CN109957521A - 一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达人血清白蛋白的基因工程菌，其是在巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表达载体的工程菌，所述的表达载体依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子；所述的基因工程菌具有抗遗传霉素性能。利用该基因工程菌进行人血清白蛋白的表达时，甲醇诱导96小时后蛋白的产量即可达8.86g/L，生产效率可达92.29mg/L/h；且发酵过程中可无需通入无菌氧气。因此，本发明中的菌株生产效率明显更高，能大幅度缩短生产周期，降低时间及人员和设备运作成本，产业化意义较大。

Description

一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是人体血浆中最丰富的蛋白质，含量占血清总蛋白的60％，约为35-40g/L，主要功能为维持血浆渗透压以及各类物质的转运。HSA广泛应用于休克及烧伤治疗、术后恢复、药物载体、细胞培养基等，其全世界需求量已达600吨/年左右，中国需求量约占其三分之一。目前，人血清白蛋白主要来自人血提取，相应的纯化工艺为低温乙醇沉淀法，其来源严重受到血液供给的限制，存在血液病毒传播和扩散风险，且纯化过程中对大量有机试剂和低温控制的需求也导致其效率低下。

利用转基因技术构建工程菌并生产外源蛋白最早起源于上世纪70年代，此后，包括大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、昆虫、动植物细胞以及动植物等在内的一系列外源蛋白表达系统得以建立和飞速发展，为珍贵的蛋白类药物以及更高效、更环保的工业酶的产业化应用提供了巨大的推动作用。目前，利用转基因技术已在多种表达系统中实现了人血清白蛋白的外源表达及相关纯化工作，包括大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动植物细胞以及动植物。

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种原核生物，因具有清晰的遗传背景、简单的营养要求以及安全性被广泛应用于外源蛋白的表达。早在1981年Richard等就利用大肠杆菌成功表达HSA，但仅定性检测出其表达，而产量未知；D.Sleep等于1990年利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)成功表达出HSA，但由于酿酒酵母表达系统产量较低，同时此系统会对HSA实施高度糖基化，极易引起免疫原性；武汉大学研究人员Yang He等将转基因技术应用于传统农作物水稻，实现了每公斤水稻获取2.75g高纯度HSA的喜人成绩。然而转基因植物的培养周期较长，受环境因素影响大，且易造成转基因作物的抗性基因扩散；台湾学者Yu-Kuo Liu等利用转基因植物离体细胞表达系统，实现了75mg/L 的HSA表达。但总体而言，转基因动植物细胞表达系统的产量不乐观，且培养成本较高，故一般不作为HSA产业化生产的首选。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种真核表达系统，于1969年由Koichi等发现其能以甲醇为唯一碳源生长的特性，并进一步于1987年首次被报道成功用于外源蛋白表达。相比传统的原核表达系统，毕赤酵母具有表达量高、后加工能力强以及外源基因稳定高等显著优势，而相比转基因动植物以及动植物细胞，毕赤酵母有具有遗传操作简单、菌体生长量大且培养成本低、产业化难度小等特点。目前，毕赤酵母表达系统已实现超过500种外源蛋白的表达。默克公司研究人员Sehoon Kim等通过优化起始诱导菌体量，在毕赤酵母系统中获得了10g/L的HSA表达(Kim S,Meehl M,d'Anjou M. Maximization recombinanthuman serum albumin production in a muts pichia pastoris strain [J].Biotechnology progress,2014,00(00):1-9.)，Kobayashi等对补料工艺进行探索，也实现了11g/L的HSA表达(Ohya T,Ohyama M,Kobayashi K.Optimization of human serumalbumin production in methylotrophic yeast pichia pastoris by repeated fed-batch fermentation [J].Biotechnology and bioengineering,2005,90(7):876-887.)。根据这两篇目前已知HSA表达量较高的文献内容，其甲醇诱导时间分别为450小时和250小时，相应目标蛋白的表达效率仅为22和44mg/(L*h)。高健等人发表的专利表明其同样在毕赤酵母中实现了10g/L 左右的HSA表达，但甲醇诱导时间也至少为200小时(专利申请CN1854301 A，高健，贾茜，李梅彦，邓建慧.一种表达人血清白蛋白的载体和工程菌[P].2005-04-29)。如此长的诱导时间显然延长了其生产周期，增加了时间成本，同时大量甲醇的长时间储存也成为一个不容忽视的安全隐患。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术当中用于表达人血清白蛋白的基因工程菌表达效率低、且在发酵过程中甲醇诱导时间过长以及需要进行纯氧通入因而运作成本高等缺陷，提供一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用。利用该基因工程菌进行人血清白蛋白的表达时，发酵罐中甲醇诱导96小时后蛋白的产量即可达8.86g/L，生产效率可达92.29mg/L/h；且发酵过程中可无需通入无菌氧气。因此，本发明中的菌株生产效率明显更高，能大幅度缩短生产周期，降低时间及人员和设备运作成本，产业化意义较大。

