CN111018966A - Hemibarbus maculatus胰岛素样生长因子3、其蛋白、其抗体及应用 - Google Patents
Hemibarbus maculatus胰岛素样生长因子3、其蛋白、其抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种花䱻（Hemibarbus maculatus）胰岛素样生长因子3（IGF3）、其蛋白、其抗体及应用，旨在解决现有技术中无法在育种或人工繁殖花䱻时进行早期雌雄鉴定的技术问题。本发明克隆了一种花䱻IGF3，表达了一种花䱻IGF3，克隆了一种花䱻IGF3的抗原序列，构建了一种包含所述花䱻IGF3抗原序列的重组表达载体和由所述的表达载体构建的重组菌，制备了一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3的多克隆抗体，并将所述的花䱻胰岛素样生长因子IGF3在花䱻人工繁育中应用，还提供了一种早期鉴定花䱻性别的方法。本发明可通过性别控制指导实践，增加产值与产出，获得较高的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种花䱻（Hemibarbus maculatus）胰岛素样生长因子3（IGF3）、其蛋白、其抗体及应用。
背景技术
花䱻（Hemibarbus maculatus Bleeker）隶属于鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、䱻属（Hemibarbus），是我国淡水养殖名贵中小型经济鱼类之一，在国内具有广阔的消费市场。花䱻肉质细嫩，出肉率高，刺少，而且蛋白质和多不饱和脂肪酸（PUFA）的含量要高于其他鲤科名优养殖鱼类，具有较好的保健功能。
花䱻的性成熟一般需要2～3年，在未达到性成熟前，雌雄个体外部形态相差不大，很难从形态学上进行区分。目前花䱻的繁育还没有达到规模化生产的程度，严重地制约着花䱻养殖业的发展。如果能够在幼苗时期准确辨别其性别，有利于在人工繁殖以及育种过程的雌雄筛选，其产量和效益也会显著提高。但是，目前尚不清楚花䱻性别决定和分化机制，极大阻碍了育种和养殖产业的发展。
性别的表现主要是取决于性别决定和性别分化两个过程。大多数脊椎动物雌雄异体，在形态和生理上表现出显著的雌雄两性性别差异，而鱼类作为低等脊椎动物，其性别分化表型存在多样性，几乎涵盖了脊椎动物的所有生殖类型。鱼类性腺从早期的生殖细胞发生、迁移、生殖嵴形成，到发育成成熟配子，这一过程涉及众多的基因参与。且，在鱼类中，由于进化上的原始性，除性染色体外，常染色体上的某些基因和一些外部环境因素亦参与性别决定。
胰岛素生长因子（Insuline-like growth factor，IGF）广泛存在于动物中，参与调控动物的生长发育、成熟，以及细胞的增殖等活动。IGFs主要分为三种亚型，包括IGF1，IGF2和IGF3。对鲑鳟鱼类的研究发现IGF1 mRNA在肝脏中含量最高，表明肝脏是IGFs主要的分泌表达场所；IGF2突变后金鱼胚胎生长受阻，所以又称生长调节素A；在罗非鱼与海鲷的成熟卵母细胞周围的滤泡细胞中检测到IGF2表达；IGF3作为新成员，目前仅在硬骨鱼类中发现，2008年Wang DS在罗非鱼（Oreochromis niloticus）体内发现第三种由不同氨基酸编码的IGF，并将其命名为IGF3，随后相继在斑马鱼（Danio rerio）、黄河鲤（Cyprinuscarpio）、双棘黄姑鱼（Protonibea diacanthus）等鱼类克隆得到IGF3基因，组织表达模式显示IGF3在双棘黄姑鱼心脏、性腺、脑区均有表达，但在其他脊椎动物体内未见其报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种花䱻（Hemibarbus maculatus）胰岛素样生长因子3（IGF3）、其蛋白、其抗体及应用，以解决现有技术中对花䱻无法在早期进行雌雄鉴定的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
克隆一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
表达一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3，氨基酸序列为：
（1）如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或
（2）在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。
克隆一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3的抗原序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
构建一种包含所述花䱻胰岛素样生长因子IGF3抗原序列的重组表达载体。
构建一种由所述的表达载体构建的重组菌。
制备一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3的多克隆抗体，所述抗体为由所述的重组菌表达的重组蛋白。
将所述的花䱻胰岛素样生长因子IGF3在花䱻人工繁育中应用。
提供一种早期鉴定花䱻性别的方法，包括以下步骤：
取孵化后第40～60天的花䱻，取其性腺组织样品，利用权利要求6的多克隆抗体进行免疫组化检测；若为阳性，则为雄鱼；若为阴性，则为雌鱼。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明首次分离鉴定出了一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3，并验证了其参与花䱻的性腺分化，进而推进了花䱻育种的进程，并为花䱻性别决定分子机制研究奠定技术基础。
