BR112015011722B1

BR112015011722B1 - Método para preparar um polissacarídeo capsular de neisseria meningitidis x

Info

Publication number: BR112015011722B1
Application number: BR112015011722-8A
Authority: BR
Inventors: Pisal Sambhaji Shankar; Chilukuri Srinivas Reddy; Peddireddy Srinivas Reddy
Original assignee: Serum Institute Of India Ltd
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2022-08-09
Also published as: CN104936615B; NZ708523A; MX2015006455A; US20150299750A1; CA2892035C; US9580734B2; EP2922569B1; EP2922569A2; AU2013349261B2; KR20150087355A; SG11201503947YA; PH12015501138B1; AU2013349261A1; RU2627156C2; RU2015123024A; MX364644B; CN104936615A; EP2922569A4; WO2014080423A3; KR102118071B1

Abstract

PRODUÇÃO DE ALTOS RENDIMENTOS DE POLISSACARÍDEOS BACTERIANOS. A presente invenção refere-se à cultura melhorada, condições de fermentação e purificação para preparar polissacarídeos de Neisseria meningitidis. A invenção, em particular, refere-se a um novo meio de fermentação, estratégias de adição de solução de alimentação ideal e um processo de purificação melhorado desprovido de quaisquer métodos cromatográficos para obter alto rendimento de polissacarídeo de Neisseria meningitidis X.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001]A presente invenção refere-se a vacinas contra Neisseria meningitidis. TÉCNICA ANTERIOR

[002]Neisseria meningitidis é a causa de meningite bacteriana epidêmica. O po- lissacarídeo capsular é um dos principais determinantes de virulência de N. meningitidis. Dentre os 13 sorogrupos meningocócicos classificados com base em estrutura de polissacarídeo capsular, sorogrupos A, B, C, Y, e W135 estão associados com a maioria dos casos de doença meningocócica. No cinturão africano de meningite, a maioria das grandes epidemias foi causada pelos meningocócos do sorogrupo A, enquanto doença esporádica e surtos em países desenvolvidos são usualmente causados pelos meningocócos do sorogrupo B e C. Os meningocócos do sorogrupo Y surgiram como uma causa importante de doença esporádica e surtos nos Estados Unidos no final da década de 90 e em 2000 os meningocócos do sorogrupo W135 causaram doença mundial em associação com Hajj (peregrinação à Meca) e grandes surtos na África subsariana.

[003]Neisseria meningitidis do sorogrupo X (MenX), anteriormente uma causa rara de casos esporádicos de meningite, recentemente foi associada com incidência aumentada de doença meningocócica e surgiu como uma causa de grandes surtos no “Cinturão de Meningite” da África. Os surtos foram documentados na Nigéria, Burquina Faso, Togo e Gana e variaram de tamanho. Na temporada de meningite de 2010, mais de 6500 casos de meningite foram relatados em Burquina Faso, e é razoável supor que pelo 1000 desses casos foram devido à MenX como uma incidência localmente relatada de 120 casos por 100.000. Anteriormente, diversos pacientes foram confirmados com a doença de MenX em um surto de pelos menos 82 casos de meningite bacteriana na fronteira do Quênia e Uganda em 2007.

[004]Os polissacarídeos capsulares dos meningocócos do sorogrupo B, C, Y, e W135 são compostos de derivados de ácido siálico. Os meningocócos do sorogrupo B e C expressam ácido polissiálico ligado a (α 2-8)- e (α 2- 9), respectivamente, enquanto alternam as sequências de D-glicose ou D-galactose e ácido siálico são expressos pelo N. meningitidis do sorogrupo Y e W135. Em contraste, a cápsula dos meningocócos do sorogrupo A é composta de N-acetilmanosamina 6-fosfato ligado a (α 1- 6), enquanto N. meningitidis do sorogrupo X sintetiza os polímeros capsulares de N-acetilglucosamina 1-fosfato ligado a (α 1-4).

[005]O aumento na incidência da doença de MenX no Cinturão Africano de Meningite nos últimos 5 anos garante o desenvolvimento e introdução de uma vacina para MenX em áreas selecionadas da região para prevenir e controlar futuras epidemias. A conjugação de polissacarídeos capsulares meningocócicos a uma proteína carreadora levou ao desenvolvimento de vacinas conjugadas de polissacarídeo monovalente (A ou C) com alta eficácia e dados de imunogenicidade de ensaios clínicos indicam que amplo uso de vacinas conjugadas tetravalentes que cobrem os sorogrupos A, C, Y e W-135 pode ser similarmente eficaz. Uma abordagem similar também pode ser frutífera para MenX. Refira-se a Ouli Xiea et al “Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccaride, and development of an assay for quantification of human antibodies”, Vaccine 30, 2012.

[006]Gunnstein Norheim discute que no momento a vacina contra o sorogrupo X não está disponível e que as vacinas acessíveis da próxima geração devem visar os sorogrupos mais predominantes: A, W-135, X. Refira-se a “Preventing the emerging serogroup X meningococcal disease in the African Meningitis Belt” Oxford Vaccine Group, 2011.

[007]A falta de vacina contra os meningocócos do grupo X é um motivo de preocupação dados os surtos causados pelos meningocócos desse sorogrupo nos últimos anos. Refira-se “Meningococcal vaccines: WHO position paper”, Novembro 2011.

[008]A fim de facilitar o polissacarídeo de MenX com base no desenvolvimento de vacina conjugada, é necessário obter polissacarídeos de MenX estruturalmente intactos com altos rendimentos.

