段；

图3为本发明astacin基因5’RACE序列PCR扩增；

M，DNA2000Marker；1，5’RACE序列；

图4为本发明astacin基因3’RACE序列PCR扩增；

M，DNA 5000Marker；1，3’RACE序列；

图5为本发明astacin基因全长序列PCR扩增；

M，DNA 5000Marker；1，astacin基因全长序列；

图6为本发明astacin基因的ORF阅读框；

图7为本发明红螯螯虾的astacin氨基酸序列比对；

图8为本发明红螯螯虾的进化树分析；

图9为本发明重组质粒PET28b-astacin的双酶切电泳图；

M，DNA 5000Marker；1，ORF基因序列；

图10为本发明astacin重组蛋白的SDS-PAGE全菌凝胶电泳；

M，蛋白marker；1，空白对照；2，诱导组；

图11为本发明astacin重组蛋白的Western blot分析；

M，蛋白marker；1，WB条带；

图12为本发明复性及浓缩后的astacin重组蛋白；

M，蛋白Marker；1，astacin蛋白；

图13为本发明astacin重组蛋白明胶降解功能鉴定；

M，蛋白Marker；1，astacin蛋白；

图14为本发明astacin重组蛋白降解纤连蛋白功能鉴定；

M，蛋白Marker；1，纤连蛋白；2，纤连蛋白+astacin蛋白；

图15为本发明astacin重组蛋白降解纤维原蛋白功能鉴定；

M，蛋白Marker；1，纤维原蛋白；2，纤维原蛋白+astacin蛋白。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1实时荧光定量PCR

从红螯螯虾的血液，胰腺，肌肉，小肠不同组织中提取RNA进行反转录获得相应的cDNA，并作为模板。以18S基因作为内参基因。用96孔板做实时荧光定量PCR。每种模板以18S引物和实时荧光定量PCR引物各做4管。总共32管，最后18S内参做一个空白对照，目的基因做一个空白对照。

实时荧光定量PCR引物序列如下：

RT-F：TCCCATACACCCTGGCAGAT；SEQIDNO：7；

RT-R：CCACCCAAACGACCGACATA；SEQIDNO：8。

18srRNA内参基因引物序列如下：

18s-F：CATGCCCGTTCTTAGTTGGT；SEQIDNO：9；

18s-R：GTGCGGCCCAGAAATATAAA；SEQIDNO：10。

加样信息如下：

astacin组：SYBRII 10μl，RT-F 0.8μl，RT-R 0.8μl，模板(四种不同组织)1μl，ddH₂O 7.4μl，共20μl。

astacin空白对照，只需把模板改为1μl ddH₂O，其他不变。

PCR反应程序：95℃30s；循环程序95℃15s，50℃30s，72℃10s，共40cycle；95℃10s，65℃5s，95℃5min；

内参18S组：SYBRII 10μl，18S-F 0.8μl，18S-R 0.8μl，模板(四种不同组织)1μl，ddH₂O 7.4μl，共20μl。

内参18S空白对照，只需把模板改为1μl ddH₂O，其他不变。

PCR反应结束后，数据依据2^(-DeltaDeltaC(T))的方法进行统计分析，再以graphpad作图。结果如图1所示，astacin在胰腺的表达量最高，而且远远高于其他组织。

实施例2红螯螯虾孵化酶astacin基因部分片段的克隆

Ⅰ、红螯螯虾RNA的提取

(1)解剖红螯螯虾活体，取胰腺，用液氮冷冻放-80℃保存；

(2)取冷冻胰腺0.5g左右用研钵液氮研磨为粉末；

(3)将研磨的粉末加入到含有1ml Trizol的2ml EP管中裂解5-10min；

(4)12,000rpm离心15min，取上清，至另一离心管中；

(5)加入200ul氯仿，轻轻混匀后室温放置5min；

(6)4℃12,000g离心15min；

(7)吸取上层水相，至另一离心管中；

(8)加入0.5mL异丙醇混匀，室温放置10min；

(9)在4℃条件下，12,000g离心10min，用移液枪小心吸取上清，避免沉淀被吸走，RNA沉于管底；

(10)加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

(11)在4℃条件下，8,000g离心5min，用移液枪小心吸取上清，避免沉淀被吸走。

(12)室温晾干或真空干燥2min；

(13)加入20μl DEPC水溶解沉淀的RNA，测OD值后，标记，放在-80℃保存。

Ⅱ、RNA反转录成cDNA(FastQuantRTKit(withgDNadse))

(1)将10×Fast RT Buffer，FQ-RTprimer mix，RNase-Free H₂O，5×DNABuffer放在室温解冻，之后迅速置于冰上；

(2)向200μl的EP管中加入RNA总量为1μg的RNA溶液，添加RNase-Free H₂O补足至8μl；离心混匀后在PCR仪上65℃孵育5min；之后加入2μl5×DNABuffer，PCR仪上42℃温育3min；

(3)配置10μl的mix，在冰上加入2μl FQ-RT primer mix，2μl10×Fast RTBuffer，5μl RNase-Free H₂O和1μl RT-Enzyme于200μl EP管中；

