KR102118071B1

KR102118071B1 - 박테리아 다당류를 고수율로 제조하는 방법

Info

Publication number: KR102118071B1
Application number: KR1020157016228A
Authority: KR
Inventors: 피살 삼브하지 샨카르; 칠루쿠리 스리니바스 레디; 페디레디 스리니바스 레디
Original assignee: 세럼 인스티튜트 오브 인디아 프라이비트 리미티드
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2020-06-02
Also published as: SG11201503947YA; AU2013349261A1; EP2922569A4; AU2013349261B2; RU2627156C2; RU2015123024A; KR20150087355A; CN104936615A; BR112015011722B1; US9580734B2; US20150299750A1; CA2892035A1; PH12015501138A1; BR112015011722A2; EP2922569B1; WO2014080423A2; CN104936615B; MX364644B; CA2892035C; PH12015501138B1

Abstract

본 발명은 수막구균의 단백질을 제조하기 위한 개선된 배양, 발효 및 정제 조건을 제공한다. 본 발명은 특히 수막구균 X 다당류를 고수율로 수득하기 위한, 새로운 발효 배지, 최적 공급 용액 투입 전략 및 크로마토그래피 방법이 생략된 개선된 정제 공정에 관한 것이다.

Description

박테리아 다당류를 고수율로 제조하는 방법 {PRODUCTION OF HIGH YIELDS OF BACTERIAL POLYSACCHARIDES}

본 발명은 수막구균 (Neisseria meningitidis) 백신에 관한 것이다.

수막구균은 유행성 박테리아 수막염의 원인균이다. 수막구균의 주요 병독성 결정인자는 캡슐 다당류이다. 캡슐 다당류의 구조를 기초로 분류된 수막구균 혈청형 13종 중에서도, 혈청형 A, B, C, Y 및 W135가 대부분의 수막구균성 질환 사례들과 연관되어 있다. 아프리카의 수막염 벨트에서, 대부분의 대유행은 혈청형 A의 수막구균에 의해 유발되어 왔지만, 개발도상국에서의 산발적인 발병과 유행은 통상적으로 혈청형 B와 C의 수막구균에 의해 유발된다. 혈청형 Y의 수막구균은 1990년대 후반 미국에서 발생한 산발적인 발병과 유행의 주요 요인으로 등장하였으며, 2000년에는 혈청형 W135의 수막구균이 하지 순례와 관련하여 전세계적인 발병과 사하라 사막 이남 아프리카에서 대규모의 유행을 유발하였다.

혈청형 X의 수막구균 (Men X)은 예전에는 산발적인 유형의 수막염 사례에서는 드문 원인균이었지만, 최근 들어 수막구균성 질환의 발병 증가와 관련있으며, 아프리카의 "수막염 벨트"에서의 대규모 발병의 원인으로 드러났다. 발병은 니제르, 부르키나파소, 토고 및 가나에서 보고되었으며, 규모에 차이가 있었다. 2010년 수막염 시즌에는, 부르키나파소에서 6500건 이상의 수막염 사례들이 보고되었으며, 이중 적어도 1000건이 Men X가 원인인 것으로 추정되었고, 100,000명 당 120건의 발병률이 국지적으로 보고되었다. 이보다 앞서, 2007년 케냐와 우간다 국경에서 82건 이상의 박테리아성 수막염 발병 사례에서 몇몇 환자들에서 Men X 질환이 확증되었다.

혈청형 B, C, Y 및 W135 수막구균들의 캡슐 다당류는 시알산 유도체들로 구성되어 있다. 혈청형 B와 C의 수막구균은 (α 2-8) 및 (α 2-9)-연결된 폴리시알산을 각각 발현하는 반면, 혈청형 Y 및 W135 N 수막구균은 D-글루코스 또는 D-갈락토스와 시알산이 교대로 나열된 서열을 발현한다. 이와는 대조적으로, 혈청형 A 수막구균의 캡슐은 (α 1-6)-연결된 N-아세틸만노사민 6-포스페이트로 구성되어 있으며, 수막구균 혈청형 X는 (α 1-4)-연결된 N-아세틸글루코사민 1-포스페이트로 된 캡슐 폴리머를 합성한다.

과거 5년간 아프리카 수막염 벨트 지역에서의 Men X 질환의 발병률 증가는 향후 유행을 예방하고 방제하기 위해 선정된 지역에서 Men X 백신의 개발 및 도입의 필요성을 제기한다. 수막구균의 캡슐 다당류에 담체 단백질을 접합하여, 효능이 높은 1가 (A 또는 C) 다당류 접합 백신을 개발하게 되었으며, 임상 실험의 면역원성 데이타는 혈청형 A, C, Y 및 W135를 포괄하는 4가 접합 백신의 광범위한 사용이 마찬가지로 효과적일 수 있다는 것을 보여준다. 또한, 이와 유사한 접근 방법은 Men X에서도 효과적일 수 있다. Ouli Xiea et al "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012를 참조한다.

군스타인 노르헤임 (Gunnstein Norheim)은, 현재 혈청형 X에 대한 백신은 없으며, 차세대의 알맞은 백신은 유행성이 가장 큰 혈청형 A, W-135, X를 표적으로 하여야 한다고 언급하였다. "Preventing the emerging serogroup X meningococcal disease in the African Meningitis Belt" Oxford Vaccine Group, 2011을 참조한다.

혈청형 X 수막구균에 대한 백신의 부재는 과거 수년간 이 혈청형의 수막구균으로 인한 유행과 관련된 문제의 원인이다. 2011년 11월의 "Meningococcal vaccines: WHO position paper"를 참조한다.

Men X 다당류 기반의 접합 백신의 개발을 촉진하기 위해서는, 구조적으로 온전한 MenX 다당류가 고수율로 확보되어야 한다.

수막구균 다당류를 대량 생산하기 위한 몇가지 합성 배지들이 개발되었다 (Frantz, I. D. Jr. Growth Requirements of the Meningococcus. J. Bact., 43: 757-761, 1942; Catlin, B. W. Nutritional profiles of Neisseria lactamica, gonorrhoeae and meningitidis, in chemically defined media. J. Inf. Dis., 128(2): 178-194, 1973; Watson-Scherp Medium: Watson R G, et al. The specific hapten of group C (group IIa) meningococcus, II. Chemical nature. J Immunol 1958; 81:337-44; Marcelo Fossa da Paz; Juulia Baruque-Ramos; Haroldo Hiss; Marcio Alberto Vicentin; Maria Betania Batista Leal; Isaias Raw. Polysaccharide production in batch process of Neisseria meningitidis serogroup C comparing Frantz, modified Frantz and Catlin 6 cultivation media, Braz. J. Microbiol. vol. 34., no. 1. Sao Paulo January/April 2003).

