KR20210027909A - 전복 동결정자의 안정성 분석방법 및 제공방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전복 동결정자의 안정성 분석방법 및 제공방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 전복의 사육관리 비용을 절감하고 안정성이 확인된 정자를 어민에게 분양할 수 있으며, 종 보존과 관련된 검증방법에도 활용할 수 있다.

Description

전복 동결정자의 안정성 분석방법 및 제공방법{Method for analysing stability of cryopreserved abalone sperm and method for providing thereof}
본 발명은 전복 동결정자의 안정성 분석방법 및 제공방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 전복의 정자를 동결보존하였을 경우 이를 해동하여 정자 원형질막, 미토콘드리아 및 첨체의 미세구조변화로부터 안정성을 확인하는 방법 및 우수한 품질의 전복 정자를 제공하는 방법에 관한 것이다.
전복 양식분야는 국내 수산양식 분야에서 양식관련 시스템 및 매뉴얼이 잘 정립된 분야 중 하나이며, 그 중 참전복(Haliotis discus hannai)의 양식법은 대표적이라고 할 수 있다. 그러나 최근 몇 년간 발생한 저조한 성장률, 낮은 유생 생존율, 해수온도의 증가로 인한 유생시기의 사망률의 증가 등으로 인하여 생산량 및 경제성의 증가 비율이 저조한 실정이다.
이와 같은 이유로 안정적인 인공수정을 위하여 참전복 정자의 동결보존 기술의 적용이 거론되고 있는 실정이다. 정자의 동결보존은 우량종의 선택교배를 가능하게 하고, 어미의 성비 불균형 및 산란시기의 불일치와 같은 시·공간적 제약을 극복할 수 있는 장점이 있다. 또한 농업, 생식, 육종환경, 실험동물의 생산, 의학 등에 많은 영향을 미치며 특히 인공수정시에 정액을 간편하게 사용할 수 있게 해주고, 양질의 정자 이용을 가능하게 해주기에 매우 각광을 받고 있는 실험기술이다. 동결정자를 이용한 인공수정은 종의 번식에 유용하며, 수정의 효율을 향상시킨다는 점에서 이점을 가진다.
반면, 동결정자의 최적 동결보존법 개발과 함께 확인되어야 할 사항은 동결 후 해동한 정자의 안정성이다. 정자의 경우 상대적으로 세포 손상에 매우 민감하며, 특히 온도저하에 대한 내성이 약하다. 또한 동결과정 동안 정자의 운동성의 감소, 원형질막의 손상, 첨체막의 손상, 미토콘드리아의 손상, DNA의 손상, 세포예정사(apoptosis) 관련 인자들의 상승 등이 발생한다는 국외 연구 결과도 존재한다. 이와 같은 동결 과정 중 정자세포의 손상은 수정률 하락의 직접적인 원인이 될 가능성이 크다. 그러므로 동결 후 융해된 정자의 안정성 판단은 산업적으로도 매우 중요하다.
이에 본 발명자들은 전복으로부터 채취한 정자를 동결시켰을 때, 이로부터 해동시킨 정자의 안정성 분석을 위하여 정자 원형질막(plasma membrane integrity, PMI), 미토콘드리아(mitochondrial potential, MP) 및 첨체(acrosome integrity, AI)의 미세구조변화를 확인할 수 있는 분석방법을 개발하였다.
이에, 본 발명의 목적은 전복 정자로부터 정자 원형질막, 미토콘드리아 및 첨체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 정자 활성 확인 단계를 포함하는 것인, 전복 정자의 안정성 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다음의 단계를 포함하는 전복 동결정자의 제공방법을 제공하는 것이다:
전복 정자에 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, Me2SO) 또는 글리세롤을 혼합하는 동결용 샘플 제조 단계;
상기 동결용 샘플을 액화질소로 동결시키는 것인 동결 단계;
상기 동결용 샘플을 해동시키는 해동 단계; 및
상기 해동된 샘플로부터 정자 원형질막, 미토콘드리아 및 첨체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 정자 활성 확인 단계.
본 발명은 전복 동결정자의 안정성 분석방법 및 제공방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 전복의 사육관리 비용을 절감하고 안정성이 확인된 정자를 어민에게 분양할 수 있으며, 종 보존과 관련된 검증방법에도 활용할 수 있다.
