CN115478033A - 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用 - Google Patents

一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115478033A
CN115478033A CN202211255293.9A CN202211255293A CN115478033A CN 115478033 A CN115478033 A CN 115478033A CN 202211255293 A CN202211255293 A CN 202211255293A CN 115478033 A CN115478033 A CN 115478033A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
fermentation
temperature
fermentation culture
meningococcus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211255293.9A
Other languages
English (en)
Inventor
朱楠
马伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aimei Weixin Biopharmaceutical Zhejiang Co ltd
Original Assignee
Aimei Weixin Biopharmaceutical Zhejiang Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aimei Weixin Biopharmaceutical Zhejiang Co ltd filed Critical Aimei Weixin Biopharmaceutical Zhejiang Co ltd
Priority to CN202211255293.9A priority Critical patent/CN115478033A/zh
Publication of CN115478033A publication Critical patent/CN115478033A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/36—Neisseria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及生物工程的领域，尤其是涉及一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用。发酵培养方法，将脑膜炎球菌液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中发酵培养，根据不同OD600值的变化，调整培养条件以及判定发酵收获终点。本申请具有的效果降低脑膜炎球菌的发酵的荚膜多糖内毒素含量以及提高荚膜多糖产量的效果。

Description

一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用
技术领域
本申请涉及生物工程的领域，尤其是涉及一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用。
背景技术
脑膜炎球菌(meningococcus)的学名是脑膜炎奈瑟氏球菌(n.meninyitidis)，为流行性脑脊髓膜炎(流脑)的病原菌。目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接种疫苗，通过发酵培养脑膜炎球菌，提取出多糖制成多糖疫苗，进而达到预防脑膜炎的效果。
例如专利申请号为2015105434251的专利文件公开了一种A群脑膜炎球菌的培养方法，将菌种在半综合培养基中培养扩增后再直接将种子培养于半综合培养基的发酵罐中，然而直接用半综合培养基的发酵罐进行发酵，半综合培养基的成本较高且发酵后的脑膜炎球菌较低，因此不适应于当前脑膜炎球菌的培养需求。
对于此，现有专利申请号为2021103499492的专利文件公开了一种脑膜炎球菌培养基及其配制方法及培养方法，具体通过优化培养基配方，在保证荚膜多糖产量和质量的前提下降低使用酸水解酪蛋白，从而节省生产成本。
具体的，脑膜炎球菌的培养方法包括以下步骤：
S1、培养基配制按设定配方配制脑膜炎球菌培养基；
S2、固体传代用菌种杆刮取A群脑膜炎球菌固体一代，接种于10％羊血琼脂培养基平面上涂抹均匀，把已接种好的10％羊血琼脂培养基放入37℃，7.5％CO2的培养箱内培养12小时；
S3、摇瓶培养用移液管吸取S1中配制的培养基，润洗10％羊血琼脂培养基上的菌苔；接种于S1中配制的培养基；把已接种好的摇瓶放入大容量振荡器中，在37℃，200rpm的条件下培养6小时。
针对上述中的相关技术，发明人认为，在发酵培养过程中，脑膜炎球菌在不同生长期处于同一培养条件，导致发酵过程中菌株死亡过多，脑膜炎球菌的发酵的荚膜多糖内毒素含量较高，使得疫苗成品易产生发热、红肿、结节等不良反应。
发明内容
为了降低脑膜炎球菌的发酵的荚膜多糖内毒素含量，本申请提供一种脑膜炎球菌发酵培养方法。
第一方面，本申请提供的一种脑膜炎球菌发酵培养方法，采用如下的技术方案：
一种脑膜炎球菌发酵培养方法，将脑膜炎球菌液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中发酵培养，根据不同OD600值的变化，调整培养条件。
可选的，OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧20％-40％进行发酵培养。
可选的，OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧40％-50％进行发酵培养。
可选的，OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧20％-40％进行发酵培养；OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧40％-50％进行发酵培养。
