CN109370996A - 一种过氧化氢酶纯净化提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种过氧化氢酶纯净化提纯方法，属于酶制品相关技术领域，所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法包括如下步骤：步骤一，试剂与主要仪器的准备；步骤二，培养改性大肠杆菌；步骤三，粗酶液制备；步骤四，热处理去除杂质；步骤五，硫酸铵分级沉淀；步骤六，离子交换层析；步骤七，疏水作用层析；步骤八，凝胶层析；本发明详细介绍了在改性大肠杆菌中纯净提纯过氧化氢酶的方法，解决了现有技术中在动物肝脏中提取过氧化氢酶时纯化难度增加，产品纯度不高，酶活不稳定，得率低且生产周期长的技术问题，在酶制品相关技术领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及酶制品相关技术领域，具体是一种过氧化氢酶纯净化提纯方法。
背景技术
过氧化氢酶是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。
现有技术中的过氧化氢酶的提取主要在动物肝脏中提取，由于现有技术对过氧化氢酶提取的相关技术不够成熟，导致后续步骤中对过氧化氢酶的纯化难度增加，产品纯度不高，酶活不稳定，得率低且生产周期长；因此，本发明提供一种过氧化氢酶纯净化提纯方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种过氧化氢酶纯净化提纯方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种过氧化氢酶纯净化提纯方法，包括如下步骤：步骤一，试剂与主要仪器的准备；步骤二，培养改性大肠杆菌；步骤三，粗酶液制备；步骤四，热处理去除杂质；步骤五，硫酸铵分级沉淀；步骤六，离子交换层析；步骤七，疏水作用层析；步骤八，凝胶层析；
所述步骤一中准备的主要仪器包括有：超声波细胞破碎仪、高速冷冻离心机、层析仪和凝胶图像分析仪，准备的试剂包括有：脱氧核糖核酸酶、苯酚盐、异丙基硫代半乳糖苷和凝胶过滤柱；
所述步骤二的具体实施过程为：挑取一环大肠杆菌接入盛有LB培养基的三角瓶中培养，其中，LB培养基为30mL，三角瓶容量为100 mL，培养温度为32℃，培养转速为180rpm，培养时间为20h；
所述步骤三的具体实施过程为：将步骤二中得到的改性大肠杆菌菌液置于高速冷冻离心机中第一次离心，然后重悬于磷酸钠-磷酸钾缓冲液中，用超声波细胞破碎仪破碎处理，最后置于高速冷冻离心机中第二次离心，第二次离心后去除菌体碎片得到粗酶液；
所述步骤四的具体实施过程为：向步骤三中得到的粗酶液中加入脱氧核糖核酸酶，然后进行热处理，热处理过后置于高速冷冻离心机中离心，离心过后收集上清液A，本步骤的目的在于去除DNA和部分杂质蛋白；
所述步骤五的具体实施过程为：向步骤四中得到的上清液A中第一次加入硫酸铵，离心去除沉淀后得到上清液B，在上清液B中第二次加入硫酸铵，离心收集沉淀；
所述步骤六的具体实施过程为：将步骤五中得到的沉淀物置于磷酸钠-磷酸钾缓冲液中溶解，25℃温度下按照沉淀物与磷酸钠-磷酸钾缓冲液1:80的体积比进行透析脱盐，得到脱盐后酶液，脱盐后酶液用聚乙二醇8000浓缩得到浓缩后酶液，将浓缩后酶液加样到玻璃层析柱上，并用含氯化钠的磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱得到洗脱后酶液；本步骤的目的是去除大部分杂蛋白；
所述步骤七的具体实施过程为：将步骤六中得到的洗脱后酶液与磷酸钠-磷酸钾缓冲液按照体积比1:1的比例混合后加样到苯酚盐层析柱上，用磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱后收集活性组份并浓缩得到浓缩产物；
所述步骤八的具体实施过程为：将步骤七中得到的浓缩产物加样到凝胶过滤柱上，并用磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱后收集具有活性的组份，完成对过氧化氢酶的纯净化提纯。
作为本发明进一步的方案：所述步骤二中培养20h后，还包括如下步骤：将培养后的大肠杆菌菌液以5%的接种量转接到含有60mL的LB培养基的300mL的三角瓶中培养至OD600为0.5-0.7，然后加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.8mmol/L后再培养5h。
作为本发明进一步的方案：所述步骤三中第一次离心的离心参数为：5000×g离心10min；所述磷酸钠-磷酸钾缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为7；所述超声波细胞破碎仪的超声频率为20HZ，时间为10min；所述第二次离心的离心参数为：12000×g离心10min。
作为本发明进一步的方案：所述步骤四中脱氧核糖核酸酶的加入量为使得终浓度为12U/mL；所述热处理的温度为80℃，时间为30min；所述离心的离心参数为12000×g离心20min。
作为本发明进一步的方案：所述步骤五中第一次加入的硫酸铵饱和度为12%，第二次加入的硫酸铵饱和度为40%。
作为本发明进一步的方案：所述步骤六中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7；所述氯化钠的浓度为0.5mol/L；所述洗脱的流速为1mL/min。
作为本发明进一步的方案：所述步骤七中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7，洗脱的流速为1mL/min。