[009]Vários meios sintéticos foram descobertos para produção em larga escala de polissacarídeo meningocócico (Frantz, I. D. Jr. Growth Requirements of the Meningococcus. J. Bact., 43: 757-761, 1942; Catlin, B. W. Nutritional profiles of Neisseria lactamica, gonorrhoeae and meningitidis, in chemically defined media. J. Inf. Dis., 128(2): 178-194, 1973; Watson-Scherp Medium: Watson R G, et al. The specific hapten of group C (group IIa) meningococcus, II. Chemical nature. J Immunol 1958; 81:337-44; Marcelo Fossa da Paz; Júulia Baruque-Ramos; Haroldo Hiss; Márcio Alberto Vicentin; Maria Betania Batista Leal; Isaías Raw. Polissacarídeo production in batch process of Neisseria meningitidis serogroup C comparing Frantz, modified Frantz and Catlin 6 cultivation media, Braz. J. Microbiol. vol. 34, no. 1. São Paulo January/April 2003).

[010]A Patente Norte-Americana n° 5.494.808 relata um processo de fermentação em larga escala, de alta densidade celular (5 g/L de peso celular seco, e uma densidade óptica entre cerca de 10 a 13 a 600 nm) para o cultivo de N. meningitidis (soro- grupo B 11). Essa patente divulga o seguinte meio (chamado “MC.6”) para cultivar Neisseria meningitidis para isolamento de OMPC (“Complexo de Proteína de Membrana Externa”).

[011]O documento US 7399615 divulga uma composição de fermentação em que a composição omite NH4Cl, e um método melhorado de fermentação de Neisseria (sorogrupos A,C,Y & W135) em uma composição de fermentação substitui cloreto e amônio (fonte de nitrogênio) com uma peptona de soja (HSP-A; Nutricepts, Inc; Minneapolis, Minn). A dita fermentação descontínua de alimentação (2L), em que o meio de fermentação bem como a solução de alimentação contém resultados de HSP-A no rendimento de polissacarídeo A de Men de cerca de 1300 a 1400 mg/l em uma OD máxima média entre 14 e 20.

[012]O documento US 7491517 divulga um meio de cultura fastidioso de Neisseria meningitidis (NMFM) para produzir polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis (sorogrupos A,C,Y & W135) compreendendo: água DI (deionizada), NaCl, K2SO4, KCl, citrato trissódico. 2H2O, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, MnCl2.6H2O, vitamina B12, NAD (Dinucleotídeo de Nicotinamida Adenina) thamina HCl, peptona de soja, D-glicose, ácido L-glutâmico, L-arginina, L-serina, L-cisteína, glicina, ácido mor- folinapropanossulfônico [MOPS], CaCO3 para manter o pH em 6,5 a 7,0 e Fe2(SO4)3 para sorogrupo A e NH4Cl para sorogrupo W-135. A dita fermentação resulta em rendimento de polissacarídeo de cerca de 30 a 40 mg/L em uma OD máxima média de 10.

[013]David Bundle et al discutem a preparação e isolamento do polissacarídeo de MenX da cepa 247 de N. meningitidis X (Centro de Laboratórios para Controle de Doenças) em que a dita cepa foi cultivada em um meio quimicamente definido (NCDM) por 18 horas. A dita fermentação resulta em rendimento de polissacarídeo de MenX de cerca de 20 mg/L. Refira-se a “Studies on the Group-specific Polysacca- rides of Neisseria meningitidis Serogroup X and an improved Procedure for its isolation” JBC, 1974.

[014]Ouli Xiea et al divulgam a preparação de MenX PS das cepas BF7/07 e BF12/03. Resumidamente, as cepas de MenX foram cultivadas em placas de agar de Infusão Cardíaca Cerebral com suplemento de Levinthals, e seguindo uma etapa pré-cultivada em meio de Franz de 0,2 L, a cepa foi cultivada em quatro frascos de agitação perplexos de 2,8 L separados contendo 1,0 ou 1,5 L de meio líquido de Franz modificados cada. As culturas de líquido foram inativadas após 16 h de cultivo através da adição de formaldeído em uma concentração final de 1% (v/v). O rendimento de MenX PS por litro de meios de crescimento parece ser ligeiramente maior para isolar BF 7/07 (4,5 mg/L) do que para isolar BF12/03 (3,8 mg/L).Refira-se a “Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polyssacaradeos, and development of an assay for quantification of human antibodies”, Vaccine 30, 2012.

[015]A técnica anterior discute estudos de melhora estrutural e rendimento com respeito aos polissacarídeos dos sorogrupos de Men A, C, Y e W135. Entretanto nenhuma técnica anterior aborda a necessidade há muito sentida para preparação de polissacarídeo MenX com rendimento mais elevado que é um pré-requisito para o desenvolvimento de polissacarídeo plano de MenX e vacinas de conjugados de proteína de polissacarídeo MenX.

[016]Os presentes inventores descobriram que as estratégias de alimentação da técnica anterior com base no pH stat, cravação e taxa constante que são adequados para fermentação de Men A C Y W135, entretanto sofre com os seguintes contratempos para MenX: i) crescimento satisfatório mas menos rendimento de polissaca- rídeo ii) limitação de cultivo, menos rendimento de polissacarídeo e iii) crescimento satisfatório mas fase de declínio precoce .Outros métodos da técnica anterior empregam peptona de soja & extrato de levedura como componentes do meio de alimentação que resultam em rendimento inferior de polissacarídeo associado com carga aumentada de contaminantes de proteína.

