CN105969691A - 粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 - Google Patents

粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌LL‑413菌株及其制备舍雷肽酶的应用，将粘质沙雷氏菌LL‑413菌株接种入产酶培养基，于28～32℃、200～250r/min发酵20～42h，获得含有舍雷肽酶的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽酶；本发明LL‑413菌株生长快、容易培养，发酵周期短；产舍雷肽酶活性高，在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达1126U/mL，10L发酵罐发酵酶活可达1505U/mL；分离纯化工艺简单，经盐析和透析脱盐后，舍雷肽酶的冻干粉酶活达2843U/mg，舍雷肽酶分子量为50kDa，纤溶活性达112357U/g。

Description

粘质沙雷氏菌LL-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用
(一)技术领域
本发明涉及一株舍雷肽酶产生菌—粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株，及其在制备舍雷肽酶中的应用。
(二)背景技术
舍雷肽酶(serratiopeptidase或serrapeptase)，又名沙雷肽酶、沙雷蛋白酶等，是来源于微生物的一种蛋白酶，因其最初发现于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)而得名。该酶的发现者Dr Hans称该酶为“奇迹之酶”，它具有良好的抗炎、抗肿胀、促进痰液、脓液溶解与排泄以及镇痛作用，临床用于手术后及外伤的消炎；副鼻窦炎、乳汁潴留性乳腺炎、膀胱炎、附睾炎、智齿周围炎及牙槽脓肿时的消炎；以及治疗支气管炎、肺结核、支气管哮喘时痰液不易咳出等。研究也表明，舍雷肽酶具有出色的纤溶活性，使其在治疗动脉粥样硬化方面也有潜在的应用。目前市场上已有舍雷肽酶相关药品，如国内市场上的“达先”、“释瑞达”和“曲坦”等肠溶片，国外市场上的“Dasen”和“Seradase”等；舍雷肽酶也可作为非处方药使用，具有对抗炎症、解除疼痛和肿胀，还具有加速复原与激发免疫系统等功效，产品如市场上的“Serretia”、“Natto-Serra”和“SerraGold”胶囊等。
舍雷肽酶的分子量在40-60kDa之间，是一种含有锌离子的金属蛋白酶。从基因序列推导出的氨基酸序列可知，该酶是由470个氨基酸组成。该酶最大的特点是其氨基酸序列中不包含硫氨基酸，水解蛋白的主要位点是甘氨酸和疏水性氨基酸(如亮氨酸、苯丙氨酸等)的肽键部位。目前舍雷肽酶主要生产菌种是粘质沙雷氏菌E15菌株，该菌株是从日本蚕蛹内脏中筛选得到，蚕蛹就是利用该酶破坏茧壳，从而化蛹成蛾。粘质沙雷氏菌又名灵杆菌，是革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)沙雷氏菌属(Serrtia)。该菌的最大特征在28～30℃下培养产生鲜红的色素—灵菌红素(prodigiosin，又称灵杆菌素)；37℃下培养不产生红色色素，灵菌红素具有抗菌、抑癌、提高免疫力等生理活性，具有一定的开发潜质。
近些年来，舍雷肽酶在作为药物在临床的使用量逐年增长，国内外市场需求量非常大，而且售价较高，国内舍雷肽酶类药物的原料多从国外进口，生产的企业屈指可数，也未见相关发酵工艺研究的报道。目前，日本和印度工业化生产规模较大，国际市场多向这两个国家采购，所以国内迫切需要开发具自主知识产权的舍雷肽酶生产工艺。本发明筛选出舍雷肽酶高产菌株，优化了舍雷肽酶发酵工艺，建立了酶的分离纯化方法，开发出一条完整的舍雷肽酶生产工艺，从而可以扩大国内舍雷肽酶的生产能力，满足国内外市场需求。
(三)发明内容
本发明提供一株新的舍雷肽酶产生菌—粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株，及其在制备舍雷肽酶中的应用，具有舍雷肽酶发酵活力单位高，发酵周期短，分离纯化成本低等优点。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供一株新的舍雷肽酶产生菌——粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M2015780，保藏日期为2015年12月25日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
所述的粘质沙雷氏菌LL-413菌株的培养特征如下，将LL-413菌株接种在营养琼脂平板上培养，30℃下培养24h后，正面可见鲜红色菌落，菌落边缘整齐，表面光滑有光泽；背面也呈鲜红色；在37℃下培养24h后可见浅粉色菌落，菌落表面光滑，边缘整齐，背面呈浅黄色；有轻微的臭味。将所述LL-413菌株接种在脱脂牛奶平板培养基上，30℃培养24h后可以看到鲜红色的菌落以及菌落四周明显的透明圈。
所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株的菌体特征如下：革兰氏阴性，短杆状，长约2.0～2.5μm，宽约0.8～1.0μm，无鞭毛和荚膜。