미국 특허 5,494,808은, 수막구균 (혈청형 B 11)을 배양하기 위한 대규모의 세포-고 밀도 (건조 세포 중량 5 g/L, 600 nm에서의 광학 밀도 10-13) 발효 공정을 발표하였다. 이 특허에는 OMPC ("외막 단백질 복합체")를 분리하기 위한 수막구균 배양용 배지 ("MC.6")가 개시되어 있다.

US 7399615에는, NH₄Cl이 생략된 발효 조성물과, 염화암모늄 (질소원)을 소이 펩톤 (HSP-A; Nutricepts, Inc; Minneapolis, Minn.)으로 대체한 발효 조성물에서 나이세리아 (Neisseria) 균 (혈청형 A, C, Y & W135)의 발효를 개선시키는 방법이 개시되어 있다. 발효 배지와 공급 용액에 HSP-A가 함유된 유가배양식 발효 (2L) 결과는 평균 OD 최대치 14-20에서 Men A 다당류 수율이 약 1300 - 1400 mg/L이었다.

US 7491517에는, D1 (탈이온) 수, NaCl, K₂SO₄, KCl, 트리소듐 사이트레이트.2H₂O, MgSO₄.7H₂O, MnSO₄.H₂O, MnCl₂.6H₂O, 비타민 B12, NAD (니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드), 티아민 HCl, 소이 펩톤, D-글루코스, L-글루탐산, L-아르기닌, L-세린, L-시스테인, 글리신, 모르폴린프로판설폰산 [MOPS], pH 6.5 - 7.0를 유지하기 위한 CaCO₃ 및 혈청형 W-135의 경우 NH₄Cl을 포함하는, 수막구균 (혈청형 A, C, Y & W135)의 캡슐 다당류를 생산하기 위한, NMFM (Neisseria meningitidis fastidious culture medium)이 개시되어 있다. 이 특허에서 발효 수율은 평균 최대 OD 10에서 약 30-40 mg/L이다.

데이비드 번들 등은, 균주를 18시간 동안 화학적으로 규정된 배지 (NCDM)에서 배양함으로써, 수막구균 균주 247 X (Laboratory Center for Disease Control)로부터 Men X 다당류를 제조 및 분리하는 방법을 개시하였다. 이러한 발효에 따른 Men X 다당류의 수율은 약 20 mg/L이다. "Studies on the Group-specific Polysaccharide of Neisseria meningitidis Serogroup X and an improved Procedure for its isolation" JBC, 1974를 참조한다.

울리 지아 등은 균주 BF7/07과 BF12/03로부터 MenX PS를 제조하는 방법을 개시하였다. 간략하게는, Men X 균주를 레빈탈 첨가물이 첨가된 브레인 파트 인푸젼 아가 플레이트 (Brain Heart Infusion agar plate)에서 배양한 다음, 프란츠 배지 0.2 L에서 예비-배양 단계를 거친 후, 균주를 각각 변형된 프란츠 액체 배지 1.0 또는 1.5 L가 들어 있는 배플형의 2.8L 교반 플라스크 4개에서 배양한다. 16시간 배양한 후, 포름알데하이드를 최종 농도 1% (v/v)로 첨가하여, 액체 배양물을 불활화한다. 배양 배지 1 L 당 MenX PS의 수율은 BF 7/07 분리주 (4.5 mg/L)가 BF12/03 분리주 (3.8 mg/L) 보다 약간 높은 것으로 나타났다. "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012를 참조한다.

현재까지는 혈청형 Men A, C, Y & W135의 다당류와 관련한 구조 및 수율 개선 연구들이 이루어졌다. 그러나, 아직까지 Men X 플레인 다당류와 Men X 다당류 단백질 접합 백신 개발을 위해 선행되어야 하는, Men X 다당류의 고 수율 생산 방법에 대한 필요성이 여전히 해결되지 않은 채 남아있다.

본 발명자들은, Men A, C, Y, W135 발효에 적합한 pH 고정기 (pH stat), 스파이킹 (spiking) 및 정률 (constant rate)에 기초한 종래의 공급 전략들이, Men X의 경우, i) 증식은 충분하지만 다당류 수율이 낮고, ii) 증식이 제한적이며, 다당류 수율이 낮고, iii) 증식은 충분하지만 조기 쇠퇴기가 형성되는 문제가 있다는 것을 인지하게 되었다. 나아가, 종래 방법들은 단백질 불순물의 함유율 증가로 인해 다당류의 수율 저하가 나타나는, 소이 펩톤 & 효모 추출물을 공급 배지로 사용하고 있다.

본 발명의 과제는 수율이 높고 불순물이 최소화된 수막구균 X 다당류를 제조하기 위한 개선된 배양, 발효 및 정제 조건들을 제공하는 것이다. 이러한 개선으로, Men X 다당류 단백질 접합 백신의 제조 방법은 경제적일 수 있으며, 백신을 저렴한 비용으로 개발도상국의 어린이들이 이용가능하게 할 수 있다.

본 발명은, a) 카사미노산 (casamino acid)을 다른 성분과 함께 포함하는 발효 배지; b) 쇠퇴기를 지연시킬 수 있는 새로운 지속적인 지수적 공급 전략 (continuous exponential feeding strategy)과 공급 배지 조성물; c) 최적의 발효기 조건; 및 d) 크로마토그래피 방법이 생략된 개선된 정제 공정을 이용함으로써, 고수율 및 고순도로 Men X 다당류를 제조할 수 있다는, 놀라운 발견 사실을 토대로 한다.

도 1: 소이 펩톤 함유 배지 대비 카사미노산 함유 배지에서의 "수막구균 X 8210"의 증식 프로파일.
도 2: Men X의 ¹³C NMR 스펙트럼
도 3: Men X의 ³¹P NMR 스펙트럼
도 4: Men X의 ¹H NMR 스펙트럼

본 발명은, 제1 측면에서, 바람직하게는, 소이 펩톤 또는 효모 추출물 대신 질소원으로서 카사미노산을 함유한 발효 배지를 이용함으로써, i) 새로운 지속적인 지수적 공급 전략의 사용에 따른 쇠퇴기 지연으로 인한 다당류 수율의 현저한 증가, ii) 발효기 수확 100KDa 단계 자체에서의 단백질 및 핵산 불순물의 농도 50% 감소 및 그로 인한 후속적인 정제 공정에 의한 잔류 불순물의 용이한 제거 확보, 및 iii) 카사미노산을 함유한 발효 배지의 규모 증대 용이성 및 경제성과 같은 이점을 제공해준다.