通过采用上述方案，根据不同OD600值的变化，调整培养条件，从而在各个培养阶段为菌种提供较适的生长环境，减少发酵过程中菌种的死亡，减少细菌内毒素的产生，同时提高产量。
可选的，对于A群脑膜炎球菌和C群脑膜炎球菌，OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养。
可选的，对于Y群脑膜炎球菌和W135群脑膜炎球菌，OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养。
可选的，OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速100，溶氧40％进行发酵培养。
第二方面，本申请提供一种上述发酵培养方法制备的脑膜炎球菌发酵液。
第三方面，本申请提供一种上述脑膜炎球菌发酵发酵液制备的精制多糖。
第四方面，本申请提供一种上述脑膜炎球菌精制多糖所制备的脑膜炎球菌多糖疫苗或结合疫苗。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本申请通过培养过程中根据不同OD600的变化，调整培养条件，从而在各个培养阶段为菌种提供较适的生长环境，减少发酵过程中菌种的死亡，减少细菌内毒素的产生，同时提高产量。
具体实施方式
原料与来源
本申请各类型脑膜炎菌株均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株A4CMCC29201，C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株C11CMCC29205，Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株YCMCC29303，W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株W135CMCC29055。
脑膜炎球菌培养基制备例
制备例1
脑膜炎球菌培养基，由A液和B液按9:1的体积比制成。具体配制时，每升脑膜炎球菌培养基包括900mL的A液和100mL的B液。其中，
每升A液包括：6g酪蛋白、4g酵母浸粉、0.125g氨基酸营养物、0.2g磷酸二氢钾、0.99g磷酸二氢钠、1.0g L-谷氨酸钠、0.75g氯化铵、3g氯化钠；其中氨基酸营养物由0.025g的L-胱氨酸和0.1g的甘氨酸制成。
每升B液包括：0.35g硫酸镁、0.005g一水硫酸锰、10g葡糖糖。
上述脑膜炎球菌培养基的配制方法，包括以下步骤：
(1)按配制量称取酸水解酪蛋白、酵母浸出粉、L-胱氨酸、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、甘氨酸、L-谷氨酸钠、氯化铵、氯化钠于容器中加注射用水溶解，再用8％氢氧化钠溶液调节pH值至7.3，得到A液；
(2)按配制量称取硫酸镁、一水硫酸锰、葡萄糖加注射用水溶解，得到B液；
(3)将A液与B液分别置于真空灭菌柜灭菌，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30min；灭菌后将A液跟B液按比例混合，得到脑膜炎球菌培养基。
需要说明的是，原料配方的含量和比例可以根据实际情况做适应性调整，例如，脑膜炎球菌培养基，可以是但不限于：由A液和B液按(8.5-9.5):(0.5-1.5)的体积比制成。
每升A液的原料配比可以是但不限于：5-8g酪蛋白、3-5g酵母浸粉、0.1-0.15g氨基酸营养物、0.15-0.25g磷酸二氢钾、0.98-1.0g磷酸二氢钠、0.5-1.0g L-谷氨酸钠、0.5-1.0g氯化铵、2-4g氯化钠；pH调节至7.2～7.4，且可以采用其他强碱或弱碱。
每升B液的原料配比可以是但不限于：0.3-0.4g硫酸镁、0.004-0.006g一水硫酸锰、9-11g葡糖糖。
可以理解的是，在配制条件上，也可以根据实际情况做适应性调整，例如，灭菌温度110-120℃,灭菌时间20-40min。
制备例2
与制备例1的区别在于，脑膜炎球菌培养基的配制方法不同，包括以下步骤:
(1)按配制量称取酸水解酪蛋白、酵母浸出粉、L-胱氨酸、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、甘氨酸、L-谷氨酸钠、氯化铵、氯化钠于容器中加注射用水溶解，再用8％氢氧化钠溶液调节pH值至7.3，得到A液；
(2)按配制量称取硫酸镁、一水硫酸锰、葡萄糖加注射用水溶解，得到B液；
(3)将A液跟B液按比例混合，置于真空灭菌柜灭菌，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30min,得到脑膜炎球菌培养基。
同样的，对于原料配方的含量和比例可以根据实际情况做适应性调整；在配制条件上，也可以根据实际情况做适应性调整。
实施例
实施例1提供的一种脑膜炎球菌发酵培养方法，包括以下步骤：
S1、液体复苏培养
分别开启A、C、Y和W135群菌种，并分别接种于制备例1提供的脑膜炎球菌培养基，培养温度37±1.5℃，培养过程用冰醋酸控制培养pH为6.5，转速200rpm培养3小时，OD600达到0.6时，结束培养，得到一代液体培养菌液。
S2、液体摇瓶培养
将一代液体培养菌液接种于制备例1提供的脑膜炎球菌培养基中，培养温度37±1.5℃，培养过程用冰醋酸控制培养pH为6.5，转速200rpm培养3小时，OD600达到1.0时，结束培养，得到二代液体培养菌液。
S3、发酵培养
将二代液体培养菌液接种于10倍体积的制备例1提供的脑膜炎球菌培养基中，在温度37±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm的条件下进行发酵培养；
当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速300rpm，溶氧20％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养。