所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株的16S rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及所述的粘质沙雷氏菌LL-413菌株在发酵制备舍雷肽酶中的应用。所述的应用是将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种入产酶培养基，于28～32℃、200～250r/min发酵20～42h，得干菌体浓度为2.67～9.40g/L，舍雷肽酶活力为360.0～1505U/mL的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽酶；所述产酶培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5～11g/L，牛肉膏3.0～6.6g/L，麦芽浸粉10.0～12.2g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.5～8.5。
所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面活化培养，然后经种子培养、获得种子液再接入产酶培养基进行培养，具体步骤如下：
(1)将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种于斜面培养基，于30℃培养24～36h，得到活化后的斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.0；
(2)将步骤(1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中，于30℃、200～250r/min振荡条件下培养18～24h，得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1％～2％的接种量，移种到产酶培养基中，于30℃、200～250r/min振荡条件下培养24～42h，得到含舍雷肽酶的发酵液；所述产酶培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5～11g/L，牛肉膏3.0～6.6g/L，麦芽浸粉10.0～12.2g/L，MgSO41g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，培养基初始pH为7.5～8.5。
本发明所述发酵液于4℃条件下5000g离心10min，分离除去菌体，得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
本发明还涉及利用10L机械搅拌发酵罐对粘质沙雷氏菌LL-413菌株进行发酵制备舍雷肽酶的应用。所述应用为：将粘质沙雷氏菌LL-413菌株经斜面培养基进行活化后，接种入种子培养基培养18～24h后，将种子液以体积浓度1-2％的接种量接入5.0～6.5L的产酶培养基中，控制温度为30±2℃，pH为8.0±0.5，调节通气量0.6～1.0v/v·min，搅拌转速300～500r/min，使溶氧饱和度50％～100％，发酵运行20～24h后，得到含有舍雷肽酶的发酵液，将发酵液进行离心去除菌体后，即得到舍雷肽酶粗酶液。
本发明所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株发酵所产的含舍雷肽酶粗酶液进行分离纯化的方法为：将粘质沙雷氏菌LL-413菌株发酵所得的舍雷肽酶粗酶液，经过硫酸铵(NH4SO4)沉淀、透析除盐和冷冻干燥后获得舍雷肽酶。具体的，所述分离纯化方法如下：
(1)往舍雷肽酶粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到30～45％，4℃沉淀12～24h，之后将粗酶液于4℃、8000g条件下离心10min，去除沉淀，保留上清液；
(2)往步骤(1)中经硫酸铵沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸铵，使其饱和度达到70～80％，4℃沉淀12～24h，之后将粗酶液于4℃、8000g条件下离心10min，弃去上清液，沉淀物用pH值8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，此时得到舍雷肽酶粗品的浓缩液；
(3)将步骤(2)所得浓缩液装入截留分子量为14kDa的透析袋中，以去离子水为透析液透析除盐后，于-40℃冷冻干燥，即得到舍雷肽酶冻干酶粉。
本发明中，所述的舍雷肽酶活力定义为：在37℃反应条件下，1min水解浓度为20mg/mL的酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。
本发明提供了产舍雷肽酶的LL-413菌株，以及发酵制备舍雷肽酶的应用，其有益效果主要体现在：(1)粘质沙雷氏菌LL-413菌株生长快、容易培养，发酵周期短；(2)粘质沙雷氏菌LL-413菌株产舍雷肽酶活性高，在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达1126U/mL，10L发酵罐发酵酶活可达1505U/mL；(3)舍雷肽酶的分离纯化工艺简单，经盐析和透析脱盐后，舍雷肽酶的冻干粉酶活达到2843U/mg。(4)本发明制备的舍雷肽酶分子量为50kDa，纤溶活性达112357U/g。
(四)附图说明
图1 A660-酪氨酸浓度标准曲线；
图2平板培养基上LL-413菌株的菌落形态照片；