[017]É um objetivo da presente invenção prover cultivo melhorado, condições de fermentação e purificação para preparar polissacarídeos de Neisseria meningitidis X com alto rendimento e mínimas impurezas. Com as ditas melhoras, a fabricação de vacina conjugada de proteína de polissacarídeo de MenX pode ser econômica e subsequentemente a vacina pode ficar disponível para crianças de países em desenvolvimento em uma taxa acessível.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[018]A presente invenção surge a partir da descoberta surpreendente que é pos- sível preparar polissacarídeo de MenX com altos rendimentos e alta pureza pela utilização de a) um meio de fermentação contendo casaminoácido junto com outros componentes, b) nova estratégia de alimentação exponencial contínua e composição de meio de alimentação que pode resultar em atraso da fase de declínio, c) condições ideias de fermentação e d) processo de purificação melhorado desprovido de métodos cromatográficos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[019]Figura 1: Perfil de crescimento de “N. meningitidis X 8210” no meio contendo casaminoácido em comparação com meio contendo petona de soja.

[020]Figura 2: Espectro de 13C RMN de MenX

[021]Figura 4: Espectro de 31P RMN de MenX

[022]Figura 5: Espectro de 1H RMN de MenX

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[023]Consequentemente em uma primeira modalidade, a presente invenção pre-ferencialmente utiliza meio de fermentação contendo casaminoácido como fonte de nitrogênio em vez de peptona de soja ou extrato de levedura, provendo assim as vantagens a seguir i) aumento significativo no rendimento de polissacarídeo devido ao atraso na fase de declínio como um resultado de utilização de uma nova estratégia de alimentação exponencial contínua ii) 50% de aumento na concentração de proteína e contaminantes de aminoácido no próprio estágio de 100 KDa da colheita do fermentador, garantindo assim que o processo de purificação subsequente possa facilmente remover as impurezas restantes iii) ampliação do meio de fermentação contendo casaminoácido pode ser simples e econômica.

[024]Uma segunda modalidade da presente invenção é que o dito meio de fermentação de Neisseria meningitidis para produzir polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis X pode compreender dextrose entre 9 e 10 g/l, cloreto de sódio entre 5,5 e 6 g/l, sulfato de potássio entre 0,8 e 1 g/l, fosfato de potássio dibásico entre 3,5 e 4 g/l, cloreto de amônio entre 0,14 e 0,19 g/l, ácido glutâmico entre 4,5 e 5,5 g/l, L-arginina entre 0,2 e 0,4 g/l, L-serina entre 0,4 e 0,6 g/l, L-cisteína entre 0,24 e 0,26 g/l, cloreto de magnésio entre 0,18 e 0,20, cloreto de cálcio de 0,02 g/l, sulfato ferroso de 0,002 g/l e casaminoácido entre 5 e 20 g/l.

[025]Uma modalidade preferida da presente invenção é que o dito meio de fermentação de Neisseria meningitidis para produzir polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis X pode compreender dextrose de 10 g/l, cloreto de sódio entre 5,8 e 6 g/l,sulfato de potássio entre 0,9 e 1 g/l, fosfato de potássio dibásico entre 3,8 e 4 g/l, cloreto de amônio entre 0,14 e 0,17 g/l, ácido glutâmico entre 4,8 e 5 g/l, L- arginina entre 0,2 e 0,3 g/l, L-serina entre 0,4 e 0,5 g/l, L-cisteína entre 0,24 e 0,25 g/l, cloreto de magnésio entre 0,18 e 0,19, cloreto de cálcio de 0,02 g/l, sulfato ferroso de 0,002 g/l e casaminoácido entre 5 e 10 g/l.

[026]Um aspecto importante da presente invenção é que os presentes inventores descobriram surpreendentemente uma estratégia de alimentação exponencial contínua vantajosa que pode manter as células na fase estacionária por uma duração mais longa, aumentando assim o rendimento de polissacarídeo de N. meningitidis X de modo que a adição de alimentação inicial pode ser iniciada quando a OD a 590 nm está entre 3 a 4 em uma taxa de 10 ml/h/1,5 L que gradualmente aumenta a 30 ml/h/1,5L até a OD da cultura ser maior e então mantida a 60 ml/h/1,5 L até a OD da cultura alcançar 50% da OD mais elevada e então a cultura pode ser colhida.

[027]Outros inventores do presente pedido descobriram que durante a fermentação para evitar a queda do pH resultante do acúmulo dos metabólitos celulares liberados, NaOH em uma concentração entre 0,25N e 0,5N e ácido ortofosfórico em uma concentração entre 5 e 10% podem ser continuamente providos pelas bombas dosadoras em cascatas com o pH mantido em ponto de ajuste, em que a proporção de carbonato de sódio (20%) a NaOH (0.5N) é mantida em 1:3.

[028]Um aspecto importante da presente invenção é que foi descoberto que a dita cepa 8210 de N. meningitidis X tem uma fase de log entre a 5a e 9a h, fase estacionária entre a 9a e 12a h e fase de declínio entre a 12a e 19a h.

[029]A fermentação na presente invenção pode ser realizada em batelada ou maneira de alimentação em batelada, preferencialmente em um modo de batelada alimentada contínua.

[030]Ainda em outro aspecto da presente invenção, a dita solução de alimentação pode compreender dextrose entre 72 e 76 g/l, glutamato de sódio entre 38 e 42 g/l, L-arginina entre 2,8 e 3,2 g/l, L-serina entre 2,8 e 3,2 g/l, L-cisteína entre 1,9 e 2,1 g/l, cloreto de magnésio entre 1,9 e 2,1, cloreto de cálcio entre 0,13 e 0,15 g/l e sulfato ferroso de 0,02g /l.

[031]Em uma terceira modalidade, a presente invenção provê um polissacarídeo capsular de MenX que tem rendimento entre 600 mg/l a 800 mg/l no estágio de colheita do fermentador a 100 KDa em que a densidade óptica medida a 590 nm pode estar entre 8 e 15, preferencialmente entre 8 e 11.