本申请还提供由脑膜炎球菌发酵发酵液制备的精制多糖，以A群脑膜炎球菌发酵液制备A群脑膜炎球菌精制多糖为例，包括以下步骤：
向实施例1收获的A群脑膜炎球菌发酵液中按1％(v/v)加入甲醛溶液，60分钟杀菌，然后经过离心机4000rpm、10℃、15min离心去除菌体收集上清液。上清液中加入浓度为0.1％的十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀，静置3小时。
将沉淀的上清液经过离心机4000rpm、10℃、15min离心收集沉淀物。沉淀物按4.0ml/g多糖复合物沉淀加入2mol/L氯化钙溶液解离，然后补加注射用水(灭菌)使氯化钙最终浓度为lmol/L，搅拌1小时，使多糖十六烷基三甲基溴化铵复合物解离。加入2～8℃预冷的95％乙醇溶液至最终浓度为25％(ml/m1)，混匀，2～8℃冷库静置3小时。离心收集上清：用9000rpm,40分钟离心去沉淀，收集上清液。
上清液用0.22μm过滤器澄清过滤。于上述上清液中加入2～8℃预冷的95％乙醇溶液至最终浓度为：75％(ml/m1)。充分振摇后，静置1～2小时或过夜。4000rpm，15分钟离心收集沉淀，用2倍于多糖体积的2～8℃预冷的无水乙醇洗涤两次(每次洗涤4000rpm，15分钟，15℃以下离心)，再用2倍于多糖体积的2～8℃预冷的丙酮洗涤两次(每次洗涤4000rpm，15分钟，15℃以下离心)。弃掉上清，收集多糖沉淀，真空干燥或吹干，干燥后即为A群脑膜炎球菌荚膜多糖粗制品。
将A群脑膜炎球菌荚膜多糖粗制品溶解于10％饱和中性乙酸钠溶液中，使A群脑膜炎球菌荚膜多糖粗制品浓度达10～15mg/ml，用2倍A群脑膜炎球菌荚膜多糖粗制品体积的10％饱和中性乙酸钠冷酚溶液抽提3～12次。用9000rpm，40分钟离心收集上清液。
在上清液中加入8～15倍体积注射用水，采用100KD切向流超滤系统超滤至原体积；再用10～20倍体积注射用水超滤透析(等体积超滤)，超滤至原体积；加入2mol/L氯化钙溶液至终浓度为0.1mol/L。加入2～8℃预冷的95％乙醇至终浓度为：75％(ml/m1)。
充分振摇后，静置2小时，4000rpm，15分钟离心收集沉淀，用2倍于多糖体积的2～8℃预冷的无水乙醇洗涤两次(每次洗涤4000rpm，15分钟，15℃以下离心)，再用2倍于多糖体积的2～8℃预冷的丙酮洗涤两次(每次洗涤4000rpm，15分钟，15℃以下离心)。弃掉上清，收集多糖沉淀，真空干燥后即为A群脑膜炎球菌精制多糖。
本申请还提供一种由上述脑膜炎球菌精制多糖所制备的脑膜炎球菌多糖疫苗或结合疫苗。具体地，疫苗制备方式为本领域人员常用的方法和工艺，在此不再赘述。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 7.0，转速300rpm，溶氧20％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 7.2，转速300rpm，溶氧20％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧20％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧30％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例7
实施例7与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例8
实施例8与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例9
实施例9与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例10
实施例10与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.2，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例11
实施例11与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速300rpm，溶氧40％进行发酵培养收获发酵液。
实施例12
实施例12与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速300rpm，溶氧45％进行发酵培养收获发酵液。
实施例13
实施例13与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速300rpm，溶氧50％进行发酵培养收获发酵液。
实施例14
实施例14与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速300rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例15
实施例15与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例16
实施例16与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧20％进行发酵培养；当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例17
实施例17与实施例1的区别在于，步骤S3中，当OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；当OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40％进行发酵培养；菌种生长进入稳定期，结束培养收获发酵液。
实施例18
实施例18与实施例1的区别在于，步骤S1、S2、S3中均采用制备例2所提供的脑膜炎球菌培养基收获发酵液。
对比例1
与实施例1的区别在于，脑膜炎球菌发酵培养方法不同，具体的，对比例1提供的一种脑膜炎球菌发酵培养方法，包括以下步骤：
S1、固体复苏培养
