CN101724085B - 一种荚膜多糖纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细菌荚膜多糖的处理方法。所述方法包括(a)在细胞荚膜多糖沉淀物中加入低终浓度低级醇，溶解所述荚膜多糖形成混合液；(b)对所述混合液进行固液分离并收集上清液；(c)在所得上清液中加入高终浓度低级醇，形成含细胞荚膜多糖的粗沉淀物并收集粗沉淀物；(d)在粗沉淀物中加入低终浓度低级醇，从而使所述粗沉淀物中的多糖处于溶解状态；(e)在上清液中加入高终浓度低级醇溶液，从而形成荚膜多糖沉淀物；(f)收集所得的荚膜多糖沉淀物，即为纯化的细菌荚膜多糖。所述方法简便、可控、高效地提高了荚膜多糖的回收率，且不使用有毒试剂苯酚或氯仿，提高了安全性。

Description

一种荚膜多糖纯化方法

技术领域

本发明涉及疫苗领域，尤其涉及有荚膜细菌的荚膜多糖的处理方法。

背景技术

本领域熟知对于致病菌感染可以采用疫苗来进行预防。目前，常用于预防致病菌感染的疫苗包括：菌体疫苗和亚单位疫苗。菌体疫苗可以通过灭活细菌或对致病菌进行减毒来制备，而亚单位疫苗则通过提取致病菌的蛋白质和/或多糖来制备。

多糖疫苗是通过纯化细菌的多糖(例如荚膜多糖)而制备的一类疫苗。已经上市使用的多糖疫苗包括：b型流感杆菌多糖疫苗、脑膜炎球菌多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗和伤寒Vi多糖疫苗等。

然而，多糖疫苗对2岁以上儿童、少年、青年和成人有效，但对2岁以下幼儿效果不佳，有的还能导致免疫抑制等不良效果。将多糖偶联到蛋白质上构成多糖-蛋白结合疫苗可以改善多糖疫苗在2岁以下幼儿中的免疫原性，为这些高危易感人群提供保护。

第一个成功的多糖结合疫苗是b型流感杆菌结合疫苗，随后又研制成功脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗。可以直接用纯化的多糖经过修饰或未经修饰与经过修饰或未经修饰的蛋白质通过化学键偶联，也可以在偶联前将纯化的多糖经过适当降解处理。

不论是制备多糖疫苗还是多糖结合疫苗，首要的步骤就是从细菌培养物中提取多糖。通常高分子量、具有免疫原性的细菌多糖可用于制备多糖疫苗。

现有技术中公开了从细菌中提取多糖的方法，例如Gotshlich在US3636192中描述了一般的多糖提取方法。

通常，用培养罐培养细菌，从全培养物或经过离心除去菌体的上清液中提制多糖。先用阳离子去污剂沉淀多糖，离心收集沉淀物；用氯化钙解离后，加入乙醇沉淀核酸等杂质；离心收集上清液，再用乙醇沉淀出粗多糖。用醋酸钠溶解所得粗多糖，再用苯酚进行抽提，去除蛋白质等杂质。经过离心分离水相和有机相，用乙醇将多糖从水相中沉淀出来，经过无水乙醇、丙酮洗涤并干燥，最终制得精制多糖。在提取过程中也可以采用超速离心去除内毒素。精制多糖可以用于制备多糖疫苗或结合疫苗。其中，现有技术中去除蛋白质除了常用的苯酚抽提外，也可以用氯仿/正丁醇混合液抽提。

由于苯酚和氯仿都是有毒有害的化学危险品，有致癌的危险性，对工作条件、人员保护、污水处理等有较高要求。因此，在提制多糖过程中，尽量避免使用上述有毒害化学试剂是非常有益的。

有人尝试用层析法纯化多糖(黄镇等，CN200610048875.4；Pato TP等，JChromatB，2006，832：262-267.)。但这种方法操作复杂、处理量小、成本高，不易用于规模生产。

Hamidi等描述了用脱氧胆酸钠盐去除蛋白质的方法(US20070065460)，该方法可用于b型流感杆菌多糖的提制。然而，该方法所用试剂脱氧胆酸钠盐低毒，具有表面活性作用，对粘膜具有不可逆的损伤作用。

Costantino描述了用乙醇将阳离子去污剂沉淀的多糖重新溶解和多步骤过滤/超滤的方法(CN02812444.8，EP1741442)，用于提制A、Y、W135群脑膜炎球菌多糖。但该方法后续步骤较为复杂，需经多步过滤、筛分过滤或超滤，且提取物质的得率低。

目前，本领域迫切需要开发出一种适用于从带荚膜细菌中简便、高效、低成本地分离纯化荚膜多糖，并避免使用有毒有害化学试剂的方法。

发明内容

本发明的目的正是提供一种细菌荚膜多糖的处理方法，该方法可简便、可控、安全、有效地获得高纯度荚膜多糖。与其它方法相比，本发明的方法不使用有毒试剂苯酚或氯仿，提高多糖的回收率，简化操作流程。本发明的另一目的是提供一种用上述处理方法所获得的荚膜多糖及其用途。