[032]Uma terceira modalidade da presente invenção é que a fermentação de Neisseria meningitidis X pode ser realizada nos valores de ponto de ajuste de i) pH de 7 a cerca de 7,2, ii) temperatura entre 36 e 37°C e em valores em cascata para i) oxigênio dissolvido de 15 a 25%, ii) agitação de 350 a 500 rpm, iii) fluxo de gás de 1 a 1,5, iv) ar de 0 a 100% e v) oxigênio de 0 a 100%.

[033]Uma quarta modalidade da presente invenção é que a colheita de diafiltra- ção a 100KDa pode ser submetida adicionalmente para etapas de purificação compreendendo:

[034](a) remoção de proteína e impurezas de endotoxina pela utilização de deso- xicolato em uma concentração de 1% em combinação com ácido etilenodiaminate- tra-acético em uma concentração de 2 mM e etanol em uma concentração de 40%;

[035](b) adição de 4 a 6% de acetato de sódio para remoção de ácidos nucleicos;

[036](c) adição de brometo de cetiltrimetilammônio em uma concentração de 3 a 4% para ligar o polissacarídeo e as impurezas;

[037](d) precipitação de polissacarídeo de complexo de brometo-polissacarídeo de cetiltrimetilamônio pela utilização de cloreto de sódio em uma concentração de 0,05 M na presença de etanol a 96% absoluto

[038](e) remoção de proteína e impurezas de ácido nucleico pela lavagem do pé- lete com etanol em uma concentração de 45% na presença de cloreto de sódio em uma concentração de 0,4 M;

[039](f) precipitação seletiva de polissacarídeo pela utilização de etanol a 96% absoluto;

[040](g) dissolução do polissacarídeo em WFI e submissão à filtração de fluxo tangencial; e

[041]em que o dito processo de purificação não utilize nenhuma cromatografia e o dito polissacarídeo purificado tem rendimento de 300 a 500 mg/L, peso molecular médio de 400 a 550 KDa, contém menos de 0,5% de proteínas/peptídeos, menos de 0,5% de ácidos nucleicos, menos de 5 EU/μg de endotoxinas com recuperação da etapa de purificação de 60% a 65%.

[042]Outro aspecto da quarta modalidade é que o dito processo de purificação do polissacarídeo de N. meningitidis X é robusto e econômico já que provê cerca de 60 a 70% de recuperação de polissacarídeo e não requer etapas cromatográficas adicionais.

[043]Um quinto aspecto da presente invenção é que o dito processo pode ser aplicável ao sorotipo de N. meningitidis X, A, B, C D, Y, Z, 29E e W-135, preferencialmente às cepas do sorotipo X de N. meningitidis selecionadas da cepa M9601, M9592, M9591,247X, M9554, M8210 e M2526,5967 (ST 750), mais preferencialmente a “M8210”.

[044]Uma sexta modalidade da presente invenção é que o dito polissacarídeo de N. meningitidis X da presente invenção pode ser utilizado para preparar composição do conjugado de proteína do polissacarídeo pelos métodos divulgados no documento WO 201314268 em que, i) polissacarídeo X pode ser dimensionado mecanicamente para obter fragmentos que têm tamanho entre 150 e 200 KDa, ii) sacarídeo dimensionado pode ser conjugado para proteína carreadora através de um ligante com uma química de conjugação de cianilação, iii) proporção de sacarídeo para proteína no conjugado final pode estar entre 0,2 e 0,6.

[045]Em um aspecto da modalidade, o dito polissacarídeo de N. meningitidis X da presente invenção também pode ser utilizado para preparar uma composição de conjugado de proteína de polissacarídeo meningocócico monovalente compreendendo sacarídeo capsular dos sorogrupos X e pelo menos um polissacarídeo capsular adicional de A, C, W135 e Y pelos métodos divulgados anteriormente no documento WO 201314268.

[046]A sétima modalidade da presente invenção é que a dita proteína carreadora pode ser selecionada de um grupo de, entre outros, CRM 197, toxóide da difteria, toxóide de tétano, toxóide de pertussis, E. coli LT, E: coli ST, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, complexo c de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação de transferina, pneumolisina, proteína A de superfície pneumocócica (PspA), proteína adesina pneumocócica (PsaA), proteínas BVH-3 e BVH-11de superfície pneumocócica, antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis e fator de edema desentoxicado (EF) e fator letal (LF) de Bacillus anthracis, ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro humano, albumina de soro bovino (BSA) e derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD). Preferencialmente, as proteínas carreadoras podem ser selecionadas de toxóide de tétano, toxóide de difteria e CRM197.

[047]As composições imunogênicas monovalentes ou multivalentes contendo po- lissacarídeo de N. meningitidis X podem estar em uma forma líquida tamponada ou em uma forma liofilizada. Preferencialmente, o dito conjugado de proteína de polis- sacarídeo pode ser liofilizado conforme divulgado anteriormente no documento US2013/0209503, em que a formulação pode ter pelo menos 6 meses de estabilidade a 40°C e teor de polissacarídeo livre pode ser menor que 11 % em p/p.

[048]A composição de vacina liofilizada da presente invenção pode ser reconstituída com um veículo de distribuição que tem um pH de cerca de 6 a 7,5, particularmente com solução salina ou PBS.

[049]As composições podem compreender adjuvante de sal de alumínio adicionado em uma quantidade de 25 a 125 μg de Al+++por 0,5 ml.

[050]Também a dita composição pode compreender um conservante selecionado de tiomersal e 2-fenoxietanol.

[051]A composição de vacina liofilizada da presente invenção pode ser dada como 1,5 ou 10 da formulação de dose.

[052]O polissacarídeo ou um conjugado do mesmo é preferencialmente administrado parentericamente, por exemplo, pela injeção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial ou intralesional.