(4)将混合均匀的溶液加入步骤(2)中的反应液中，充分混匀；

(5)放在PCR仪中进行反应，反应程序为：42℃，30min；95℃，3min；4℃，∞；

(6)得到的cDNA作为PCR反应的模板。

Ⅲ、引物设计

从NCBI上下载12个不同物种的astacin蛋白序列，用DNAman软件进行氨基酸序列的比对，找出保守区域；用亲缘最近的北欧鳌虾的astacin基因Astacusastacus(ACCESSION:AJ242595)作为模板，在其基因的基础之上，结合保守区的DNA序列，进行引物设计，其引物序列如下：

F：CCAGTGGTTCAGGGTGTT；SEQIDNO：11；

R：GCAGCATGTGAGCTTTATC；SEQIDNO：12。

Ⅳ、PCR扩增

以Ⅱ中得到的cDNA作为模板进行PCR扩增，向200μl EP管中加入以下试剂：10×Taq polymerse Buffer 5μl，dNTP mix(10mmol/L)2μl，引物F(0.01mmol/L)2μl，引物R(0.01mmol/L)2μl，模板2μl，Taq DNA聚合酶1μl，ddH₂O 36μl，共50μl。加完震荡离心EP管。PCR反应程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35cycle；72℃延伸7min。PCR反应结束后取5μl PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示，astacin基因部分片段长度在250bp和500bp之间。

Ⅴ、PCR产物纯化(Gelextractkit(omega))

(1)在紫外灯的照射下，切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量；

(2)加入相同凝胶体积的binding Buffer，混合均匀后，于55℃加热，直至凝胶完全熔化；

(3)将制备柱放入2ml收集管中，把上一步熔化的液体加入制备柱中，10000rpm离心1min；

(4)弃滤液，将制备管置回2ml离心管中，加入700ul DNAWashbuffer(加乙醇)，10000rpm，离心1min；

(5)重复步骤4；

(6)将制备管置回2ml离心管中，13000rpm离心1min，彻底去除残余的液体；

(7)将制备管置于1.5ml离心管中，在制备膜中央，加25～30ul Elution Buffer，室温静置2min，13000rpm离心1min，洗脱DNA；再次把洗脱液吸出，重新洗脱一次，室温静置2min，13000rpm离心1min，洗脱DNA，得纯化DNA。

Ⅵ、感受态细胞的制备

(1)在无抗性的固体LB培养基平板涂布，过夜培养，挑取大肠杆菌单菌落，接种到50ml无抗性的LB液体培养基中，37℃下振荡培养12-14h。将扩培的菌液以1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃条件下，振荡培养2-3h至OD₆₀₀＝0.6-0.8。

(2)无菌条件，把培养液转入离心管中，置冰上10min，让培养物冷却到0℃，而后4℃，4000rpm离心10min；

(3)弃去上清，倒置1min，使残留的培养液流尽；

(4)将10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液悬浮细胞，充分混匀，置冰上30min后，4℃，4000rpm离心10min；

(5)弃去上清，倒置1min，使残留的培养液流尽；

(6)加入4ml预冷含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，悬浮细胞，置冰上5min，即可得到感受态细胞悬液；

(7)每管100μL分装感受态细胞，贮存于-80℃保存备用。

Ⅶ、连接转化扩培

(1)在200ul离心管中加入5ul solutionI、1ul PMD19-T和4ul纯化DNA(载体和目标DNA的比例(质量比)为1:5～1:7)；

(2)震荡离心，在PCR仪中16℃连接30min；

(3)将连接产物加入100ul的DH5α感受态细胞，用枪头反复吹打混匀离心，冰上放置30min；

(4)42℃热激45s后，立即放冰上2min；加入890ul的LB液体培养基；37℃，170rpm摇床振荡培养1h；

(5)将摇好的菌液涂布在含有氨苄抗性的固体平板上；37℃恒温箱培养12-14h；

(6)在长好的平板上挑取单菌落，溶于7ul ddH₂O混匀；取2ul作为模板；试剂添加如下：10×Taqpolymerse Buffer 2.5μl，dNTPmix(10mmol/L)1μl，引物F(0.01mmol/L)1μl，引物R(0.01mmol/L)1μl，模板2μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，ddH₂O 17μl，共25μl。加完振荡离心EP管。PCR反应程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35cycle；72℃延伸7min。PCR反应结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

(7)电泳后在紫外光下照射，将有很亮的目标条带对应的模板菌液进行扩培；接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养14-16h。

Ⅷ、质粒提取和测序(plasmidminikit(omega))

(1)将菌液吸出600μl于2ml EP管中，再加入400μl 50％甘油，用封口胶封好，-80℃保存；

(2)取1.5～5ml菌液室温10000×g离心1min；

(3)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNaseA)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮；

(4)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次(此过程需要非常缓慢)，获得澄清的裂解液；

(5)加350μl溶液Ⅲ，温和反复颠倒数次(此过程需要非常缓慢)，至出现白色絮状沉淀；

(6)室温13000×g离心10min，小心吸取上清，移至容积2ml装配好离心管的吸收柱中；此过程应保证没有吸入沉淀和细胞碎片；室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱；