본 발명의 제2 구현예에서, 수막구균 X 유래 캡슐 다당류 생산용 수막구균 발효 배지는 덱스트로스 9 - 10 g/L, 염화나트륨 5.5 - 6 g/L, 황산 칼륨 0.8 - 1 g/L, 제2인산칼륨 3.5 - 4 g/L, 염화암모늄 0.14 - 0.19 g/L, 글루탐산 4.5 - 5.5 g/L, L-아르기닌 0.2 - 0.4 g/L, L-세린 0.4 - 0.6 g/L, L-시스테인 0.24 - 0.26 g/L, 염화마그네슘 0.18 - 0.20 g/L, 염화칼슘 0.02 g/L, 황산 제1철 0.002 g/L 및 카스미노산 5 - 20 g/L을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 수막구균 X 유래 캡슐 다당류 생산용 수막구균 발효 배지는 덱스트로스 10 g/L, 염화나트륨 5.8 - 6 g/L, 황산 칼륨 0.9 - 1 g/L, 제2인산칼륨 3.9 - 4 g/L, 염화암모늄 0.14 - 0.17 g/L, 글루탐산 4.8 - 5 g/L, L-아르기닌 0.2 - 0.3 g/L, L-세린 0.4 - 0.5 g/L, L-시스테인 0.24 - 0.25 g/L, 염화마그네슘 0.18 - 0.19 g/L, 염화칼슘 0.02 g/L, 황산 제1철 0.002 g/L 및 카스미노산 5 - 10 g/L을 포함할 수 있다.

본 발명의 주요 측면에서, 본 발명자들은, 세포를 장기간 정체기로 유지시킴으로써, 수막구균의 X 다당류의 수율을 높일 수 있는, 즉 초기 공급원 투입은 590 nm에서의 OD가 3-4일 때 10ml/hr/1.5 L 속도로 시작하여, 배양물의 OD가 최대가 될 때까지 점차적으로 30ml/hr/1.5L로 높인 다음, 배양물의 OD가 OD 최대치의 50%가 될 때까지 60ml/hr/1.5 L로 유지한 다음 배양물을 수확할 수 있는, 유용한 지속적인 지수적 공급 전략을 놀랍게도 발견하게 되었다.

또한, 본 발명의 발명자들은, 방출된 세포 대사산물의 축적으로 인한 pH 하락을 방지하기 위해, 발효 중에, pH를 설정치로 유지하는 것과 케스케이드로 NaOH를 0.25 N - 0.5 N 농도로, 그리고 오르소인산을 5 - 10%의 농도로, 정량 펌프 (dosing pump)에 의해 연속적으로 공급할 수 있으며, 이때 탄산나트륨 (20%)과 NaOH (0.5 N)의 비율이 1:3으로 유지된다는 것을 알게 되었다.

본 발명의 중요한 일 측면에서, 수막구균 X 균주 8210은 5시간째부터 9시간째까지 지수 증식기, 9시간째부터 12시간째까지 정체기 및 12시간째부터 19시간째까지 쇠퇴기를 가진다는 것을 확인하게 되었다.

본 발명에서 발효는 회분식 (batch) 또는 유가배양식 (fed batch)으로, 바람직하게는 연속 유가배양 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 공급 용액은 덱스트로스 72 - 76 g/L, 글루타민산 나트륨 38 - 42 g/L, L-아르기닌 2.8 - 3.2 g/L, L-세린 2.8 - 3.2 g/L, L-시스테인 1.9 - 2.1 g/L, 염화마그네슘 1.9 - 2.1 g/L, 염화칼슘 0.13 - 0.15 g/L 및 황산 제1철 0.02 g/L로 구성될 수 있다.

제3 구현예에서, 본 발명은, 590 nm에서의 광학 밀도가 8 - 15, 바람직하게는 8 - 11일 수 있는, 100 KDa 발효기 수확 단계에서, Men X 캡슐 다당류 수율 600 mg/L - 800 mg/L를 제공한다.

본 발명의 제3 구현예에서, 수막구균 X의 발효는, i) pH 7 - 약 7.2, ii) 온도 36 - 37℃의 설정값과, i) 용존 산소 15 - 25%, ii) 교반 속도 350 - 500 rpm, iii) 기체 흐름 1 - 1.5, iv) 공기 0 - 100% 및 v) 산소 0 - 100%의 연쇄적인 수치 (cascading value)에서 수행될 수 있다.

본 발명의 제4 구현예에서, 100 KDa 정용여과 (diafiltration) 수확물은 하기 단계를 포함하는 정제 단계들을 추가로 거칠 수 있으며:

(a) 데옥시콜레이트 1%를 에틸렌다이아민테트라아세트산 2mM 및 에탄올 40%와 조합 사용하여, 단백질과 내독소 불순물을 제거하는 단계;

(b) 핵산을 제거하기 위해 초산나트륨을 4 - 6%로 첨가하는 단계;

(c) 다당류 및 불순물과의 결합을 위해 세틸트리메틸암모늄 브로마이드를 3 - 4%의 농도로 첨가하는 단계;

(d) 96% 무수 에탄올의 존재 하에 염화나트륨을 0.05 M 농도로 사용하여, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드-다당류 복합체로부터 다당류를 석출시키는 단계;

(e) 펠릿을 0.4 M 농도의 염화나트륨의 존재 하에 45% 농도의 에탄올로 세척하여, 단백질과 핵산 불순물들을 제거하는 단계;

(f) 96% 무수 에탄올을 사용하여 다당류를 선택적으로 석출시키는 단계;

(g) 다당류를 WFI에 용해하여, TFF (tangential flow filtration)를 수행하는 단계,

상기 정제 공정은 임의의 크로마토그래피를 사용하지 않으며, 상기 정제된 다당류는 300 - 500 mg/L의 수율을 나타내며, 평균 분자량이 400 - 550 KDa이고, 단백질/펩타이드를 0.5% 미만으로, 핵산을 0.5% 미만으로, 내독소를 5 EU/㎍ 미만으로 포함하며, 정제 단계의 회수율은 60 - 65%이다.

제4 구현예에 대한 다른 측면으로, 수막구균 X 다당류의 정제 공정은, 약 다당류 회수율이 60 - 70%이고 임의의 추가적인 크로마토그래피 단계가 필요하지 않기 때문에, 견고하며, 비용-효율적이다.

본 발명의 제5 측면에서, 상기 공정은 수막구균 혈청형 X, A, B, C D, Y, Z, 29E 및 W-135, 바람직하게는 M9601, M9592, M9591,247X, M9554, M8210 및 M2526으로부터 선택되는 수막구균 혈청형 X 균주, 5967 균주 (ST 750), 가장 바람직하게는 "M8210"에 적용가능할 수 있다.