在本发明的第一方面中，提供了一种细菌荚膜多糖的处理方法，所述方法包括：

(a)在含细菌荚膜多糖的沉淀物中加入终浓度为20-30体积％的低级醇，从而溶解所述荚膜多糖，形成混合液；

(b)对步骤(a)的所述混合液进行固液分离，然后收集上清液；

(c)在步骤(b)所得上清液中加入终浓度为60-90体积％的低级醇，从而形成含细胞荚膜多糖的粗沉淀物，然后收集所述粗沉淀物；

(d)在粗沉淀物中加入终浓度为30-70体积％的低级醇，从而使所述粗沉淀物中的多糖处于溶解状态，然后对形成的混合液进行固液分离，收集上清液；

(e)在步骤(d)所得上清液中加入终浓度为60-90体积％的低级醇溶液，从而形成荚膜多糖沉淀物；

(f)收集步骤(e)中所得的荚膜多糖沉淀物，即为纯化的细菌荚膜多糖，

其中，步骤(c)和步骤(e)中的低级醇终浓度高于步骤(d)中的低级醇终浓度。

在一个优选实施方式中，所述细胞荚膜多糖沉淀物是通过对生物样品进行处理而获得的沉淀物。

在另一优选例中，所述的生物样品是带荚膜菌的培养物、带荚膜菌的培养液、培养物或培养液的离心上清液、含有细菌裂解碎片的混悬液、或它们的混合物或浓缩物，所述生物样品优选为带荚膜菌培养液的离心上清液或浓缩物。

在一个优选例中，用化学、物理、酶或它们的组合处理生物样品以获得含有荚膜多糖的沉淀物。

在另一优选例中，采用阳离子去污剂、低级醇处理生物样品以获得含有荚膜多糖的沉淀物。所述阳离子去污剂优选十六烷基三甲铵盐或十四烷基三甲铵盐，更优选十六烷基三甲基溴化铵。

在另一优选例中，采用机械破碎或超声波破碎处理生物样品以获得含有荚膜多糖的沉淀物。在另一个优选例中，采用核酸酶和/或蛋白酶处理生物样品以获得含有荚膜多糖的沉淀物。在另一个优选例中，所述沉淀物中含有细菌荚膜多糖、蛋白质、核苷酸和/或它们的片段。

在本发明的另一优选实施方式中，所述细菌选自下组：脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌、嗜血流感杆菌、肺炎链球菌、或伤寒沙门菌。

在一个优选例中，所述生物样品获自：脑膜炎奈瑟菌血清群A(以下简称A群流脑)、脑膜炎奈瑟菌血清群C(以下简称C群流脑)、脑膜炎奈瑟菌血清群Y、脑膜炎奈瑟菌血清群W135、b型流感杆菌、或伤寒沙门菌。

在本发明的另一优选实施方式中，所述低级醇选自：乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇或丙二醇。

在一个优选例中，所述低级醇选自：乙醇、甲醇、或1-丙醇，最优选乙醇。

在另一个优选例中，所述低级醇为100％醇或溶液形式，优选为水溶液、钙盐溶液、或钠盐溶液，更优选所述低级醇溶液中低级醇与溶剂的体积比为70-99:30-1，优选75-95:25-5。

在本发明的另一优选实施方式中，所述低级醇含有钙盐、钠盐、钾盐或镁盐，所述盐浓度为0.01-2.5M，盐与低级醇的比例可为10:4-10:22(v:v)。

在一个优选例中，所述盐为钙盐或钠盐，优选CaCl₂或NaCl，所述盐浓度优选0.1-1.5M。

在另一个优选例中，在步骤(d)中可先加入盐再加入低级醇、先加入低级醇再加入盐、或可同时加入盐和醇，从而达到所需的醇浓度和盐浓度。

在本发明的另一优选实施方式中，步骤(c)中低级醇的终浓度比步骤(a)中低级醇的终浓度高30-70％，步骤(e)中低级醇的终浓度比步骤(d)中低级醇的终浓度高5-60％。

在一个优选例中，步骤(c)中所述低级醇的终浓度为60-90％，优选65-80％。在另一个优选例中，步骤(d)中所述低级醇的终浓度为35-65％。在另一优选例中，对于C群流脑菌种采用40-50％的醇浓度，对于A群流脑菌种可采用50-65％的醇浓度。

在另一个优选例中，步骤(e)中所述低级醇的终浓度为60-90％，优选70-80％。

在另一优选例中，步骤(c)中低级醇的终浓度比步骤(a)中低级醇的终浓度高35-65％，优选高40-65％，更优选高45-60％。在另一优选例中，步骤(e)中低级醇的终浓度比步骤(d)中低级醇的终浓度高10-55％，优选高20-50％，更优选高25-45％。在另一优选例中，步骤(c)和步骤(e)中的低级醇终浓度不同。优选步骤(c)中低级醇的终浓度高于步骤(e)中的低级醇浓度。

在本发明的另一优选实施方式中，在步骤(b)和(c)之间或步骤(d)和步骤(e)之间还包括对上清液进行过滤和/或浓缩。

优选所述过滤选自：深度过滤、活性碳过滤、微孔膜过滤或超滤。

在另一优选例中，所述方法还包括对步骤(e)所得沉淀物进行选自下组的一种或多种的处理：洗涤、离心、干燥、冷冻干燥或真空干燥。

在另一优选例中，所述方法还包括以步骤(f)中纯化的细菌荚膜多糖为粗沉淀物，重复步骤(d)、(e)和(f)一次或多次，从而获得进一步纯化的细菌荚膜多糖。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(g)：将纯化的细菌荚膜多糖与免疫学上或药学上可接受的赋形剂或佐剂组合，从而形成多糖疫苗、多糖结合疫苗或药物组合物。