本发明提供一种表达人血清白蛋白的基因工程菌，其是在巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表达载体的工程菌，所述的表达载体依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子。

所述的启动子可为本领域中常规的用于酵母菌中以表达分泌蛋白的启动子，较佳地为AOX1启动子。

所述的α引导肽可为本领域常规的α引导肽，较佳地为来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的引导肽。

为了能够有效筛选到已经转入表达载体的基因工程菌，所述的表达载体可以带有抗性基因，所述抗性基因优选为遗传霉素基因，所述的基因工程菌具有抗0.25～5.0mg/mL浓度的遗传霉素的性能。本发明人经过诸多尝试和研究最终发现随着所述基因工程菌抗遗传霉素的性能的提高，其表达人血清白蛋白的能力也相应提高。尤其当所述的基因工程菌能够抗5.0mg/mL以上的遗传霉素时其具有较强的表达人血清白蛋白的能力。

所述的人血清白蛋白基因可为本领域常规的人血清白蛋白基因，较佳地为未经突变的人血清白蛋白基因，更佳地，所述人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示。

所述的表达载体的骨架可为本领域常规，较佳地为质粒pPIC9K，其是市售的本领域常规适用于毕赤酵母的质粒，本身就带有AOX1启动子、来源于酿酒酵母的α引导肽和终止子，还带有抗遗传霉素基因(G418)，常将G418作为后续转化子的抗性筛选标记。

本发明还提供一种表达载体，其依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子。如上所述，其中所述的启动子优选AOX1启动子；所述的表达载体的骨架优选质粒pPIC9K；所述的表达载体优选带有基因筛选标记——抗性基因，所述的抗性基因优选遗传霉素；所述的α引导肽优选来源于酿酒酵母；所述人血清白蛋白基因的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种上述表达人血清白蛋白的基因工程菌的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)构建上述表达载体；

(2)将步骤(1)所得表达载体转化至巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中；

(3)将步骤(2)所得的巴斯德毕赤氏酵母涂布于含有抗性基因筛选标记的抗生素的平板中培养后挑选平板上的转化子即得。

其中，步骤(2)中所述的转化可为本领域常规的转化方法，较佳地为电转化，所述电转化的电势优选0.75～1.5Kv/cm，更优选1.0Kv/cm；

步骤(3)中所述的遗传霉素的浓度优选为0.25～5.0mg/mL；

步骤(3)中所述的平板可为本领域常规的用于培养巴斯德毕赤氏酵母的平板(固体培养基)；优选为YPD平板。

步骤(3)中所述培养的条件优选为22～30℃，培养24～144小时；当培养的温度和时间不在上述范围中时，菌体不能够很好地生长，同时产率降低。所述培养的条件更优选在发酵罐中，28℃，培养96小时。本发明中，目的蛋白的浓度在诱导144小时时仍然处于增加状态，本发明权衡实验结果可靠性和时间成本发现培养96小时更为合适。