(7)弃去滤液，加500μl Buffer HB，10000×g离心1min；

(8)弃去滤液，再用100％乙醇稀释的700μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min；

(9)将吸收柱13000×g离心2min，将残留的乙醇去除；

(10)把吸收柱放入1.5ml离心管，加30-50μl(取决于需要的终浓度)ddH₂O或EB缓冲液在滤膜上，静置2min，13000×g离心1min后，将EP管中的溶液吸出再次加入吸收柱，静置2min，13000×g离心1min；

(11)检测：分别在260nm和280nm波长下测定；送测序。

测序结果如SEQIDNO：4所示，将该序列用blast搜索，发现其与北欧鳌虾的astacin基因相似度最高达到100％，因此初步判定该序列为红螯螯虾的astacin基因的部分片段。

实施例3RACE扩增astacin基因全长

Ⅰ、RACE引物设计

在已知astacin部分序列的基础上设计RACE引物。

5’race引物序列如下：

5’Outer-F：GCTGATGGCGATGAATGAACACTG；SEQIDNO：13；

5’Inner-F：CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG；SEQIDNO：14；

5’Inner-R：CATTCCACCCAAACGACCGACATA；SEQIDNO：15；

5’Outer-R：GTAAGAGTCACGGTCCATACGAGT；SEQIDNO：16。

3’race引物序列如下：

3’Outer-R：GCGAGCACAGAATTAATACGACT；SEQIDNO：17；

3’Inner-R：CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG；SEQIDNO：18；

3’Inner-F：ATGAGCACACTCGTATGGACCG；SEQIDNO：19；

3’Outer-F：GTGGTTCAGGGTGTTGGTCATA；SEQIDNO：20。

Ⅱ、PCR扩增(FirstChoiceRLM-RACE试剂盒)

(1)5’RACE

①使用CIP处理RNA，在PCR仪上37℃孵育1h；

②终止CIP反应，分别用苯酚酸和氯仿纯化RNA；

③加异丙醇沉淀RNA，之后用75％的乙醇清洗RNA；

④添加Nuclease-free Water溶解RNA沉淀；

⑤用TAP处理步骤4得到的RNA溶液，在PC仪上37℃孵育1h；

⑥在5’RACE端连接Adapter；

⑦反转录获得cDNA；

⑧Outer 5’PCR，PCR反应程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35cycle；72℃延伸7min；

⑨Inner 5’PCR，向200μL EP管中加入1-2μL上一步Outer5’PCR产物，5μL 10X PCRBuffer，4μL dNTP Mix，10μM 5'RACE gene-specific inner primer，2μL 5'RACE innerPrimer，0.25μLthermostable DNApolymerase，补充Nuclease-free Water至50μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，57℃30s，72℃30s，共35cycle；72℃延伸7min。PCR结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图3所示，astacin 5’RACE序列长度在250bp左右。

(2)3’RACE

①将提取的RNA进行反转录；

②Outer 3’PCR，向200μL EP管中加入1μLRNA，5μL 10X PCR Buffer，4μL dNTPMix，10μM 3'RACE gene-specific outer primer，3μL 3'RACE Outer Primer，0.25μLthermostable DNApolymerase，补充Nuclease-free Water至50μL。PCR程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，53℃30s，72℃30s，共35cycle，72℃延伸7min。

③Inner 3’PCR，向200μL EP管中加入1-2μL上一步Outer3’PCR产物，5μL 10X PCRBuffer，4μL dNTP Mix，10μM 3'RACE gene-specific inner primer，2μL 3'RACE innerPrimer，0.25μLthermostable DNApolymerase，补充Nuclease-free Water至50μL。PCR程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，57℃30s，72℃30s，共35cycle；72℃延伸7min。PCR结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图4所示，astacin 3’RACE序列长度在499bp左右。

Ⅲ、连接转化扩培

将5’RACE和3’RACE获得的目标基因与PMD19-T连接，转入DH5α感受态细胞，涂板，菌落PCR，扩培。(详细步骤同实施例1步骤Ⅶ)

Ⅳ、质粒提取和测序

将扩培的菌液离心提质粒送去测序。(详细步骤同实施例1步骤Ⅷ)

5’RACE测序结果如SEQIDNO：5所示；

3’RACE测序结果如SEQIDNO：6所示。

实施例4astacin全长基因的克隆

Ⅰ、引物设计

全长基因由astacin部分序列+5’RACE序列+3’RACE序列拼接得到，然后根据拼接序列设计引物进行全长基因克隆。

astacin全长基因的引物序列如下：

W-F：AATATCTTTGGCCAGGTGGTG；SEQIDNO：21；

W-R：TTAAGTAATAATACTTTATTTGCAGTAGGC；SEQIDNO：22。

Ⅱ、PCR扩增

向200μl EP管中加入以下试剂：10×Taq polymerse Buffer 5μl，dNTP mix(10mmol/L)2μl，引物F(0.01mmol/L)2μl，引物R(0.01mmol/L)2μl，模板2μl，Taq DNA聚合酶1μl，ddH₂O 36μl，共50μl。PCR反应程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，50℃30s，72℃40s，共35cycle；72℃延伸7min。PCR结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图5所示，astacin全长基因序列长度在750bp左右。