在另一优选例中，采用所述方法获得的纯化的荚膜多糖的产率为30-99％，优选50-95％，更优选60-92％，最优选75-85％。

在本发明的第二方面中，提供了一种纯化的细菌荚膜多糖，所述的细菌荚膜多糖中的核酸含量≤5mg/g，并且，所述细菌荚膜多糖是用本发明所述方法制得的。

在一个优选例中，所述的细菌荚膜多糖中核酸含量≤3mg/g，优选≤2.5mg/g，更优选≤1mg/g。

在一个优选例中，核酸含量≤10mg/g；蛋白含量≤10mg/g；用琼脂糖4B凝胶柱层析法测定分子量的分布，K_D值≤0.4。

在另一优选例中，所述的细菌荚膜多糖中的蛋白含量≤8mg/g，优选≤5mg/g。

在另一个优选例中，所述纯化的细菌荚膜多糖是寡糖。

在另一优选例中，所述纯化的细菌荚膜多糖是乙酰化的多糖。

在本发明第三方面中，提供了一种组合物，所述组合物包含：

(i)如前所述的本发明纯化的细菌荚膜多糖、其免疫原性片段、或它们与载体的结合物；

(ii)免疫学上或药学上可接受的赋形剂或佐剂。

在一个优选例中，所述组合物为多糖疫苗、多糖结合疫苗或药物组合物。

在另一优选例中，所述载体选自：蛋白质、多糖、脂质、聚合物，优选所述载体为蛋白载体，所述蛋白载体优选细菌毒素、类毒素、基因脱毒细菌毒素、细菌毒素片段或细菌菌体蛋白，更优选破伤风类毒素、白喉类毒素、或白喉类毒素突变体。

在另一优选例中，所述佐剂选自：铝盐、皂角甙佐剂、完全弗氏佐剂、细胞活素或钙盐，优选铝盐、钙盐，更优选氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙。

在另一优选例中，所述组合物还包含一种或多种选自下组的活性物质：抗原或治疗剂。所述抗原优选选自下组：来自脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、伤寒沙门菌、甲肝病毒、乙肝病毒、百日咳博德特氏菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、幽门弯曲杆菌、脊髓灰质炎和/或流感嗜血菌的抗原。

在本发明的第四方面中，提供了如前述所述的本发明纯化的细菌荚膜多糖在制备用于预防或治疗带荚膜致病菌引起的疾病或增强对带荚膜致病菌的免疫应答的多糖疫苗、多糖结合疫苗或药物组合物中的用途。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

以下结合附图对本发明进行进一步阐述。

图1：按照本发明实施例1制备C群流脑多糖过程中各时期的产量(菌号：CMCC29025)。其中，纵坐标单位产量(mg/L)是指每L培养液中收获多糖的mg数，取样1-4分别是指培养过程中于5h、6h、7h和7.5h时取样。

图2：按照本发明实施例2制备C群流脑多糖过程中各时期的产量(菌号：CMCC29205)。其中，纵坐标单位产量(mg/L)是指每L培养液中收获多糖的mg数，取样1-4分别是指培养过程中于6h、7h、8h和9h时取样。

图3：按照本发明实施例4制备A群流脑多糖过程中各时期的产量(菌号：CMCC29201)。其中，纵坐标单位产量(mg/L)是指每L培养液中收获多糖的mg数，取样1-4分别是指培养过程中于5h、5.5h、6h和6.5h时取样。

图4：C群流脑多糖的核磁共振图谱。

图5：C群流脑结合疫苗CPS-TT(1)、CPS-TT(2)以及C群流脑多糖(CPS)免疫小鼠2针和3针后血清中的抗C群流脑多糖抗体的几何平均抗体滴度(GMT)。其中：CPS-TT(1)和CPS-TT(2)分别为降解2、3小时的C群流脑多糖与破伤风类毒素的结合物。

图6：A群流脑结合疫苗APS-TT以及A群流脑多糖(APS)免疫小鼠2针和3针后血清中的抗A群流脑多糖抗体的几何平均抗体滴度(GMT)。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究发现采用对哺乳动物基本无毒性的低级醇即可实现对细菌荚膜多糖的高效分离和纯化处理，而无需使用苯酚或氯仿等有毒试剂，从而成功地获得了无毒的高纯度细菌荚膜多糖。

具体而言，本发明人出乎意料地发现用低浓度的低级醇可溶解含有荚膜多糖的沉淀物，而用高浓度的低级醇则可使得荚膜多糖从溶液中沉淀出，交替使用低浓度低级醇和高浓度低级醇对含有荚膜多糖的生物样品进行多次溶解和沉淀，可实现从蛋白质、核酸等杂质中分离、纯化荚膜多糖的目的。在此基础上，发明人完成了本发明。

发明人采用生物反应器对细菌进行发酵培养，于对数生长后期加入甲醛进行杀菌。然后，采用阳离子去污剂，尤其是十六烷基三甲铵盐(例如十六烷基三甲基溴化铵)沉淀可溶性多糖，并离心收集沉淀物。将所得沉淀物用盐溶液重新溶解，再加入低级醇(优选乙醇或其水溶液)，保持多糖溶解状态，而使杂质再次沉淀，所述低级醇的最终浓度为20％和30％之间。再对重新溶解的沉淀物离心收集上清液，加入低级醇(优选乙醇或其水溶液)，重新沉淀多糖，所述低级醇的最终浓度为60％和90％之间。然后离心收集沉淀的粗多糖。可对粗多糖进行进一步的后处理，例如洗涤、干燥、冷冻干燥等，以利于保存待进一步精制。

在所述粗多糖中加入低级醇(优选乙醇或其水溶液)重新溶解所述沉淀物，使得最终醇浓度为30％和65％之间。对重新溶解的粗多糖离心收集上清液，加入低级醇(优选乙醇或其水溶液)再次重新沉淀多糖，最终的醇浓度为60％和90％之间。

