CN1235981A - 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化 - Google Patents

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本发明涉及一种人血清白蛋白在毕赤氏酵母(Pichia pastors)中的表达与纯化方法。本发明的方法特征在于重组表达质粒pPKQ－HSA的构建和表达HSA的高效分离纯化。用该方法获得的样品纯度高于99%。

Description

人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化
本发明涉及基因工程药物，具体涉及高表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)重组细胞的构建、表达和高度纯化。
人血清白蛋白(Human Semm Albumin,HSA)是血浆中最重要的蛋白质成分之一，其含量约占血浆总蛋白的60％，具有维持血液渗透压和携带血液中多种配基(包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物)与组织进行交换等生理功能。临床医疗中用于手术输血和危重病人补液，治疗创伤烧伤休克、发烧、水肿和大出血，又能增强人体抵抗能力，是重要的临床药物。但由于人血来源有限，又因爱滋病及肝炎的蔓延及检测与技术的原因，对HSA药物的制备提出了更高的要求，如何用基因重组细胞制备HSA取代人血源HSA，阻止爱滋病、肝炎病毒的传染成为众所瞩目的研究方向。
八十年代以来，国际上许多公司尝试通过基因工程开发HSA，HSA基因已被引入细菌、酵母、放线菌、植物以及动物进行表达。(Goodey,A.R.,TIBTECH 1993,8(11):430-433)大肠杆菌表达HSA的量为细胞蛋白的7％，但大分子HSA含有大量二硫键，使体外折叠极难完成，未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖造成热源反应，结果不很理想。HSA在面包酵母和工业酵母中的表达量为1％细胞总蛋白，为胞内表达，虽无热源物质，但LAL(LinulusAmoebocyte Lysate)检验不合格。在众多努力中发现HSA基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的表达为细胞外分泌型，人们在努力寻求高效表达及高度纯化[Prevatt,W.D.et al.,1994 US Pat.5330901Ohmura,T.et.al.,1995,US Pat.5440018 Ohda,T.et.al.,1997 USPat.5612197 Sreekrishna,K.et.al.1998,US Pat.5707828]鉴于HSA需求量极大，纯度要求极高，更高表达量的重组细胞的构建和高效、简单、大规模易工业化的纯化工艺极为必要。
本发明的目的在于克服上述不足，运用所构建的巴斯德毕赤酵母重组细胞进行高水平的外分泌表达HSA。运用所建立的高效分离纯化工艺获得高纯度的HSA。
本发明所用材料及来源：
DNA合成试剂盒、Klenow片段多聚酶和所有使用的内切酶均为G1BCO BRL公司产品。pPIC9、Pichia pastoris GS115(his4 Mut+)为Invitrogen公司产品，DNA序列测定试剂盒和Trizol RNA抽提试剂盒购自Promega公司，YNB(W/O amino acid)购自DIFCO公司。
本发明提供了一种高表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母重组细胞的构建、表达和高效纯化方法，该方法包括下列步骤：一、中国人血清白蛋白cDNA的获得：
1、人肝白细胞总RNA的抽提
按照Trizol RNA抽提试剂盒推荐方法，从中国人胚肝细胞中抽提总RNA；
2、pre-HSA cDNA合成和PCR体外扩增
根据已知天然HSA基因5’和3’端序列，设计引物：引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC 3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC 3’以抽取的人肝白细胞总RNA为模板，按照DNA合成试剂盒推荐的方法，通过引物1和引物2反转录合成人血清白蛋白pre-HSAcDNA。
3、PCR合成pre-HSA cDNA的序列验证
按照klenow聚合酶推荐使用方法，将回收的PCR产物用klenow片段聚合酶补平。酚/氯仿回收补平产物。将补平的PCR产物与Smal酶切的PUC19载体平端连接，所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA，所得质粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定出重组质粒PUC19-HSA。然后使用PUC19载体上引物-W40和W1，测定pre-HSA两端序列。再根据已知正确序列设计引物测定剩余部分序列，最后得到一个序列与天然HSA基因基本一致的克隆。序列的部分核苷酸有改变，但氨基酸序列与天然HSA完全一致。pre-HSA核酸及蛋白序列见图1(pre-HSA核酸及蛋白序列)。