本发明还提供一种人血清白蛋白的制备方法，其包括将上述的基因工程菌接种于巴斯德毕赤氏酵母菌培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可。较佳地，所述的培养基含有BMGY(Buffered Minimal Glycerol-complex Medium)或者BMMY(BufferedMethanol-complex Medium)；所述BMGY或者所述BMMY占摇瓶总体积(摇瓶的装液量)百分比优选10-30％，更优选20％。

所述发酵的培养的过程中，每12～24小时添加体积分数为0.5～2.0％的甲醇，添加4～8 次；优选每12小时添加体积分数为1.0％的甲醇，添加8次。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

利用该基因工程菌进行人血清白蛋白的表达时，甲醇诱导96小时后蛋白的产量即可达8.86g/L，生产效率可达92.29mg/L/h；且发酵过程中可无需通入无菌氧气。因此，本发明中的菌株生产效率明显更高，能大幅度缩短生产周期，降低时间及人员和设备运作成本，产业化意义较大。

附图说明

图1为HSA基因片段PCR产物回收电泳示意图；

图2为pPIC9K-HSA质粒提取后电泳验证示意图；

图3为pPIC9K-HSA质粒的双酶切验证示意图；

图4为pPIC9K-HSA的构建示意图；

图5为随机挑取10个MD平板转化子的表达量检测示意图；

图6为摇瓶发酵液上清Western blot结果示意图；

图7为含5mg/mL G418的YPD平板中7个转化子的表达量检测示意图；

图8为摇瓶水平诱导期间不同甲醇添加量对菌体生物量和目标蛋白产量的影响示意图；

图9为5L发酵罐水平上菌体湿重(WCW)和目标蛋白浓度与发酵时间的关系示意图；

图10为5L发酵罐水平上的表达量检测示意图；

图11为使用AKTA系统分离纯化洗脱曲线示意图；

图12为使用AKTA系统分离纯化后各洗脱峰的检测示意图；

图13为HPLC检测目标蛋白纯度结果示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

DH5α购自上海唯地生物技术有限公司；

氨苄抗生素、G418、0.45um微孔滤膜购自上海生工生物工程技术有限公司；

目的基因合成、引物合成以及测序服务为上海生工生物工程技术有限公司提供；

NotI、EcoRI、SalI、DNA连接酶、Max DNA polymerase均购自大连宝生物有限公司(TaKaRa,Dalian,China)；

DNA胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；

人血清白蛋白标品购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；

pPIC9K载体购自Invitrogen；

GS115购自Invitrogen。

实施例1人血清白蛋白原始基因序列的扩增

从NCBI网站上获取人血清白蛋白原始基因序列(登录号：AF190168.1)，(序列如SEQ ID NO.1所示)。以去掉编码前24个自身前导肽氨基酸的72bp的序列为目标序列，委托专业生物公司进行序列合成并将序列插入pUC19载体上作为模板，以

P1:5’-CGGAATTCGATGACACAAGAGTGAGGTTGCTCAT-3’(SEQ ID NO.2)

P2:5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’(SEQ ID NO.3)