본 발명의 제6 구현예에서, 본 발명의 수막구균 X 다당류는, i) 다당류 X를 기계적으로 크기 조절하여, 150 - 200 KDa 크기의 단편을 수득하고, ii) 적합한 크기의 당류에 화학적인 시아닐화 접합법을 이용하여 링커를 통해 담체 단백질에 접합시키고, iii) 최종 접합체에서 당류/단백질의 비율이 0.2 - 0.6일 수 있는, WO 201314268에 기술된 방법으로 다당류 단백질 접합 조성물을 제조하는데 이용할 수 있다.

제6 구현예에 대한 일 측면에서, 본 발명의 수막구균 X 다당류는 또한 종래에 WO 201314268에 기술된 방법으로 혈청형 X 유래의 캡슐 당류와 A, C, W135 및 Y로부터 유래된 1종 이상의 추가적인 캡슐 다당류를 포함하는, 다가 수막구균 다당류 단백질 접합 조성물을 제조하는데 이용할 수 있다.

본 발명의 제7 구현예에서, 담체 단백질은, 비제한적인 예로, CRM 197, 디프테리아 톡소이드, 파상풍균 톡소이드, 백일해균 톡소이드, E. coli LT, E: coli ST 및 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)의 외독소 A, 외막 복합체 C (OMPC), 포린 (porin), 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균 용혈소 (pneumolysin), 폐렴구균의 표면 단백질 A (PspA), 폐렴구균의 어드헤신 단백질 (PsaA), 폐렴구균의 표면 단백질 BVH-3 및 BVH-11, 탄저균 (Bacillus anthracis)의 보호 항원 (PA), 탄저균의 독소제거된 부종 인자 (EF: edema factor) 및 치사 인자 (LF: lethal factor), 오발부민, 키홀 림페트 헤모시아닌 (KLH), 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 담체 단백질은 파상풍균 톡소이드, 디프테리아 톡소이드 및 CRM197로부터 선택될 수 있다.

수막구균의 X 다당류를 함유한 1가 또는 다가 면역원성 조성물은 완충화된 액체 형태 또는 동결건조된 형태일 수 있다. 바람직하게는, 다당류 단백질 접합체는 종래에 US2013/0209503에 기술된 바와 같이 동결건조될 수 있으며, 이 제형은 40℃에서 적어도 6개월간 안정적이며, 유리형 다당류의 함유량은 11% w/w 미만일 수 있다.

본 발명의 동결건조된 백신 조성물은 pH 약 6 - 7.5의 전달 비히클, 특히 염수 또는 PBS로 재구성될 수 있다.

조성물은 0.5 ml 당 Al⁺⁺⁺25 - 125 ㎍의 함량으로 첨가되는 알루미늄 염 보강제를 포함할 수 있다.

또한, 조성물은 티오메살 및 2-페녹시에탄올로부터 선택되는 보존제를 포함할 수 있다.

본 발명의 동결건조된 백신 조성물은 1회, 5회 또는 10회 투약 제형 (dose formulation)으로서 제공될 수 있다.

다당류 또는 이의 접합체는 바람직하게는 비경구로, 예를 들어 정맥내, 복막내, 근육내, 동맥내 또는 병소내 경로로 주사 또는 주입함으로써, 비경구로 투여된다.

실시예들 :

I) 발효 공정:

OD가 1/ml인 "수막구균 X M8210" (CBER) 배양물 3 ml이 담긴 종균 바이얼을 -70℃에서 냉동시켰다. 그런 후, 바이얼을 해동시키고, 종균 배지 30 ml에 접종하여 37℃에서 150 - 180 rpm으로 교반하면서 배양하였다. OD가 0.7 보다 높아지면 부피를 60 ml로 2배로 만든 다음, 각각 120 ml, 210 ml로 2배로 만들었다.

OD가 1.0 ± 0.2인 배양물 70 ± 10 ml를 반응조에 접종하며, 이때 반응조내 배지 부피는 1500 ml이었다. 반응조를 0시간 배양하였을 때 OD는 0.04 - 0.05로 유지되었다.

발효 전체 공정은 NBS bio flow Celligen 115 (2.2L) 유리 생물반응조에서 수행하였으며, 발효 사이클은 연속적인 유가배양 방식으로 운영하였으며, 전체 발효 사이클 기간은 19시간이었다.

II) 발효 배지 조성:

표 1: 수막구균 혈청형 X(NMXM-CA-I)용 카사미노산 함유 신규 배지의 조성

구성 성분	농도 (gm/l)
덱스트로스	10
염화나트륨	5.8
황산칼륨	1
제2인산칼륨	4
염화암모늄	0.15
글루탐산	5
아르기닌	0.3
세린	0.5
시스테인	0.25
염화마그네슘	0.19
염화칼슘	0.02
황산 제1철	0.002
카사미노산	10

표 2: 수막구균 혈청형 X(NMXM-CA-II)용 카사미노산 함유 신규 배지의 조성

구성 성분	농도 (gm/l)
덱스트로스	10
염화나트륨	5.8
황산칼륨	1
제2인산칼륨	4
염화암모늄	0.15
글루탐산	5
아르기닌	0.3
세린	0.5
시스테인	0.25
염화마그네슘	0.19
염화칼슘	0.02
황산 제1철	0.002
카사미노산	8

표 3: 수막구균 혈청형 X(NMXM-CA-III)용 카사미노산 함유 신규 배지의 조성

구성 성분	농도 (gm/l)
덱스트로스	10
염화나트륨	5.8
황산칼륨	1
제2인산칼륨	4
염화암모늄	0.15
글루탐산	5
아르기닌	0.3
세린	0.5
시스테인	0.25
염화마그네슘	0.19
염화칼슘	0.02
황산 제1철	0.002
카사미노산	7

표 4: 수막구균 혈청형 X(NMXM-SP)용 소이 펩톤 함유 배지의 조성

구성 성분	농도 (gm/l)
덱스트로스	10
염화나트륨	5.8
황산칼륨	1
제2인산칼륨	4
염화암모늄	0.15
글루탐산	5
아르기닌	0.3
세린	0.5
시스테인	0.25
염화마그네슘	0.19
염화칼슘	0.02
황산 제1철	0.002
소이 펩톤	9

표 5: 수막구균 혈청형 X(NMXM-SP-II)용 소이 펩통 함유 배지의 조성

구성 성분	농도 (gm/l)
덱스트로스	10
염화나트륨	5.8
황산칼륨	1
제2인산칼륨	4
염화암모늄	0.15
글루탐산	5
아르기닌	0.3
세린	0.5
시스테인	0.25
염화마그네슘	0.19
염화칼슘	0.02
황산 제1철	0.002
소이 펩톤	8

III) 증식 동태, 새로운 공급 전략 & 공급 용액:

표 6: 수막구균 X 균주 8210의 증식 프로파일

시간	카사미노산 함유 배지에서의 OD (590nm)	소이 펩톤 함유 배지에서의 OD (590nm)
0	0.07	0.08
1	0.19	0.23
2	0.40	0.55
3	0.80	1.27
4	1.73	2.55
5	3.89	5.49
6	6.93	8.17
7	12.45	10.08
8	16.40	12.49
9	14.40	11.03
10	13.49	10.33
11	11.48	9.28
12	10.74	8.84
13	10.09	7.89
14	10.29	7.92
15	10.32	7.97
16	11.32	7.94
17	11.67	5.21
18	11.54	5.77

지수증식기는 5시간째에서 9시간째에, 정체기는 9시간째에서 12시간째, 쇠퇴기는 12시간째부터 19시간째로 확인되었다.