Ⅲ、连接转化扩培

将astacin全长基因与载体PMD19-T连接，转入DH5α大肠杆菌感受态，小摇，涂板，菌落PCR扩培。(详细步骤同实施例1步骤Ⅶ)

Ⅳ、质粒提取和测序

根据测序结果，找出完全相同的序列，astacin全长基因序列如SEQIDNO：1所示。

Ⅴ、生物信息学分析

(1)利用DNAman7.0找出红螯螯虾astacin基因的ORF阅读框，NCBI在线，利用Blastp搜索比对。

如图6所示，plus3即为astacin基因的ORF阅读框，其序列如SEQIDNO：2所示。

(2)将其ORF序列转换为氨基酸序列，利用DNAman7.0将红螯螯虾astacin基因的ORF的氨基酸序列(如SEQ ID NO：3所示)与其家族的其他氨基酸序列：1：北欧鳌虾(Astacus_astacus)；2：马来丝虫(Brugia_malayi)；3：新小杆线虫(Caenorhabditis_briggsae)；4：秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis_remanei)；5:红螯螯虾：(Cherax_quadricarinatus)；6：鲤鱼(Cyprinus_carpio)；7：大乳头水蛭(Hydra_magnipapillata)；8：凡纳滨对虾(Litopenaeus_vannamei)；9：帝王蟹(Paralithodes_camtschaticus)；进行比对。结果如图7所示，该蛋白具备其家族蛋白固有的HEXXHXXGXXXH和SXMHY保守区域。进一步确定该序列的确为红螯螯虾的astacin基因全长序列。

(3)利用MEGA5.0进行进化树分析。

在线下载15个其他物种的astacin氨基酸序列，1：北欧鳌虾(Astacus_astacus)；2：合浦珠母贝(Pinctada_fucata)；3：大乳头水蛭(Hydra_magnipapillata)；4：太平洋牡蛎(Crassostrea_gigas)；5：秀丽隐杆线虫(Caenorhabditisremanei)；6：斑马鱼(Daniorerio)；7：新小杆线虫(Caenorhabditis_briggsae)；8：紫海胆(Strongylocentrotus_purpuratus)；9：靑鳉(Oryzias_latipes)；10：马来丝虫(Brugia_malayi)；11：美洲鲎(Limulus_polyphemu)；12：鲤鱼(Cyprinus_carpio)；13：克氏螯虾(Procambarus_clarkii)；14拉斯加帝王虾(Paralithodes_camtschaticus)；15：凡纳滨对虾(Litopenaeus_vannamei)。

利用MEGA5.0进行进化树分析。结果如图8所示，红螯螯虾(Cherax_quadricarinatus)和克氏螯虾(Procambarus_clarkii)与北欧螯虾(Astacus_astacus)的亲缘性最近。

实施例5表达载体的构建

Ⅰ、引物设计

利用ORF finder，找到红螯螯虾astacin基因的ORF，在ORF序列两端设计添加酶切位点的引物，引物序列如下：

ORF-F：gcGTCGACATGCAAGAACTTGAAGAGATG；SalI；SEQIDNO：23；

ORF-R：gcCTCGAGCTATTTCCTTAGGCTGCATTCAT；Xhol；SEQIDNO：24。

其中，小写字母gc为保护碱基；划横线的部分为酶切位点。

Ⅱ、给目的基因添加酶切位点

向200μl EP管中添加以下试剂：10×Taq polymerse Buffer 5μl，dNTP mix(10mmol/L)2μl，引物ORF-F(0.01mmol/L)2μl，引物ORF-R(0.01mmol/L)2μl，模板2μl，TaqDNA聚合酶1μl，ddH₂O 36μl，共50μl。加完震荡离心EP管。PCR反应程序为：94℃预变性5min；循环程序变性94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35cycle；72℃延伸7min。PCR反应结束后，PCR产物全部进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，获得含有酶切位点的目的基因。

Ⅲ、测序

将上述获得的含有酶切位点的目的基因与PMD19-T连接，转化，筛选，扩培，提质粒送去测序。选出100％正确的序列。

Ⅳ、双酶切

将连有测序100％正确的目标基因的PMD19-T载体进行双酶切，双酶切加样体系如下：

在200μl EP管中加入质粒(2μg)5μl，Green Buffer 2μl，Sal I 1μl，Xho l 1μl，ddH₂O 12μl，总体积20μl。

加完样振荡离心，放在PCR仪上37℃30min，80℃10min。结束后，产物全部进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。切胶回收，获得加酶切位点序列100％正确的目标基因。用相同的方法对PET-28b(带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签)进行双酶切获得线状PET-28b表达载体。

Ⅴ、连接

将目标基因ORF与PET-28b载体连接，加样体系如下：在200μl EP管中加入线状PET-28b(20ng)1μl，目标DNA(100ng)5μl，T4DNA连接酶1μl，T4DNA连接酶buffer 0.5μl，ddH₂O 1.5μl，总体积10μl。加完样振荡离心，放在PCR仪上16℃ 60min。