作为本发明进一步的方案：所述步骤八中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7，洗脱的流速为0.5mL/min。
一种如上述所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法在过氧化氢酶提纯产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明一种过氧化氢酶纯净化提纯方法，包括如下步骤：步骤一，试剂与主要仪器的准备；步骤二，培养改性大肠杆菌；步骤三，粗酶液制备；步骤四，热处理去除杂质；步骤五，硫酸铵分级沉淀；步骤六，离子交换层析；步骤七，疏水作用层析；步骤八，凝胶层析；本发明详细介绍了在改性大肠杆菌中纯净提纯过氧化氢酶的方法，在各个步骤的紧密配合之下，解决了现有技术中在动物肝脏中提取过氧化氢酶时纯化难度增加，产品纯度不高，酶活不稳定，得率低且生产周期长的技术问题，在酶制品相关技术领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
请参阅图1，本发明实施例中，一种过氧化氢酶纯净化提纯方法，包括如下步骤：步骤一，试剂与主要仪器的准备；步骤二，培养改性大肠杆菌；步骤三，粗酶液制备；步骤四，热处理去除杂质；步骤五，硫酸铵分级沉淀；步骤六，离子交换层析；步骤七，疏水作用层析；步骤八，凝胶层析；
所述步骤一中准备的主要仪器包括有：超声波细胞破碎仪、高速冷冻离心机、层析仪和凝胶图像分析仪，准备的试剂包括有：脱氧核糖核酸酶、苯酚盐、异丙基硫代半乳糖苷和凝胶过滤柱；
所述步骤二的具体实施过程为：挑取一环大肠杆菌接入盛有LB培养基的三角瓶中培养，其中，LB培养基为30mL，三角瓶容量为100 mL，培养温度为32℃，培养转速为180rpm，培养时间为20h；
所述步骤三的具体实施过程为：将步骤二中得到的改性大肠杆菌菌液置于高速冷冻离心机中第一次离心，然后重悬于磷酸钠-磷酸钾缓冲液中，用超声波细胞破碎仪破碎处理，最后置于高速冷冻离心机中第二次离心，第二次离心后去除菌体碎片得到粗酶液；
所述步骤四的具体实施过程为：向步骤三中得到的粗酶液中加入脱氧核糖核酸酶，然后进行热处理，热处理过后置于高速冷冻离心机中离心，离心过后收集上清液A，本步骤的目的在于去除DNA和部分杂质蛋白；
所述步骤五的具体实施过程为：向步骤四中得到的上清液A中第一次加入硫酸铵，离心去除沉淀后得到上清液B，在上清液B中第二次加入硫酸铵，离心收集沉淀；
所述步骤六的具体实施过程为：将步骤五中得到的沉淀物置于磷酸钠-磷酸钾缓冲液中溶解，25℃温度下按照沉淀物与磷酸钠-磷酸钾缓冲液1:80的体积比进行透析脱盐，得到脱盐后酶液，脱盐后酶液用聚乙二醇8000浓缩得到浓缩后酶液，将浓缩后酶液加样到玻璃层析柱上，并用含氯化钠的磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱得到洗脱后酶液；本步骤的目的是去除大部分杂蛋白；
所述步骤七的具体实施过程为：将步骤六中得到的洗脱后酶液与磷酸钠-磷酸钾缓冲液按照体积比1:1的比例混合后加样到苯酚盐层析柱上，用磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱后收集活性组份并浓缩得到浓缩产物；
所述步骤八的具体实施过程为：将步骤七中得到的浓缩产物加样到凝胶过滤柱上，并用磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱后收集具有活性的组份，完成对过氧化氢酶的纯净化提纯。
本发明实施例中，所述步骤二中培养20h后，还包括如下步骤：将培养后的大肠杆菌菌液以5%的接种量转接到含有60mL的LB培养基的300mL的三角瓶中培养至OD600为0.5-0.7，然后加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.8mmol/L后再培养5h。
本发明实施例中，所述步骤三中第一次离心的离心参数为：5000×g离心10min；所述磷酸钠-磷酸钾缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为7；所述超声波细胞破碎仪的超声频率为20HZ，时间为10min；所述第二次离心的离心参数为：12000×g离心10min。
本发明实施例中，所述步骤四中脱氧核糖核酸酶的加入量为使得终浓度为12U/mL；所述热处理的温度为80℃，时间为30min；所述离心的离心参数为12000×g离心20min。
本发明实施例中，所述步骤五中第一次加入的硫酸铵饱和度为12%，第二次加入的硫酸铵饱和度为40%。
本发明实施例中，所述步骤六中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7；所述氯化钠的浓度为0.5mol/L；所述洗脱的流速为1mL/min。
本发明实施例中，所述步骤七中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7，洗脱的流速为1mL/min。
本发明实施例中，所述步骤八中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7，洗脱的流速为0.5mL/min。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，试剂与主要仪器的准备；步骤二，培养改性大肠杆菌；步骤三，粗酶液制备；步骤四，热处理去除杂质；步骤五，硫酸铵分级沉淀；步骤六，离子交换层析；步骤七，疏水作用层析；步骤八，凝胶层析；
所述步骤一中准备的主要仪器包括有：超声波细胞破碎仪、高速冷冻离心机、层析仪和凝胶图像分析仪，准备的试剂包括有：脱氧核糖核酸酶、苯酚盐、异丙基硫代半乳糖苷和凝胶过滤柱；