(下划线序列分别为NotI和EcoRI酶切位点)为上下游引物，进行PCR扩增反应，反应体系如下：

反应程序：98℃预变性10秒；98℃变性10秒，66℃退火10秒，72℃延伸20秒，进行30个循环；最后于72℃延伸8分钟结束反应。

PCR扩增结束后使用凝胶回收试剂盒回收产物，大小约为1758bp左右，如图1。

实施例2表达载体pPIC9K-HSA的构建

使用NotI和EcoRI双酶切实施例1中获得的PCR产物以及pPIC9K载体，酶切体系参考TaKaRa说明书。使用DNA连接酶连接两个酶切产物，将连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中，在含氨苄抗生素的LB平板中过夜培养。挑取转化子进行培养、质粒提取和电泳检测，其中数个质粒大小明显大于pPIC9K空质粒，如图2。使用NotI和EcoRI 双酶切验证这些质粒，电泳结果显示有与目的片段大小相同的酶切片段出现，如图3。将含有双酶切检测结果正确的质粒的转化子送往专业的测序公司测序，结果显示HSA基因片段成功插入AOX1启动子以及α因子引导肽基因的下游，且无任何序列突变， pPIC9K-HSA表达载体成功构建，构建示意图如图4。

实施例3分泌表达HSA的毕赤酵母工程菌的构建和筛选

1、表达质粒的抽提及线性化

使用碱裂解法提取表达质粒pPIC9K-HSA；

使用以下酶切体系进行酶切反应：

37℃下过夜酶切，将酶切产物放置70℃金属浴中10分钟以灭活限制性内切酶；

使用乙醇沉淀回收法回收酶切产物，nano drop检测结果显示回收后线性质粒浓度约为1500ng/μL。

2、制作毕赤酵母感受态细胞并转化

试验过程：过夜培养2mL GS115，在OD值为1.2-1.5时停止摇菌，取1.6mL菌液分装到2个EP管中，每管0.8mL，1500g 30s离心；

弃上清，用640μL冰冷水重悬，1500g 30s离心；

重复一次；

弃上清，用320μL冰冷山梨醇重悬，1500g 30s离心；

重复一次；

用40μL冰冷山梨醇重悬菌体，收集2管菌体混合，为80μL感受态GS115；

加入10μL前述的酶切回收产物，冰浴5分钟电转(25μF,200Ω,1.0kV)，并立即用1mL冰冷山梨醇洗出菌体，28℃静止孵育2h后涂MD平板，28℃培养，72小时后每板长出约数百个转化子。

3、高拷贝转化子筛选

按每平板1mL无菌水的比例将MD平板中的转化子洗下并混合，涂布在含有0.25、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/mL G418的YPD平板上，28℃培养，72小时后各个抗性平板中均有转化子出现，且转化子数目随着G418浓度的升高而显著降低，含5.0mg/mL G418 的YPD平板上仅出现7个转化子。

实施例4摇瓶水平培养发酵

挑取MD平板以及含5.0mg/mL G418的YPD平板中的转化子，转接于含有2mL YPD 的试管中，28℃230rpm过夜培养；

取200μL YPD培养物于含有20mL BMGY的100mL摇瓶中，28℃230rpm培养约18 小时，将摇瓶放置4℃冰箱静置6小时，菌体自由沉降；

将摇瓶中上清液吸出，并打入20mL BMMY(Buffered Methanol-complex Medium)，28℃230rpm继续培养，每24小时添加0.5％体积分数的甲醇以实现诱导，连续诱导96 小时后取发酵液，离心后保存上清液于-20℃。筛选出表达量最高的菌株作为后期研究的出发菌株。以出发菌株为基础，以不同频度(每24小时加0.5％到每12小时加2.0％)添加纯甲醇，摸索最佳甲醇添加量。

SDS-PAGE结果表明，10个随机挑取的MD平板转化子均有大小正确的蛋白表达，表达量为105-135mg/L，如图5；Western blot结果表明，表达的蛋白与人血清白蛋白抗体有很好的特异性结合，确定为人血清白蛋白，且随着诱导时间的延长，目标蛋白的浓度也越来越高，如图6；SDS-PAGE结果表明，含5.0mg/mL G418的YPD平板中的7个转化子的表达量明显高于未经筛选的MD平板转化子，如图7，选取表达量最高(585mg/L) 的菌株5-4作为出发菌株。

对于不同的甲醇添加量，实验结果表明，每12小时添加体积分数为1.0％的甲醇，其生物量和表达量均最高，表达量(约1200mg/L)相比每24小时添加0.5％甲醇的表达量有显著提升，如图8。