Ⅵ、提质粒测序

连接完毕，转化，涂板，筛选，扩培提质粒。将构建好的表达载体送测序，测序结果，利用DNAman进行比对，确认表达载体pET28b-astacin/ORF已经构建成功。

利用SaII和XhoI酶将载体进行双酶切后进行电泳，结果如图9所示，在500bp左右出现了目标条带。

实施例6重组蛋白的表达、鉴定及蛋白免疫印迹验证

Ⅰ、astacin蛋白的诱导表达

把构建好的表达载体pET28b-astacin/ORF转入E.coliBL21大肠杆菌感受态细胞中，然后在含60μg/mL卡那霉素的固体LB平板上涂布，37℃培养过夜，挑阳性E.coliBL21单菌落，接种于含60μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中扩培，37℃振荡培养14-16h。将上述菌液1:100接种于100mL含60μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇瓶培养约4h后，即OD₆₀₀＝0.6时迅速加入诱导剂IPTG继续培养(培养液IPTG的最终浓度为1mM/L)4h，诱导外源蛋白的表达。

Ⅱ、表达蛋白的鉴定

取2mL诱导后的菌液，12000rpm离心1min后，弃去上清，菌体用100μL裂解缓冲液悬浮，得悬浮菌液。取20μL悬浮菌液，加入5μL上样缓冲液混匀，100℃煮沸10min，短暂离心后以微量进样器依次上样20μL，进行全菌的蛋白电泳鉴定。

Ⅲ、SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE凝胶配方如下：

SDS-PAGE凝胶电泳以5μL低分子量蛋白标准Marker作为电泳分子量指示，将样品以微量进样器依次上样10μL；60-100V电压开始电泳，待样品进入分离胶后加大电压150-200V电泳；样品迁移至分离胶底部后关闭电源；取下电泳后的凝胶，将凝胶放在培养皿中，用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡凝胶，放在脱色摇床缓慢染色40min；用去离子水冲洗凝胶，再用考马斯亮蓝脱色液浸泡凝胶，放在脱色摇床上缓慢摇动1h，定期更换脱色液；等到凝胶背景清晰后，拍照。结果如图10所示，转入表达载体的E.coliBL21经诱导表达后，进行SDS-PAGE全菌凝胶电泳，可以看到诱导组在20KDa-25KDa之间有清晰的条带，而空白对照组对应位置没有蛋白条带。

Ⅳ、Westernblot(蛋白免疫印迹)

按蛋白样品和loadingbuffer的比例为4:1的量，向蛋白样品中加loading buffer后，沸水浴10min，完毕后上样电泳。经过转膜、用5％脱脂牛奶封闭、靶蛋白与第一抗体结合、与第二抗体反应、显色、曝光完成蛋白免疫印迹试验。

结果如图11所示，目标蛋白经过一抗和二抗的孵育后，通过ECL检测，的确发出了荧光，由此可以说明红螯螯虾的astacin蛋白经过IPTG诱导，表达成功。

所用试剂如下：

(1)1.5mol/LTris(PH8.8)100ml

称取Tris碱18.17g放入大烧杯中。加入约80ml去离子水，充分搅拌溶解。用浓盐酸调节pH值至8.8。定容至100ml。高压灭菌后，室温保存。

(2)1mol/LTris(PH6.8/8.0)各100ml

称取Tris碱12.11g加入大烧杯中。加入约80ml去离子水，充分搅拌溶解。加入浓盐酸调节所需的pH值。定容至100ml。高压灭菌后，室温保存。

(3)30％丙烯酰胺(100ml)

称量下列试剂置于烧杯中。丙烯酰胺(Acrylamide)29g，亚甲基双丙烯酰胺1g，加入约60ml去离子水，充分搅拌溶解。定容至100ml后，使用0.45μm滤膜将杂质滤去。于棕色瓶中4℃避光保存。

(4)10％SDS

称取10g电泳级的SDS加入大烧杯中。加入去离子水约90ml，68℃条件加热溶解。定容至100ml，室温保存。

(5)10％过硫酸铵

称量1g过硫酸铵。加入约10ml去离子水后搅拌溶解。分装后储存于-20℃。

(6)TEMED 4℃避光保存。

(7)5×SDS－PAGE Loading Buffer(上样缓冲液)(5ml)

称量下列试剂置于10ml塑料离心管中。1M Tris·Cl(pH 6.8)1.25ml，SDS(电泳级)0.5g，溴酚蓝(BPB)25mg，甘油2.5ml，β-巯基乙醇0.25ml。加去离子水溶解后定容至5ml。

(8)5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)(1L)

称量下列试剂置于烧杯中。Tris 15.1g，Glycine 94g，10％(W/V)SDS(电泳级)50ml，加入约900ml去离子水搅拌溶解。定容至1L(母液)，室温或4℃保存。

(9)10×Transfer Buffer(膜转移缓冲液)(1L)

称量下列试剂置于烧杯中。Tris 58g，Glycine 29g，SDS(电泳级)3.7g加入去离子水600ml，充分溶解。定容至800ml(母液),4℃保存。

(10)10×TBSTWash Buffer(洗膜液)