在上述的所述醇或其溶液可含盐，优选钙盐、钠盐、钾盐或镁盐，更优选钙盐或钠盐(如CaCl₂或NaCl)，所述盐浓度为0.01-2.5M，更优选0.1-1.5M。

可直接收取精制多糖或重复该精制过程一次或多次由此获得纯度更高的精制多糖。可对精制多糖进行进一步的后处理，例如洗涤、干燥、冷冻干燥等，以获得多糖产品。精制多糖或多糖产品可以用于配制疫苗、制备多糖-蛋白结合疫苗，也可以经过适当降解或者/和修饰后用于制备多糖-蛋白结合疫苗。

含荚膜多糖的沉淀物

在本发明方法以含细菌荚膜多糖的沉淀物为初始原料，对其进行进一步纯化和处理。

本发明的荚膜多糖可以是任何带荚膜细菌的荚膜多糖，所述细菌包括但不限于：脑膜炎奈瑟菌，例如脑膜炎奈瑟菌血清群A、脑膜炎奈瑟菌血清群C、脑膜炎奈瑟菌血清群Y或脑膜炎奈瑟菌血清群W135；嗜血流感杆菌，例如b型流感杆菌；无乳链球菌，例如B群链球菌；肺炎链球菌，例如肺炎链球菌1型、肺炎链球菌2型、肺炎链球菌3型、肺炎链球菌4型、肺炎链球菌5型、肺炎链球菌6B型、肺炎链球菌7F型、肺炎链球菌8型、肺炎链球菌9N型、肺炎链球菌9V型、肺炎链球菌10A型、肺炎链球菌11A型、肺炎链球菌12F型、肺炎链球菌14型、肺炎链球菌15B型、肺炎链球菌17F型、肺炎链球菌18C型、肺炎链球菌19A型、肺炎链球菌19F型、肺炎链球菌20型、肺炎链球菌22F型、肺炎链球菌23F型或肺炎链球菌33F型；伤寒沙门菌。

获取本发明含细菌荚膜多糖的沉淀物所用的生物样品可以采取多种形式，包括但不限于：培养带荚膜细菌的培养基或培养液，其中含有细菌分泌到培养基或培养液中的部分荚膜多糖；含有带荚膜细菌的培养物或培养液；含有细菌裂解或分解碎片的混悬液；上述生物样品经混合、过滤、离心、浓缩等加工而获得的含荚膜多糖沉淀物。

在本发明中可采用多种方式来处理生物样品以获得含荚膜多糖的沉淀物，例如物理、化学、酶学方法或它们的组合。物理处理方法包括但不限于：超声波裂解、机械破碎、研磨等。化学处理细菌的方法包括但不限于：加入阳离子去污剂、高浓度盐溶液、有机溶剂等。可用于处理细菌的酶包括但不限于：核酸梅、蛋白酶等。本领域技术人员可根据常识对具体使用的方法和试剂进行选择。

优选加入阳离子去污剂来处理细菌以获得沉淀物，例如十六烷基三甲铵盐、十四烷基三甲铵盐，更优选加入十六烷基三甲基溴化铵。在本发明的一个具体实施方式中，采用了浓度为0.05-0.5％(w/v)、优选0.07-0.2％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵来获取沉淀。

采用上述方法获得的沉淀物中含有荚膜多糖和大量杂质，例如蛋白质、核酸或脂类等。

低级醇

在本发明中采用低级醇来溶解和沉淀荚膜多糖。

本发明所用术语“低级醇”是指含有1-6个碳原子的脂肪醇，该术语中不包括苯酚。在本发明方法中可采用的低级醇包括但不限于：乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇或丙二醇。在本发明的优选实施方式中，采用了乙醇为溶剂。本发明各步骤中所采用的醇可以是同一种低级醇，也可以是不同的低级醇，但优选使用同一种低级醇，更优选全部使用乙醇。

可以纯的形式或混溶物的形式运用所述低级醇，例如可采用100体积％的纯低级醇或其与水的混溶物，如低级醇与水的70:30-98:2(v:v)混溶物，具体例子为75:25、80:20、90:10、95:5的混溶物。在本发明的优选实施方式中，采用了100％乙醇或乙醇与水的70:30-98:2(v:v)混溶物，优选75:25、80:20、90:10、95:5的乙醇水溶液。

在本发明中，术语“低浓度低级醇”是指加入提纯体系后最终醇浓度低于65％，且可用于溶解含荚膜多糖沉淀物的低级醇。在本发明中，术语“高浓度低级醇”是指加入提纯体系后最终醇浓度高于65％，且可用于使荚膜多糖的溶液析出沉淀的低级醇。通常，在同一个溶解、沉淀循环中，溶解用的低浓度低级醇比沉淀用的高浓度低级醇的最终浓度要低20-60％，优选低25-50％。

在本发明中，“(低级)醇浓度”或“最终醇浓度”是指醇在提纯体系中所占的体积百分比。

纯化过程

如上所述，通过物理、机械、化学或酶法所获得的沉淀物中含有荚膜多糖和多种杂质，例如蛋白质、核酸或脂类等，需对其进行溶解以进一步去除其中杂质以纯化所需荚膜多糖。

本发明用低浓度低级醇溶解从生物样品获得的原料沉淀物，收集含有荚膜多糖的上清液，再用高浓度低级醇使得溶解形式的荚膜多糖沉淀，然后重复用低浓度低级醇溶解荚膜多糖、用高浓度低级醇沉淀的溶解的荚膜多糖的步骤，最终达到去除杂质、获得纯化的荚膜多糖的目的。