实施例5 5L发酵罐水平高密度发酵

取菌株5-4的甘油菌(所述甘油菌为收集生长在对数期的菌株5-4加入含有甘油的细菌冻存液后制得)划YPD平板活化；

挑取单克隆于装有10mL YPD的100mL三角瓶中，于28℃、230rpm中培养约24 小时，作为一级种子；

取5mL YPD培养物于装有100mL YPD的500mL三角瓶中，于28℃、230rpm中培养约12小时，作为二级种子，并在接种前测量其OD600以及菌体湿重，同时做镜检确保无杂菌；

配置BMMY培养基、PTM1(微量元素)、25％氨水(调pH及补充N源)、50％甘油补料液；

校正pH和溶氧电极后，将BMGY培养基中可灭菌的成分(蛋白胨+酵母膏)随罐一起灭菌；

灭菌后将罐体放置在室温中，冷却到室温；

通过补料瓶和发酵罐补料装置将培养基中不可高温灭菌的成分(YNB、生物素、磷酸钾缓冲液)打入罐内；

温度控制在28℃、初始转速200rpm、1vvm条件下，稳定1小时后，溶氧校正100％，同时通过补料瓶和补料装置将二级种子液打入；

维持温度28℃、pH 5.75、DO(溶氧水平)和Agit(转速)偶联，DO出现反弹后补充甘油补料培养基(50％甘油+12mL PTM1(/L)，维持15mL/(L*h)的速度，4小时内补完；

维持温度28℃、pH 5.75、DO和Agit偶联，DO出现反弹后补充甲醇补料培养基(100％甘油+12mL PTM1/L)，以3mL/h的补料速度补2小时，随后调整为6mL/h的速度补2小时，最后调整为10mL/h的速度维持到发酵终点。每隔12小时取样、称湿重、镜检。

结果表明，初始的40g/L甘油维持菌体生长了20小时，菌体湿重达到120g/L；甘油补料阶段维持4小时，菌体湿重达到约200g/L；而在甲醇诱导阶段，菌体持续生长，但长势较为缓慢，诱导后132小时(即发酵156小时)，菌体湿重为437g/L，如图9a。

由于无甲醇作为诱导剂，甘油分批培养阶段(0-20小时)和甘油补料培养阶段(20-24 小时)皆无目标蛋白表达。而甲醇补料阶段开始后，目标蛋白即开始快速积累，最终于诱导后96小时(即发酵120小时)，目标蛋白的浓度达到峰值，为8.86g/L，随后即开始下降，如图9b。故诱导后96小时(即发酵120小时)为最佳放罐时间，此时的蛋白生产效率为92.29mg/L/h。

每隔12小时取发酵液离心，上清样品做SDS-PAGE检测，检测示意图如图10。

实施例6高密度发酵产物纯化与纯度鉴定

取诱导后96小时发酵液，于12000rpm，4℃离心25分钟，收集上清液，去除菌体以及大颗粒固态杂质；

取上清液与上样缓冲液(含0.1M氯化钠的磷酸钾缓冲液，pH7.2)按1：9的比例进行稀释，稀释后使用0.45um的微孔滤膜进行过滤，收集滤过液，进一步去除小颗粒固态杂质；

将Blue Sepharose 6FF亲和柱连接ATKA系统，使用上样缓冲液A平衡亲和柱；

将滤过液泵入亲和柱，UV280基线上升时收集洗脱液至基线水平，此为流穿峰FT；

使用100％比例的洗脱缓冲液(含2.0M氯化钠的磷酸钾缓冲液，pH7.2)进行洗脱，UV280基线上升时收集洗脱液至基线水平，此为洗脱峰Peak1；

使用0.1M的NaOH进行洗脱，UV280基线上升时收集洗脱液至基线水平，此为洗脱峰Peak2；

整个洗脱曲线如图11；对各个样品液及洗脱液进行SDS-PAGE，检测结果如图12。结果表明，流穿液FT中含有大量杂蛋白，同时含有一定比例的目标蛋白；洗脱液Peak1 中含有纯度较高的目标蛋白，浓缩后仍然只见一个条带；洗脱液Peak2中含有浓度较高的降解片段(45KD)，同时含有一定比例的杂蛋白，可见降解片段对亲和柱的结合能力强于目标蛋白。