称量下列试剂置于烧杯中。NaCl 88g，1M Tris-HCL((PH8.0)200ml加入600ml去离子水，充分搅拌溶解。加入Tween205ml后,充分混匀。定容至1L(母液)，4℃保存。

(11)Blocking Buffer(封闭液):

1g脱脂奶粉加入20ml的TBST Wash Buffer中，搅拌溶解，4℃或-20℃保存。

(12)一抗二抗稀释液1×TBST Wash Buffer或1％脱脂奶。

实施例7astacin重组蛋白的纯化、复性及浓缩

Ⅰ、astacin重组蛋白的纯化

(1)向扩培菌液中加入IPTG，诱导4-6h，使OD值达到0.6-0.8，10000-12000rpm，离心10-15min，收集菌体；

(2)用菌体破碎液悬浮菌体沉淀，超声30-40min(工作3s，间隔8s)，10000-12000rpm，离心10-15min，收集沉淀；

(3)用蛋白洗涤液超声5-10min(工作3s，间隔8s)，悬浮沉淀，10000-12000rpm，离心10-15min，收集沉淀；

(4)重复步骤(3)，共洗涤沉淀三次；

(5)用蛋白溶解液1超声5-10min(工作3s，间隔8s)悬浮沉淀后，37℃，孵育30-40min，10000-12000rpm，离心10-15min，收集沉淀；

(6)用蛋白溶解液2超声5-10min(工作3秒，间隔8秒)悬浮沉淀后，37℃，孵育30-40min，10000-12000rpm，离心10-15min，收集上清即为纯化后的蛋白。

Ⅱ、astacin重组蛋白的复性及浓缩

(1)将纯化后的蛋白稀释于稀释复性液中，使蛋白最终浓度为8-10μg/μl，置于4℃，20-24h；

(2)取10ml稀释复性液透析于1L透析液1中，置于4℃，10-12h；

(3)将稀释复性液透析于1L透析液2中，置于4℃，3-4h；

(4)用浓缩管对稀释复性液进行浓缩，5000-6000rpm，30-40min。

经洗涤，复性，浓缩后的目标蛋白如图12所示。

所用试剂如下：

(1)菌体破碎液：50mM Tris-HCL，PH8.0，1.0M NaCl。

(2)蛋白洗涤液：5％Triton-X-100，50mM Tris-HCl，PH8.0。

(3)蛋白溶解液1：50mM Tris-HCl buffer，PH8.0，1M Urea，1mM EDTA。

(4)蛋白溶解液2：50mM Tris-HCl buffer，PH8.0，8M Urea，0.1Mβ-巯基乙醇，1mMEDTA。

(5)稀释复性液：50mM Tris-HCl buffer，PH8.0，1mM GSH，0.1mM GSSH，0.8M精氨酸。

(6)透析液1：50mM Tris-HCl buffer，PH8.0，0.1μmol Zn²⁺。

(7)透析液2：50mM Tris-HCl buffer，PH8.0。

实施例8astacin重组蛋白的功能鉴定

Ⅰ、明胶降解功能鉴定

(1)SDS-PAGE凝胶制备：将一定量的gelatin加入15％分离胶中共聚，使其终浓度为0.01％；

(2)样品制备：将复性后的蛋白液(2.5ug)与loadingbuffer(不含β-巯基乙醇)按比例4：1混匀后，20℃孵育30min；

(3)SDS-PAGE电泳：在4℃下进行电泳，维持电流25mA；

(4)洗脱SDS：取下玻璃板上的凝胶，用含2.5％(v/v)TritonX-100的SDS洗脱液清洗两次，每次30min以除去凝胶中的SDS；

(5)漂洗：用漂洗液漂洗凝胶3次，每次5min，以洗去凝胶上残留的SDS洗脱液；

(5)孵育：室温，孵育液孵育16h；

(6)染色，脱色：使用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色后用脱色液进行脱色。

astacin重组蛋白对明胶降解功能鉴定结果如图13所示，白色条带即为目标蛋白降解明胶结果，可见目标蛋白对明胶具有降解作用。

Ⅱ、降解纤连蛋白及纤维原蛋白功能鉴定

(1)将纤连蛋白和纤维蛋白原分别与复性后的astacin蛋白液按照浓度比为25：1在37℃下孵育16h；

(2)将混合液与loading Buffer按照5：1的比例混匀，100℃煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳；纤连蛋白和纤维蛋白原分别在7.5％和10％的分离胶和5％的浓缩胶中进行电泳。

对照组：a.空白对照：在缺少复性后的蛋白液的条件下孵育纤连蛋白和纤维原蛋白，其余条件和步骤与上述相同。

astacin重组蛋白降解纤连蛋白结果如图14所示，astacin重组蛋白降解纤维原蛋白功能鉴定结果如图15所示，可见目标蛋白对纤连蛋白和纤维原蛋白没有明显的降解作用。

所用试剂如下：

(1)loading buffer(不含β-巯基乙醇)5ml：SDS(电泳级)0.5g，溴酚蓝25mg，甘油2.5ml，1M Tris-HCl(PH6.8)1.25ml。

