RU2161037C2 - Низкотоксичный, низкопирогенный липоолигосахарид из neisseria meningitidis - Google Patents
Низкотоксичный, низкопирогенный липоолигосахарид из neisseria meningitidis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2161037C2 RU2161037C2 RU98123924A RU98123924A RU2161037C2 RU 2161037 C2 RU2161037 C2 RU 2161037C2 RU 98123924 A RU98123924 A RU 98123924A RU 98123924 A RU98123924 A RU 98123924A RU 2161037 C2 RU2161037 C2 RU 2161037C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- low
- pyrogenic
- product
- pyrogenicity
- serogroup
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Сущность изобретения состоит в следующем. Липоолигосахарид (ЛОС), выделенный из Neisseria meningitidis серогруппы В, штамм N 125, обладает повышенной безопасностью применения при введении в организм лабораторных животных: низкой пирогенностью (пороговая пирогенная доза - 0,0125 мкг/кг) и низкой острой токсичностью (ЛД50 = 200 мг/кг). Улучшенный профиль безопасности препарата ЛОС не влияет на его высокую иммуногенность и позволяет использовать его для индукции системного гуморального иммунного ответа как при парентеральном, так и пероральном введении в расширенном диапазоне доз. Технический результат изобретения состоит в расширении арсенала средств регулирования системного гуморального иммунитета. 2 ил., 4 табл.
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности инфекционной иммунологии, а именно описывает соматический антиген - липоолигосахарид (ЛОС) менингококка группы B с улучшенными иммунобиологическими характеристиками, а именно пониженной пирогенностью и токсичностью, может быть использован как основа для создания противоменингококковой вакцины.
ЛОС является весьма важным поверхностным антигеном менингококка группы B, обладающим выраженными протективными свойствами. Однако серьезным препятствием на пути использования этого антигена в качестве вакцинного компонента является его высокая токсичность и пирогенность. Поэтому если ЛОС и обнаруживается в составе вакцин против менингита группы B, то в весьма незначительных количествах либо в условиях, резко снижающих его токсичность (липосомы, детоксифицирующие пептиды).
В доступной нам литературе и материалах не обнаружены описания ЛОС с низкой пирогенностью и токсичностью, выделенного из какого-либо штамма N. meningitidis. Попытки снизить уровень токсичности ЛОС путем его введения в липосомы или с использованием детоксифицирующих пептидов направлены на функциональную детоксификацию ЛОС. Такие модификации не могут рассматриваться в качестве прямых аналогов данного изобретения, так как они предлагают использование специфических приемов (веществ) для "маскировки" пирогенности и токсичности
ЛОС N.meningitidis серогруппы B, штамм N125 получают в результате выращивания микробной культуры в условиях управляемого культивирования в жидкой синтетической питательной среде, дополнительно содержащей L-глутамат и L-цистеин при pH 7,6-7,7; полученную культуральную жидкость концентрируют ультрафильтрацией и проводят дополнительную очистку трехкратным ультрацентрифугированием.
ЛОС N.meningitidis серогруппы B, штамм N125 получают в результате выращивания микробной культуры в условиях управляемого культивирования в жидкой синтетической питательной среде, дополнительно содержащей L-глутамат и L-цистеин при pH 7,6-7,7; полученную культуральную жидкость концентрируют ультрафильтрацией и проводят дополнительную очистку трехкратным ультрацентрифугированием.
Технической задачей настоящего изобретения является повышение безопасности использования ЛОС путем разработки препарата, обладающего улучшенными токсикологическими характеристиками.
Полученный препарат ЛОС из N.meningitidis группы B обладает в 20 раз более низкой пирогенностью и в 5-6 раз более низкой острой токсичностью по сравнению с препаратом традиционного липополисахарида (ЛПС), полученного по методу Westphal из брюшно-тифозной бактерии.
Порог пирогенности препарата 0,0125 мкг/кг веса кролика приближается к таковому, установленному ВОЗ для менингококковых и тифозных вакцин на основе соответствующих капсульных полисахаридов - 0,025 мкг/кг веса кролика. Таким образом, по своей пирогенности ЛОС близок к другому компоненту, широко используемому в менингококковых вакцинах - капсульному полисахариду. Исследования, проведенные в Центре лекарств и биологических препаратов (США), позволяют оценивать порог пирогенности для препаратов ЛОС групп A и C на значительно более низком уровне - 0,025-0,25 нг/кг веса кролика
ЛД50 ЛОС - 200 мг/кг веса позволяет его оценить как умеренно токсичный препарат.