图3光学显微镜下LL-413菌株的菌体形态照片；
图4由LL-413菌株发酵制备的舍雷肽酶的电泳图，泳道1：标准蛋白Marker；泳道2：舍雷肽酶样品(实施例7制备)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：产舍雷肽酶菌株的分离与筛选
所述的LL-413菌株的分离和筛选方法如下：
(1)平板初筛：取蚕茧1只(3.1g)，剥去茧壳，取出蚕蛹(1.6g)，于体积浓度75％的乙醇水溶液中浸泡15s后取出，用镊子和剪刀小心剪去头部，剖开腹腔取出内脏；将内脏放入无菌研钵，加入1mL无菌去离子水研磨至匀浆；将匀浆液用无菌水梯度稀释至10-1-10-6倍。吸取0.2mL各稀释度溶液，涂布到脱脂牛奶平板培养基上，30℃恒温箱培养至菌落数不再增加。挑取红色且在平板上形成透明圈的菌落，划线接种于新鲜的营养琼脂平板培养基上。30℃恒温箱培养至长出单菌落。纯化后的单菌落接种于斜面培养基，每个菌株给以编号，共获得7个具上述特征的菌株，分别编号(见表1)，4℃保存备用；
(2)摇瓶复筛：从斜面培养基挑取上述分离纯化后获得的菌株菌体，接入营养琼脂平板培养基于30℃培养36h，活化培养后挑取菌体接入50mL初始产酶培养基中，于30℃、200r/min摇床中发酵培养24h，将发酵液5000g离心10min，上清液即为粗酶液。测定粗酶液的沙雷肽酶活力，不同菌株产舍雷肽酶的活力及干菌体浓度见表1，可见活力最高的菌株为LL-413菌株，舍雷肽酶的活力为113.4U/mL。
表1不同菌株产舍雷肽酶的活力比较
所述的蚕茧采集自浙江省杭州临安市，采集时间为2015年3月。
所述脱脂牛奶平板培养基终浓度组成及配制方法为：NaCl 10g/L，琼脂40g/L，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。灭菌结束后加入等体积的60℃保存的无菌脱脂牛奶，混合均匀倒平板。
所述斜面培养基和营养琼脂平板培养基组成相同，终浓度组成及配制方法为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。培养基加热至琼脂溶化后分装试管或三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面或倒入无菌培养皿。
所述初始产酶培养基终浓度组成及配制方法为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，pH 7.0，250mL三角瓶装50mL，8层纱布扎口，121℃高压蒸汽灭菌20min。
所述的舍雷肽酶活力测定方法为：
取4支试管分别编号1、2、3、4；先在4支试管中分别加入用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液稀释20～50倍的酶液1mL；然后，1号试管中加入TCA终止液2mL，2、3、4加入20mg/mL酪蛋白溶液1mL；将4支试管一起放入37℃的恒温水浴中反应10min后，1号试管加入1mL酪蛋白溶液，作为空白对照。2、3、4号试管立刻加入TCA终止液2mL终止反应。将4支试管中的反应液8000g离心5min，分别取出1mL上清液，加入5mL Na2CO3溶液，再加入1mL福林酚试剂快速混匀；于37℃保温显色30min后，在660nm波长处测定吸光值A660。
测出的2、3、4号试管样品A660平均值代入以下公式计算被测舍雷肽酶的活力。
U = 4 × A × K × n 10
式中：A＝660nm处吸光度值；K＝吸光常数，由酪氨酸浓度-A660标准曲线算得；n＝酶液稀释倍数；10为反应时间10min；4为反应体系4mL。
所述的酪氨酸浓度-A660标准曲线绘制方法为：取浓度为0、10、20、30、40、50μg/mL的酪氨酸水溶液各1mL于6支试管中，各加入0.4mol/L的Na2CO3水溶液5mL，福林酚试剂1mL，于漩涡振荡器上混匀30s后，静置于37℃的恒温水浴锅内显色30min。显色结束后，在660nm波长处测定吸光值A660。以测得的吸光值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线见附图1，由线性拟合公式计算得K值为105.2。
本发明中，所述的舍雷肽酶活力定义为：在37℃反应条件下，1min水解浓度为20mg/mL的酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)。
所述的TCA(三氯乙酸)终止液的配制方法：精确称取三氯乙酸18g，无水乙酸钠30g以及冰醋酸30mL用去离子水定容至1L。
所述的20mg/mL酪蛋白溶液配制方法为：称取酪蛋白2g，用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液溶解并且定容至100mL，4℃冰箱保存48h之内使用。
所述的Tris-HCl缓冲液配制方法为：先称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)19g，用900mL去离子水溶解后，用1M的盐酸将pH调至8.0，再定容至1L。
所述的福林酚试剂为成品试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例2：LL-413菌株的分类鉴定