具体而言，本发明的方法依次包括以下主要步骤：

步骤(a)：在含细菌荚膜多糖的沉淀物中加入盐溶液和终浓度为20-30％(v/v)的低级醇，从而溶解所述荚膜多糖，形成混合液。所用低级醇优选乙醇，更优选乙醇水溶液。本领域技术人员可根据细菌的血清型/群，在上述浓度范围内确定最适合的最终醇浓度，例如对于C群流脑菌种可采用22-28％的醇浓度。

步骤(b)：对步骤(a)的所述混合液进行固液分离，然后收集上清液。

步骤(c)：在步骤(b)所得上清液中加入高浓度低级醇以产生沉淀，使得低级醇浓度高于步骤(a)中低级醇的浓度至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，然后收集沉淀物。所用低级醇优选乙醇，更优选乙醇水溶液。该步骤中低级醇的浓度优选为60-90％，更优选65-80％。本领域技术人员可根据细菌的血清型/群，在上述浓度范围内确定最适合的最终醇浓度，例如对于C群流脑菌种可采用65-75％的醇浓度。

步骤(d)：在粗沉淀物中加入终浓度为30-70％，更优选35-65％的低级醇，从而溶解所述粗沉淀物，然后对形成的混合液进行固液分离，收集上清液。所用低级醇优选乙醇，更优选乙醇水溶液。本领域技术人员可根据细菌的血清型/群，在上述浓度范围内确定最适合的最终醇浓度，例如对于C群流脑菌种可采用40-50％的醇浓度，对于A群流脑菌种可采用50-65％的醇浓度。

此外，所述低级醇中可含盐，例如钙盐、钠盐、钾盐、或镁盐(优选钙盐或钠盐)，所述盐浓度通常为0.005-5M，优选0.01-2.5M，更优选0.1-1.5M。盐与低级醇的比例可为10:4-10:22(v:v)。本领域技术人员可根据细菌的血清型/群，在上述范围内确定最适合的盐浓度。

步骤(e)：在步骤(d)所得上清液中加入终浓度为60-90％的低级醇溶液，从而形成荚膜多糖沉淀物。所用低级醇优选乙醇，更优选乙醇水溶液。该步骤中低级醇的浓度优选为60-90％，更优选70-80％。本领域技术人员可根据细菌的血清型/群，在上述浓度范围内确定最适合的最终醇浓度，例如对于C群流脑可采用70-78％的醇浓度，对于A群流脑可采用75-85％的醇浓度。

步骤(f)：收集步骤(e)中所得的荚膜多糖沉淀物，即为纯化的细菌荚膜多糖。

通过步骤(d)-(f)可从步骤(c)所得的粗制荚膜多糖中制得精制的荚膜多糖。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤(d)用低级醇溶解粗沉淀物还可分步进行，例如可先加盐溶解，再加乙醇至终浓度30-65％；或者先加乙醇至终浓度30-65％，再加盐，从而使多糖处于溶解状态而不溶解蛋白等杂质。

通过步骤(a)主要可去除核酸类杂质以及一部分的蛋白质和色素等，而通过步骤(d)则可使得所需多糖溶解于醇溶液中，从而与蛋白质等杂质分离，还可以进一步去除核酸类杂质。

在本发明一个实施方式中，步骤(e)的荚膜多糖符合WHO标准。根据《中华人民共和国药典》(2005年版，三部，国家药典委，化学工业出版社，2005。以下简称《中国药典》)附录II A和附录VI B第二法所规定的测定方法测定所得产物中：核酸含量≤10mg/g，优选≤5mg/g，更优选≤3mg/g，最优选≤1mg/g；蛋白含量≤10mg/g，优选≤8mg/g，更优选≤5mg/g，最优选≤1mg/g。

应理解，可将步骤(f)中所得的纯化的细菌荚膜多糖作为原料，重复步骤(d)-(f)一次或多次(例如1-5次，优选1-3次)，以获得品质更高的荚膜多糖。

本领域技术人员应理解可在本发明的各步骤中采用本领域常用的方法来收集含有荚膜多糖的沉淀或上清液，这些方法包括但不限于：离心、过滤(包括活性碳过滤、超滤、微孔滤膜过滤等)、浓缩、干燥、洗涤、冷冻干燥等。

通过本发明方法制得的荚膜多糖可以是多聚糖、寡聚糖或单体糖，所述糖上可带有修饰基团，例如甲基或乙酰基等。

可对最终获得的纯化荚膜多糖进行冷冻干燥、活化等处理以使其适于储藏或进一步使用。

本发明的优选实施方式包括如下步骤：

(1)采用生物反应器对细菌进行发酵培养，于对数生长后期加入甲醛进行杀菌；

(2)采用阳离子去污剂，尤其是十六烷基三甲铵盐(例如十六烷基三甲基溴化铵)沉淀可溶性多糖。沉淀之前可以是细菌培养物、培养物的离心收集上清液，也可以对收集的上清液进行浓缩；

(3)沉淀之后，离心收集沉淀物，重新溶解。优选的是乙醇水溶液。最终乙醇浓度为20％和30％之间。最适宜的最终乙醇浓度依赖于细菌血清群/型；

(4)对重新溶解的沉淀物离心收集上清液，重新沉淀多糖。优选的是乙醇水溶液。最终乙醇浓度为60％和90％之间。最适宜的最终乙醇浓度依赖于细菌血清群/型；

(5)离心收集沉淀的多糖为粗多糖，重新溶解。优选的是乙醇水溶液。最终乙醇浓度为30％和65％之间。最适宜的最终乙醇浓度依赖于细菌血清群/型。粗多糖重新溶解之前，可以先用无水乙醇洗涤数次后再用丙酮洗涤数次，然后干燥；