EXEMPLOS I) Procedimento de Fermentação:

[053]Frasco de sementes contendo 3 ml de cultura de “N. meningitidis X M8210” (CBER) tendo OD de 1/ml foi congelado a -70°C. Então, o frasco foi descongelado e semeado em 30 ml de meio de semente que foi incubado a 37 °C e agitado de 150 a 180 rpm. O volume foi duplicado a 60 ml quando a OD estava acima de 0,7 e então para 120 ml, 210 ml, respectivamente.

[054]A cultura que tem OD 1,0 ± 0.2 com volume de 70 ± 10 ml foi semeada no reator, em que o volume médio no reator foi de 1500 ml. Após inoculação do reator a 0 h, a OD foi mantida de 0,04 a 0,05.

[055]Todo o processo de fermentação foi realizado no biorreator de vidro Celligen 115 (2,2 L) de fluxo biológico NBS, em que o ciclo de fermentação foi executado em um modo de batelada alimentada contínua e duração total de ciclo de fermentação foi de 19 h.

II) Composição do meio de fermentação:

[056]Tabela 1: Composição de novo meio contendo casaminoácido para sorogru- po X de N. meningitidis (NMXM-CA-I)

[057]Tabela 2: Composição de novo meio contendo casaminoácido para sorogrupo X de N. meningitidis (NMXM-CA-II)

[058]Tabela 3: Composição de novo meio contendo casaminoácido para Soro- grupo X de N. meningitidis (NMXM-CA-III)

[059]Tabela 4: Composição de um meio contendo peptona de soja para sorogru- po X de N. meningitidis (NMXM-SP)

[060]Tabela 5: Composição de um meio contendo peptona de soja para sorogru- po X de N. meningitidis (NMXM-SP-II)

III) Cinética de crescimento, Nova Estratégia de Alimentação e Soluções de Alimentação:

[061]Tabela 6: Perfil de crescimento da cepa 8210 de N. meningitidis X

[062]A fase de log foi identificada entre a 5a e 9a h, fase estacionária entre 9a e 12a h e fase de declínio entre 12a e 19a h.

NOVA ESTRATÉGIA DE ALIMENTAÇÃO

[063]A estratégia de alimentação foi designada de modo que a adição de alimentação inicial pode ser iniciada quando a OD a 590nm está entre 3 e 4 em uma taxa de 10 ml/h/1,5 L que gradualmente aumenta para 30 ml/h/1,5L até a OD de cultura ser mais elevada e então mantida a 60 ml/h/1,5 L até a OD de cultura alcançar 50% da OD mais elevada e então a cultura pode ser colhida. SOLUÇÕES DE ALIMENTAÇÃO Componente Concentração (g/i) Dextrose 75 G lutam ato de sódio 40 Arginina 3 Serina 3 Cisteína 2 Cloreto de magnésio 2 Cloreto de cálcio 0,15 Sulfato ferroso 0,02

[064]Tabela 7: Composição de nova “Solução de Alimentação 1”(FS-1) para so- rogrupo X de N. meningitidis

[065]Tabela 8: Composição de nova “Solução de Alimentação 2” (FS-2) para so- rogrupo X de N. meningitidis

RESULTADOS

[066]A estratégia de alimentação exponencial contínua resultou na manutenção das células na fase estacionária para uma duração mais longa, aumentando assim o rendimento do polissacarídeo de N. meningitidis X. Foi descoberto que o uso de ca- saminoácido como uma fonte de nitrogênio fornece alto rendimento e alto peso molecular de polissacarídeo de MenX com mínimas impurezas no estágio de 100 Kda como comparado à peptona de soja como fonte de nitrogênio.

[067]Quando apenas dextrose e glutamato de sódio foram usados como solução de alimentação (FS-2), a morfologia de célula foi afetada em última análise resultando em características de polissacarídeo desfavoráveis. Considerando que quando FS-1 (contendo aminoácidos, sais além de dextrose e glutamato de sódio) foi usado, foi descoberto que a morfologia das células é melhorada, aumentando assim o rendimento de polissacarídeo e provendo polissacarídeo com características favoráveis.

[068]O estudo do perfil de crescimento de N. meningitidis X 8210 revela que durante a fermentação uma queda do pH resultante do acúmulo de metabólitos celulares liberados foi observada que essa taxa estava afetando adversamente a produção de polissacarídeo capsular. Para evitar tal queda do pH, NaOH em uma concentração entre 0,25N e 0.5N e ácido ortofosfórico em uma concentração entre 5 e 10% foi continuamente provido pelas bombas dosadoras em cascata com o pH mantida em ponto de ajuste, em que a proporção do carbonato de sódio (20%) para NaOH (0,5N) é mantida em 1:3.

IV) Condições do fermentador

[069]Tabela 9: Variáveis do fermentador

[070]Tabela 10: Concen tração de Polissacaríd eo e perfil de pureza em 100 KDa

RESULTADOS

[071]Para meio de NMXM-CA contendo casaminoácidos, no estágio de 100 KDa, o rendimento de polissacarídeo estava entre 500 e 650 mg/l com carga mínima, em que a colheita foi realizada quando a OD alcançou 50% de OD de cultura mais elevada. Enquanto para meio de NMXM-SP contendo peptona de soja, no estágio de 100 KDa, o rendimento de polissacarídeo foi comparativamente baixo, isto é, entre 450 e 500 mg/l com maior carga de impurezas.

V) Colheita e Inativação

[072]A fermentação foi concluída uma vez que a queda na densidade óptica foi observada seguida pela inativação usando 1% de formaldeído por 2 h a 37oC. Além disso, a temperatura foi reduzida a 10oC e incubada por 30 minutos. A colheita foi descarregada e centrifugada a 14.500g por 45 minutos.

