CN111034656A - 一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，包括以下步骤：S1、收集受精卵；S2、孵化收集到的受精卵，将收集到的受精卵放到溶液A中进行孵化，待孵化完成后，收集孵化液；S3、孵化酶的浓缩和部分纯化。本发明工艺简单规范，可操作性强，得率高，而且能够长期保存，通过本发明获得的孵化酶可以大大提高青鳉的孵化率，充分利用青鳉资源，同时，在孵化液的浓度足够高时，可用于除去卵囊，孵化酶还通过浓缩和部分纯化进一步有效地溶解卵囊，使得对青鳉胚胎进行显微注射和细胞移植成为简易方便的操作，便于后续研究和操作。
Description
技术领域
本发明属于，具体涉及一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法。
背景技术
青鳉(Oryzias latipes)具有体型较小、性别差异明显、世代周期短、产卵率高，鱼卵和幼体对环境中各类污染物的干预敏感，盐度适应范围广等特性，目前已被推荐为“一种理想的用于研究的模式鱼种”。青鳉受精卵的卵包膜(卵囊)非常硬，由较薄的外层(约0.3μm厚)和较厚(约15μm)的多层内层组成(如图1所示)。许多短绒毛附着在卵壳的外表面，长的附着丝位于植物极上。受精后，卵囊变得越来越硬，且不溶解在变性剂，如十二烷基硫酸钠、尿素和氯化胍中。这个硬化被认为是由(γ-谷氨酰)赖氨酸等肽的形成引起的转谷氨酰胺酶作用下卵囊亚单位蛋白间的交联(γ-glu--lys)。
构成卵囊的内层是糖蛋白，当青鳉胚胎孵化(受精后4-5天，4-5dpf)时，卵囊的内层被孵化酶完全溶解，而较薄的外层则不被酶消化，被胚胎的运动机械性地破坏。青鳉孵化酶由两种蛋白酶组成：高脉络膜溶解酶(脉络膜溶素H或HCE；酶代码EC3.4.24.67)和低脉络膜溶解酶(脉络膜溶素L或LCE；EC3.4.24.66)。这两种酶协同消化卵囊内层：HCE部分消化内层并使其显著膨胀；相反，LCE有效溶解肿胀的内层，但几乎不影响完整的内层。两种酶都是属于虾青素家族的锌蛋白酶，它们的成熟形式(200个氨基酸)是55％相同的。
青鳉鱼作为模式动物，其卵囊比斑马鱼卵囊更厚更硬，用镊子很难剥除。这使得在青鳉受精卵发育的早期阶段(受精后1小时，1hpf)，采用显微注射、体细胞移植、核移植等需要去膜才能进行的生物技术操作中在青鳉中显得尤为困难。此外，目前没有可买到的商业蛋白酶能有效消化青鳉卵囊。因此，研发和制备青鳉孵化酶，从活胚胎中除去卵囊，使得对青鳉胚胎进行显微注射和细胞移植成为简易方便的操作，是十分必要且具备较大市场潜力的方向。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，包括以下步骤：
S1、收集受精卵；
S2、孵化收集到的受精卵，将收集到的受精卵放到溶液A中进行孵化，待孵化完成后，收集孵化液；
S3、孵化酶的浓缩和部分纯化，包括以下步骤：
S31、向孵化液中加入1/20体积的1m Tris HCl，以达到50mm的浓度；
S32、将孵化液涂在与50mm Tris HCl平衡的阳离子交换柱上，在此过程中，HCE和LCE是碱性蛋白质，它们大部分吸附在柱上，但消化的卵囊物质是酸性的，因此可以通过阳离子交换柱；
S33、用相同的缓冲液清洗色谱柱，然后用0.4M NaCl和50M Tris HCl洗脱吸附蛋白质；监测观察上述酶溶液在280nm处的吸光度，该酶在刚具有空隙体积被洗脱后，出现一个尖锐的蛋白质峰，然后用10mM NaCl和50mM Tris HCl对峰值部分进行透析，并在0-4℃下保存，即获得孵化酶溶液。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S1收集受精卵后，把囊胚期的卵摊放在滤纸之间或在细尼龙网中揉搓，用以去除附着的碎片杂物，其中，细尼龙网的孔径小于50μm。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S2中溶液A为自来水或含10mm NaCl、2mmNaHCO3、100单位/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素中至少一种混合液。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤S2中孵化温度为24-30℃，孵化时，每2天，取出死卵，并在含10mm NaCl和2mm NaHCO3的溶液中用倾析法清洁活卵，以防真菌和细菌感染。
作为本发明的一种优选技术方案，孵化酶的活性在0-4℃下稳定数月，但冷冻可能导致酶变性，使用1-4毫升小体积柱浓缩和部分纯化孵化酶。
作为本发明的一种优选技术方案，阳离子交换柱包括交换柱和阳离子交换材料，交换柱为中空的柱体结构，交换柱的顶部设有液体进口，交换柱的底部设有液体出口，阳离子交换材料设置于交换柱的内壁上，孵化液在经过阳离子交换柱的时候，因为阳离子交换柱本身是带阳离子正电荷，正负相吸使得HCE和LCE蛋白就会留在交换柱的内壁上，同性相斥使得孵化酶从液体出口流出。
本发明的有益效果是：本发明工艺简单规范，可操作性强，得率高，而且能够长期保存，通过本发明获得的孵化酶可以大大提高青鳉的孵化率，充分利用青鳉资源，同时，在孵化液的浓度足够高时，可用于除去卵囊，孵化酶还通过浓缩和部分纯化进一步有效地溶解卵囊，使得对青鳉胚胎进行显微注射和细胞移植成为简易方便的操作，便于后续研究和操作。
附图说明
图1是青鳉受精卵的结构示意图。
图2是本发明一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法的工作流程图。
图3是本发明一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法中离子交换原理的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