(2)SDS洗脱液：100ml 50mM Tris-HCl buffer，PH8.0，2.5％Triton。

(3)漂洗液：50mM Tris-HCl buffer，PH8.0，0.1μmol Zn²⁺。

(4)孵育液：50mM Tris-HCl buffer，PH8.0。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种红螯螯虾孵化酶基因及其应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 740

<212> DNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 1

atctttggcc aggtggtgtc atcccataca ccctggcaga tgatgttacc aatgaagagc 60

aagcagcaat cattagtggg atgcaagaac ttgaagagat gacttgcatc cgttttttgc 120

ccagaaccac cgaagccgac tatattgaaa ttttcaccag tggctcagga tgttggtcat 180

atgtcggtcg tttgggtgga atgcagcaag tgtccctgca aagcagtggt tgcatttacc 240

atggtactat tatccatgag ttgatgcatt caatcggctt ctaccatgag cacactcgta 300

tggaccgtga ctcttacgtc cacattaatt atgaaaatgt cgagccttca tacacgtatg 360

ccttcgacat tgatacatac tcccgctacg ttggcgaaga ttaccagtac tacagcataa 420

tgcactatgg caagtattcc ttctccatac agtggggagt cttggagacc attgtagccc 480

tgcaagatgg cattgatctc actgatcctt atgataaggc tcatatgctc caaactgatg 540

ctaaccagat caataacctt tatacaaatg aatgcagcct aaggaaatag agatctcata 600

actgaggtcc acatgcatac aacccattct cttaagcata tgtttaagaa atgtcaaagc 660

attttatcca cagtggtata ttaccagaca ttctgataaa atatgacttt gcctactgca 720

aataaagtat tattacttaa 740

<210> 2

<211> 510

<212> DNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 2

atgcaagaac ttgaagagat gacttgcatc cgttttttgc ccagaaccac cgaagccgac 60

tatattgaaa ttttcaccag tggctcagga tgttggtcat atgtcggtcg tttgggtgga 120

atgcagcaag tgtccctgca aagcagtggt tgcatttacc atggtactat tatccatgag 180

ttgatgcatt caatcggctt ctaccatgag cacactcgta tggaccgtga ctcttacgtc 240

cacattaatt atgaaaatgt cgagccttca tacacgtatg ccttcgacat tgatacatac 300

tcccgctacg ttggcgaaga ttaccagtac tacagcataa tgcactatgg caagtattcc 360

ttctccatac agtggggagt cttggagacc attgtagccc tgcaagatgg cattgatctc 420

actgatcctt atgataaggc tcatatgctc caaactgatg ctaaccagat caataacctt 480

tatacaaatg aatgcagcct aaggaaatag 510

<210> 3

<211> 169

<212> PRT

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 3

Met Gln Glu Leu Glu Glu Met Thr Cys Ile Arg Phe Leu Pro Arg Thr

1 5 10 15

Thr Glu Ala Asp Tyr Ile Glu Ile Phe Thr Ser Gly Ser Gly Cys Trp

20 25 30

Ser Tyr Val Gly Arg Leu Gly Gly Met Gln Gln Val Ser Leu Gln Ser

35 40 45

Ser Gly Cys Ile Tyr His Gly Thr Ile Ile His Glu Leu Met His Ser

50 55 60

Ile Gly Phe Tyr His Glu His Thr Arg Met Asp Arg Asp Ser Tyr Val

65 70 75 80

His Ile Asn Tyr Glu Asn Val Glu Pro Ser Tyr Thr Tyr Ala Phe Asp

85 90 95

Ile Asp Thr Tyr Ser Arg Tyr Val Gly Glu Asp Tyr Gln Tyr Tyr Ser

100 105 110

Ile Met His Tyr Gly Lys Tyr Ser Phe Ser Ile Gln Trp Gly Val Leu

115 120 125

Glu Thr Ile Val Ala Leu Gln Asp Gly Ile Asp Leu Thr Asp Pro Tyr

130 135 140

Asp Lys Ala His Met Leu Gln Thr Asp Ala Asn Gln Ile Asn Asn Leu

145 150 155 160

Tyr Thr Asn Glu Cys Ser Leu Arg Lys

165

<210> 4

<211> 375

<212> DNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 4

ccagtggttc agggtgttgg tcctatgtgg gacgaataag tggagcgcag caggtgtcac 60

tgcaagccaa tggttgtgtt taccatggca ccatcatcca tgagctcatg catgccattg 120

gcttctacca tgagcacacc cgtatggacc gagacaacta cgtcactatt aactatcaaa 180

atgttgatcc ttcaatgacg tccaacttcg acattgacac ctactcgcgc tatgtgggtg 240

aggattacca gtactacagc ataatgcact acggcaagta ctccttctcc atacagtggg 300

gagtcctcga gaccattgta cctctgcaaa acggtattga tctcactgac ccttatgata 360

aagctcacat gctgc 375

<210> 5

<211> 241

<212> DNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 5

cgcggatccg aacactgcgt ttgctggctt tgatgaatat ctttggccag gtggtgtcat 60

cccatacacc ctggcagatg atgttaccaa tgaagagcaa gcagcaatca ttagtgggat 120

gcaagaactt gaagagatga cttgcatccg ttttttgccc agaaccaccg aagccgacta 180

tattgaaatt ttcaccagtg gctcaggatg ttggtcatat gtcggtcgtt tgggtggaat 240

g 241

<210> 6

<211> 469

<212> DNA

<213> Cherax quadricarinatus

<400> 6

atgagcacac tcgtatggac cgtgactctt acgtccacat taattatgaa aatgtcgagc 60