[073]O sobrenadante foi submetido à filtração de 0,2 μ seguida por dialfiltração de 100KD (10 a 15 vezes) e foi ainda concentrado com WFI. Filtração estéril posterior com 0,2 μ de filtro foi realizada.

VI) Purificação de polissacarídeo de MenX PROTOCOLO 1:

[074]Adição de 0,5% de desoxicolado, 6% de acetato de sódio, EDTA a 2 mM e etanol a 40% para a colheita diafiltrada de 100KD. Então, a mistura foi mantida de 2 a 80C por 3 a 4 h com agitação. A mistura posterior foi submetida à centrifugação a 10000 rpm por 20 min e o sobrenadanete foi diafiltrado contra Tris a 25 mM com membrana de cassete de 100KD. Além disso, 10% em p/v de precipitação de CTAB foram carregados durante a noite de 2 a 80C com agitação e o pélete foi coletado. O dito pélete foi dissolvido em etanol a 96%com NaCl a 0,05M de 2 a 80C por 2 h em agitação. Então, a precipitação do polissacarídeo foi realizada por 30 minutos e o pélete foi coletado. O dito pélete foi dissolvido em etanol a 45% com NaCl a 0,4M por 1 h. O sobrenadante foi coletado e filtrado através de filtro de carbono CUNO R32SP. Então, o polissacarídeo foi precipitado em etanol a 96% por 1 a 2 h e o péle- te foi coletado. Então, o pélete foi dissolvido em WFI seguido por TFF. O polissaca- rídeo de N. meningitidis X final purificado foi armazenado a -20°C.

PROTOCOLO 2:

[075]Adição de 1,5% de desoxicolato, 6% de acetato de sódio, EDTA a 2 mM e etanol a 40% para a colheita diafiltrada de 100KD. Então, a mistura foi mantida de 2 a 80C por 3 a 4 h com agitação. A mistura posterior foi submetida à centrifugação a 10000 rpm por 20 minutos e o sobrenadante foi diafiltrado contra Tris a 25 mM com membrana de cassete de 100KD. Além disso, 6% em p/v de precipitação de CTAB foram realizados durante a noite de 2 a 80C com agitação e o pélete foi coletado. O dito pélete foi dissolvido em etanol a 96% com NaCl a 0,05M de 2 a 80C por 2 h em agitação. Então, a precipitação do polissacarídeo foi realizada por 30 minutos e o pélete foi coletado. O dito pélete foi dissolvido em etanol a 45% com NaCl a 0,4M por 1h. O sobrenadante foi coletado e filtrado através de filtro de carbono CUNO R32SP. Então, o polissacarídeo foi precipitado em etanol a 96% por 1 a 2 h e o péle- te foi coletado. Então, o pélete foi dissolvido em WFI seguido por TFF. O polissaca- rídeo de N. meningitidis X final purificado foi armazenado a -20°C.

PROTOCOLO 3:

[076]Adição de 1% de desoxicolato, 6% de acetato de sódio, EDTA a 2 mM e etanol a 40% para a colheita diafiltrada de 100KD. Então, a mistura foi mantida de 2 a 80C por 3 a 4 h com agitação. A mistura posterior foi submetida à centrifugação a 10000 rpm por 20 minutos e o sobrenadante foi diafiltrado contra Tris a 25 mM com membrana de cassete de 100KD. Além disso, 3% em p/v de precipitação de CTAB foram realizados durante a noite de 2 a 80C com agitação e o pélete foi coletado. O dito pélete foi dissolvido em etanol a 96% com NaCl a 0,05M de 2 a 80C por 2 h em agitação. Então, a precipitação de polissacarídeo foi realizada por 30 minutos e o pélete foi coletado. O dito pélete foi dissolvido em etanol a 45% com NaCl a 0,4M por 1 h. O sobrenadante foi coletado e filtrado através do filtro de carbono CUNO R32SP. Então, o polissacarídeo foi precipitado em etanol a 96% por 1 a 2 h e o péle- te foi coletado. Então, o pélete foi dissolvido em WFI seguido por TFF. O polissaca- rídeo de N. meningitidis X final purificado foi armazenado a -20°C.

[077]Protocolo 1 tendo baixo DOC resultado em remoção ineficaz dos contami- nantes (proteína/ácido nucleicos) enquanto altas concentrações de CTAB resultaram em um complexo de CTAB-polissacarídeo que não era facilmente separável.

[078]Protocolo 2 tendo DOC mais elevado resultou em soluções de polissacarí- deo mais viscosas, tornando assim difícil para processar TFF. Também, a concentração intermediária de CTAB resultou em um complexo de CTAB-polissacarídeo que não era facilmente separável.

[079]Foi descoberto que o Protocolo 3 tendo DOC intermediário e menos concentração de CTAB é mais eficaz do que o Protocolo 1/2 e, por isso, foi finalizado para purificação de polissacarídeo de N. meningitidis X.

[080]O polissacarídeo de N. meningitidis X purificado preparado pelo Protocolo 3 foi testado para impurezas como Proteína, Ácido nucleico, Endotoxina e tamanho Molecular. Embora a especificação/orientação de WHO para polissacarídeo de MenX não estava disponível, foi descoberto que o polissacarídeo de N. meningitidis X atende às especificações de WHO já estabelecidas para um fosfodiéster similar contendo polissacarídeo, isto é, N. meningitidis A.

[081]Além disso, comparação com atribuições de 1H, 13C, 31P RMN de polissaca- rídeo de MenX de SIIL com dados de RMN relacionados ao X recentemente publicados (Vaccine 30 ,2012, 5812-5823 & Vaccine 30, 2012, 6409-6415) confirmam a identidade estrutural do polissacarídeo de MenX de SIIL.