본 발명자들은 전복의 정자를 동결보존하였을 경우 이를 해동하여 정자 원형질막, 미토콘드리아 및 첨체의 미세구조변화를 확인함으로써 안정성을 분석할 수 있음을 제시하였고, 이를 통해 양질의 전복 정자를 제공할 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 전복 정자로부터 정자 원형질막(plasma membrane integrity, PMI), 미토콘드리아(mitochondrial potential, MP) 및 첨체(acrosome integrity, AI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 정자 활성 확인 단계를 포함하는 것인, 전복 정자의 안정성 분석 방법이다.
상기 전복 정자는 동결 후 해동된 전복 정자인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 정자 활성 확인 단계는 정자의 PMI, MP 및 AI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에서 손상 여부를 확인하는 것일 수 있고, 예를 들어, 형광 염색을 통해 획득한 이미지로부터 손상 여부를 확인하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 "손상 여부"란 기능적 결함이 예상될 수 있는 구조적 결함이 발생했는지의 여부를 의미하고, 예를 들어, 정자의 PMI, MP 및 AI에서의 손상 여부는 정자의 수정능에 영향을 주는 것으로 판단할 수 있으며, 해당 조직에 대한 형광 염색을 통한 미세구조변화 유무의 확인을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 전복 동결정자의 제공방법이다:
전복 정자에 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, Me2SO) 또는 글리세롤을 혼합하는 동결용 샘플 제조 단계;
상기 동결용 샘플을 액화질소로 동결시키는 것인 동결 단계;
상기 동결용 샘플을 해동시키는 해동 단계; 및
상기 해동된 샘플로부터 정자 원형질막(plasma membrane integrity, PMI), 미토콘드리아(mitochondrial potential, MP) 및 첨체(acrosome integrity, AI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 정자 활성 확인 단계.
상기 동결 단계는 다음의 단계를 포함하는 것인, 전복 동결정자의 제공방법인 것일 수 있다:
상기 동결용 샘플을 액화질소의 증기와 접촉시키는 것인 1차 동결 단계; 및
상기 동결용 샘플을 액화질소에 침지시키는 2차 동결 단계.
상기 방법은 정자 활성 확인 단계를 통해 전복 동결정자의 안정성을 확인하고, 이에 따라 품질이 검증된 정자를 제공할 수 있다.
상기 방법은 동결용 샘플 제조 단계 이전에 방정직후의 정자에 대하여 PMI, MP 및 AI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 방정직후 정자 활성 확인 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 방정직후 정자 활성 확인 단계의 수행에 따라, 동결시킬 정자를 선별하는 과정에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
상기 Me2SO는 5 내지 12%(v/v), 5 내지 10%(v/v), 5 내지 8%(v/v), 7 내지 12%(v/v) 또는 7 내지 10%(v/v), 예를 들어, 7 내지 8%(v/v)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 글리세롤은 1 내지 8%(v/v), 1 내지 6%(v/v) 또는 1 내지 4%(v/v), 예를 들어, 1 내지 2%(v/v)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 전복 동결정자의 안정성 분석방법 및 제공방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 전복의 사육관리 비용을 절감하고 안정성이 확인된 정자를 어민에게 분양할 수 있으며, 종 보존과 관련된 검증방법에도 활용할 수 있다.
도 1은 동해방지제 처리에 따른 참전복 정자의 미세구조변화 유무를 확인하기 위하여, 동해방지제 처리를 하지 않은 신선한 참전복 정자와 8% Me2SO를 동해방지제로 하여 동결 후 해동 처리한 참전복 정자의 원형질막(plasma membrane integrity, PMI), 미토콘드리아(mitochondrial potentiality, MP) 및 첨체(acrosome integrity, AI)에 형광 프로브 처리를 한 후 1000 배 배율로 나타낸 비교 사진이다.
도 2는 동해방지제 처리에 따른 참전복 정자의 미세구조변화 유무를 확인하기 위하여, 동해방지제 처리를 하지 않은 신선한 참전복 정자와 2% 글리세롤을 통해방지제로 하여 동결 후 해동 처리한 참전복 정자의 원형질막, 미토콘드리아 및 첨체에 형광 프로브 처리를 한 후 1000배 배율로 나타낸 비교 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 실험종 채집 및 정액 채취
실험종 수집 및 정액 채취는 토종수산영어조합법인(전라남도 여수시 돌산읍)에서 양식중인 참전복(Haliotis discus hannai) 중 수컷을 번식기에 5 내지 10마리를 수집하여 진행되었다. 각장(shell length) 9.23±0.70 cm, 각고(shell height) 2.34±0.33 cm, 중량(total weight) 89.67±18.14 g의 수컷 전복을 사용하였으며, 수집시에는 성성숙(sex maturation)이 완료된 참전복 정액의 채취를 위하여 수컷의 생식소의 발달정도를 육안으로 관찰하는 단계가 필수적이었고, 생식소의 색과 크기가 각각 진한 유백색인지 및 크게 부풀어올랐는지의 여부를 판단 기준으로 하였다.