ЛД50 ЛОС - 200 мг/кг веса позволяет его оценить как умеренно токсичный препарат.
Проверка предложенного ЛОС на его соответствие критерию "изобретательский уровень" показала, что ни в научной, ни в патентной литературе не выявлено бактериальных источников, которые содержали бы липоолигосахаридный антиген с таким низким уровнем токсичности.
Ниже приводятся примеры, характеризующие химические и иммунобиологические характеристики ЛОС N.meningitidis серогруппы B.
Пример 1 Химическая идентификация ЛОС.
В полученных образцах B-ЛОС определяли содержание примесей:
-белок - по методу Lowry
-капсульный полисахарид группы B - с помощью резорцинового реагента (на сиаловые кислоты),
-нуклеиновые кислоты - по методу Спирина.
-белок - по методу Lowry
-капсульный полисахарид группы B - с помощью резорцинового реагента (на сиаловые кислоты),
-нуклеиновые кислоты - по методу Спирина.
Полученные образцы ЛОС N.meningitidis серогруппы B содержали менее 3% примесей.
Структурные характеристики ЛОС (моносахаридный состав и фосфорсодержащие заместители липида A) изучали методами газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса на ядрах 31P(31P-ЯМР).
ГЖХ ацетатов полиолов моносахаридов проводили на хроматографе Hewlett-Packard 5890 с капиллярной колонкой Ultra U (25 м) в градиенте температуры от 150oC до 290 C со скоростью изменения 10oC/мин. Спектры 31P-ЯМР записывали на приборе Bruker Physics AM-250. В качестве внешнего стандарта использовали 85% фосфорную кислоту ( σ 0 ppm).
Анализ моносахаридного состава ЛОС показал, что все изучаемые образцы препарата содержат гептозу, галактозу, глюкозу и глюкозамин, что соответствует данным, описанным в литературе.
Анализ 31P-спектров ЯМР подтверждает содержание в препарате ЛОС N.meningitidis серогруппы B, штамм 125 полностью достроенного липида A, несущего β- (2-аминоэтил) пирофосфатные заместители при C-1 и C-4'.
Из данных SDS-гель-электрофореза в полиакриламидном геле последующим окрашиванием аммиачным раствором азотнокислого серебра следовало, ЛОС представляет собой довольно гомогенное соединение с молекулярной массой 3,5- 4.0 КД, что типично для менингококковых ЛОС (фиг 1.)
Таким образом, данные определения моносахаридного состава, анализа спектров 31P-ЯМР и картины гель-электрофореза полученного препарата позволили однозначно идентифицировать препарат как высокоочищенный ЛОС N.meningitidis группы B.
Таким образом, данные определения моносахаридного состава, анализа спектров 31P-ЯМР и картины гель-электрофореза полученного препарата позволили однозначно идентифицировать препарат как высокоочищенный ЛОС N.meningitidis группы B.
Пример 2 Пирогенность
Пирогенность препарата ЛОС N.meningitidis серогруппы B, штамм 125 определяли в сравнении с образцами традиционного ЛПС Salmonella typhi, а также коммерческими полисахаридными вакцинами ВИАНВАК и Тифим-Ви.
Пирогенность препарата ЛОС N.meningitidis серогруппы B, штамм 125 определяли в сравнении с образцами традиционного ЛПС Salmonella typhi, а также коммерческими полисахаридными вакцинами ВИАНВАК и Тифим-Ви.
Пирогенный тест ставился на кроликах в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XII изд. и Европейской Фармакопеи, результаты представлены в табл 1.
Данные, представленные в табл. 1, подтверждают низкую пирогенность препарата ЛОС - пороговая апирогенная доза - 0,0125 μg/кг веса кролика.
Такой ЛОС по своей пирогенности близок к коммерческим полисахаридным вакцинам ВИАНВАК и Тифим-Ви и существенно отличается по этой характеристике от классического ЛПС из брюшно-тифозной бактерии.