4、所构建基因5’端含一BamHⅠ位点，BamHⅠ位点与ATG之间含一Kozak序列5’-CCACC-3’，见图2(构建pre-HSA cDNA 5’端Kozak序列)。3’端紧接终止密码子含一EcoRⅠ位点，参见图3(构建pre-HSA cDNA 3’端序列)。二、HSA在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
1、重组表达质粒pPKQ-HSA的构建：
将PUC19-HSA克隆载体中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切下，1％琼脂糖电泳分离，并用酚/氯仿回收。将约2Kb的pre-HSA基因回收片段，与用相同酶切的pPIC3.5K表达载体连接，转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定出重组质粒pPKQ-HSA。
2、表达质粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的构建
设计引物3：
5’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA 3’用引物3和引物1从PUC19-HSA上PCR扩增HSA cDNA片段，酚/氯仿抽提PCR产物后，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收。再与用相同酶切的pPIC9质粒连接，转化E.coli TG1感受态细胞。涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定重组质粒pPIC9-HSA，
取4个经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定的重组克隆，制备高纯度质粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，测定重组质粒HSA cDNA两端序列。结果有三个含完全正确的阅读框。经测序验证的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，与用相同酶切的pPIC9k质粒连接，转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA，所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定得重组质粒pPIC9k-HSA。
3、重组质粒pPKQ-HSA转化毕赤酵母细胞GS115(his4Mut+)
毕赤酵母表达载体pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA分别由pPIC3.5K和pPIC9K衍生而来，内含G418抗性基因，为多基因拷贝载体，可以在同一酵母细胞中整合多个基因拷贝，从而提高蛋白的表达量。同一转化细胞中整合基因的拷贝数与转化细胞对G418的抗性成比例。因此可以通过G418抗性筛选出不同基因拷贝数的重组细胞，获得高表达的重组菌株。将构建的重组表达质粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalⅠ或BglⅡ酶切线性化。同时将空载pPIC3.5k和pPIC9k质粒相同酶切线性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于无菌水中。按照Invitrogen,Pichia Expression Kit Instruction Manual(Version E)方法电转化GS115细胞，涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得不同G418抗性的阳性克隆，经MD平板验证his+表型获得GS115/HSA重组克隆S1B119。
4、重组克隆Pichia pastoris GS115/HSA-S1B119株细胞的表达