2.基于本发明，可将花䱻胰岛素样生长因子IGF3在花䱻人工繁育中应用，为培育出花䱻新品种提供了新的技术支持。
3.本发明早期鉴定花䱻性别的方法可通过性别控制指导实践，增加产值与产出，获得较高的经济效益。
附图说明
图1为中间片段序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2为3´端序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图3为5´端序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图4为抗原区段序列的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图5为IGF3重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE电泳图；
图中，M为：蛋白分子量标准Marker；泳道1为：pET32a空载体对照；泳道2为：重组蛋白内未诱导菌液表达；泳道3为：融合重组蛋白IPTG诱导菌液表达；泳道4为：纯化后目的蛋白。
图6为不同浓度变性缓冲液洗脱后重组蛋白检测的SDS-PAGE电泳胶图；
图中，M为：蛋白分子量标准Marker；泳道1为：15mM咪唑；泳道2为：50mM咪唑；泳道3为：100mM咪唑；泳道4为：200mM咪唑；泳道5为：500mM咪唑。
图7为重组蛋白特异性检测的SDS-PAGE电泳胶图。
图8为IGF3在性别分化时期的实时荧光定量PCR检测对比图。
图9为IGF3在性别分化时期的细胞定位荧光检测图；
图中，OG指卵原细胞；OC指卵巢腔细胞；GC指生殖细胞; SG指精原细胞。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：花䱻胰岛素样生长因子IGF3的cDNA全序列的克隆
（1）总RNA的提取
冰上取性成熟的花䱻精巢后用液氮迅速研磨成粉末，采取Trizol Plus（TaKaRa）法提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，Nanodrop 2000检测RNA浓度与质量，A260/A280数值比为1.92。
（2）第一链cDNA的合成
将精巢的RNA，根据PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大连）说明书操作反转录为cDNA，用于后续实验。
（3）从GenBank中查找IGF3序列，用ClustalX2进行氨基酸同源性分析其保守区段，其引物核苷酸序列如下：
IGF3F：5´-CCTCGCACTCGTGGGAAAG-3´；
IGF3R：5´-CTGGTATCGCCGCTGAAA-3´。
（4）用合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应条件：12.5 µL Premix Taq™ (ExTaq™ Version 2.0 plus dye TaKaRa)，模板2µL、引物（IGF3F和IGF3R）各0.5µL、H2O 9.5µL，共25µL；
反应程序：94℃ 3min，94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 1min，34个循环，72℃ 10min。
采用1%琼脂糖对PCR产物进行电泳检测，电泳结果如图1所示：扩增得到171bp大小的片段，为中间片段序列。
胶回收后与pMD19-T载体16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板，挑取阳性克隆测序。
（5）根据获得的中间片段序列，设计3´RACE与5´RACE特异性引物，其核苷酸序列如下：
IGF3RACE5´：5´-AGGTCACATCCCCGCACACAACA-3´；
IGF3RACE3´：5´-TGGAAGATCAGTTTTGGCTGGTG-3´。
按照SMARTer® RACE 5´/3´Kit试剂盒（TaKaRa，大连）说明书合成3′-RACE-ReadycDNA和5′-RACE-Ready cDNA，以其为模板，利用引物IGF3RACE5´和IGF3RACE3´，进行PCR扩增。
采用1%琼脂糖对PCR产物进行电泳检测，电泳结果如图2和3所示：扩增得到IGF3的3´端（803bp）与5´端（455bp）。
胶回收后与pMD19-T载体16℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆测序。
（6）将步骤（4）和（5）测序获得的序列拼接得花䱻胰岛素样生长因子IGF3 cDNA全长1357bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：花䱻胰岛素样生长因子IGF3重组蛋白的表达与纯化
（1）重组表达载体的构建
1）根据抗原引物设计要求，结合pET-32a质粒上酶切位点，选取BamH I与Hind Ⅲ，设计实施例1所得花䱻胰岛素样生长因子IGF3的抗原引物，其核苷酸序列如下：
IGF3abF：5´-CGGATCCGTGTGTGGAGACCGTGGCTT-3´；
IGF3abR：5´-CCTCGAGGTCGGATGTGGGAGTAAATG-3´。
进行PCR扩增得到480bp抗原区段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，胶回收，电泳检测如图4所示。
2）将目的片段和pET32α载体分别进行双酶切，条件为37℃ 3h；
3）用T4 DNA连接酶将酶切后的目的片段和载体在16℃条件下进行过夜培养连接；
4）将连接产物导入大肠杆菌DH-5α中，挑取阳性菌落，扩大培养，并根据质粒DNA小量抽提试剂盒的操作步骤提取重组质粒，酶切验证，电泳检测后测序。