用菌种杆分别刮取A、C、Y和W135群脑膜炎球菌固体一代，分别接种于10％羊血琼脂培养基平面上涂抹均匀，把已接种好的10％羊血琼脂培养基放入37℃，7.5％CO2的培养箱内培养12小时；
S2、液体摇瓶培养
用移液管吸取S1中配制的培养基，润洗10％羊血琼脂培养基上的菌苔；接种于S1中配制的培养基；把已接种好的摇瓶放入大容量振荡器中，在37℃，200rpm的条件下培养6小时。
S3、发酵培养将二代液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中，培养温度37±1.5℃，培养pH为6.9，转速300rpm，培养至菌种生长进入稳定期，结束培养，得到脑膜炎球菌发酵液。
对比例2
与实施例1的区别在于，脑膜炎球菌发酵培养方法不同，具体的，对比例2提供的一种脑膜炎球菌发酵培养方法，包括以下步骤：
S1、液体复苏培养
分别开启A、C、Y和W135群菌种，并分别接种于制备例1提供的脑膜炎球菌培养基，培养温度37±1.5℃，培养过程用冰醋酸控制培养pH为6.5，转速200rpm培养3小时，OD600达到0.6时，结束培养，得到一代液体培养菌液。
S2、液体摇瓶培养
将一代液体培养菌液接种于制备例1提供的脑膜炎球菌培养基中，培养温度37±1.5℃，培养过程用冰醋酸控制培养pH为6.5，转速200rpm培养3小时，OD600达到1.0时，结束培养，得到二代液体培养菌液。
S3、发酵培养
将二代液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中进行发酵培养，控制溶氧在20％，至菌种生长进入稳定期，结束培养，收获A、C、Y和W135群脑膜炎球菌发酵液。
性能检测
一、细菌内毒素：
采用2020版《中国药典》通则1143方法进行细菌内毒素检查，A群、C群、Y群、W135群多糖均应不高于12.5EU/ug，结果见表1。
二、精制多糖的有效收益测试：
称量上述实施例和对比例的多糖产量，检测结果见表1。
表1细菌内毒素测定表
Figure BDA0003889413120000091
表2精致多糖收率表
Figure BDA0003889413120000092
Figure BDA0003889413120000101
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脑膜炎球菌发酵培养方法，其特征在于：将脑膜炎球菌液体培养菌液接种于脑膜炎球菌培养基中发酵培养，根据不同OD600值的变化，调整培养条件。
2.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌发酵培养方法，其特征在于：OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧20%-40%进行发酵培养。
3.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌发酵培养方法，其特征在于：OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧40%-50%进行发酵培养。
4.根据权利要求1或2或3所述的脑膜炎球菌发酵培养方法，其特征在于：OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧20%-40%进行发酵培养；OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 6.8-7.0，转速100～300rpm，溶氧40%-50%进行发酵培养。
5.根据权利要求2所述的脑膜炎球菌发酵培养方法，其特征在于：对于A群脑膜炎球菌和C群脑膜炎球菌，OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40%进行发酵培养。
6.根据权利要求2所述的脑膜炎球菌发酵培养方法，其特征在于：对于Y群脑膜炎球菌和W135群脑膜炎球菌，OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40%进行发酵培养。
7.根据权利要求4所述的脑膜炎球菌发酵培养方法，其特征在于：OD600达到3.0以上时，控制温度33±1.5℃，pH 6.8，转速100rpm，溶氧40%进行发酵培养；OD600达到4.0以上时，控制温度31±1.5℃，pH 7.0，转速100rpm，溶氧40%进行发酵培养。
8.采用权利要求1-7任一项所述的发酵培养方法制备的脑膜炎球菌发酵液。
9.由权利要求8所述的脑膜炎球菌发酵发酵液制备的精制多糖。
10.由权利要求9所述的脑膜炎球菌精制多糖所制备的脑膜炎球菌多糖疫苗或结合疫苗。
CN202211255293.9A 2022-10-13 2022-10-13 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用 Pending CN115478033A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211255293.9A CN115478033A (zh) 2022-10-13 2022-10-13 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211255293.9A CN115478033A (zh) 2022-10-13 2022-10-13 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115478033A true CN115478033A (zh) 2022-12-16

Family

ID=84395522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211255293.9A Pending CN115478033A (zh) 2022-10-13 2022-10-13 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115478033A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040229319A1 (en) * 2003-05-16 2004-11-18 Egen Richard C. Animal component free meningococcal polysaccharide fermentation and seedbank development