将筛选出的GS115/HSA重组细胞接种3ml YPD试管，30℃300rpm培养过夜，再以0.2％～0.5％接种量接种50ml BMGY,30℃,300rpm培养至OD600 4～7。离心收集菌体悬于15ml含甲醇的BMMY培养液中，置20-30℃摇床诱导培养，每24hr加甲醇至0.5ml/L。定时取样，经4℃离心，上清加入PMSF至1mM,-20℃冻存。20ml上清液经10％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果显示分子量67KDa部位有明显条带，如图4．(SDS-PAGE分析HSA的表达)。(Ⅰ:24hr发酵液，Ⅱ:48hr发酵液，Ⅲ:LMW蛋白标准)Westen-blot分析证明其抗HSA抗体的免疫活性。火箭电泳测定上清液中HSA含量，如图5．(火箭电泳测定HSA含量)(Ⅰ：标准HSA＜500ug/ml,Ⅱ：标准HSA300ug/ml,Ⅲ：标准HSA100ug/ml,Ⅳ：标准HSA50ug/ml,Ⅴ-Ⅶ:48hr发酵液)。HSA分泌曲线如图6．(低密度诱导HSA分泌曲线)。诱导2天发酵液中HSA含量可达约140mg/L。通过改变BMMY中诱导的菌体浓度，发现随菌体浓度的增加，HSA分泌量几乎线性地增加(图7．菌体浓度对HSA诱导的影响)。表明经过自动发酵罐中高密度诱导可获更高表达量。三、表达HSA的分离纯化
HSA的分离纯化已有较多报道，但大多较为繁琐[U.S.Pat.5440018,US Pat.5369020]。我们发现重组巴斯德毕赤酵母细胞所表达的产物溶液中杂质较少，主要为一些毒素和色素。本发明主要采用膜分离技术，亲和层析技术结合其他方法除去杂质以高产率地获得高纯度HSA。
HSA分离纯化流程：
1、中空纤维柱
2L低密度诱导发酵液除去细胞后，用截留分子量10KDa-50KDa的中空纤维柱除去低于50KDa的杂质并使浓缩到0.2L浓缩液。HSA收率≥95％；
2、脱色
浓缩发酵液经50℃保温后，加入3％活性炭或732等脱色树脂处理10分钟后离心除去，得脱色浓缩液；
3、疏水柱分离
浓缩发酵液或脱色浓缩液中加入固体(NH4)2SO4直至达20％终浓度，并流过20％(NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱，上样后用平衡液洗涤至流出液OD280＜0.01，再改用水洗脱。收集用水洗脱的HSA蛋白，收率≥95％；
4、亲和层析除去杂蛋白
(1)无HSA发酵液抗血清-Sepharose的制备：由1、所得浓缩发酵液流经抗HSA抗体-Sepharose以除去HSA。流出液为无HSA发酵液，按发明人论文[徐俊等，生物工程学报1993,9(1)69-73]方法将无HSA发酵液制得的抗血清通过醛基结合于Sepharose上；
(2)将疏水层析纯化得到的水洗脱峰通过“无HSA发酵液的抗血清”亲和柱，直接流过的蛋白峰即为HSA，回收率≥98％；
5、超滤脱盐
将亲和层析流出蛋白峰经截留分子量10KDa中空纤维或超滤膜组件中脱盐。可得纯度≥99％的HSA，回收率≥98％；
6、真空冷冻干燥
脱盐后的HSA溶液真空冷冻干燥得到HSA样品。
按本发明方法制得的HSA经10％SDS-PAGE凝胶电泳，银染显色扫描分析表明，纯度高于99％，并且验证不含色素，见图8．(SDS-PAGE分析纯化的HSA)。
本发明的另一目的是提供了一种用于上述方法的菌株GS115/HSA-SIB119，该菌种属巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于1998年5月5日藏于“中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No 0349。
实施例1 pre-HSA cDNA的获得
取2克人胚肝细胞，按照Trizol RNA抽提试剂盒推荐方法，从人胚肝细胞中抽提总RNA。根据已知天然HSA基因5’和3’端序列，设计引物(Primer)如下：引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC 3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC 3’以抽提的人胚肝细胞总RNA为模板，PCR反转录合成人血清白蛋白pre-HSA cDNA。PCR反应体系参照文献(Scharf S.J.,In PCRprotocol:A Guide to Method and Application,2nd ed.New York,Academic Press,USA 1990)进行。反应条件为：
94℃变性45秒，
55℃退火1分钟，
72℃延伸1分30秒，共40个循环，最后72℃保温10分钟。PCR产物经1％琼脂糖电泳初步确证后，酚/氯仿抽提回收。得5’端为BamHⅠ,3’端为EcoRⅠ的PCR产物。
按照klenow多聚酶推荐使用方法，将回收的PCR产物用klenow片段聚合酶补平。酚/氯仿回收补平产物。将补平的PCR产物与SmaⅠ酶切的PUC19载体平端连接，连接反应体系如下：
PUC19(SmaⅠ切)         1ul
5×连接缓冲液          3ul
T4 DNA连接酶(1u/ul)    1.5ul
SmaⅠ(1u/ul)           0.5ul
PCR补平产物            5ul
H2O                   4ul以上混合物21℃连接5小时。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定出重组质粒PUC19-HSA。