새로운 공급 전략:

공급 전략은 첫 공급원 투입은 590 nm에서의 OD가 3 - 4일 때 10ml/hr/1.5 L 속도로 개시하였으며, 배양물의 OD가 최고치가 될 때까지 30ml/hr/1.5L로 점차적으로 증가시킨 후, 배양물 OD가 OD 최고치의 50%가 될 때까지 60ml/hr/1.5 L로 유지한 다음 배양물을 수확할 수 있도록, 설계되었다.

공급 용액:

표 7: 수막구균 혈청형 X를 위한 새로운 "공급 용액 1"( FS - 1)의 조성

구성 성분	농도 (gm/l)
덱스트로스	75
Sod 글루타메이트	40
아르기닌	3
세린	3
시스테인	2
염화마그네슘	2
염화칼슘	0.15
황산 제1철	0.02

표 8 수막구균 혈청형 X를 위한 새로운 "공급 용액 2"( FS - 2)의 조성

구성 성분	농도 (gm/l)
덱스트로스	75
Sod 글루타메이트	40

결과:

지속적인 지수적 공급 전략으로 세포를 보다 장기간 정체기로 유지시킬 수 있었으며, 이로써 수막구균 X 다당류의 수율이 증가되었다. 질소원으로서의 카사미노산의 사용은, 질소원으로서 소이 펩톤을 사용한 경우에 비해, 100 KDa 단계에서 불순물이 최소화된 Men X 다당류가 고수율 및 고분자량으로 수득된다는 것을 확인하였다.

공급 용액으로서 덱스트로스와 글루타민산 나트륨만 사용한 경우 (FS-2), 세포 형태에 궁극적으로 작용하여, 비우호적인 다당류 특징들이 발현되었다. 반면, FS-1 (덱스트로스 및 글루타민산 나트륨 외에도 아미노산과 염이 함유됨)은 세포 형태형성에 사용되어, 이를 개선함으로써, 따라서 다당류 수율이 증가되고 우호적인 특징을 가진 다당류가 수득되는 것으로 확인되었다.

수막구균 X 8210의 증식 프로파일에 대한 연구를 통해, 발효 중에, 방출된 세포성 대사산물의 축적으로 인한 pH 하락이 관찰되었으며, 이는 캡슐 다당류 생산 속도에 부정적으로 작용한 것으로, 밝혀졌다. 이러한 pH 하락을 방지하기 위해, pH를 설정치로 유지시키는 케스케이드로 정량 펌프에 의해 NaOH가 0.25N - 0.5N 농도로, 오르토인산이 5 - 10% 농도로 지속적으로 제공되며, 탄산나트륨 (20%) : NaOH (0.5 N)의 비율은 1:3으로 유지된다.

IV) 발효기 조건

표 9: 발효기의 변수

발효 측면	농도
온도	36 ℃
OD	16 OD
pH	7.2
DO(%)	25 %
교반(rpm)	400
기체 흐름	1.0
공기(%)	0-100%
산소(%)	0-100%

표 10: 100 KDa에서의 다당류 농도 & 순도 프로파일

사용 질소원	다당류 농도 (mg/L)	내독소, 단백질 & 핵산의 상대적인 농도
NMXM-CA-I의 100 KDa 발효 수확 단계에서의 Men X Ps	650	단백질 :50- 75 % 핵산 : 15-30%
NMXM-CA-II의 100 KDa 발효 수확 단계에서의 Men X Ps	625	단백질 :42- 70 % 핵산 : 15-30%
NMXM-CA-III의 100 KDa 발효 수확 단계에서의 Men X Ps	610	단백질 :35- 65 % 핵산 : 15-30%
NMXM-SP-I의 100 KDa 발효 수확 단계에서의 Men X Ps	500	단백질 :65- 95 % 핵산 : 15-40%
NMXM-SP-II의 100 KDa 발효 수확 단계에서의 Men X Ps	475	단백질 :65- 90 % 핵산 : 15-40%

결과:

카사미노산이 함유된 NMXM-CA 배지의 경우, 100 KDa 단계에서, OD가 배양물의 OD 최고치의 50%가 될 때 수확하였을 때, 다당류의 수율은 500 - 650 mg/L였으며, 불순물은 최소화되었다. 반면, 소이 펩톤이 함유된 NMXM-SP 배지의 경우, 100 KDa 단계에서, 다당류의 수율은 상대적으로 낮았으며, 즉 450 - 500 mg/L였으며, 불순물의 함유율이 더 높았다.

V) 수확 & 불활화

광학 밀도의 하락이 관찰되면, 발효를 종결시키고, 37℃에서 2시간 동안 1% 포름알데하이드를 사용하여 불활화하였다. 이후, 온도를 10℃로 냉각시켜, 30분간 배양하였다. 수확물을 취하여, 45분간 14,500g로 원심분리하였다.

이후 상층액을 0.2 ㎛로 여과한 다음 100 KD 정용여과 (10-15회)하고, WFI로 농축하였다. 이후 0.2 ㎛ 필터로 멸균 여과하였다.

VI) Men X 다당류의 정제

프로토콜 1:

100KD 정용여과된 수확물에, 0.5% 데옥시콜레이트, 6% 소듐 아세테이트, 2mM EDTA & 40% 에탄올을 첨가하였다. 이 혼합물을 3-4시간 동안 2-8℃에서 교반하면서 유지시켰다. 이후 혼합물을 20분간 10000 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 25 mM 트리스에 대해 100KD 카세트 막을 사용하여 정용여과하였다. 아울러, 교반하면서 2-8℃에서 밤새 10% w/v CTAB 석출을 수행하고, 펠릿을 수집하였다. 이 펠릿을 2-8℃에서 2시간 동안 교반하면서 96% 에탄올 + 0.05 M NaCl에 용해시켰다. 그런 후, 30분간 다당류를 석출시키고, 펠릿을 수집하였다. 이 펠릿을 1시간 동안 45% 에탄올 + 0.4 M NaCl에 용해하였다. 상층액을 수집하고, CUNO R32SP 탄소 필터로 여과하였다. 그런 후, 다당류를 1-2시간 동안 96% 에탄올에서 석출시켜, 펠릿을 수득하였다. 이 펠릿을 WFI에 용해한 다음 TFF를 수행하였다. 최종적으로 정제된 수막구균 X 다당류는 -20℃에 보관하였다.