cttcatacac gtatgccttc gacattgata catactcccg ctacgttggc gaagattacc 120

agtactacag cataatgcac tatggcaagt attccttctc catacagtgg ggagtcttgg 180

agaccattgt agccctgcaa gatggcattg atctcactga tccttatgat aaggctcata 240

tgctccaaac tgatgctaac cagatcaata acctttatac aaatgaatgc agcctaagga 300

aatagagatc tcataactga ggtccacatg catacaaccc attctcttaa gcatatgttt 360

aagaaatgtc aaagcatttt atccacagtg gtatattacc agacattctg ataaaatact 420

gactttgcct actgcaaata aagtattatt acttaaaaaa aaaaaaacc 469

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tcccatacac cctggcagat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ccacccaaac gaccgacata 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

catgcccgtt cttagttggt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gtgcggccca gaaatataaa 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccagtggttc agggtgtt 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gcagcatgtg agctttatc 19

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gctgatggcg atgaatgaac actg 24

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cgcggatccg aacactgcgt ttgctggctt tgatg 35

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

cattccaccc aaacgaccga cata 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gtaagagtca cggtccatac gagt 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gcgagcacag aattaatacg act 23

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

cgcggatccg aattaatacg actcactata gg 32

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

atgagcacac tcgtatggac cg 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gtggttcagg gtgttggtca ta 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

aatatctttg gccaggtggt g 21

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

ttaagtaata atactttatt tgcagtaggc 30

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gcgtcgacat gcaagaactt gaagagatg 29

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gcctcgagct atttccttag gctgcattca t 31

Claims

1.红螯螯虾孵化酶astacin基因，其特征在于，所述红螯螯虾孵化酶astacin基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.红螯螯虾孵化酶astacin基因的ORF，其特征在于，所述红螯螯虾孵化酶astacin基因的ORF的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

3.红螯螯虾孵化酶，其特征在于，所述红螯螯虾孵化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，所述红螯螯虾孵化酶由红螯螯虾孵化酶astacin基因的ORF编码。

4.一种包含红螯螯虾孵化酶astacin基因全长序列的工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(3)通过测序得到的5’RACE序列和3’RACE序列获得astacin基因全长序列，连接PMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，获得含有红螯螯虾孵化酶astacin基因的工程菌；从所述工程菌中提取携带有astacin基因全长序列的PMD19-T质粒，测序，获得astacin基因全长序列；

所述红螯螯虾孵化酶astacin基因全长序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

5.根据权利要求4所述的一种包含红螯螯虾孵化酶astacin基因全长序列的工程菌的构建方法，其特征在于，所述工程菌在制备红螯螯虾孵化酶中的应用。

6.一种诱导、纯化红螯螯虾孵化酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)根据astacin基因全长序列确定红螯螯虾astacin基因的ORF；所述红螯螯虾孵化酶astacin基因的ORF的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；

(2)将ORF与pET28b载体连接，构建重组表达载体pET28b-astacin/ORF，转化DH5α感受态细胞，获得pET28b-astacin/ORF质粒；

(4)对astacin/ORF重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。

7.一种复性异源表达红螯螯虾孵化酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)利用超声波破碎法对astacin/ORF重组蛋白进行纯化；

④重复步骤③，共洗涤沉淀三次；

(2)利用稀释复性法对astacin/ORF重组蛋白进行复性，浓缩；

②取10ml稀释复性液透析于1L透析液1中，置于4℃，10-12h；

③将稀释复性液透析于1L透析液2中，置于4℃，3-4h；

④用浓缩管对稀释复性液进行浓缩，5000-6000rpm，30-40min；

所述红螯螯虾孵化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

8.根据权利要求7所述的一种复性异源表达红螯螯虾孵化酶的方法，其特征在于，所述蛋白溶解液1为50mM Tris-HCl buffer，pH8.0，1M Urea，1mM EDTA；所述蛋白溶解液2为50mM Tris-HCl buffer，pH8.0，8M Urea，0.1Mβ-巯基乙醇，1mM EDTA；所述稀释复性液为50mM Tris-HCl buffer，pH8.0，1mM GSH，0.1mM GSSH，0.8M精氨酸；所述透析液1为50mMTris-HCl buffer，pH8.0，0.1μmol Zn²⁺；所述透析液2为50mM Tris-HCl buffer，pH8.0。

9.红螯螯虾孵化酶在提高红螯螯虾孵化率中的应用；所述红螯螯虾孵化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

10.红螯螯虾孵化酶在大规模养殖中的应用；所述红螯螯虾孵化酶的氨基酸序列为SEQID NO：3。