        实施例2    表达质粒pPKQ-HSA的构建
将PUC19-HSA克隆载体中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EccRⅠ双酶切下，1％琼脂糖电泳，酚/氯仿回收约2Kb的pre-HSA基因片段。回收片段与用相同酶切的pPIC3.5K表达载体连接，连接反应如下：
pPIC3.5K(BamHⅠ,EcoRⅠ切)    1ul
5×连接缓冲液                3ul
T4 DNA连接酶(1u/ul)          1.5ul
pre-HSA                      3ul
H2O                         6.5ul以上混合物21℃连接5小时。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定得重组质粒pPKQ-HSA。
         实施例3表达质粒pPIC9K-HSA的构建
设计引物如下：引物3:5’CGCTCGAGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA 3’用引物3和引物1(见实施例1)从PUC19-HSA上PCR扩增HSA cDNA片段，扩增条件如同实例1。酚/氯仿抽提回收PCR产物，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收，与相同酶切的pPIC9质粒连接，连接条件同实例2。连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定重组质粒pPIC9-HSA。
取4个经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定的重组克隆。碱裂解法制备质粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，测定重组质粒HSA cDNA两端序列。测序方法按照Promega测序试剂盒推荐方法。结果有三个含完全正确的阅读框。将测序验证的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，与用相同酶切的pPIC9K质粒连接，转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定得重组质粒pPIC9K-HSA。
        实施例4表达质粒转化毕赤酵母GS115
将构建的重组表达质粒pPKQ-HSA和pPIC9K-HSA分别用SalⅠ或BglⅡ酶切线性化，同时将空载pPIC3.5K和pPIC9K质粒相同酶切线性化。酚/氯仿抽提回收并溶解于无菌水中。按Invitrogen手册介绍的方法(Invitrogen,Pichia Expression Kit InstructionManual<Version E>)制备GS115电转化细胞。将上述约5ug线性化DNA分别与80ul GS115电转化细胞混合，采用Bio-Rad电转化仪电击转化，电转化条件为：电压1500V，电容25uF，电阻200Ω。电转化产物分别转移到一无菌微量离心管中，立即加入0.50ml℃预冷1mol/L山梨醇，30℃静置一小时，加入0.5mlYPD(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)后30℃保温过夜。第二天快速离心去除上清，加入300ul无菌水悬浮菌体。各取100ul涂布含不同浓度G418的YPD平板(含G418各0.5mg/ml,1.0mg/ml,1.5mg/ml),30℃3～4天后将阳性克隆点接MD平板验证his+表型，30℃2天后的阳性克隆即为Pichia pastoris GS115/HSA重组克隆，其中含G418浓度高的YPD平板上的阳性克隆整合入HSA基因的拷贝数也高。
          实施例5 HSA在毕赤酵母中的表达
将筛选出的GS115/HSA重组克隆S1B119细胞接种3ml YPD试管，30℃300r/min摇床中培养过夜，以0.2％接种量加入含50ml BMGY(10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，0.1M磷酸钾缓冲液pH6.0，13.4g/L YNB,4×10-4g/L生物素，10g/L甘油)的250ml培养瓶中。30℃300rpm培养至OD600为4～5。常温5000rpm离心4min。收集的菌体用15ml BMMY(将BMGY中10g/L甘油改变为5ml/L甲醇)悬浮后转移到150ml三角瓶，28℃300rpm开始诱导。每24小时补加甲醇到5ml/L。并在12、24、36、48、96小时取样。4℃15000rpm离心10min后，上清立即加入PMSF至1mM，放-20℃冻存。