使用Mab-Pac反相色谱柱对洗脱液Peak1中目标蛋白的纯度进行检测。缓冲液A为含有0.1％三氟乙酸的水，缓冲液B为含有0.1％三氟乙酸的乙腈，洗脱方法为10％B-90％B线性洗脱，洗脱时间为30分钟，流速为0.7mL/min，柱温控制在80℃，检测波长为215nm。

检测结果如图13所示，目标蛋白的纯度达到96.47％，同时其回收率为58.1％。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海医药工业研究院；中国医药工业研究总院

<120> 一种表达人血清白蛋白的基因工程菌及其制备方法和应用

<130> P1711628C

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1830

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120

gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180

gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240

gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300

gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360

gagagtaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420

agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480

aaatacctat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540

tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600

tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660

agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720

gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780

gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840

agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900

gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960

gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020

aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080

aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140

ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200

tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260

cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320

caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380

tgttgtaaac atcctggagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440

ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500

tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560

tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620

tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagcttgt gaaacacaag 1680

cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740

aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800

gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa 1830

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P1

<400> 2

cggaattcga tgacacaaga gtgaggttgc tcat 34

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P2

<400> 3

ataagaatgc ggccgcttat aagcctaagg cagctt 36

Claims (10)

1.一种表达人血清白蛋白的基因工程菌，其特征在于，其是在巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)中整合有人血清白蛋白基因的表达载体的工程菌，所述的表达载体依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的启动子为AOX1启动子；

所述的α引导肽来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

和/或，所述的表达载体带有抗遗传霉素基因，所述的基因工程菌具有抗0.25～5.0mg/mL浓度的遗传霉素的性能。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

和/或，所述的表达载体的骨架为质粒pPIC9K。

4.一种表达载体，其特征在于，其依次含有启动子、α引导肽、人血清白蛋白基因和终止子。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的启动子为AOX1启动子；

所述的α引导肽来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

所述的表达载体的骨架为质粒pPIC9K；

所述的表达载体带有抗性基因；所述抗性基因优选遗传霉素；

和/或，所述人血清白蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

6.一种如权利要求1～3任一项所述的表达人血清白蛋白的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)构建权利要求4或5所述的表达载体；

(2)将步骤(1)所得表达载体转化至巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中；

(3)将步骤(2)所得的巴斯德毕赤氏酵母涂布于含有抗性基因筛选标记的抗生素的平板中培养后挑选平板上的转化子即得。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的转化为电转化，所述电转化的电势优选0.75～1.5Kv/cm，更优选1.0Kv/cm；

步骤(3)中所述的抗生素为遗传霉素，遗传霉素的浓度为0.25～5.0mg/mL；

步骤(3)中所述的平板为YPD平板；

和/或，步骤(3)中所述培养的条件为22～30℃，培养24～144小时；优选28℃，培养96小时。

8.一种人血清白蛋白的制备方法，其特征在于，其包括将权利要求1～3任一项所述的基因工程菌接种于巴斯德毕赤氏酵母菌培养基中发酵，从发酵液中获得人血清白蛋白即可。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的培养基含有BMGY或者BMMY；所述BMGY或者所述BMMY占摇瓶总体积百分比优选10-30％，更优选20％。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养的过程中，每12～24小时添加体积分数为0.5～2.0％的甲醇，添加4～8次；优选每12小时添加体积分数为1.0％的甲醇，添加8次。