（2）重组蛋白的诱导
1）将构建好的重组质粒导入BL21（DE3）感受态细胞中，转化筛选阳性菌株；
2）筛选得到的阳性菌接种到300mL LB液体培养基中，37℃ 200rmp培养至 OD 值为0.46；
3）收集10mL菌液，作为对照组；剩余菌液加入IPTG（终浓度为1mmol/L），在恒温培养箱中37℃ 以200r/min 的转速培养6h，然后将菌液离心，8 000 r/min离心5 min，收集菌体，经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染液色30 min、脱色，观察结果，如图5所示。
通过PCR扩增抗原区段，构建重组质粒，经IPTG诱导出大小为32.2Ku的目的蛋白，用镍柱纯化目的蛋白。
（3）重组蛋白的纯化、透析与鉴定
1）加入变性结合缓冲液，重悬菌液后用超声波破碎，破碎条件：破3s，停6s，功率为100%，直到菌悬液变澄清为止。破碎好的菌悬液12000g，4℃离心30min，收集上清液；
2）用0.22 μm的Millex一次性过滤器过滤，10倍柱体积的变性结合缓冲液平衡His TagHP柱；
3）将准备好的蛋白溶液2～3ml过柱，每过柱1ml蛋白溶液，室温静止放置5min，使带有His标签的目的蛋白与柱子中的镍离子充分结合；
4）蛋白上柱后，用5ml的不同浓度的咪唑洗脱液冲洗柱子，以除去柱子中未与镍离子结合的杂蛋白；
5）用3ml的变性洗脱缓冲液冲洗柱子，收集目的蛋白；
6）将透析袋在沸水中煮5min，用夹子固定一段后把纯化后的蛋白加入其中，另一端加紧后放置于PBS缓冲液中，加热搅拌12h后取出，更换一次磷酸盐缓冲液，12h后将透析完成的蛋白溶液转移至EP管中保存。
SDS-PAGE电泳检测不同浓度变性缓冲液洗脱后重组蛋白，如图6所示：重组蛋白大部分都表达于上清液中，用不同浓度的咪唑洗脱时发现，目的蛋白不是一次性从柱子上被洗脱出来，在15mM的咪唑浓度时，小分子量杂蛋白被洗出来，融合蛋白在100mM的咪唑浓度洗脱出来，200mM时全部洗脱出来。
（4）重组蛋白特异性检测
SDS-PAGE电泳后，将聚丙烯凝胶浸泡于膜转移缓冲液中平衡5min，在转膜仪中200mA转50min。TBST洗5次，5min/次，5%脱脂奶粉封闭1h，TBST洗5次，5min/次。His-Tag抗体4℃孵育过夜，洗涤5次后，滴加带有IgG标记的二抗溶液（1:5000），置于脱色摇床上，室温孵育1h，TBST洗涤五次。化学发光仪拍照观察，结果如图7所示。
结果显示在33.2 Ku处检测出特异性条带，证明了纯化所得IGF3重组蛋白的正确性。
实施例3：花䱻胰岛素样生长因子IGF3多克隆抗体的制备
（1）将实施例2得到的重组pET32α-IGF3蛋白透析，与弗氏佐剂等体积融合，为了使其充分混匀，于震荡仪上乳化至 “油包水”状态；
（2）取6只NIH 1月龄的雌性小鼠，采用皮下静脉注射法免疫小鼠，每只小鼠注射剂量为1mL。；
（3）每隔1周加强免疫1次，方法同步骤1和2，区别在于初次免疫用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂乳化蛋白；
（4）免疫5周后，摘掉小鼠眼球取血，同时取6只未免疫的小鼠作为阴性对照；
（5）将采集的血液4℃静置过夜，然后4℃ 4000g离心10min收集血清，即得抗体，分装后置于-80℃保存备用；
（6）采用ELISA法对抗体的效价进行检测，计算处理组/阴性对照组的光吸收比值。
结果显示：制得的IGF3多克隆抗体的效价为8.1×105。
实施例4：花䱻胰岛素样生长因子IGF3在性别分化时期的时空表达
（1）采集孵化后10、20、30、40、45、50、55、60天的花䱻组织样品，用于RNA提取和组织学鉴定分析；
（2）根据实施例1所得的花䱻胰岛素样生长因子IGF3基因序列，设计定量引物，其核苷酸序列如下：
IGF3qF：5´-ACCTGGAGTTTGTGTGTGGA-3´；
IGF3qR：5´-GGTTGGGTGTGTTGGTGTTT-3´。
（3）将提取的RNA按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒操作步骤进行反转录cDNA的合成；
（4）以β-actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测IGF3基因在花䱻孵化后不同发育天数的表达量；
（5）采用 2-ΔΔCt的方法计算基因的相对表达量，用SPSS 20.0进行数据统计分析，结果用平均值±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)不同组之间的差异，P<0.05 为差异显著。结果如图8所示。
可得：
组织学检测显示，花䱻孵化后第15天，PGCs迁移到性腺原基位置，形成原始性腺；孵化后第40天左右，卵巢腔形成，标志着卵巢分化开始；孵化后第60天，精原细胞出现，标志着精巢分化开始。因此，40天和60天是花䱻雌雄性别分化的关键时间点。
荧光定量结果显示，在花䱻性腺未分化时期，胰岛素样生长因子IGF3在原始性腺表达量较低；从孵化后第40天开始，卵巢开始分化，IGF3在卵巢中的表达量虽然有所增加，但差异不显著；而在精巢分化的关键时间点，IGF3的表达量显著增高。随着精巢发育，IGF3的表达量不断增加，并且IGF3在雄鱼的表达量显著高于雌鱼，如图8所示，结果显示IGF3在雌雄两性中差异表达，可作为花䱻雄性性别标记基因。
实施例5：花䱻胰岛素样生长因子IGF3在性别分化时期的细胞定位
（1）选取孵化后第40天雌鱼和60天雄鱼性腺，依次进行组织包埋、切片、贴片、展片、烤片；
（2）在脱蜡盒里进行二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；