프로토콜 2:

100KD 정용여과된 수확물에, 1.5% 데옥시콜레이트, 6% 소듐 아세테이트, 2mM EDTA & 40% 에탄올을 첨가하였다. 이 혼합물을 3-4시간 동안 2-8℃에서 교반하면서 유지시켰다. 이후 혼합물을 20분간 10000 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 25 mM 트리스에 대해 100KD 카세트 막을 사용하여 정용여과하였다. 아울러, 교반하면서 2-8℃에서 밤새 6% w/v CTAB 석출을 수행하고, 펠릿을 수집하였다. 이 펠릿을 2-8℃에서 2시간 동안 교반하면서 96% 에탄올 + 0.05 M NaCl에 용해시켰다. 그런 후, 30분간 다당류를 석출시키고, 펠릿을 수집하였다. 이 펠릿을 1시간 동안 45% 에탄올 + 0.4 M NaCl에 용해하였다. 상층액을 수집하고, CUNO R32SP 탄소 필터로 여과하였다. 그런 후, 다당류를 1-2시간 동안 96% 에탄올에서 석출시켜, 펠릿을 수득하였다. 이 펠릿을 WFI에 용해한 다음 TFF를 수행하였다. 최종적으로 정제된 수막구균 X 다당류는 -20℃에 보관하였다.

프로토콜 3:

100KD 정용여과된 수확물에, 1% 데옥시콜레이트, 6% 소듐 아세테이트, 2mM EDTA & 40% 에탄올을 첨가하였다. 이 혼합물을 3-4시간 동안 2-8℃에서 교반하면서 유지시켰다. 이후 혼합물을 20분간 10000 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 25 mM 트리스에 대해 100KD 카세트 막을 사용하여 정용여과하였다. 아울러, 교반하면서 2-8℃에서 밤새 3% w/v CTAB 석출을 수행하고, 펠릿을 수집하였다. 이 펠릿을 2-8℃에서 2시간 동안 교반하면서 96% 에탄올 + 0.05 M NaCl에 용해시켰다. 그런 후, 30분간 다당류를 석출시키고, 펠릿을 수집하였다. 이 펠릿을 1시간 동안 45% 에탄올 + 0.4 M NaCl에 용해하였다. 상층액을 수집하고, CUNO R32SP 탄소 필터로 여과하였다. 그런 후, 다당류를 1-2시간 동안 96% 에탄올에서 석출시켜, 펠릿을 수득하였다. 이 펠릿을 WFI에 용해한 다음 TFF를 수행하였다. 최종적으로 정제된 수막구균 X 다당류는 -20℃에 보관하였다.

DOC 농도가 낮은 프로토콜 1은, 오염원 (단백질/핵산)의 제거에는 비효율적이었으며, 동시에 고농도의 CTAB의 사용으로 쉽게 분리하기 어려운 CTSB-다당류 복합체가 형성되었다.

DOC 농도가 높은 프로토콜 2는, 좀더 끈적한 다당류 용액이 형성되어, TFF 공정을 진행하기 어려웠다. 또한 중간 농도의 CTAB의 사용으로 쉽게 분리하기 어려운 CTSB-다당류 복합체가 형성되었다.

DOC의 농도는 중간이고, CTAB 농도는 낮은 프로토콜 3는, 프로토콜 1/2 보다 훨씬 효과적인 것으로 확인되었으며, 이로써 수막구균 X 다당류의 정제가 완료되었다.

프로토콜 3에 따라 준비한 정제된 수막구균 X 다당류를 대상으로 단백질, 핵산, 내독소 및 분자 크기 등의 불순물을 검사하였다. Men X 다당류에 대한 WHO의 세목/지침은 없지만, 정제된 수막구균 X 다당류는 기존에 확립된 유사 다당류 함유 포스포다이에스테르, 즉 수막구균 A에 대한 WHO 세목에 부합되는 것으로 확인되었다.

나아가, SIIL의 Men X 다당류에 대한 ¹H, ¹³C, ³¹P NMR 결과를 최근 공표된 X-관련 NMR 데이타와 비교한 바, SIIL의 Men X 다당류에 대한 구조적인 동일성이 검증되었다.

표 11: 정제된 Men X 다당류의 특징

이용 질소원	Ps 농도 (mg/L)	핵산 (%)	내독소 (Eu/ug)	단백질( % )	Mw(KDa)
Men X Ps, NMXM-CA-I	440	0.062	1.51	0.18	410
Men X Ps, NMXM-CA-II	420	0.047	1.33	0.14	520
Men X Ps, NMXM-CA-III	380	0.052	1.25	0.13	549
Men X Ps, NMXM-SP-I	300	0.081	1.90	0.19	380
Men X Ps, NMXM-SP-II	250	0.062	1.25	0.15	463

결과:

Men X 다당류의 NMXM-CA 및 NMXM-SP 기반의 배치들은 수막구균 A 다당류에 대한 WHO 세목을 충족시키는 것으로 확인되었다.

카사미노산을 함유한 NMXM-CA 배지의 경우, 최종 정제 단계에서, 배양물의 OD가 최고치의 50%일 때 수확하였을 때, 정제 단계 회수율은 60 - 65%, 다당류 수율은 350 - 500 mg/L였으며, 불순물이 최소화되었다. 반면, 소이 펩톤을 함유한 NMXM-SP 배지의 경우, 최종 정제 단계에서, 다당류에 대한 정제 단계 회수율과 다당류 수율 모두 상대적으로 낮았으며, 불순물의 함유율도 높았다.

이러한 Men X 다당류의 고수율은 어떠한 추가적인 크로마토그래피 방법을 사용하지 않고도 달성되어, 이는 전술한 정제 프로토콜이 견고하며 비용 효율적이라는 것을 입증해준다.

VII) 동결건조된, 면역원성 Men X 다당류-단백질 접합체의 제조:

수막구균 X 다당류-파상풍균 톡소이드를 함유한 1가 또는 다가 면역원성 조성물은 완충화된 액체 형태 또는 동결건조된 형태일 수 있다.

바람직하게는, 상기 다당류 단백질 접합체는 기존에 US 2013/0209503에 개시된 바와 같이 동결건조할 수 있으며, 이 제형은 40℃에서 6개월 이상 안정적이며, 유리형 다당류의 함량이 11% w/w 미만일 수 있다.