[082]Tabela 11: Características de polissacarídeo de MenX purificado

RESULTADOS

[083]Foi descoberto que ambos as bateladas baseados em NMXM-CA NMXM-SP do polissacarídeo de MenX atendem às especificações de WHO estabelecidas para polissacarídeo A de N. meningitidis.

[084]Para meio de NMXM-CA contendo casaminoácidos, no estágio purificado final, a recuperação da etapa de purificação estava entre 60 e 65%, o rendimento de polissacarídeo estava entre 350 e 500 mg/l com carga mínima de impurezas quando a colheita foi realizada quando a OD da cultura alcançou 50% da OD de cultura mais elevada. Enquanto para meio de NMXM-SP contendo peptona de soja, no estágio purificado final, a recuperação da etapa de purificação para polissacarídeo bem como rendimento de polissacarídeo foi comparativamente baixa junto com maior carga de impurezas.

[085]Acima, alto rendimento de polissacarídeo de MenX foi alcançado sem utilizar quaisquer métodos cromatográficos adicionais, demonstrando assim que o protocolo de purificação acima é robusto e econômico.

VII) PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE PROTEÍNA DE POLISSACARÍDEOS X DE MEN IMUNOGÊNICOS, LIOFILIZADOS:

[086]Composições imunogênicas monovalentes ou multivalentes contendo polis- sacarídeo de N. meningitidis X-toxóide de tétano podem estar em uma forma líquida tamponada ou em uma forma liofilizada.

[087]Preferencialmente, o dito conjugado de proteína de polissacarídeo pode ser liofilizado conforme divulgado anteriormente no documento US 2013/0209503, em que a formulação pode ter pelo menos 6 meses de estabilidade a 40°C e teor de po- lissacarídeo livre pode ser menor que 11% em p/p.

[088]O polissacarídeo de MenX da presente invenção pode ser utilizado para preparar composições de conjugado de proteína de polissacarídeo meningocócico imunogênico, multivalente compreendendo sacarídeo capsular dos sorogrupos X e pelo menos um sacarídeo capsular de A, C, W135 e Y conforme discutido anteriormente no documento WO 201314268.

[089]Em vista de muitas modalidades possível às quais os princípios da invenção divulgada podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as modalidades ilustradas são apenas exemplos preferidos da invenção e não devem ser tomados como limi- tantes do escopo da invenção. Em vez disso, o escopo da invenção é definido pelas reivindicações a seguir. Portanto, é reivindicado como invenção tudo o que estiver dentro do escopo e espírito dessas reivindicações.

Claims

1. Método para preparar um polissacarídeo capsular de sorogrupo de Neisseria meningitidis (Neisseria meningitidis X) CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: (a) preparação de um meio nutriente fermentador aquoso compreendendo casaminoácido; (b) inoculação do meio nutriente fermentador com uma bactéria X de Neisseria meningitidis tendo densidade óptica (OD) a 590 nm de 0,8 a 1,2; (c) alimentação exponencial contínua com uma solução de alimentação com uma taxa de adição de alimentação variando entre 10 ml/h/1,5 L e 60 ml/h/1,5 L começando na OD entre 3 e 4; (d) incubação do meio nutriente fermentador inoculado sob condições controladas de pH, temperatura e porcentagem de oxigênio dissolvido; (e) colheita do sacarídeo capsular produzido na etapa (d) quando a densidade óptica (OD) a 590 nm é menor que 60% da OD de cultura mais elevada; (f) purificação do sacarídeo capsular obtido na etapa (e); (g) concentração opcional do polissacarídeo capsular purificado obtido na etapa (f); em que o dito polissacarídeo purificado tem um rendimento de 300 a 550 mg/L, peso molecular médio de 400 a 550 KDa, recuperação da etapa de purificação de 60% a 65% e contém menos de 0,5% de proteínas/peptídeos, menos de 0,5% de ácidos nucleicos e menos de 5 EU/μg de endotoxinas.