所述步骤二的具体实施过程为：挑取一环大肠杆菌接入盛有LB培养基的三角瓶中培养，其中，LB培养基为30mL，三角瓶容量为100 mL，培养温度为32℃，培养转速为180rpm，培养时间为20h；
所述步骤三的具体实施过程为：将步骤二中得到的改性大肠杆菌菌液置于高速冷冻离心机中第一次离心，然后重悬于磷酸钠-磷酸钾缓冲液中，用超声波细胞破碎仪破碎处理，最后置于高速冷冻离心机中第二次离心，第二次离心后去除菌体碎片得到粗酶液；
所述步骤四的具体实施过程为：向步骤三中得到的粗酶液中加入脱氧核糖核酸酶，然后进行热处理，热处理过后置于高速冷冻离心机中离心，离心过后收集上清液A；
所述步骤五的具体实施过程为：向步骤四中得到的上清液A中第一次加入硫酸铵，离心去除沉淀后得到上清液B，在上清液B中第二次加入硫酸铵，离心收集沉淀；
所述步骤六的具体实施过程为：将步骤五中得到的沉淀物置于磷酸钠-磷酸钾缓冲液中溶解，25℃温度下按照沉淀物与磷酸钠-磷酸钾缓冲液1:80的体积比进行透析脱盐，得到脱盐后酶液，脱盐后酶液用聚乙二醇8000浓缩得到浓缩后酶液，将浓缩后酶液加样到玻璃层析柱上，并用含氯化钠的磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱得到洗脱后酶液；
所述步骤七的具体实施过程为：将步骤六中得到的洗脱后酶液与磷酸钠-磷酸钾缓冲液按照体积比1:1的比例混合后加样到苯酚盐层析柱上，用磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱后收集活性组份并浓缩得到浓缩产物；
所述步骤八的具体实施过程为：将步骤七中得到的浓缩产物加样到凝胶过滤柱上，并用磷酸钠-磷酸钾缓冲液洗脱后收集具有活性的组份，完成对过氧化氢酶的纯净化提纯。
2.根据权利要求1所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，所述步骤二中培养20h后，还包括如下步骤：将培养后的大肠杆菌菌液以5%的接种量转接到含有60mL的LB培养基的300mL的三角瓶中培养至OD600为0.5-0.7，然后加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.8mmol/L后再培养5h。
3.根据权利要求1所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，所述步骤三中第一次离心的离心参数为：5000×g离心10min；所述磷酸钠-磷酸钾缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为7；所述超声波细胞破碎仪的超声频率为20HZ，时间为10min；所述第二次离心的离心参数为：12000×g离心10min。
4.根据权利要求1所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，所述步骤四中脱氧核糖核酸酶的加入量为使得终浓度为12U/mL；所述热处理的温度为80℃，时间为30min；所述离心的离心参数为12000×g离心20min。
5.根据权利要求1所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，所述步骤五中第一次加入的硫酸铵饱和度为12%，第二次加入的硫酸铵饱和度为40%。
6.根据权利要求1所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，所述步骤六中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7；所述氯化钠的浓度为0.5mol/L；所述洗脱的流速为1mL/min。
7.根据权利要求1所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，所述步骤七中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7，洗脱的流速为1mL/min。
8.根据权利要求1所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法，其特征在于，所述步骤八中磷酸钠-磷酸钾缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为7，洗脱的流速为0.5mL/min。
9.一种如权利要求1-8任一所述的过氧化氢酶纯净化提纯方法在过氧化氢酶提纯产品中的应用。
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| CN201811551185.XA CN109370996A (zh) | 2018-12-18 | 2018-12-18 | 一种过氧化氢酶纯净化提纯方法 |
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| CN (1) | CN109370996A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112080485A (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-15 | 北京格源天润生物技术有限公司 | 一种从牛胰脏中提取核糖核酸酶的方法 |
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2018
- 2018-12-18 CN CN201811551185.XA patent/CN109370996A/zh active Pending
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