CN105969691B - 粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 - Google Patents
粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种粘质沙雷氏菌LL‑413菌株及其制备舍雷肽酶的应用,将粘质沙雷氏菌LL‑413菌株接种入产酶培养基,于28~32℃、200~250r/min发酵20~42h,获得含有舍雷肽酶的发酵液,发酵液经过离心后去除菌体,上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后,即可得到舍雷肽酶;本发明LL‑413菌株生长快、容易培养,发酵周期短;产舍雷肽酶活性高,在优选的条件下,摇瓶发酵的酶活可达1126U/mL,10L发酵罐发酵酶活可达1505U/mL;分离纯化工艺简单,经盐析和透析脱盐后,舍雷肽酶的冻干粉酶活达2843U/mg,舍雷肽酶分子量为50kDa,纤溶活性达112357U/g。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株舍雷肽酶产生菌—粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株,及其在制备舍雷肽酶中的应用。
(二)背景技术
舍雷肽酶(serratiopeptidase或serrapeptase),又名沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等,是来源于微生物的一种蛋白酶,因其最初发现于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)而得名。该酶的发现者Dr Hans称该酶为“奇迹之酶”,它具有良好的抗炎、抗肿胀、促进痰液、脓液溶解与排泄以及镇痛作用,临床用于手术后及外伤的消炎;副鼻窦炎、乳汁潴留性乳腺炎、膀胱炎、附睾炎、智齿周围炎及牙槽脓肿时的消炎;以及治疗支气管炎、肺结核、支气管哮喘时痰液不易咳出等。研究也表明,舍雷肽酶具有出色的纤溶活性,使其在治疗动脉粥样硬化方面也有潜在的应用。目前市场上已有舍雷肽酶相关药品,如国内市场上的“达先”、“释瑞达”和“曲坦”等肠溶片,国外市场上的“Dasen”和“Seradase”等;舍雷肽酶也可作为非处方药使用,具有对抗炎症、解除疼痛和肿胀,还具有加速复原与激发免疫系统等功效,产品如市场上的“Serretia”、“Natto-Serra”和“SerraGold”胶囊等。
舍雷肽酶的分子量在40-60kDa之间,是一种含有锌离子的金属蛋白酶。从基因序列推导出的氨基酸序列可知,该酶是由470个氨基酸组成。该酶最大的特点是其氨基酸序列中不包含硫氨基酸,水解蛋白的主要位点是甘氨酸和疏水性氨基酸(如亮氨酸、苯丙氨酸等)的肽键部位。目前舍雷肽酶主要生产菌种是粘质沙雷氏菌E15菌株,该菌株是从日本蚕蛹内脏中筛选得到,蚕蛹就是利用该酶破坏茧壳,从而化蛹成蛾。粘质沙雷氏菌又名灵杆菌,是革兰氏阴性兼性厌氧杆菌,属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)沙雷氏菌属(Serrtia)。该菌的最大特征在28~30℃下培养产生鲜红的色素—灵菌红素(prodigiosin,又称灵杆菌素);37℃下培养不产生红色色素,灵菌红素具有抗菌、抑癌、提高免疫力等生理活性,具有一定的开发潜质。
近些年来,舍雷肽酶在作为药物在临床的使用量逐年增长,国内外市场需求量非常大,而且售价较高,国内舍雷肽酶类药物的原料多从国外进口,生产的企业屈指可数,也未见相关发酵工艺研究的报道。目前,日本和印度工业化生产规模较大,国际市场多向这两个国家采购,所以国内迫切需要开发具自主知识产权的舍雷肽酶生产工艺。本发明筛选出舍雷肽酶高产菌株,优化了舍雷肽酶发酵工艺,建立了酶的分离纯化方法,开发出一条完整的舍雷肽酶生产工艺,从而可以扩大国内舍雷肽酶的生产能力,满足国内外市场需求。
(三)发明内容
本发明提供一株新的舍雷肽酶产生菌—粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株,及其在制备舍雷肽酶中的应用,具有舍雷肽酶发酵活力单位高,发酵周期短,分离纯化成本低等优点。
本发明采用的技术方案为:
本发明提供一株新的舍雷肽酶产生菌——粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC No:M2015780,保藏日期为2015年12月25日,地址:中国武汉,武汉大学,邮编:430072。
所述的粘质沙雷氏菌LL-413菌株的培养特征如下,将LL-413菌株接种在营养琼脂平板上培养,30℃下培养24h后,正面可见鲜红色菌落,菌落边缘整齐,表面光滑有光泽;背面也呈鲜红色;在37℃下培养24h后可见浅粉色菌落,菌落表面光滑,边缘整齐,背面呈浅黄色;有轻微的臭味。将所述LL-413菌株接种在脱脂牛奶平板培养基上,30℃培养24h后可以看到鲜红色的菌落以及菌落四周明显的透明圈。
所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株的菌体特征如下:革兰氏阴性,短杆状,长约2.0~2.5μm,宽约0.8~1.0μm,无鞭毛和荚膜。