为了达到本发明的目的，如图2所示，在本发明的其中一种实施方式中提供一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，包括以下步骤：
S1、收集受精卵；
收集受精卵后，把囊胚期的卵摊放在滤纸之间或在细尼龙网中揉搓，用以去除附着的碎片杂物，其中，细尼龙网的孔径小于50μm；具体方式可以根据实际情况选择，而不仅限于本实施例的方式；
S2、孵化收集到的受精卵，将收集到的受精卵放到溶液A中进行孵化，待孵化完成后，收集孵化液；
其中，溶液A为含10mm NaCl、2mm NaHCO3、100单位/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素中至少一种混合液；
另外，孵化温度为24-30℃，孵化时，每2天，取出死卵，并在含10mm NaCl和2mmNaHCO3的溶液中用倾析法清洁活卵，以防真菌和细菌感染，保证超过90％的胚胎在一个批次中孵化；
S3、孵化酶的浓缩和部分纯化，包括以下步骤：
S31、向孵化液中加入1/20体积的1m Tris HCl，以达到50mm的浓度；
S32、将孵化液涂在与50mm Tris HCl平衡的阳离子交换柱上，在此过程中，HCE和LCE是碱性蛋白质，它们大部分吸附在柱上，但消化的卵囊物质是酸性的，因此可以通过阳离子交换柱(如图3所示)；
S33、用相同的缓冲液清洗色谱柱，然后用0.4M NaCl和50M Tris HCl洗脱吸附蛋白质；监测观察上述酶溶液在280nm处的吸光度，该酶在刚具有空隙体积被洗脱后，出现一个尖锐的蛋白质峰，然后用10mM NaCl和50mM Tris HCl对峰值部分进行透析，并在0-4℃下保存，即获得孵化酶溶液。
其中，孵化酶的活性在0-4℃下稳定数月，但冷冻可能导致酶变性，使用1-4ml小体积柱浓缩和部分纯化孵化酶。
具体的，阳离子交换柱包括交换柱和阳离子交换材料，交换柱为中空的柱体结构，交换柱的顶部设有液体进口，交换柱的底部设有液体出口，阳离子交换材料设置于交换柱的内壁上，孵化液在经过阳离子交换柱的时候，因为阳离子交换柱本身是带阳离子正电荷，正负相吸使得HCE和LCE蛋白就会留在交换柱的内壁上，同性相斥使得孵化酶从液体出口流出。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、收集受精卵；
S2、孵化收集到的受精卵，将收集到的受精卵放到溶液A中进行孵化，待孵化完成后，收集孵化液；
S3、孵化酶的浓缩和部分纯化，包括以下步骤：
S31、向孵化液中加入1/20体积的1m Tris HCl，以达到50mm的浓度；
S32、将孵化液涂在与50mm Tris HCl平衡的阳离子交换柱上，在此过程中，HCE和LCE是碱性蛋白质，它们大部分吸附在柱上，但消化的卵囊物质是酸性的，因此可以通过阳离子交换柱；
S33、用相同的缓冲液清洗色谱柱，然后用0.4M NaCl和50M Tris HCl洗脱吸附蛋白质；监测观察上述酶溶液在280nm处的吸光度，该酶在刚具有空隙体积被洗脱后，出现一个尖锐的蛋白质峰，然后用10mM NaCl和50mM Tris HCl对峰值部分进行透析，并在0-4℃下保存，即获得孵化酶溶液。
2.根据权利要求1所述的基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，其特征在于，步骤S1收集受精卵后，把囊胚期的卵摊放在滤纸之间或在细尼龙网中揉搓，用以去除附着的碎片杂物，其中，细尼龙网的孔径小于50μm。
3.根据权利要求1所述的基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，其特征在于，步骤S2中溶液A为自来水或含10mm NaCl、2mm NaHCO3、100单位/毫升青霉素、100毫克/毫升链霉素中至少一种混合液。
4.根据权利要求1所述的基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，其特征在于，步骤S2中孵化温度为24-30℃，孵化时，每2天，取出死卵，并在含10mm NaCl和2mm NaHCO3的溶液中用倾析法清洁活卵，以防真菌和细菌感染。
5.根据权利要求1所述的基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，其特征在于，孵化酶的活性在0-4℃下稳定数月，但冷冻可能导致酶变性，使用1-4毫升小体积柱浓缩和部分纯化孵化酶。
6.根据权利要求1所述的基于青鳉孵化液制备孵化酶溶液的制备方法，其特征在于，阳离子交换柱包括交换柱和阳离子交换材料，交换柱为中空的柱体结构，交换柱的顶部设有液体进口，交换柱的底部设有液体出口，阳离子交换材料设置于交换柱的内壁上，孵化液在经过阳离子交换柱的时候，因为阳离子交换柱本身是带阳离子正电荷，正负相吸使得HCE和LCE蛋白就会留在交换柱的内壁上，同性相斥使得孵化酶从液体出口流出。
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| CN1699561A (zh) * | 2005-05-05 | 2005-11-23 | 中国海洋大学 | 一种用卤虫孵化液生产卤虫孵化酶的方法 |
| CN109329140A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-02-15 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种简化的青鳉受精卵孵化液 |
| CN110257409A (zh) * | 2018-05-10 | 2019-09-20 | 海南大学 | 一种红螯螯虾孵化酶基因及其应用 |
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