将LL-413菌株接种在营养琼脂平板上培养，30℃下培养24h后，正面可见鲜红色菌落，菌落边缘整齐，表面光滑有光泽；背面也呈鲜红色；在37℃下培养24h后可见浅粉色菌落，菌落表面光滑，边缘整齐，背面呈浅黄色；有轻微的臭味。将所述LL-413菌株接种在脱脂牛奶平板培养基上，30℃培养24h后可以看到鲜红色的菌落以及菌落四周明显的透明圈，菌落照片见附图2。
所述LL-413菌株的菌体特征如下：革兰氏阴性，短杆状，长约2.0～2.5μm，宽约0.8～1.0μm，无鞭毛和荚膜，菌体照片见附图3。
提取LL-413菌株的总DNA，利用细菌通用16S rDNA引物进行PCR扩增，获得该菌株的16S rDNA片段，经测序，其16S rDNA的序列大小为1430bp，具体序列(SEQ ID NO.1)如下：
TGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATACGCTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACT。
将上述序列与美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation USA，NCBI)的基因库中的微生物16sRNA序列比对，结果表明该菌株与35株粘质沙雷氏菌同源性达到99％及以上。依据16S rDNA序列，绘制的该菌株与沙雷氏菌属不同种的系统发育树显示，该菌株与粘质沙雷氏菌亲缘关系较近，与沙雷氏菌属其他种的亲缘关系相对较远，所以可以判断该菌株是1株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，定名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株。该菌株已递交中国典型培养物保藏中心，保藏编号(CCTCC No.)：M2015780，保藏日期为2015年12月25日。
实施例3：初始条件下LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为产酶菌种，在50mL摇瓶发酵规模下，增加了种子扩大培养步骤，摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法如下：
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30℃培养36h，得到LL-413菌株的活化斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.0。培养基加热至琼脂溶化后分装于试管中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面；
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养24h，得到种子液；所述种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1％的接种量，移种到产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养24h，得干菌体浓度为1.79g/L的发酵液；所述初始产酶培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0，250mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min，分离除去菌体，得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例3方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为229.3U/mL，实施例3方法重复实验3批次，3批次实验结果无显著性差异，表明LL-413菌株发酵制备舍雷肽酶性能稳定。
实施例4：LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为菌种，改变了产酶培养基组成，摇瓶发酵制备舍雷肽酶的活力单位较实施例3有所提高，具体步骤如下：
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30℃培养36h，得到活化后的LL-413菌株的活化斜面；所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3；
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养24h，得到种子液；所述种子培养基组成和制备方法同实施例3；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1％的接种量，移种到产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养24h，得干菌体浓度为2.67g/L的发酵液；所述产酶培养基组成为：酵母浸出粉5g/L，牛肉膏3g/L，麦芽浸粉10g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0，250mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min，分离除去菌体，得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例4方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为360.0U/mL，是实施例3的1.57倍。