본 발명의 Men X 다당류를 이용하여, 기존에 WO 201314268에 언급된 바와 같이, 혈청형 X의 캡슐 당류와 A, C, W135 및 Y 유래 1종 이상의 캡슐 당류를 포함하는, 면역원성의 다가 수막구균 다당류 단백질 접합체 조성물을 제조할 수 있다.

본원에 기술된 본 발명의 내용이 적용될 수 있는 다수의 가능한 구현예들을 참작하여, 예시된 구현예들은 본 발명의 바람직한 예에 불과하며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는 것으로, 이해되어야 한다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 규정된다. 이에, 본 발명자들은 이들 청구항의 범위와 사상내에 해당되는 모든 것을 본 발명으로서 청구한다.

Claims

(a) 카사미노산(casamino acids)을 포함하는 수성 발효 영양 배지를 준비하는 단계;
(b) 상기 발효 영양 배지에, 590nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.8 - 1.2인 수막구균 X 박테리아를 접종하는 단계;
(c) OD 3 - 4에서 시작하여, 10ml/hr/1.5L 내지 60ml /hr/1.5 L의 공급원 투입 속도로 공급 용액을 지속적인 지수적 공급(continuous exponential feeding)으로 투입하는 단계;
(d) pH, 온도 및 용존 산소%가 제어되는 조건 하에, 상기 접종된 발효 영양 배지를 배양하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 생산되는 캡슐 다당류를, 590nm에서의 광학 밀도(OD)가 배양물 OD 최고치의 60% 미만일 때, 수확하는 단계;
(f) 단계 (e)에서 수득되는 캡슐 다당류를 정제하는 단계; 및
(g) 선택적으로, 단계 (f)에서 수득되는 정제된 캡슐 다당류를 농축하는 단계
를 포함하고,
상기 정제된 다당류는 수율이 300 - 550 mg/L이고, 평균 분자량은 400 - 550 KDa이며, 정제 단계의 회수율은 60% - 65%이고, 단백질/펩타이드를 0.5% 미만으로, 핵산을 0.5% 미만으로, 및 내독소를 5 EU/㎍ 미만으로 포함하는,
수막구균 혈청형 X(Neisseria meningitidis serogroup X) 캡슐 다당류의 제조 방법.
제1항에 있어서,
(a) 상기 캡슐 다당류를 생산하는 수막구균 X 균주는 M8210, M9601, M9591, M9592, M9554, M2526, 247X 및 5967(ST 750)로부터 선택되고;
(b) 상기 발효 영양 배지는,
(i) 카사미노산 5 g/L - 20 g/L, 염화암모늄 0.14 g/L - 0.19 g/L, 덱스트로스 10 g/L - 11 g/L, 염화나트륨 5.8 g/L - 6 g/L, 황산칼륨 0.9 g/L - 1 g/L, 제2인산칼륨 3.8 g/L - 4 g/L, 글루탐산 4.8 g/L - 5 g/L, L-아르기닌 0.2 g/L - 0.3 g/L, L-세린 0.4 g/L - 0.5 g/L, L-시스테인 0.24 g/L - 0.25 g/L, 염화마그네슘 0.18 g/L - 0.19 g/L, 염화칼슘 0.02 g/L 및 황산 제1철 0.002 g/L를 포함하고, 배지의 구성 성분들의 농도는 ± 10% 범위에서 변동가능하거나, 또는
(ii) 카사미노산 5 g/L - 10 g/L, 염화암모늄 0.14 g/L - 0.17 g/L, 덱스트로스 10 g/L - 11 g/L, 염화나트륨 5.8 g/L - 6 g/L, 황산칼륨 0.9 g/L - 1 g/L, 제2인산칼륨 3.8 g/L - 4 g/L, 글루탐산 4.8 g/L - 5 g/L, L-아르기닌 0.2 g/L - 0.3 g/L, L-세린 0.4 g/L - 0.5 g/L, L-시스테인 0.24 g/L - 0.25 g/L, 염화마그네슘 0.18 g/L - 0.19 g/L, 염화칼슘 0.02 g/L 및 황산 제1철 0.002g /L를 포함하고, 배지의 구성 성분들의 농도는 ± 10% 범위에서 변동가능하며,
(c) 상기 발효 영양 배지로의 접종은 광학 밀도가 0.8 - 1인 종균 배양물에 의해 이루어지고;
(d) 상기 지속적인 지수적 공급은, 590nm에서의 OD가 3-4일 때 10ml/hr/1.5 L의 속도로 공급원의 투입으로 시작하여, 배양물의 OD가 최고치가 될 때까지 30ml/hr/1.5L까지 점차적으로 증가시킨 다음, 배양물의 OD가, 배양물을 회수할 수 있는, OD 최고치의 50%에 도달할 때까지 60ml/hr/1.5 L로 유지하는 것이며;
(e) 상기 공급 용액은 덱스트로스 72 - 76 g/L, 글루타민산 나트륨 38 g/L - 42 g/L, L-아르기닌 2.8 g/L - 3.2 g/L, L-세린 2.8 g/L - 3.2 g/L, L-시스테인 1.9 g/L - 2.1 g/L, 염화마그네슘 1.9 g/L - 2 g/L, 염화칼슘 0.13 g/L - 0.15 g/L 및 황산제1철 0.02 g/L을 포함하고, 상기 공급 용액의 구성 성분들의 농도는 ±10% 범위에서 변동가능하며;
(f) 상기 배양은,
(i) 온도 36 - 37℃, pH 7-7.2, 350 - 500 rpm, 용존 산소율 15% - 25%, 기체 흐름 1 - 1.5, 공기 0 - 100% 및 산소 0 - 100%에서 7-10시간 동안, 또는
(ii) 온도 36℃, pH 7.2, 400 rpm, 용존 산소율 25%, 기체 흐름 1 - 1.5, 공기 0 - 100% 및 산소 0 - 100%에서 8-9시간 동안 수행되며;
(g) 불활화가, 1% 포름알데하이드를 이용하여 37℃에서 1-2시간 동안 수행되며, 이후 30분간 10℃에서 배양하며;
(h) 상기 수확은,
(i) 45분간 14500g로 원심분리하여 모든 세포 잔여물들을 제거하는 단계;
(ii) 상층액에 대해 0.2μ 여과를 수행한 후, 100KD 정용여과(diafiltration)하고, WFI를 이용하여 농축하는 단계에 의해 수행되며;
상기 방법은 연속적인 유가배양 시스템(continuous fed-batch culture system)으로 수행되는,
제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (f)는
(a) 1 - 1.2% 농도의 음이온성 디터전트를 1.5 - 3 mM 농도의 킬레이트제와 40% - 50% 농도의 알코올과 조합하여 사용함으로써, 단백질 및 내독소 불순물들을 제거하는 단계;
(b) 핵산을 제거하기 위해 초산나트륨을 4 - 6% 농도로 첨가하는 단계;
(c) 다당류 및 불순물에 결합시키기 위해, 양이온성 디터전트를 3 - 4%의 농도로 첨가하는 단계;
(d) 96% 알코올 존재 하에 염화나트륨을 0.05 M로 사용하여, 양이온 디터전트-다당류 복합체로부터 다당류를 석출(precipitation)시키는 단계;
(e) 0.4 M 농도의 염화나트륨의 존재 하에 45%의 알코올로 펠릿을 세척하여, 단백질과 핵산 불순물들을 제거하는 단계; 및