(6)对重新溶解的粗多糖离心收集上清液，再次重新沉淀多糖。优选的是乙醇水溶液。最终乙醇浓度为60％和90％之间。最适宜的最终乙醇浓度依赖于细菌血清群/型。再次重新沉淀的多糖为精制多糖，可以先用无水乙醇洗涤数次后再用丙酮洗涤数次，然后干燥。

上述步骤中所用醇或醇溶液中可含盐，例如在步骤(3)和步骤(4)中，所述盐可选自钙盐、钠盐、钾盐或镁盐，优选钙盐或钠盐，所述盐浓度为0.01-2.5M，优选0.1-1.5M。

纯化的荚膜多糖及其应用

通过本发明纯化方法可获得纯度较高的荚膜多糖，该多糖可单独使用、与其它物质以混合物形式或组合物形式配伍使用、经或不经适当修饰、活化或降解后形成诸如多糖-蛋白质等结合物的形式使用。

本发明提供了一种组合物，其含有：(i)有效量的用本发明方法纯化得到的荚膜多糖、其免疫原性片段或它们与载体的结合物，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂的组合物。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的食品组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，术语“有效量”是指使用时足以获得需要的效果而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的成分的量。本领域普通技术人员可根据具体情况确定所述有效量。

在本发明中，术语“药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂”是指本身并不是必要的活性成分，且施用后没有或没有过分的毒性的辅助成分。合适的赋形剂或佐剂是本领域普通技术人员所熟知的。例如，药学上可接受的赋形剂记载于《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)。

本发明中可使用的赋形剂包括但不限于：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、赋形剂、或缓/控释剂等。本发明中可使用的免疫学上可接受的佐剂可参见例如CN02812444.8，它们包括但不限于：铝盐、皂角甙佐剂、完全弗氏佐剂、细胞活素或钙盐，优选铝盐、钙盐，更优选氢氧化铝、磷酸铝或磷酸钙。

本发明的组合物中，荚膜多糖、其免疫原性片段或它们与载体的结合物的含量通常为0.1-1.5(w/w)，优选0.2-1.0(w/w)，更优选0.3-0.7(w/w)。

可将本发明的荚膜多糖或其片段与一种或多种活性物质联合使用，这些活性物质包括但不限于：来自脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、伤寒沙门菌、甲肝病毒、乙肝病毒、百日咳博德特氏菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、幽门弯曲杆菌、脊髓灰质炎和/或流感嗜血菌的抗原等。

可对本发明的荚膜多糖进行或不进行适当的修饰、活化或降解，再使其与适当的载体连接，形成诸如多糖-蛋白质等结合物。所述修饰、活化或降解以及连接可按照常规方法进行，例如参照(Chu C，等.Infect Immun，1983，39：245-256或Costantino，等.Vaccine，1992，10：691-698)文献所记载的方法进行。适当的载体包括但不限于：蛋白载体、脂质载体、聚合物载体、或无活性的病毒颗粒等。在本发明的一个优选实施方式中，采用了蛋白载体，所述蛋白载体选自：细菌毒素、类毒素、基因脱毒细菌毒素、细菌毒素片段或细菌菌体蛋白，更优选破伤风类毒素、白喉毒素或白喉类毒素突变体。

本发明纯化的荚膜多糖、或由其衍生的组合物、混合物或结合物可用于治疗或预防与带荚膜的致病菌相关的疾病，例如流行性脑膜炎、脑膜炎、败血症、肺炎、中耳炎、会厌炎、心肌炎或伤寒等。

本发明还提供了一种治疗或预防与带荚膜的致病菌相关的疾病的方法，所述方法包括给予对象治疗或免疫有效量的本发明的纯化的荚膜多糖、或由其衍生的组合物、混合物或结合物。

本发明的优点

本发明的优点在于：

(1)在整个提制过程中不使用苯酚、氯仿等危险程度高、有致癌性的溶剂，与苯酚或氯仿-正丁醇萃取法相比，减少了对自然环境的破坏，有效保护了工作人员的安全；

(2)不使用层析方法，简便、易操作、且低成本；

(3)提制的荚膜多糖纯度高、内毒素含量低，产量高，重复性好，操作过程简单，可以使质量可控，提高产品质量的稳定性，减少批间差异。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《临床免疫学技术》(余贺等，上海科学技术出版社，1982)、《医学生物制品学》(卢锦汉等主编，人民卫生出版社，1995)、《分子克隆实验手册》(Molecular cloning:A laboratory manual，第3版，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.C群流脑多糖的提制

开启冻干的C群流脑菌种(菌号:CMCC29025，购自中国医学细菌保藏管理中心)，接种到含10％羊血的普通琼脂培养基，于35-37℃二氧化碳环境下培养16小时。

将经培养的细菌接种到半综合斜面培养基，于35-37℃二氧化碳环境下培养16小时。刮取菌苔，接种至装有50ml改良半综合培养基(按照《微生物培养基的制造与应用》<陈天寿主编，中国农业出版社，1995，第206-207页>自行配制，培养基主要成分为盐酸乳酪水解液、谷氨酸钠、甘氨酸、酵母透析液、氯化铵、硫酸镁、葡萄糖等)的三角瓶中，于35-37℃振荡培养3小时，按1％(v/v)比例接种5L发酵罐，培养基为改良半综合培养基，培养8小时。按1％(v/v)比例加入甲醛杀菌30分钟。放出培养物，经4000rpm离心1小时，合并上清液。按0.1％(w/v)加入十六烷基三甲基溴化铵，于2-8℃放置过夜，使多糖沉淀。经4000rpm离心30分钟，收集沉淀的多糖复合物。沉淀的复合物用1M CaCl₂溶解，加乙醇至乙醇终浓度为25％(v/v)，大部分核酸、蛋白质等杂质不溶解。经8000rpm离心60分钟，收集澄清的上清液。再加入乙醇至70％(v/v)，沉淀多糖，其中可能含蛋白质、色素、核酸等杂质，得到C群流脑粗多糖，湿重6.9g。