선별된 전복은 방정 유도를 진행하기 일주일 전부터 탱크(유수식, 수온: 16.5℃)에 순응시켰다. 일주일의 순응단계가 진행된 전복은 이후 방정을 유도하기 전에 다른 탱크(유수식, 수온: 20.0℃)로 옮겨 1시간 동안 반응시켰으며, 해당 반응 완료 후 간출작업이 진행되었다.
간출작업은 음지에서 10분 동안 진행 후, 전복을 뒤집어서 10분 동안 진행하여 총 20분으로 진행되었다. 간출작업이 완료된 수컷 참전복은 복부자극을 통하여 방정이 진행되게 하였으며, 방정액은 마이크로튜브(microtube, 1.5 ml)로 옮긴 후 얼음이 채워진 상자(on-ice)에 보관하였다. 사용된 샘플은 방정 후 1시간 이내의 것들만 사용하였으며, 방정액을 현미경으로 관찰 후 정자의 운동성이 높은 방정액만을 실험에 사용하였다.
실시예 2: 동결정자의 제조
본 실험에서 사용한 동해방지제는 Me2SO(dimethyl sulfoxide, DMSO, Sigma-Aldrich Pty Ltd)와 글리세롤(glycerol, Sigma-Aldrich Pty Ltd)을 여과된 해수(0.5 um, filtered seawater, FSW)를 이용하여 각각 8 및 2%(v/v)로 희석시켜서 사용하였다.
동결과정의 진행을 위하여 샘플이 주입된 0.25 ml 용량의 스트로(straw)를 액화질소(liquid nitrogen; LN2, -196℃) 표면의 증기를 이용하여 1차 동결을 진행한 후 액화질소에 침지시켜 2차 동결을 진행하였다.
1차 동결은, 액화질소의 표면으로부터 5.2 cm의 높이에 샘플을 위치시켜 액화질소의 증기를 이용하여 10분 동안 수행하였다. 2차 동결은, 1차 동결의 수행이 완료된 직후에 샘플을 액화질소에 최소 120분 동안 침지시켜 수행하였다.
실시예 3: 동결정자의 안정성 분석
해동한 참전복 정자의 안정성 분석은 액화질소에 침지시켜 동결한 후 최소 2시간이 경과한 이후의 것을 사용하여 조사하였다. 참전복 동결정자의 안정성 분석은 총 3가지 부위에서 진행되었으며, 해당 부위는 각각 정자 원형질막(plasma membrane integrity, PMI), 미토콘드리아(mitochondrial potential, MP), 첨체(acrosome integrity, AI)로 이의 미세구조변화의 여부를 파악하는 것으로 구성되었다.
특히 첨체는 정자의 머리 정단부에 위치한 과립으로 난자의 보호막인 난막 (egg membrane)을 녹이는 단백질이나 효소를 함유하고 있어서 난자의 난막을 녹여 정자가 난자 안으로 들어가서 수정이 발생하게 하기 때문에 동결 후 융해된 정자의 정상적인 수정능력을 평가하기 위해서는 첨체의 미세구조변화유무를 확인하는 것이 필수적이다.
PMI, MP 및 AI의 미세구조변화를 확인하기 위하여 각 부위에 특이적으로 결합하는 형광 프로브(fluorescent probe)를 시약으로 사용하여 형광염색을 수행하였고, 상기 시약은 통상적으로 사용되는 형광 염료 중에서 선택되어 사용되었다. 구체적으로, 식별을 용이하게 하기 위하여 상기 PMI, MP 및 AI의 부위에 특이적으로 결합하는 형광 프로브는 초록색을 나타내는 것으로 선택하였고, 손상이 있는 세포에 대하여 특이적으로 결합하는 형광 프로브는 붉은색으로 선택하여 정자의 활성을 명확히 판단할 수 있도록 준비하였다.
미세구조변화 발생유무에 대한 평가기준으로는 PMI의 경우에 머리 부분을 제외한 몸 부분에서, MP의 경우는 정자체의 아랫부분에 위치한 미토콘드리아에서, AI는 정자의 머리부분에 위치한 첨체에서 각각 형광염색이 되는 결과를 통해서 확인할 수 있었다. 활성을 소유한 정자는 초록색, 비활성 정자는 붉은색으로 형광염색이 된 결과를 관찰하여 확인할 수 있었다.