实施例5：优选条件下LL-413菌株摇瓶发酵制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为菌种，经过产酶培养基组成及初始pH和发酵时间优化后，摇瓶发酵制备舍雷肽酶的活力单位显著提高，具体步骤如下：
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30℃培养24h，得到活化后的LL-413菌株的活化斜面；所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3；
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至种子培养基中，于30℃、250r/min振荡条件下培养18h，得到种子液；所述种子培养基组成和制备方法同实施例3；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1％的接种量，移种到产酶培养基中，于30℃、250r/min振荡条件下培养42h，得干菌体浓度为5.51g/L的发酵液；所述产酶培养基组成为：酵母浸出粉11g/L，牛肉膏6.6g/L，麦芽浸粉12.2g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为8.0，250mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min，分离除去菌体，得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例5方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为1126U/mL，是实施例4的提高了3.13倍。
实施例6：LL-413菌株发酵罐中制备舍雷肽酶的方法
以LL-413菌株为菌种，利用10L机械搅拌发酵罐发酵制备舍雷肽酶，具体方法如下：
(1)将LL-413菌株接种于斜面培养基，于30℃培养24h，得到活化后的LL-413菌株的活化斜面；所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例3；
(2)将步骤(1)活化培养后LL-413菌株的菌体接种至种子培养基中，于30℃、250r/min振荡条件下培养18h，得到种子液；所述种子培养基组成和制备方法同实施例3；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度2％的接种量，即130mL的种子液移种到6.5L产酶培养基中。温度设定30±2℃，调节通气量0.6～1.0v/v·min，搅拌转速300～500r/min(发酵开始时，通气量0.6v/v·min，转速300r/min)，使得溶氧饱和度在50％～100％，通过流加2moL/L的NaOH水溶液或2moL/L的HCl水溶液，控制pH＝8.0±0.5，流加聚醚消泡剂控制泡沫的产生。发酵运行20h放罐，得干菌体浓度为9.40g/L的发酵液；所述产酶培养基组成为：酵母浸出粉11g/L，牛肉膏6.6g/L，麦芽浸粉12.2g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，10L发酵罐装6.5L，原位高压蒸汽121℃灭菌20min；
(4)将步骤(3)含舍雷肽酶的发酵液于4℃条件下5000g离心10min，分离除去菌体，得澄清的舍雷肽酶粗酶液。
按实施例6方法，所得上清液的舍雷肽酶活力为1505U/mL，是实施例5的1.34倍。
实施例7：舍雷肽酶的分离纯化
将实施例6制备的舍雷肽酶粗酶液，经过硫酸铵沉淀、透析除盐和冷冻干燥，得舍雷肽酶纯化产品。
(1)往500mL的舍雷肽酶粗酶液中，边搅拌边加入145.5g硫酸铵，使其饱和度至45％，4℃沉淀12h，之后将上述溶液于4℃、8000g条件下离心10min，弃去沉淀，得上清液580mL；
(2)继续往步骤(1)中所得的上清液中加入110.2g硫酸铵，使其饱和度达到75％，4℃沉淀12h，之后将上述溶液于4℃、8000g条件下离心10min，弃去上清液，用30mL的pH8.0Tris-HCl缓冲液将沉淀溶解，此时得到舍雷肽酶粗品的浓缩液约35mL；
(3)将步骤(2)所得浓缩液，装入截留分子量为14kDa的透析袋中，用去离子水作为透析液，透析12h除盐；
(4)将步骤(3)透析除盐的舍雷肽酶浓缩液转入洁净培养皿中，于-40℃、真空度10Pa条件下冷冻干燥，得到215.6mg舍雷肽酶冻干酶粉，此冻干粉的酶活力2843U/mg，舍雷肽酶的纯化收率为81.5％。
实施例8：舍雷肽酶水解纤维蛋白原的应用
取在55℃保存的15g/L琼脂糖水溶液40mL，加入在37℃保温的浓度1.5mg/mL牛血纤维蛋白原溶液40mL，迅速混匀并注意不要产生气泡，再加入20U/mL凝血酶溶液2mL，立即混匀，快速倒入直径6cm的平皿中，室温下放置1h至凝固。用直径2mm的打孔器打孔，用滤纸吸干孔里残留的液体，然后吸取10μL活力为28000U/mL舍雷肽酶液(实施例7制备的舍雷肽酶冻干酶粉用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成)加入到孔里，盖上皿盖，37℃恒温孵育18h后，用卡尺测量溶解圈两垂直直径，对照纤溶活性与溶解圈两垂直直径的乘积标准曲线，计算出舍雷肽酶的纤溶活性。此法测得LL-413菌株所产的舍雷肽酶的纤溶活性为112357U/g。