粗多糖加1M CaCl₂和乙醇(乙醇终浓度为35％(v/v))搅拌溶解，经8000rpm离心60分钟，收集澄清的上清液。加入乙醇至80％(v/v)沉淀多糖。离心收集沉淀的多糖，用无水乙醇洗涤2次，再用丙酮洗涤2次，每次洗涤后离心收集沉淀多糖，最后真空干燥，得到精制的多糖1.2g。

对培养不同时间和收罐样品进行多糖含量测定，计算各步骤多糖的产量，见图1。多糖产量随着培养时间而增加，在粗多糖提制步骤损失部分多糖，从粗多糖进一步精制过程多糖损失少，但杂质被有效去除。值得注意的是，图中所示的多糖产量指的是从取样测定值推算的理论产量。实际收获物中因为含有杂质、取样、留样、损失等原因，可能高于或低于理论值。

实施例2.从5L罐培养物中提制C群流脑多糖

开启冻干的C群流脑菌种(菌号:CMCC29205，购自中国医学细菌保藏管理中心)，同实施例1进行细菌的培养、杀菌和收获培养上清液。在5L发酵罐中的培养时间为10小时。按0.1％(w/v)加入十六烷基三甲基溴化铵，于2-8℃放置过夜，使多糖沉淀。经4000rpm离心30分钟，收集沉淀的多糖复合物。沉淀的复合物用1M CaCl₂溶解，加乙醇至20％(v/v)，大部分核酸、蛋白等杂质不溶解。经8000rpm离心60分钟，收集澄清的上清液。再加入乙醇至70％(v/v)，沉淀多糖。离心收集沉淀的多糖，用无水乙醇洗涤2次，再用丙酮洗涤2次，每次洗涤后离心收集沉淀多糖，最后真空干燥，得到C群流脑粗多糖1.5g，其中可能含蛋白、色素、核酸等杂质。

粗多糖加1M CaCl₂和乙醇(乙醇终浓度40％(v/v))搅拌溶解，经8000rpm离心60分钟，收集澄清的上清液。加入乙醇至75％(v/v)沉淀多糖。同实施例1离心收集、洗涤、干燥，得到精制的多糖1.0g。

对培养不同时间和收罐样品进行多糖含量测定，计算各步骤多糖的产量，见图2。与图1相似，粗制步骤损失部分多糖，但精制步骤能有效去除杂质，多糖损失少。

对精制多糖进行核磁共振(NMR)分析，显示典型的C群流脑多糖的NMR谱图(参见图4)，与文献一致(Jones等.Biologicals，1991，19：41-47，)。

实施例3.从100L罐培养物中提制C群流脑多糖

同实施例1开启C群流脑菌种(菌号：CMCC29205，同前)，进行细菌的传代，按1％(v/v)比例接种100L发酵罐，培养10小时。按1％(v/v)比例加入甲醛杀菌1小时。冷却培养物至15-20℃，用连续流离心机(CEPA101)离心，收集澄清培养液。按0.1％(w/v)加入十六烷基三甲基溴化铵，于2-8℃放置过夜，使多糖沉淀。同实施例2处理，获得经4000rpm离心30分钟，收集沉淀的多糖复合物，得到粗多糖41g。取5g粗多糖同实施例2处理，获得精制多糖2.4g。

实施例4.A群流脑多糖的提制

同实施例1开启A群流脑菌株(菌号：CMCC29201，购自中国医学细菌保藏管理中心)，进行7h细菌培养、杀菌、提制粗多糖，获得粗多糖湿重7.8g。

粗多糖用0.02M CaCl₂和乙醇(乙醇终浓度为55％(v/v))搅拌溶解，经8000rpm离心60分钟，收集澄清的上清液。加入乙醇至75％(v/v)沉淀多糖。同实施例1离心收集、洗涤、干燥，得到精制的多糖665mg。

对培养不同时间和收罐样品进行多糖含量测定，计算各步骤多糖的产量，见图3。多糖产量随着培养时间而增加，在粗多糖提制步骤和进一步精制过程多糖有所损失，但杂质被有效去除。

实施例5.C群流脑多糖的检定

依据《中国药典》附录方法，对从实施例2和3获得的精制C群流脑多糖以及用苯酚法获得的C群流脑多糖进行检定，包括核酸含量(附录II A)、蛋白含量(附录VI B第二法)、唾液酸含量(附录VI C)、O-乙酰基含量(附录VI C)、多糖分子大小测定(附录VIII G)，和内毒素(附录XII E)、异常毒性检查(附录XII F)。用苯酚法获得的多糖，系参照《中国药典》第34页“A群脑膜炎球菌多糖疫苗”2.2.5所述方法从100L罐培养物中提取。多糖分子大小系采用琼脂糖4B凝胶层析法测定多糖分子量的分布，K_D值越小表明分子量越大。