각각의 시약처리에 따라 안정성 검증이 완료된 참전복 동결정자는 형광현미경으로 관찰 후 사진 촬영(x1000)을 진행하였다. 또한 해당 결과의 검증을 위하여 방정 직후의 참전복 정자를 대조군으로 설정하였다.
도 1A는 방정직후 참전복 정자의 원형질막, 도 1B는 방정직후 참전복 정자의 미토콘드리아, 도 1C는 방정직후 참전복 정자의 첨체, 도 1D는 8% Me2SO를 사용하여 동결한 정자의 원형질막, 도 1E는 8% Me2SO를 사용하여 동결한 정자의 미토콘드리아, 도 1F는 8% Me2SO를 사용하여 동결한 정자의 첨체를 나타낸다.
도 2A는 방정직후 참전복 정자의 원형질막, 도 2B는 방정직후 참전복 정자의 미토콘드리아, 도 2C는 방정직후 참전복 정자의 첨체, 도 2D는 2% 글리세롤을 사용하여 동결한 정자의 원형질막, 도 2E는 2% 글리세롤을 사용하여 동결한 정자의 미토콘드리아, 도 2F는 2% 글리세롤을 사용하여 동결한 정자의 첨체를 나타낸다.
도 1 및 2에서 확인할 수 있듯이, 정자 원형질막, 미토콘드리아 및 첨체의 염색을 통하여 8% Me2SO 및 2% 글리세롤을 각각 사용하여 동결 후 해동한 정자를, 방정직후 정자를 기준으로 비교하였을 때 그 활성에 있어서 유의적인 차이가 나타나지 않음을 분석을 통해 확인하였다.

Claims (9)

  1. 전복 정자로부터 정자 원형질막(plasma membrane integrity, PMI), 미토콘드리아(mitochondrial potential, MP) 및 첨체(acrosome integrity, AI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 정자 활성 확인 단계를 포함하는 것인, 전복 정자의 안정성 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전복 정자는 동결 후 해동된 전복 정자인 것인, 전복 정자의 안정성 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 정자 활성 확인 단계는 정자의 PMI, MP 및 AI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에서 손상 여부를 확인하는 것인, 전복 정자의 안정성 분석 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 정자 활성 확인 단계는 형광 염색을 통해 손상 여부를 확인하는 것인, 전복 정자의 안정성 분석 방법.
  5. 다음의 단계를 포함하는 전복 동결정자의 제공방법:
    전복 정자에 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, Me2SO) 또는 글리세롤을 혼합하는 동결용 샘플 제조 단계;
    상기 동결용 샘플을 액화질소로 동결시키는 것인 동결 단계;
    상기 동결용 샘플을 해동시키는 해동 단계; 및
    상기 해동된 샘플로부터 정자 원형질막(plasma membrane integrity, PMI), 미토콘드리아(mitochondrial potential, MP) 및 첨체(acrosome integrity, AI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 정자 활성 확인 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동결 단계는 다음의 단계를 포함하는 것인, 전복 동결정자의 제공방법:
    상기 동결용 샘플을 액화질소의 증기와 접촉시키는 것인 1차 동결 단계; 및
    상기 동결용 샘플을 액화질소에 침지시키는 2차 동결 단계.
  7. 제5항에 있어서, 상기 방법은 동결용 샘플 제조 단계 이전에 방정직후의 정자에 대하여 PMI, MP 및 AI로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터의 활성을 확인하는 방정직후 정자 활성 확인 단계를 더 포함하는 것인, 전복 동결정자의 제공방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 Me2SO는 5 내지 12%(v/v)인 것인, 전복 동결정자의 제공방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 글리세롤은 1 내지 8%(v/v)인 것인, 전복 동결정자의 제공방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102438197B1 (ko) * 2021-03-19 2022-08-31 전남대학교산학협력단 전복 동결정자의 염색체 손상 여부 판단 방법
KR102499499B1 (ko) * 2022-11-29 2023-02-13 한국수산자원공단 전복 폐사율 저감을 위한 분석시료 채집방법과 이를 이용한 유전자 분석방법

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KR102438197B1 (ko) * 2021-03-19 2022-08-31 전남대학교산학협력단 전복 동결정자의 염색체 손상 여부 판단 방법
KR102499499B1 (ko) * 2022-11-29 2023-02-13 한국수산자원공단 전복 폐사율 저감을 위한 분석시료 채집방법과 이를 이용한 유전자 분석방법

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