所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株的16S rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及所述的粘质沙雷氏菌LL-413菌株在发酵制备舍雷肽酶中的应用。所述的应用是将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种入产酶培养基,于28~32℃、200~250r/min发酵20~42h,得干菌体浓度为2.67~9.40g/L,舍雷肽酶活力为360.0~1505U/mL的发酵液,发酵液经过离心后去除菌体,上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后,即可得到舍雷肽酶;所述产酶培养基终浓度组成为:酵母浸出粉5~11g/L,牛肉膏3.0~6.6g/L,麦芽浸粉10.0~12.2g/L,MgSO4 1g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,初始pH为7.5~8.5。
所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株在产酶培养前,通常需要先经斜面活化培养,然后经种子培养、获得种子液再接入产酶培养基进行培养,具体步骤如下:
(1)将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种于斜面培养基,于30℃培养24~36h,得到活化后的斜面菌体;所述的斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,琼脂20g/L,溶剂为水,初始pH为7.0;
(2)将步骤(1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中,于30℃、200~250r/min振荡条件下培养18~24h,得到种子液;所述种子培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,初始pH为7.0;
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1%~2%的接种量,移种到产酶培养基中,于30℃、200~250r/min振荡条件下培养24~42h,得到含舍雷肽酶的发酵液;所述产酶培养基终浓度组成为:酵母浸出粉5~11g/L,牛肉膏3.0~6.6g/L,麦芽浸粉10.0~12.2g/L,MgSO41g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,培养基初始pH为7.5~8.5。
本发明所述发酵液于4℃条件下5000g离心10min,分离除去菌体,得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
本发明还涉及利用10L机械搅拌发酵罐对粘质沙雷氏菌LL-413菌株进行发酵制备舍雷肽酶的应用。所述应用为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株经斜面培养基进行活化后,接种入种子培养基培养18~24h后,将种子液以体积浓度1-2%的接种量接入5.0~6.5L的产酶培养基中,控制温度为30±2℃,pH为8.0±0.5,调节通气量0.6~1.0v/v·min,搅拌转速300~500r/min,使溶氧饱和度50%~100%,发酵运行20~24h后,得到含有舍雷肽酶的发酵液,将发酵液进行离心去除菌体后,即得到舍雷肽酶粗酶液。
本发明所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株发酵所产的含舍雷肽酶粗酶液进行分离纯化的方法为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株发酵所得的舍雷肽酶粗酶液,经过硫酸铵(NH4SO4)沉淀、透析除盐和冷冻干燥后获得舍雷肽酶。具体的,所述分离纯化方法如下:
(1)往舍雷肽酶粗酶液中加入硫酸铵,使其饱和度达到30~45%,4℃沉淀12~24h,之后将粗酶液于4℃、8000g条件下离心10min,去除沉淀,保留上清液;
(2)往步骤(1)中经硫酸铵沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸铵,使其饱和度达到70~80%,4℃沉淀12~24h,之后将粗酶液于4℃、8000g条件下离心10min,弃去上清液,沉淀物用pH值8.0的Tris-HCl缓冲液溶解,此时得到舍雷肽酶粗品的浓缩液;
(3)将步骤(2)所得浓缩液装入截留分子量为14kDa的透析袋中,以去离子水为透析液透析除盐后,于-40℃冷冻干燥,即得到舍雷肽酶冻干酶粉。
本发明中,所述的舍雷肽酶活力定义为:在37℃反应条件下,1min水解浓度为20mg/mL的酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。
本发明提供了产舍雷肽酶的LL-413菌株,以及发酵制备舍雷肽酶的应用,其有益效果主要体现在:(1)粘质沙雷氏菌LL-413菌株生长快、容易培养,发酵周期短;(2)粘质沙雷氏菌LL-413菌株产舍雷肽酶活性高,在优选的条件下,摇瓶发酵的酶活可达1126U/mL,10L发酵罐发酵酶活可达1505U/mL;(3)舍雷肽酶的分离纯化工艺简单,经盐析和透析脱盐后,舍雷肽酶的冻干粉酶活达到2843U/mg。(4)本发明制备的舍雷肽酶分子量为50kDa,纤溶活性达112357U/g。
(四)附图说明
图1 A660-酪氨酸浓度标准曲线;
图2平板培养基上LL-413菌株的菌落形态照片;
图3光学显微镜下LL-413菌株的菌体形态照片;
图4由LL-413菌株发酵制备的舍雷肽酶的电泳图,泳道1:标准蛋白Marker;泳道2:舍雷肽酶样品(实施例7制备)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:产舍雷肽酶菌株的分离与筛选
所述的LL-413菌株的分离和筛选方法如下:
(1)平板初筛:取蚕茧1只(3.1g),剥去茧壳,取出蚕蛹(1.6g),于体积浓度75%的乙醇水溶液中浸泡15s后取出,用镊子和剪刀小心剪去头部,剖开腹腔取出内脏;将内脏放入无菌研钵,加入1mL无菌去离子水研磨至匀浆;将匀浆液用无菌水梯度稀释至10-1-10-6倍。吸取0.2mL各稀释度溶液,涂布到脱脂牛奶平板培养基上,30℃恒温箱培养至菌落数不再增加。挑取红色且在平板上形成透明圈的菌落,划线接种于新鲜的营养琼脂平板培养基上。30℃恒温箱培养至长出单菌落。纯化后的单菌落接种于斜面培养基,每个菌株给以编号,共获得7个具上述特征的菌株,分别编号(见表1),4℃保存备用;
(2)摇瓶复筛:从斜面培养基挑取上述分离纯化后获得的菌株菌体,接入营养琼脂平板培养基于30℃培养36h,活化培养后挑取菌体接入50mL初始产酶培养基中,于30℃、200r/min摇床中发酵培养24h,将发酵液5000g离心10min,上清液即为粗酶液。测定粗酶液的沙雷肽酶活力,不同菌株产舍雷肽酶的活力及干菌体浓度见表1,可见活力最高的菌株为LL-413菌株,舍雷肽酶的活力为113.4U/mL。
表1不同菌株产舍雷肽酶的活力比较
所述的蚕茧采集自浙江省杭州临安市,采集时间为2015年3月。
所述脱脂牛奶平板培养基终浓度组成及配制方法为:NaCl 10g/L,琼脂40g/L,pH7.0,121℃高压蒸汽灭菌20min。灭菌结束后加入等体积的60℃保存的无菌脱脂牛奶,混合均匀倒平板。
所述斜面培养基和营养琼脂平板培养基组成相同,终浓度组成及配制方法为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,琼脂20g/L,pH 7.0。培养基加热至琼脂溶化后分装试管或三角瓶中,经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面或倒入无菌培养皿。
所述初始产酶培养基终浓度组成及配制方法为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl5g/L,pH 7.0,250mL三角瓶装50mL,8层纱布扎口,121℃高压蒸汽灭菌20min。
所述的舍雷肽酶活力测定方法为:
取4支试管分别编号1、2、3、4;先在4支试管中分别加入用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液稀释20~50倍的酶液1mL;然后,1号试管中加入TCA终止液2mL,2、3、4加入20mg/mL酪蛋白溶液1mL;将4支试管一起放入37℃的恒温水浴中反应10min后,1号试管加入1mL酪蛋白溶液,作为空白对照。2、3、4号试管立刻加入TCA终止液2mL终止反应。将4支试管中的反应液8000g离心5min,分别取出1mL上清液,加入5mL Na2CO3溶液,再加入1mL福林酚试剂快速混匀;于37℃保温显色30min后,在660nm波长处测定吸光值A660。
测出的2、3、4号试管样品A660平均值代入以下公式计算被测舍雷肽酶的活力。
式中:A=660nm处吸光度值;K=吸光常数,由酪氨酸浓度-A660标准曲线算得;n=酶液稀释倍数;10为反应时间10min;4为反应体系4mL。
所述的酪氨酸浓度-A660标准曲线绘制方法为:取浓度为0、10、20、30、40、50μg/mL的酪氨酸水溶液各1mL于6支试管中,各加入0.4mol/L的Na2CO3水溶液5mL,福林酚试剂1mL,于漩涡振荡器上混匀30s后,静置于37℃的恒温水浴锅内显色30min。显色结束后,在660nm波长处测定吸光值A660。以测得的吸光值为横坐标,酪氨酸浓度为纵坐标,绘制标准曲线,标准曲线见附图1,由线性拟合公式计算得K值为105.2。
本发明中,所述的舍雷肽酶活力定义为:在37℃反应条件下,1min水解浓度为20mg/mL的酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。
所述的TCA(三氯乙酸)终止液的配制方法:精确称取三氯乙酸18g,无水乙酸钠30g以及冰醋酸30mL用去离子水定容至1L。
所述的20mg/mL酪蛋白溶液配制方法为:称取酪蛋白2g,用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液溶解并且定容至100mL,4℃冰箱保存48h之内使用。
所述的Tris-HCl缓冲液配制方法为:先称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)19g,用900mL去离子水溶解后,用1M的盐酸将pH调至8.0,再定容至1L。
所述的福林酚试剂为成品试剂,购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例2:LL-413菌株的分类鉴定
将LL-413菌株接种在营养琼脂平板上培养,30℃下培养24h后,正面可见鲜红色菌落,菌落边缘整齐,表面光滑有光泽;背面也呈鲜红色;在37℃下培养24h后可见浅粉色菌落,菌落表面光滑,边缘整齐,背面呈浅黄色;有轻微的臭味。将所述LL-413菌株接种在脱脂牛奶平板培养基上,30℃培养24h后可以看到鲜红色的菌落以及菌落四周明显的透明圈,菌落照片见附图2。
所述LL-413菌株的菌体特征如下:革兰氏阴性,短杆状,长约2.0~2.5μm,宽约0.8~1.0μm,无鞭毛和荚膜,菌体照片见附图3。
提取LL-413菌株的总DNA,利用细菌通用16S rDNA引物进行PCR扩增,获得该菌株的16S rDNA片段,经测序,其16S rDNA的序列大小为1430bp,具体序列(SEQ ID NO.1)如下:
TGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATACGCTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACT。