结果如表1所示：

表1.C群流脑多糖的检定

项目	WHO标准	5L罐提制多糖	100L罐提制多糖	100L罐提制多糖(苯酚法)
					核酸含量(mg/g)	<10	0.5	0.6	1.5
蛋白质含量(mg/g)	<10	4.7	7.8	4.4
					唾液酸含量(mg/g)	≥800	961	910	813
O-乙酰基含量(mmol/g)	≥1.5	2.12	2.43	2.09
					分子大小KD值KD值<0.5多糖回收率(％)	≤0.4≥75	0.0584.9	0.0688.4	0.3681.6
内毒素(EU/μg)	≤100	<25	0.27	0.40
					异常毒性试验豚鼠法(μg)小鼠法(μg)	500100	合格合格	合格合格	合格合格

上述结果表明：用本发明提制的C群流脑多糖质量完全符合WHO规程的要求，可以用于疫苗配制，或者经过进一步加工制备多糖结合疫苗。用本方法提制的多糖产量(274mg/L培养液)高于苯酚法(144mg/L培养液)；核酸含量大大低于后者，提高了多糖的安全性；所获得的多糖分子量大于苯酚法，而高分子量多糖具有更好的免疫原性。

实施例6.A群流脑多糖的检定

依据《中国药典》，对从实施例4获得的精制A群流脑多糖进行检定，包括核酸含量、蛋白含量、磷含量、O-乙酰基含量、多糖分子大小测定。结果如表2所示：

表2.A群流脑多糖的检定

项目	WHO标准	检定结果
			核酸含量(mg/g)	<10	2.3
蛋白质含量(mg/g)	<10	0.8
			O-乙酰基含量(mmol/g)	≥2	2.7
磷含量(mg/g)	≥80	81
			分子大小KD值KD值<0.5多糖回收率(％)	≤0.4≥65	0.2277

上述结果表明：用本发明提制的A群流脑多糖质量完全符合WHO规程和《中国药典》的要求，可以用于疫苗配制，或者经过进一步加工制备多糖结合疫苗。

实施例7.C群流脑多糖结合疫苗的制备和免疫效果研究

用实施例2所得的精制C群流脑多糖用pH5的醋酸盐缓冲液溶解，分别作用2、3小时使多糖降解，然后对蒸馏水充分透析后冻干。参照文献方法(Costantino等.Vaccine，1992，10：691-698)将C群流脑多糖与破伤风类毒偶联，得到C群流脑多糖结合疫苗(批号CPS-TT(1)、CPS-TT(2))。

分别用结合疫苗和C群流脑多糖免疫四周龄NIH小鼠(购自上海生物制品研究所实验动物中心)，间隔2周免疫3针，注射剂量为2.5μg，于第2针和第3针免疫后1周采血，分离血清，用ELISA法测定血清中抗C群流脑多糖抗体滴度，计算几何平均抗体滴度(GMT)。

结果表明：结合疫苗可以诱导小鼠产生高水平抗C群流脑多糖的抗体，免疫2针和3针后抗体GMT>1:800，而单独多糖(CPS)免疫小鼠3针后只能产生很低滴度的抗体(≤1:25)，如图5所示。用本发明制备C群流脑多糖经过降解后制备的结合疫苗具有比单独多糖高得多的免疫原性。

实施例8.A群流脑多糖结合疫苗的制备和免疫效果研究

采用文献方法(朱为等，中华微生物学和免疫学杂志，2002，22：299-302)，用实施例5得到的精制A群流脑多糖与破伤风类毒素结合，制备A群流脑多糖结合疫苗(批号APS-TT)。同实施例7进行小鼠免疫、采血、分离血清，用ELISA法测定血清中抗A群流脑多糖抗体滴度，计算几何平均抗体滴度(GMT)。

结果表明：结合疫苗可以诱导小鼠产生高水平抗A群流脑多糖抗体，免疫2针后抗体GMT为1:2260，免疫3针后抗体GMT为1:3507；单独多糖免疫小鼠3针后，抗体GMT仅为1:46，如图6所示。用本发明制备A群流脑多糖制备的结合疫苗具有比单独多糖高得多的免疫原性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种细菌荚膜多糖的处理方法，所述方法包括：

(a)在含细菌荚膜多糖的沉淀物中加入终浓度为20-30体积％的低级醇，从而溶解所述荚膜多糖，形成混合液；

(b)对步骤(a)的所述混合液进行固液分离，然后收集上清液；

(c)在步骤(b)所得上清液中加入终浓度为60-90体积％的低级醇，从而形成含细胞荚膜多糖的粗沉淀物，然后收集所述粗沉淀物；

(d)在粗沉淀物中加入终浓度为30-70体积％的低级醇，从而使所述粗沉淀物中的多糖处于溶解状态，然后对形成的混合液进行固液分离，收集上清液；

(e)在步骤(d)所得上清液中加入终浓度为60-90体积％的低级醇溶液，从而形成荚膜多糖沉淀物；

(f)收集步骤(e)中所得的荚膜多糖沉淀物，即为纯化的细菌荚膜多糖，

其中，步骤(c)和步骤(e)中的低级醇终浓度高于步骤(d)中的低级醇终浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞荚膜多糖沉淀物是通过对生物样品进行处理而获得的沉淀物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌选自下组：脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌、嗜血流感杆菌、肺炎链球菌、或伤寒沙门菌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低级醇选自：乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇或丙二醇。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低级醇含有钙盐、钠盐、钾盐或镁盐，所述盐浓度为0.01-2.5M，盐与低级醇的体积比为10∶4-10∶22。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中低级醇的终浓度比步骤(a)中低级醇的终浓度高30-70％，步骤(e)中低级醇的终浓度比步骤(d)中低级醇的终浓度高5-60％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)和(c)之间或步骤(d)和步骤(e)之间还包括对上清液进行过滤和/或浓缩。

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