           实施例6表达HSA的分离纯化
1、抗HSA抗血清的获得用1mg/ml的HSA(Sigma)与福氏完全佐剂乳化剂皮下多点注射免疫成熟雄兔。以后每3周用1mg/ml的HSA与福氏不完全佐剂乳化剂加强免疫。共3次加强免疫后采血，分离上清并用38％饱和度硫酸铵沉淀抗学清。
2、抗HSA-Sepharose 4B亲和柱制备按文献(徐俊，祁俊，袁中一。生物工程学报，1993,9(1):69-73)制备醛基-Sepharose4B载体。将获得的兔抗HSA抗血清用0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液透析后，用透析液稀释到约10OD280/ml。在40g抽干的醛基-Sepharose 4B载体中加入80ml抗HSA抗血清中，置4℃冰箱搅拌过夜。凝胶用0.5mol/L NaCl洗涤3次后抽干，抗HSA-Sepharose再置于160ml含3.1mg/ml氰基硼氢化钠的1mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液中，室温反应一小时。然后用大量水洗去未反应的氰基硼氢化钠。所得免疫吸附剂抽干浸泡于0.02mol/L pH7.2磷酸缓冲液(含0.9％氯化钠)备用。
3、表达rHSA的火箭电泳测定方法以2％含兔抗HSA抗血清的琼脂糖形成电泳凝胶，点样不同浓度标准HSA样品(50-500ug/ml)和待测样品各5ul,120V电泳2-3小时至沉淀峰明显。测量沉淀峰的高度。用标准样品峰高与HSA对应浓度关系制作标准曲线。根据标准曲线求算待测样品的HSA含量。
4、中空纤维柱浓缩将2L诱导发酵液用孔径(MWCO)50000道尔顿的中空纤维柱浓缩到0.2L。Folin-酚法和火箭电泳测量前后总蛋白及HSA含量，结果经由中空纤维柱处理，可有效浓缩发酵液，HSA含量为1.33mg/ml。回收率≥95％。
5、脱色100ml浓缩发酵液加热至50℃后搅拌下添加3.0克活性炭。继续搅拌10分钟。过滤除去活性炭，得到除去色泽的浓缩液。
6、Phenyl-Sepharose疏水柱分离中空纤维柱浓缩液100ml中加入固体硫酸铵到20％终浓度。HSA/(NH4)2SO4溶液流入硫酸铵平衡的Phenyl-Sepharose柱，上样后用2倍体积平衡液洗脱，流出液中不再有蛋白时改用双蒸水洗脱，收集用双蒸水洗脱HSA。含量分析表明，经Phenyl-Sepharose处理HSA纯化近10倍，回收率超过90％。
7、免疫亲和层析纯化疏水层析纯化HSA峰20ml对0.01mol/L、pH7.2磷酸缓冲液(含0.9％氯化钠)透析。无HSA发酵液的抗体-Sepharose 4B亲和柱依序以0.1mol/L pH2.6的Gly-HCl缓冲液-3mol/L硫氰酸钾、0.01mol/L pH7.2的磷酸缓冲液-0.9％氯化钠洗涤。上述透析平衡的HSA溶液(约25ml)进入HSA亲和柱，用透析液洗涤出单一HSA峰。此HSA溶液SDS-PAGE电泳中银染呈现一条带。亲和柱先后用0.1mol/L pH2.6Gly-HCl缓冲液-3mol/L硫氰酸钾、0.01mol/L pH7.2磷酸缓冲液-0.9％氯化钠洗涤再生。HSA回收率98％
8、超滤脱盐亲和层析漏出蛋白峰(约30ml)经MWCO为10000道尔吨的小型超滤器脱盐。HSA回收率≥95％。
9、真空冷冻干燥将脱盐后的HSA溶液真空冷冻干燥得到HSA样品。

Claims (2)

1、一种高表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母重组细胞的构建表达和纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤：一、人血清白蛋白cDNA的获得：
(1)人胚肝细胞总RNA的抽提
按照Trizol RNA抽提试剂盒推荐方法，从中国人胚肝细胞中抽提总RNA；
(2)pre-HSA cDNA合成和PCR体外扩增
根据已知天然HSA基因5’和3’端序列，设计引物：引物1:5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC 3’引物2:5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC 3’以抽取的人肝白细胞总RNA为模板，反转录合成人血清白蛋白pre-HSA cDNA，
(3)所构建的基因5’端BamH1位点与ATG之间插入了一段Kozak序列5’CCACC3’,3’端紧接基因的终止密码含一EcoR1a位点。二、HSA在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
(1)重组表达质粒pPKQ-HSA的构建：