（3）磷酸盐缓冲液洗涤：1×PBS清洗3次，一次5min，置于脱色摇床上；
（4）曲拉通洗涤：Triton X-100浸泡10min分钟；
（5）PBS洗涤：1×PBS置于脱色摇床上洗5次，每次5min；
（6）封闭：5%的牛血清蛋白（BSA），37℃恒温恒湿培养箱内封闭30min；
（7）滴加一抗：用1%的BSA稀释实施例3制备的IGF3多克隆抗体，稀释比为1:100，湿盒里4℃冰箱过夜；
（8）PBS洗涤：1×PBS置于脱色摇床上洗5次，每次5min；
（9）滴加荧光二抗：按照抗体说明书稀释，滴加在组织上，注意避光，37℃孵育1h；
（10）重复步骤（8）；
（11）核染：室温DAPI染色10min，注意避光；
（12）重复步骤8；
（13）用防猝灭荧光封片剂封片，荧光显微镜拍照观察信号。
IGF3花䱻性别分化时期的细胞定位检测结果如图9所示，（1-12）为孵化后第40天性腺；（12-24）为孵化后第60天性腺；（3、15）为IGF3在卵巢中的表达；（6、18）为IGF3在精巢中的表达。
可知，IGF3在花䱻性别分化时期卵巢中未见阳性信号，而在精巢的间质细胞中检测到其表达，进一步证明了其可作为花䱻雄性性别分化标记。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南师范大学
<120> Hemibarbus maculatus胰岛素样生长因子3、其蛋白、其抗体及应用
<130> 2019
<160> 11
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1357
<212> DNA
<213> Hemibarbus maculatus Bleeker
<400> 1
acatggggag gtgtcgtctg tgtgtagagg gaagagtagg atgtgtccgg gtgtgtgcag 60
ttggcccgtc ccctcctggt cctcctataa gagcacaccg gagcaagaac atcagtagct 120
ccttagagag accaatccat aaaaaaaata gacatgccat cagacggaat gccagcctgt 180
catgccagcc gcctccagat tcttagagga ttcacgctga aggtgcccag ctggcgaagt 240
gtgtgtgtcc tctactccct gtactgcgtc ctgattctgc cagacgccgg cgaagcggcc 300
aaatcgcgct gtggacgaga actagtcgct gacctggagt ttgtgtgtgg agaccgtggc 360
ttttacagag gcaaacccgg agcaacccgg agcggcagtc ctcgcactcg tgggaaaggg 420
atcgtcgagc agtgttgtgt gcggggatgt gacctccagc atttggagtc gtactgtgcc 480
aaacccaaga gggtacgccg tgacgtccct gattctctgc agcagacttt ggaagatcag 540
ttttggctgg tgtttcagcg gcgataccag aagcttgcag agatgaagag agatgaggaa 600
gctccatctc gtagactcag agagcggacg ctctaccggt ggaacaacag agattcagta 660
ttactaaaca ccaacacacc caaccgaccc ccttcaacac accaacatcc ttccactgag 720
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tctgggtgga ctctatgaat catcttcctt ttctaagaaa gacttttccg tccttgcaca 840
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atgaactgta tttttccatt ttgttttcag cttccctcct agcattgact tgtgtatttg 1020
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aaaaaaaaaa aaagtactct gcgttgatac cactgct 1357
<210> 2
<211> 202
<212> PRT
<213> Hemibarbus maculatus Bleeker
<400> 2
Met Pro Ser Asp Gly Met Pro Ala Cys His Ala Ser Arg Leu Gln Ile
1 5 10 15
Leu Arg Gly Phe Thr Leu Lys Val Pro Ser Trp Arg Ser Val Cys Val
20 25 30
Leu Tyr Ser Leu Tyr Cys Val Leu Ile Leu Pro Asp Ala Gly Glu Ala
35 40 45
Ala Lys Ser Arg Cys Gly Arg Glu Leu Val Ala Asp Leu Glu Phe Val
50 55 60
Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Arg Gly Lys Pro Gly Ala Thr Arg Ser
65 70 75 80
Gly Ser Pro Arg Thr Arg Gly Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Val
85 90 95
Arg Gly Cys Asp Leu Gln His Leu Glu Ser Tyr Cys Ala Lys Pro Lys