所述的20U/mL凝血酶溶液配制方法为：100U/支的凝血酶，加入5mL的PBS缓冲液溶解，既得到20U/mL的凝血酶溶液。
所述的1.5mg/mL牛血纤维蛋白原溶液配制方法为：称取60mg牛血纤维蛋白原，加入40mL的PBS缓冲液溶液溶解。
所述的PBS缓冲液的配制方法为：称取Na2HPO4·H2O 7.16g，用去离子水定容至100mL(A液)；称取NaH2PO4·2H2O 3.12g，用去离子水定容至100mL(B液)；取81mL的A液和19mL的B液混合，即得到pH 7.4的PBS缓冲液。
所述的纤溶活性与溶解圈两垂直直径的乘积标准曲线回归方程为：Y＝-0.0000004839X2+0.02203X-12.2715，式中，X为酶的纤溶活性(U/mL)，Y为溶解圈的两垂直直径乘积(mm2)。该标准曲线回归方程引用自文献：杨祖伟，邓月新.琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆冻干粉中纳豆激酶活性.医学信息，2015,(5):67-72。

Claims (8)

1.粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LL-413菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No:M2015780，保藏日期为2015年12月25日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
2.一种权利要求1所述粘质沙雷氏菌LL-413菌株在制备舍雷肽酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种入产酶培养基，于28～32℃、200～250r/min发酵20～42h，获得含有舍雷肽酶的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽酶；所述产酶培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5～11g/L，牛肉膏3.0～6.6g/L，麦芽浸粉10.0～12.2g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.5～8.5。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述产酶培养基终浓度组成为：酵母浸出粉11g/L，牛肉膏6.6g/L，麦芽浸粉12.2g/L，MgSO4 1g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为8.0。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液制备方法为：
(1)将粘质沙雷氏菌LL-413菌株接种于斜面培养基，于30℃培养24～36h，得到活化后的斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.0；
(2)将步骤(1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中，于30℃、200～250r/min振荡条件下培养18～24h，得到种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，初始pH为7.0；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1％～2％的接种量，移种到产酶培养基中，于30℃、200～250r/min振荡条件下培养24～42h，得到含舍雷肽酶的发酵液。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将粘质沙雷氏菌LL-413菌株经斜面培养基进行活化后，接种入种子培养基培养18～24h后，将种子液以体积浓度1-2％的接种量接入含产酶培养基的发酵罐中，控制温度为30±2℃，pH为8.0±0.5，调节通气量0.6～1.0v/v·min，搅拌转速300～500r/min，使溶氧饱和度50％～100％，发酵运行20～24h后，得到含有舍雷肽酶的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥后，即可得到舍雷肽酶。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述发酵液在4℃条件下5000g离心10min，获得上清液。
8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述上清液再经过盐析、透析和冷冻干燥方法为：
(1)往上清液中加入硫酸铵，使其饱和度达到30～45％，4℃沉淀12～24h，之后于4℃、8000g条件下离心10min，去除沉淀，收集上清液；
(2)往步骤(1)中经硫酸铵沉淀后所得的上清液中再次加入硫酸铵，使其饱和度达到70～80％，4℃沉淀12～24h，之后于4℃、8000g条件下离心10min，弃去上清液，沉淀用pH值8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，获得浓缩液；
(3)将步骤(2)所得浓缩液用截留分子量为14kDa的透析袋，以去离子水为透析液透析除盐后，于-40℃冷冻干燥，即得到舍雷肽酶冻干酶粉。
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