将PUC19-HSA克隆载体中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切下，1％琼脂糖电泳分离，并用酚/氯仿回收。将约2Kb的pre-HSA基因回收片段与用相同酶切的pPIC3.5K表达载体连接，转化E.coli TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定出重组质粒pPKQ-HSA。
(2)表达质粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的构建
设计引物：引物3：
5’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA 3’用引物3和引物1从PUC19-HSA上PCR扩增HSA cDNA片段，酚/氯仿抽提PCR产物后，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收。再与用相同酶切的pPIC9质粒连接，转化E.coli TG1感受态细胞。涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定重组质粒pPIC9-HSA，
取4个经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定的重组克隆，制备高纯度质粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，测定重组质粒HSA cDNA两端序列。结果有三个含完全正确的阅读框。经测序验证的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，与相同酶切的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含HSA基因片段，与用相同酶切的pPIC9k质粒连接，转碱裂解法制备质粒DNA，所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定得重组质粒pPIC9k-HSA。
(3)重组质粒pPKQ-HSA转化毕赤酵母细胞GS115(his4Mut+)
将构建的重组表达质粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalⅠ或BglⅡ酶切线性化。同时将空载pPIC3.5k和pPIC9k质粒相同酶切线性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于无菌水中。按照Invitrogen,PichiaExpression Kit Instruction Manual(Version E)方法电转化GS115细胞，涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得不同G418抗性的阳性克隆，经MD平板验证his+表型获得GS115/HSA重组克隆S1B119。
(4)重组克隆pichia pastoris GS115/HSA S1B119株细胞的表达
将筛选出的GS115/HSA重组细胞接种3ml YPD试管，30℃300rpm培养过夜，再以0.2％～0.5％接种量接种50ml BMGY,30℃、300rpm培养至OD600 4～7。离心收集菌体悬于15ml含甲醇的BMMY培养液中，置20-30℃摇床诱导培养，每24hr加甲醇到0.5ml/L。定时取样，经4℃离心，上清加入PMSF至1mM,-20℃冻存；三、表达HSA的分离纯化
(1)中空纤维柱
将2L低密度诱导发酵液除细胞后用截留分子量10KDa-50KDa的中空纤维柱除去低于50KDa的杂质并使浓缩到0.2L浓缩液。HSA收率为95％；
(2)脱色浓缩发酵液经50℃保温后，加入3％活性炭或732等脱色树脂处理10分钟后离心除去，得脱色浓缩液；
(3)pharose疏水柱分离
浓缩发酵液或脱色浓缩液中加入固体(NH4)2SO4至20％并流过(NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱，上样后用平衡液洗涤至流出液OD280＜0.01后改用水洗脱，收集用水洗脱的HSA蛋白，收率为95％；
(4)亲和层析除杂蛋白
①无HSA发酵液抗血清-Sepharose制备：由1所得浓缩发酵流经抗HSA抗体-Sepharose除去HSA。流出液为无HSA发酵液，按发明人论文[徐俊等，生物工程学报1993,9(1)69-73]方法将无HSA发酵液制得的抗血清，通过醛基结合于Sepharose；
②疏水层析纯化得到的水洗脱峰通过“无HSA发酵液的抗血清”亲和柱，收集未吸附的蛋白峰为HSA，回收率≥98％；
(5)超滤脱盐
将亲和层析漏出蛋白峰经截留分子量10KDa中空纤维或超滤膜组件中脱盐。可得纯度≥99％的HSA，回收率≥98％；
(6)真空冷冻干燥
将脱盐后的HSA溶液真空冷冻干燥得到HSA样品。
2、一种用于权利要求1所述方法的菌种CGMCC No 0349。
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