Пример 3 Острая токсичность
Определение острой токсичности препаратов проводили на мышах (СВА х C57BL/6)F1, самках весом 18-20 г. Препараты вводили внутривенно или внутрибрюшинно. Учет гибели животных вели в течение одной недели. Расчет ЛД50 проводили традиционным методом по формуле Korber (8). ЛД50 для препарата ЛОС N. meningitidis группы B существенно выше, чем для ЛПС S.typhi (см. табл. 2).
Определение острой токсичности препаратов проводили на мышах (СВА х C57BL/6)F1, самках весом 18-20 г. Препараты вводили внутривенно или внутрибрюшинно. Учет гибели животных вели в течение одной недели. Расчет ЛД50 проводили традиционным методом по формуле Korber (8). ЛД50 для препарата ЛОС N. meningitidis группы B существенно выше, чем для ЛПС S.typhi (см. табл. 2).
Пример 4 Иммуногенность
Мышей (СВА х C57/BL/6)F1 самок весом 18-20 г иммунизировали препаратом ЛОС внутрибрюшинно в дозах 0,1; 1; 5; 25; 125; 250 μg. Ни одно из иммунизированных животных не погибло при иммунизации ЛОС в диапазоне доз 25-250 мкг, то есть в зоне пирогенности ЛОС.
Мышей (СВА х C57/BL/6)F1 самок весом 18-20 г иммунизировали препаратом ЛОС внутрибрюшинно в дозах 0,1; 1; 5; 25; 125; 250 μg. Ни одно из иммунизированных животных не погибло при иммунизации ЛОС в диапазоне доз 25-250 мкг, то есть в зоне пирогенности ЛОС.
Титр ЛОС- специфических IgG антител определяли на 34 сутки, используя прямой иммуноферментный анализ (ИФА). Для математической обработки кривых титрования использовали компьютерную программу. Высокий титр антиЛОС антител определяется в широком диапазоне доз 5-25 мкг (фиг.2).
Четкое нарастание средних значений оптической плотности в ИФА - тесте при детекции антиЛОС антител (разведение сыворотки 1:1000; длина волны 492 нм) также свидетельствуют об индукции препаратом ЛОС выраженного иммунного ответа по IgG - типу (табл. 3).
Определение существенных количеств специфических антител на 34 сутки иммунного ответа служит доказательством активации иммунологической памяти и запуска долгоживущего иммунного ответа.
Пример 5 Иммуногенность при пероральном введении.
Мышей (СВА х C57/BL/6)F1 (самки весом 18-20 г) иммунизировали перорально препаратом ЛОС в дозах 1, 5, 25, 50, 125, 250 мкг. Специфические антиЛОС антитела определяли в периферической крови с помощью ИФА.
У мышей, иммунизированных дозой 25 мкг перорально, отмечается статистически достоверное повышение титра антител на 15 сутки первичного ответа (табл. 4). Эффект индукции системного IgG-антиЛОС ответа отмечен также при пероральной иммунизации ЛОС в дозах 50, 125, 250 мкг.
Представленное изобретение позволит расширить арсенал средств, обладающих противоменингококковой активностью. Улучшенный профиль безопасности препарата ЛОС не влияет на его высокую иммуногенность и позволяет использовать его для индукции системного гуморального иммунного ответа как при парентеральном, так и пероральном введении в расширенном диапазоне доз.