100 105 110
Arg Val Arg Arg Asp Val Pro Asp Ser Leu Gln Gln Thr Leu Glu Asp
115 120 125
Gln Phe Trp Leu Val Phe Gln Arg Arg Tyr Gln Lys Leu Ala Glu Met
130 135 140
Lys Arg Asp Glu Glu Ala Pro Ser Arg Arg Leu Arg Glu Arg Thr Leu
145 150 155 160
Tyr Arg Trp Asn Asn Arg Asp Ser Val Leu Leu Asn Thr Asn Thr Pro
165 170 175
Asn Arg Pro Pro Ser Thr His Gln His Pro Ser Thr Glu Arg Met Thr
180 185 190
Ser Arg Pro Thr Phe Ile Ser His Ile Arg
195 200
<210> 3
<211> 417
<212> DNA
<213> Hemibarbus maculatus Bleeker
<400> 3
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cgcactcgtg ggaaagggat cgtcgagcag tgttgtgtgc ggggatgtga cctccagcat 120
ttggagtcgt actgtgccaa acccaagagg gtacgccgtg acgtccctga ttctctgcag 180
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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<210> 7
<211> 23
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<210> 8
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cggatccgtg tgtggagacc gtggctt 27
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cctcgaggtc ggatgtggga gtaaatg 27
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 11
ggttgggtgt gttggtgttt 20
Claims (8)
1. 一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2. 一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3，其特征在于，其氨基酸序列为：
（1）如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或
（2）在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。
3. 一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3的抗原序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.一种包含权利要求3所述花䱻胰岛素样生长因子IGF3抗原序列的重组表达载体。
5.一种由权利要求4所述的表达载体构建的重组菌。
6.一种花䱻胰岛素样生长因子IGF3的多克隆抗体，其特征在于，所述抗体为由权利要求5所述的重组菌表达的重组蛋白。
7.权利要求1所述的花䱻胰岛素样生长因子IGF3在花䱻人工繁育中的应用。
8.一种早期鉴定花䱻性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取孵化后第40～60天的花䱻，取其性腺组织样品，利用权利要求6的多克隆抗体进行免疫组化检测；若为阳性，则为雄鱼；若为阴性，则为雌鱼。
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| AU9715701A (en) * | 1996-12-02 | 2002-02-07 | Baylor College Of Medicine | Insulin-like growth factor I (IGF-I) expression system and methods of use |
| CN1487083A (zh) * | 2003-07-10 | 2004-04-07 | 中山大学 | 一种石斑鱼胰岛素样生长因子ⅱ基因、含有该基因的载体、重组株及其应用 |
| CN101481689A (zh) * | 2008-06-26 | 2009-07-15 | 哈尔滨师范大学 | 新序列人胰岛素样生长因子-ⅰ基因的克隆及其高效表达 |
-
2019
- 2019-12-27 CN CN201911374477.5A patent/CN111018966B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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|---|---|---|---|---|
| CN112625118A (zh) * | 2020-11-26 | 2021-04-09 | 广东海洋大学 | 一种金钱鱼促生殖细胞成熟基因igf3及其应用 |
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