将上述序列与美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation USA,NCBI)的基因库中的微生物16sRNA序列比对,结果表明该菌株与35株粘质沙雷氏菌同源性达到99%及以上。依据16S rDNA序列,绘制的该菌株与沙雷氏菌属不同种的系统发育树显示,该菌株与粘质沙雷氏菌亲缘关系较近,与沙雷氏菌属其他种的亲缘关系相对较远,所以可以判断该菌株是1株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),定名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株。该菌株已递交中国典型培养物保藏中心,保藏编号(CCTCC No.):M2015780,保藏日期为2015年12月25日。
实施例3:初始条件下LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为产酶菌种,在50mL摇瓶发酵规模下,增加了种子扩大培养步骤,摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法如下:
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基,于30℃培养36h,得到LL-413菌株的活化斜面;所述的斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,琼脂20g/L,溶剂为水,初始pH为7.0。培养基加热至琼脂溶化后分装于试管中,经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面;
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至50mL种子培养基中,于30℃、200r/min振荡条件下培养24h,得到种子液;所述种子培养基组成为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,初始pH为7.0,250mL的三角瓶装50mL种子培养基,8层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min;
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1%的接种量,移种到产酶培养基中,于30℃、200r/min振荡条件下培养24h,得干菌体浓度为1.79g/L的发酵液;所述初始产酶培养基组成为:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,初始pH为7.0,250mL的三角瓶装50mL产酶培养基,8层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min;
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min,分离除去菌体,得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例3方法,所得上清液的舍雷肽酶活力为229.3U/mL,实施例3方法重复实验3批次,3批次实验结果无显著性差异,表明LL-413菌株发酵制备舍雷肽酶性能稳定。
实施例4:LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为菌种,改变了产酶培养基组成,摇瓶发酵制备舍雷肽酶的活力单位较实施例3有所提高,具体步骤如下:
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基,于30℃培养36h,得到活化后的LL-413菌株的活化斜面;所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3;
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至50mL种子培养基中,于30℃、200r/min振荡条件下培养24h,得到种子液;所述种子培养基组成和制备方法同实施例3;
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1%的接种量,移种到产酶培养基中,于30℃、200r/min振荡条件下培养24h,得干菌体浓度为2.67g/L的发酵液;所述产酶培养基组成为:酵母浸出粉5g/L,牛肉膏3g/L,麦芽浸粉10g/L,MgSO4 1g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,初始pH为7.0,250mL的三角瓶装50mL产酶培养基,8层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min;
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min,分离除去菌体,得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例4方法,所得上清液的舍雷肽酶活力为360.0U/mL,是实施例3的1.57倍。
实施例5:优选条件下LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为菌种,经过产酶培养基组成及初始pH和发酵时间优化后,摇瓶发酵制备舍雷肽酶的活力单位显著提高,具体步骤如下:
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基,于30℃培养24h,得到活化后的LL-413菌株的活化斜面;所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3;
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至种子培养基中,于30℃、250r/min振荡条件下培养18h,得到种子液;所述种子培养基组成和制备方法同实施例3;
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1%的接种量,移种到产酶培养基中,于30℃、250r/min振荡条件下培养42h,得干菌体浓度为5.51g/L的发酵液;所述产酶培养基组成为:酵母浸出粉11g/L,牛肉膏6.6g/L,麦芽浸粉12.2g/L,MgSO4 1g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,初始pH为8.0,250mL的三角瓶装50mL产酶培养基,8层纱布扎口,高压蒸汽121℃灭菌20min;
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min,分离除去菌体,得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例5方法,所得上清液的舍雷肽酶活力为1126U/mL,是实施例4的提高了3.13倍。
实施例6:LL-413菌株发酵罐中制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为菌种,利用10L机械搅拌发酵罐发酵制备舍雷肽酶,具体方法如下:
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基,于30℃培养24h,得到活化后的LL-413菌株的活化斜面;所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3;
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至种子培养基中,于30℃、250r/min振荡条件下培养18h,得到种子液;所述种子培养基组成和制备方法同实施例3;
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度2%的接种量,即130mL的种子液移种到6.5L产酶培养基中。温度设定30±2℃,调节通气量0.6~1.0v/v·min,搅拌转速300~500r/min(发酵开始时,通气量0.6v/v·min,转速300r/min),使得溶氧饱和度在50%~100%,通过流加2moL/L的NaOH水溶液或2moL/L的HCl水溶液,控制pH=8.0±0.5,流加聚醚消泡剂控制泡沫的产生。发酵运行20h放罐,得干菌体浓度为9.40g/L的发酵液;所述产酶培养基组成为:酵母浸出粉11g/L,牛肉膏6.6g/L,麦芽浸粉12.2g/L,MgSO4 1g/L,NaCl 5g/L,溶剂为水,10L发酵罐装6.5L,原位高压蒸汽121℃灭菌20min;
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min,分离除去菌体,得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例6方法,所得上清液的舍雷肽酶活力为1505U/mL,是实施例5的1.34倍。
实施例7:舍雷肽酶的分离纯化
将实施例6制备的舍雷肽酶粗酶液,经过硫酸铵沉淀、透析除盐和冷冻干燥,得舍雷肽酶纯化产品。
(1)往500mL的舍雷肽酶粗酶液中,边搅拌边加入145.5g硫酸铵,使其饱和度至45%,4℃沉淀12h,之后将上述溶液于4℃、8000g条件下离心10min,弃去沉淀,得上清液580mL;
(2)继续往步骤(1)中所得的上清液中加入110.2g硫酸铵,使其饱和度达到75%,4℃沉淀12h,之后将上述溶液于4℃、8000g条件下离心10min,弃去上清液,用30mL的pH8.0Tris-HCl缓冲液将沉淀溶解,此时得到舍雷肽酶粗品的浓缩液约35mL;
(3)将步骤(2)所得浓缩液,装入截留分子量为14kDa的透析袋中,用去离子水作为透析液,透析12h除盐;
(4)将步骤(3)透析除盐的舍雷肽酶浓缩液转入洁净培养皿中,于-40℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥,得到215.6mg舍雷肽酶冻干酶粉,此冻干粉的酶活力2843U/mg,舍雷肽酶的纯化收率为81.5%。
实施例8:舍雷肽酶水解纤维蛋白原的应用
取在55℃保存的15g/L琼脂糖水溶液40mL,加入在37℃保温的浓度1.5mg/mL牛血纤维蛋白原溶液40mL,迅速混匀并注意不要产生气泡,再加入20U/mL凝血酶溶液2mL,立即混匀,快速倒入直径6cm的平皿中,室温下放置1h至凝固。用直径2mm的打孔器打孔,用滤纸吸干孔里残留的液体,然后吸取10μL活力为28000U/mL舍雷肽酶液(实施例7制备的舍雷肽酶冻干酶粉用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成)加入到孔里,盖上皿盖,37℃恒温孵育18h后,用卡尺测量溶解圈两垂直直径,对照纤溶活性与溶解圈两垂直直径的乘积标准曲线,计算出舍雷肽酶的纤溶活性。此法测得LL-413菌株所产的舍雷肽酶的纤溶活性为112357U/g。
所述的20U/mL凝血酶溶液配制方法为:100U/支的凝血酶,加入5mL的PBS缓冲液溶解,既得到20U/mL的凝血酶溶液。
所述的1.5mg/mL牛血纤维蛋白原溶液配制方法为:称取60mg牛血纤维蛋白原,加入40mL的PBS缓冲液溶液溶解。