2. Processo para a produção de polissacarídeo capsular de Neisseria meningitidis X, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) a dita bactéria que produz polissacarídeo capsular é selecionada das cepas de N. meningitidis X M8210, M9601, M9591, M9592, M9554, M2526, 247X e 5967 (ST 750); (b) o dito meio nutriente fermentador compreende: (i) casaminoácidos em uma quantidade de 5g/L a 20 g/L, 0,14g/L a 0,19 g/L de cloreto de amônio, 10 g/L a 11 g/L de dextrose, 5,8 g/L a 6 g/L de cloreto de sódio, 0,9 g/L a 1 g/L de sulfato de potássio, 3,8 g/L a 4 g/L de fosfato de potássio dibásico, 4,8 g/L a 5 g/L de ácido glutâmico, 0,2g/L a 0,3 g/L de L-arginina, 0,4 g/L a 0,5 g/L de serina, 0,24 g/L a 0,25 g/L de L-cisteína, 0,18 g/L a 0,19 g/L de cloreto de magnésio, 0,02 g/L de cloreto de cálcio e 0,002 g/L de sulfato ferroso de modo que a concentração de componentes do meio pode variar em ± 10% ou (ii) casaminoácidos em uma quantidade de 5g/L a 10 g/L, 0,14 g/L a 0,17 g/L de cloreto de amônio, 10 g/L a 11 g/L de dextrose, 5,8 g/L a 6 g/L de cloreto de sódio, 0,9 g/L a 1 g/L de sulfato de potássio, 3,8 g/L a 4 g/L de fosfato de potássio dibásico, 4,8 g/L a 5 g/L de ácido glutâmico, 0,2 g/L a 0,3 g/L de L-arginina, 0,4 g/L a 0,5 g/L de L-serina, 0,24 g/L a 0,25 g/L de L-cisteína, 0,18 g/L a 0,19 g/L de cloreto de magnésio, 0,02 g/L de cloreto de cálcio e 0,002g/L de sulfato ferroso de modo que a concentração dos componentes do meio pode variar em ± 10%; (c) a dita inoculação do meio nutriente fermentador é por um inóculo de semente que tem uma densidade óptica de 0,8 a 1; (d) a dita alimentação exponencial contínua começa com adição de alimentação inicial em uma taxa de 10 ml/h/1,5 L quando a OD a 590 nm está entre 3 a 4, a qual gradualmente aumenta para 30 ml/h/1,5L até que a OD da cultura seja maior e então mantida a 60 ml/h/1,5 L até que a OD da cultura alcance 50% da maior OD quando a cultura pode ser colhida; (e) a dita solução de alimentação compreende de 72 a 76 g/L de dextrose, 38 g/L a 42 g/L de glutamato de sódio, 2,8 g/L a 3,2 g/L de L-arginina, 2,8 g/L a 3,2 g/L de L-serina, 1,9 g/L a 2,1 g/L de L-cisteína,1,9 g/L a 2 g/L de cloreto de magnésio, 0,13 g/L a 0,15 g/L de cloreto de cálcio e 0,02 g/L de sulfato ferroso de modo que a concentração dos componentes da solução de alimentação possa variar em ±10%; (f) a dita incubação é realizada: (i) em uma temperatura de 36oC a 37oC, em um pH de 7-7,2, a 350 a 500 rpm, com porcentagem de oxigênio dissolvido de 15 % a 25%, fluxo de gás de 1 a 1,5, ar de 0 a 100% e oxigênio de 0 a 100% por 7 a 10 horas, ou (ii) em uma temperatura de 36oC, em um pH de 7,2, a cerca de 400 rpm, porcentagem de oxigênio dissolvido de 25%, fluxo de gás de 1 a 1,5, ar de 0 a 100% e oxigênio de 0 a 100% por 8 a 9 horas; (g) a dita inativação é realizada usando 1% de formaldeído por 1 a 2 h a 37oC seguida pela incubação a 10oC por 30 minutos. (h) a dita colheita é realizada por: (i) centrifugação a 14500 g por 45 minutos para remover todos os resíduos de célula; (ii) submissão do sobrenadante a 0,2μ de filtração seguida por 100KD de diafiltração e concentração com WFI (Água Para Injeção); e (i) o dito processo é realizado em sistema de cultura em batelada alimentada contínua.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (e) compreende: (a) remoção de impurezas de proteína e de endotoxina pela utilização de detergente aniônico em uma concentração de 1 a 1,2% em combinação com agente quelante em uma concentração de 1,5 a 3 mM e álcool em uma concentração de 40% a 50%; (b) adição de acetato de sódio em uma concentração de 4 a 6% para remoção de ácidos nucleicos; (c) adição de um detergente catiônico de 3 a 4% para ligar o polissacarídeo e impurezas; (d) precipitação de polissacarídeo do complexo de polissacarídeo-detergente catiônico pela utilização de cloreto de sódio a 0,05 M na presença de álcool a 96%; (e) remoção de impurezas de proteína e de ácido nucleico pela lavagem do pélete com álcool a 45% na presença de cloreto de sódio em uma concentração de 0,4 M; (f) precipitação seletiva de polissacarídeo pela utilização de álcool a 96%; (g) dissolução de polissacarídeo em WFI e submissão à filtração de fluxo tangencial; e em que o dito processo de purificação não utiliza qualquer cromatografia.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a purificação compreende as seguintes etapas: (a) remoção de impurezas de proteína e de endotoxina pela utilização de desoxicolato em uma concentração de 1% em combinação com ácido etilenodiami- natetra-acético em uma concentração de 2 mM e etanol em uma concentração de 40%; (b) adição de 4 a 6% de acetato de sódio para remoção de ácidos nucleicos; (c) adição de brometo de cetiltrimetilamônio em uma concentração de 3 a 4% para ligar o polissacarídeo e impurezas; (d) precipitação de polissacarídeo a partir do complexo de brometo- polissacarídeo de cetiltrimetilamônio pela utilização de cloreto de sódio em uma concentração de 0,05 M na presença de etanol a 96%; (e) remoção de impurezas de proteína e de ácido nucleico pela lavagem de pélete com etanol em uma concentração de 45% na presença de cloreto de sódio em uma concentração de 0,4 M; (f) precipitação seletiva de polissacarídeo pela utilização de etanol a 96%; (g) dissolução de polissacarídeo em WFI e submissão à filtração de fluxo tangencial; e em que o dito processo de purificação não utiliza qualquer cromatografia.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende a etapa (h) em que polissacarídeo de N. meningitidis X purificado é dimensionado a um tamanho médio entre 100 e 150 Kda pelo uso do sistema de interrupção de célula de alta pressão.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende a etapa (i) em que o dito polissacarídeo de tamanho reduzido é conjugado a uma proteína carreadora para dar um conjugado de proteína- sacarídeo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito sacarídeo de N. meningitidis X é conjugado a uma proteína carreadora selecionada do grupo consistindo em TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, proteína D, OMPC e pneumolisina.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito sacarídeo de N. meningitidis X é conjugado à proteína carreadora através de um ligante hetero- ou homo-bifuncional com produto químico de conjugação de cianilação.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito reagente de cianilação é selecionado a partir de um grupo de tetrafluoro- borato de l-ciano-4-pirrolidinopiridínio (CPPT), 1-ciano-imidazol (1-CI), 1- cianobenzotriazol (1-CBT), ou 2-cianopiridazina-3(2H)ona (2-CPO).