Claims (1)
- Низкопирогенный низкотоксичный липоолигосахарид Neisseria meningitidis серогруппы В N125, обладающий иммуногенными свойствами, характеризующийся следующими признаками: выделен из штамма указанной серогруппы бактерий, селекционированного в НИИВС им.И.И.Мечникова и депонированного в ГНИИС и КМБП им. Л. А.Тарасевича, локализован в наружной клеточной мембране, извлечен методом Westphal путем экстракции целевого продукта водным раствором фенола, имеет следующее количество примесей в расчете на сухую массу продукта, %:
Белок - Менее 1
Нуклеиновые кислоты - Менее 2
Сиаловые кислоты - Не выявлены
мол. м. продукта составляет 3,8 кД, продукт обладает низкой токсичностью (ЛД 50 = 200 мг/кг) и низкой пирогенностью (пороговая пирогенная доза = 0,0125 мкг/кг).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU98123924A RU2161037C2 (ru) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | Низкотоксичный, низкопирогенный липоолигосахарид из neisseria meningitidis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU98123924A RU2161037C2 (ru) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | Низкотоксичный, низкопирогенный липоолигосахарид из neisseria meningitidis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98123924A RU98123924A (ru) | 2000-09-27 |
RU2161037C2 true RU2161037C2 (ru) | 2000-12-27 |
Family
ID=20214148
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98123924A RU2161037C2 (ru) | 1998-12-24 | 1998-12-24 | Низкотоксичный, низкопирогенный липоолигосахарид из neisseria meningitidis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2161037C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2627156C2 (ru) * | 2012-11-21 | 2017-08-03 | Серум Инститьют Оф Индия Прайват Лтд. | Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция |
-
1998
- 1998-12-24 RU RU98123924A patent/RU2161037C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TSdI C.M. at al. Heterogeneity and variation among Neisseria meningitidis lipopolysaccharides. J.Bacteriol. 1983. V.155, p.498-504. 2068270 C1, 27.10.1996. 2077574 C1, 20.04.1997. 2083661 C1, 10.07.1997. 2089215 C1, 10.09.1997. 2105568 C1, 27.02.1998. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2627156C2 (ru) * | 2012-11-21 | 2017-08-03 | Серум Инститьют Оф Индия Прайват Лтд. | Высокоэффективный способ получения бактериального полисахарида, получение конъюгата на его основе и иммуногенная композиция |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Anderson et al. | Immunization of humans with polyribophosphate, the capsular antigen of Hemophilus influenzae, type b | |
US4711779A (en) | Glycoproteinic conjugates having trivalent immunogenic activity | |
Wyle et al. | Immunologic response of man to group B meningococcal polysaccharide vaccines | |
Avery et al. | Chemoimmunological studies on the soluble specific substance of pneumococcus: I. The isolation and properties of the acetyl polysaccharide of pneumococcus type I | |
CN100556459C (zh) | 多价脑膜炎球菌多糖-蛋白质缀合疫苗 | |
AU661071B2 (en) | Oligoside derived from an antigen polyoside obtained from a pathogenic agent | |
US7491517B2 (en) | Method of producing meningococcal meningitis vaccine for Neisseria meningitidis serotypes A,C,Y, and W-135 | |
JP2020533442A (ja) | 肺炎球菌多糖体および免疫原性多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートでのその使用 | |
BR112020004509A2 (pt) | polissacarídeos pneumocócicos e uso dos mesmos em conjugados imunogênicos polissacarídeo-proteína carreadora | |
CN1709505B (zh) | 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗 | |
JPH0347253B2 (ru) | ||
BRPI0710918B1 (pt) | formulação que estabiliza um conjugado de polissacarídeo-proteína | |
US5807553A (en) | Immonogenic oligosaccharide compositions | |
Kersten et al. | Incorporation of the major outer membrane protein of Neisseria gonorrhoeae in saponin-lipid complexes (iscoms): chemical analysis, some structural features, and comparison of their immunogenicity with three other antigen delivery systems | |
Springer et al. | Cross reactive human blood-group H (O) specific polysaccharide from Sassafras albidum and characterization of its hapten | |
EP1124576B1 (en) | Method for preparing solid phase conjugate vaccines | |
CN110214022A (zh) | 免疫原性缀合物及其用途 | |
JPH0545570B2 (ru) | ||
US20070031447A1 (en) | Method of isolating biologically active fraction containing clinically acceptable native S-lipopolysaccharides obtained from bacteria producing endotoxic lipopolysaccharides | |
RU2161037C2 (ru) | Низкотоксичный, низкопирогенный липоолигосахарид из neisseria meningitidis | |
ES2686875T3 (es) | Exopolisacárido de la bacteria Shigella sonnei, método para producirlo, vacuna y composición farmacéutica que lo contienen | |
CN107184972B (zh) | 一种结核杆菌OS-tb寡糖缀合物及其制备方法与应用 | |
Bolaños et al. | Isolation and characterization of the K1 (L) antigen of Escherichia coli | |
CN1376158A (zh) | 核糖-核糖醇-磷酸之寡糖衍生物及含有它们的疫苗 | |
CN113663065B (zh) | 一种肌醇甘露寡糖缀合物、制备方法及作为抗结核糖疫苗的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131225 |