所述的PBS缓冲液的配制方法为:称取Na2HPO4·H2O 7.16g,用去离子水定容至100mL(A液);称取NaH2PO4·2H2O 3.12g,用去离子水定容至100mL(B液);取81mL的A液和19mL的B液混合,即得到pH 7.4的PBS缓冲液。
所述的纤溶活性与溶解圈两垂直直径的乘积标准曲线回归方程为:Y=-0.0000004839X2+0.02203X-12.2715,式中,X为酶的纤溶活性(U/mL),Y为溶解圈的两垂直直径乘积(mm2)。该标准曲线回归方程引用自文献:杨祖伟,邓月新.琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性.医学信息,2015,(5):67-72。
Claims (8)
1.粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC No: M2015780,保藏日期为2015年12月25日,地址:中国武汉,武汉大学,邮编:430072。
2.一种权利要求1所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株在制备舍雷肽酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述应用方法为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种入产酶培养基,于28~32℃、200~250 r/min发酵20~42 h,获得含有舍雷肽酶的发酵液,发酵液经过离心后去除菌体,上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后,即得到舍雷肽酶;所述产酶培养基终浓度组成为:酵母浸出粉5~11 g/L,牛肉膏3.0~6.6 g/L,麦芽浸粉10.0~12.2 g/L,MgSO4 1 g/L,NaCl 5 g/L,溶剂为水,初始pH为7.5~8.5。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述产酶培养基终浓度组成为:酵母浸出粉11g/L,牛肉膏6.6 g/L,麦芽浸粉12.2 g/L,MgSO4 1 g/L,NaCl 5 g/L,溶剂为水,初始pH为8.0。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述发酵液制备方法为:
(1)将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种于斜面培养基,于30℃培养24~36 h,得到活化后的斜面菌体;所述的斜面培养基终浓度组成为:蛋白胨10 g/L,牛肉膏3 g/L,NaCl 5 g/L,琼脂 20 g/L,溶剂为水,初始pH为7.0;
(2)将步骤(1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中,于30℃、200~250 r/min振荡条件下培养18~24 h,得到种子液;所述种子培养基终浓度组成为:蛋白胨10 g/L,牛肉膏3g/L,NaCl 5 g/L,溶剂为水,初始pH为7.0;
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1%~2%的接种量,移种到产酶培养基中,于30℃、200~250 r/min振荡条件下培养24~42 h,得到含舍雷肽酶的发酵液。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述应用方法为:将粘质沙雷氏菌LL-413菌株经斜面培养基进行活化后,接种入种子培养基培养18~24 h后,将种子液以体积浓度1-2%的接种量接入含产酶培养基的发酵罐中,控制温度为30±2℃,pH为8.0±0.5,调节通气量0.6~1.0 v/v·min,搅拌转速300~500 r/min,使溶氧饱和度50%~100%,发酵运行20~24h后,得到含有舍雷肽酶的发酵液,发酵液经过离心后去除菌体,上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后,即得到舍雷肽酶。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述发酵液在4℃条件下5000 g离心10 min,获得上清液。
8.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥方法为:
(1)往上清液中加入硫酸铵,使其饱和度达到30~45%,4℃沉淀12~24 h,之后于4℃、8000 g条件下离心10 min,去除沉淀,收集上清液;
(2)往步骤(1)中经硫酸铵沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸铵,使其饱和度达到70~80%,4℃沉淀12~24 h,之后于4℃、8000 g条件下离心10 min,弃去上清液,沉淀用pH值8.0的Tris-HCl缓冲液溶解,获得浓缩液;
(3)将步骤(2)所得浓缩液用截留分子量为14 kDa的透析袋,以去离子水为透析液透析除盐后,于-40℃冷冻干燥。
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Media optimization studies for serratiopeptidase production from Serratia marcescens ATCC 13880;Badhe RV,et al;《Hindustan Antibiot Bull》;20091231;第51卷;摘要,第18页 * |
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