(f) 96% 알코올 사용하여 다당류를 선택적으로 석출시키는 단계;
(g) 다당류를 WFI에 용해시키고, TFF(tangential flow filtration)를 수행하는 단계
를 포함하고,
상기 정제 단계는 크로마토그래피를 사용하지 않는,
제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 정제 단계는
(a) 데옥시콜레이트 1%를 에틸렌다이아민테트라아세트산 2mM 및 에탄올 40%와 조합하여 사용하여, 단백질과 내독소 불순물을 제거하는 단계;
(b) 핵산을 제거하기 위해 초산나트륨을 4 - 6%로 첨가하는 단계;
(c) 다당류 및 불순물과의 결합을 위해 세틸트리메틸암모늄 브로마이드를 3 - 4%의 농도로 첨가하는 단계;
(d) 96% 무수 에탄올의 존재 하에 염화나트륨을 0.05 M 농도로 사용하여, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드-다당류 복합체로부터 다당류를 석출시키는 단계;
(e) 0.4 M 농도의 염화나트륨의 존재 하에 45% 농도의 에탄올로 펠릿을 세척하여, 단백질과 핵산 불순물들을 제거하는 단계;
(f) 96% 무수 에탄올을 사용하여 다당류를 선택적으로 석출시키는 단계; 및
(g) 다당류를 WFI에 용해하여, TFF(tangential flow filtration)를 수행하는 단계를 포함하며,
상기 정제 단계는 크로마토그래피를 사용하지 않는,
제조 방법.
제1항에 있어서, (h) 고압 세포 파괴 시스템(high pressure cell disruption system)을 이용하여 정제된 수막구균 X 다당류를 평균 크기 100 - 150 KDa으로 만드는 단계
를 더 포함하는, 제조 방법.
제5항에 있어서, (i) 크기가 축소된 다당류를 담체 단백질과 접합시켜, 단백질-다당류 접합체(protein-saccharide conjugate)를 제조하는 단계
를 더 포함하는, 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 수막구균 X의 다당류가 TT(Tetanus toxid), DT(Diphtheria toxid), CRM197(Cross Reacting Material 197; Mutant Diphteria toxoid), TT의 단편 C, 단백질 D, OMPC(Outer Membrane Protein Complex) 및 폐렴구균 용혈소(pneumolysin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 담체 단백질에 접합되는, 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 수막구균 X의 다당류가 화학적인 시아닐화 접합법을 이용하여 헤테로- 또는 호모-2 관능성 링커를 통해 상기 담체 단백질에 접합되는, 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 시아닐화 시약이 l-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오로보레이트(CPPT), 1-시아노-이미다졸(1-CI), 1-시아노벤조트리아졸(1-CBT), 및 2-시아노피리다진-3(2H) 온(2-CPO)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 단백질-다당류 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서,
상기 단백질-다당류 접합체가 동결건조된 형태인, 면역원성 조성물.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 단백질-다당류 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서,
상기 단백질-다당류 접합체가 완충화된 액체 형태(buffered liquid form)인, 면역원성 조성물.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 제조되는 단백질-다당류 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서,
상기 단백질-다당류 접합체가 선택적으로 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 이들의 혼합물에 흡착되어 있거나, 또는 보강제에 흡착되지 않은 형태인, 면역원성 조성물.
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수막구균 X의 캡슐 다당류의 고수율 및 고순도 제조 방법으로서,
i) 카사미노산 및 염화암모늄을 다른 성분과 함께 포함하는 발효 배지, ii) 쇠퇴기를 지연시킬 수 있는 지속적인 지수적 공급 전략 및 공급 배지 조성물, iii) 발효기의 최적 조건, 및 iv) 크로마토그래피 방법이 생략된 개선된 정제 공정을 이용함으로써 수행되며,
상기 정제 공정에서 정제된 다당류는 수율이 300 - 550 mg/L이고, 평균 분자량이 400 - 550 KDa이며, 단백질/펩타이드를 0.5% 미만으로, 핵산을 0.5% 미만으로, 및 내독소를 5 EU/㎍ 미만으로 포함하고, 상기 정제 공정의 회수율이 60% - 65%인,
수막구균 X의 캡슐 다당류의 고수율 및 고순도 제조 방법.
수막구균 X의 캡슐 다당류의 고수율 및 고순도 제조 방법으로서,
i) 소이 펩톤 및 효모 추출물로부터 선택되는 1종 이상의 추가적인 질소원과 카사미노산의 조합을 포함하는 발효 배지, ii) 쇠퇴기를 지연시킬 수 있는 지속적인 지수적 공급 전략 및 공급 배지 조성물, iii) 발효기의 최적 조건, 및 iv) 크로마토그래피 방법이 생략된 개선된 정제 공정을 이용함으로써 수행되며,
상기 정제 공정에서 정제된 다당류는 수율이 300 - 550 mg/L이고, 평균 분자량이 400 - 550 KDa이며, 단백질/펩타이드를 0.5% 미만으로, 핵산을 0.5% 미만으로, 및 내독소를 5 EU/㎍ 미만으로 포함하고, 상기 정제 공정의 회수율이 60% - 65%인,
수막구균 X의 캡슐 다당류의 고수율 및 고순도 제조 방법.
수막구균 X의 캡슐 다당류의 고수율 및 고순도 제조 방법으로서,
i) 소이 펩톤 및 효모 추출물로부터 선택되는 1종 이상의 추가적인 질소원과 카사미노산 및 염화암모늄의 조합을 포함하는 발효 배지, ii) 쇠퇴기를 지연시킬 수 있는 지속적인 지수적 공급 전략 및 공급 배지 조성물, iii) 발효기의 최적 조건, 및 iv) 크로마토그래피 방법이 생략된 개선된 정제 공정을 이용함으로써 수행되며,
상기 정제 공정에서 정제된 다당류는 수율이 300 - 550 mg/L이고, 평균 분자량이 400 - 550 KDa이며, 단백질/펩타이드를 0.5% 미만으로, 핵산을 0.5% 미만으로, 및 내독소를 5 EU/㎍ 미만으로 포함하고, 상기 정제 공정의 회수율이 60% - 65%인,
수막구균 X의 캡슐 다당류의 고수율 및 고순도 제조 방법.