CN104936615A (zh) * 2012-11-21 2015-09-23 印度血清研究所公司 高产量的细菌多糖的制备
US20180185465A1 (en) * 2015-07-04 2018-07-05 Bharat Biotech International Limited Polysaccharide vaccine formulations and processes for industrial production of bacterial polysaccharides
CN113025532A (zh) * 2021-03-31 2021-06-25 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种脑膜炎球菌培养基及其配制方法及培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040229319A1 (en) * 2003-05-16 2004-11-18 Egen Richard C. Animal component free meningococcal polysaccharide fermentation and seedbank development
CN104936615A (zh) * 2012-11-21 2015-09-23 印度血清研究所公司 高产量的细菌多糖的制备
US20180185465A1 (en) * 2015-07-04 2018-07-05 Bharat Biotech International Limited Polysaccharide vaccine formulations and processes for industrial production of bacterial polysaccharides
CN113025532A (zh) * 2021-03-31 2021-06-25 艾美卫信生物药业（浙江）有限公司 一种脑膜炎球菌培养基及其配制方法及培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HENRIQUES A W S等: "Capsular polysaccharide production by Neisseria meningitidis serogroup C: Optimization of process variables using response surface methodology" *
安建科等: "A群脑膜炎球菌发酵工艺的优化" *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108504621B (zh) 用于蝙蝠蛾拟青霉Cs-4的培养基及其制备方法
WO2013155866A1 (zh) 一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法
CN101037661A (zh) 假交替单胞菌及其用途
CN113025532B (zh) 一种脑膜炎球菌培养基及其配制方法及培养方法
CN107557407B (zh) 一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法
CN109837217B (zh) 耐高温糙皮侧耳菌及其筛选方法和应用
CN111543254A (zh) 一种桑黄菌丝体的培养方法、饮品及其应用
CN101033456A (zh) 一种低酸发酵肉制品加工用戊糖片球菌专用菌株及其发酵剂的制备方法
CN112852780B (zh) 黄柄曲霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用
CN115478033A (zh) 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用
CN109609482B (zh) 一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法
CN115478034B (zh) 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、精制多糖、应用
CN101230337A (zh) 亚硝酸还原酶的制备及亚硝酸还原酶制剂的制备方法
CN110616153A (zh) 康宁木霉lccc30119在生产纤维素酶和烟叶发酵中的应用
CN115466701A (zh) 一种脑膜炎球菌发酵培养方法、发酵液、荚膜多糖、应用
CN115677823A (zh) 一种富硒灵芝天然活性蛋白的提取方法
CN102816751B (zh) 一种高活性壳聚糖酶及其制备方法
CN109554420A (zh) B型产气荚膜梭菌外毒素及其制备方法、产毒培养基和应用
US3594284A (en) Lysostaphin fermentation with accelerated time cycle
CN114790438A (zh) 一种提高牛樟芝胞外多糖产量及其抗氧化性的方法
CN113907135A (zh) 一种桑黄风味酸奶及其制备方法
CN109207402B (zh) 一株凝结芽孢杆菌及其液体发酵产酶方法
CN1807591A (zh) 一种发酵肉制品的发酵剂及其专用菌株
CN111004788A (zh) 一种果胶酯酶及其制备方法和应用
CN110591968A (zh) 一种肉桂链霉菌产磷脂酶d的方法及磷脂酶d活性测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20221216

RJ01 Rejection of invention patent application after publication