CN109609482B - 一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，采用地衣芽孢杆菌BL312制备，制备方法包括以下步骤：步骤1，将地衣芽孢杆菌BL312涂布、划线培养后接种于改良培养基，培养得到种子液；步骤2，将种子液接种于麸皮培养基，培养得发酵液，将发酵液冷冻离心后取上清液；步骤3，将上清液与硫酸铵的混合液沉析后冷冻离心，并收集沉淀物，将沉淀物溶解于Tris‑HCl缓冲液中，透析后冻干，得到粗酶；步骤4，将粗酶用Tris‑HCl缓冲液溶解后透过滤膜，再经DEAE‑Sepharose Fast Flow离子交换柱分离纯化并透析、冻干后得到地衣芽孢杆菌凝乳酶。

Description

一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法。
背景技术
凝乳酶作为奶酪加工生产中的关键酶对奶酪的品质有至关重要的影响。随着市场需求的逐年增大，单纯依靠宰杀幼畜提取凝乳酶的方法已不能满足市场的需求，而且大量宰杀幼畜受生长周期及经济因素的限制，加之动物性凝乳酶制成的奶酪很难被素食主义者接受，种种因素促使人们开始不停寻找新的凝乳酶来源。近年来，一些来源于真菌、酵母和细菌的微生物凝乳酶已经在奶酪制作加工中显示了其商业价值，尽管如此，寻找高效、优质的凝乳酶替代品仍然是当今的一大研究热题。由于我国对凝乳酶研究起步较晚，现阶段我国凝乳酶主要依赖进口，只有少数科研单位对产凝乳酶的菌株进行了较系统的研究。因此，筛选高产凝乳酶菌株并高效地得到凝乳酶产品对于我国奶酪产业的发展具有重要意义。
许多微生物，尤其是霉菌和细菌来源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相同或相似的性质，较植物和动物来源凝乳酶，微生物具有生产成本低、酶容易提取、经济效益高和更加广泛的生化多样性的特点。目前，细菌来源凝乳酶的研究较真菌少，但细菌的浸入式发酵较真菌的固态发酵更易控制且物质利用率更高，且通过筛选新菌株和优化发酵条件可克服细菌MCEs具有较低的MCA/PA比值的问题。所以，有关细菌凝乳酶的研究报道逐渐增加。
筛选高产凝乳酶细菌，确定较佳的发酵条件，探索该细菌凝乳酶的性质是否满足后期干酪生产的要求，快速、经济、高效地得到细菌凝乳酶产品成为当今国内外凝乳酶研究的重要方向。有学者研究了一株枯草芽孢杆菌，发现其所产凝乳酶最适作用pH 7.5，培养72h酶活达到最高571.43U/mL；也有学者研究了一株诺卡氏菌，发现其所产凝乳酶最适凝乳pH分别为11.0和7.5，培养40h时凝乳酶活力达到最高24.49U/mg。但目前，天然菌株筛选的地衣芽孢杆菌所产凝乳酶活性都不高，且发酵时间长，纯化过程中酶活损失较大，凝乳酶性质不能更好地满足后期干酪生产的要求。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法。
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，具有这样的特征，采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL312进行制备，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL312已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15009，保藏时间为2017年12月4号，地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法包括以下步骤：
步骤1，将地衣芽孢杆菌BL312涂布、划线培养14～16小时后接种于改良培养基中，并在温度为37℃、转速为150～170r/min的条件下震荡培养12～14小时后得到种子液；
步骤2，将种子液以5％接种量接种于麸皮培养基中，在温度为37℃、转速为150r/min的条件下震荡培养40～48小时后得发酵液，将该发酵液在4℃的温度下以5000r/min的转速进行10min的冷冻离心后，取上清液；
步骤3，将上清液与硫酸铵混合来得到混合液，将混合液在4℃的温度下沉析2小时后，再在4℃的温度下以7000r/min的转速进行10min的高速冷冻离心，而后收集沉淀物，并将该沉淀物溶解于20mmol/L且pH值为7的Tris-HCl缓冲液中，透析2～4小时后进行冷冻干燥，得到粗酶；
步骤4，将粗酶用20mmol/L且pH值为7的Tris-HCl缓冲液溶解后在压力下透过滤膜，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离纯化并透析、冷冻干燥后得到地衣芽孢杆菌凝乳酶。
在本发明提供的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤1中，改良培养基通过将15g酪蛋白胨，5g酵母浸粉，50g葡萄糖，0.2gL-胱氨酸，1gNaCl，2gNa2HPO4·12H2O，2gNaHCO3以及2％的琼脂混合后加入去离子水定容至1000mL，并在115℃下灭菌20min后得到。
在本发明提供的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤2中，震荡培养在250ml的发酵容器中进行，发酵容器中培养基装液量为50ml。
在本发明提供的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤4中，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱的起始缓冲液为20mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液，流速为5ml/min。
在本发明提供的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤3和步骤4中的冷冻干燥均包括在-45℃的温度下预冻180分钟、在-10℃的温度下第一次干燥400分钟以及在4℃的温度下第二次干燥400分钟。
在本发明提供的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤4中，透析是在4℃的温度下透析2～4小时。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，因为筛选的地衣芽孢杆菌所产凝乳酶活性高，纯化后比酶活、得率和提纯比较高，并且在制备方法上简化了制备工艺，提升了凝乳酶的纯化效率，大幅度缩短了发酵周期，提高了生产速度，降低了生产成本，所以能够更好地满足后期干酪生产的要求,对于细菌凝乳酶的工业化生产具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的实施例中地衣芽孢杆菌BL312菌落形态；
图2是本发明的实施例中的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法的流程图；
图3是本发明的实施例中脱脂乳体系pH对地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶活力的影响；
图4是本发明的实施例中地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶的pH稳定性；
图5是本发明的实施例中地衣芽孢杆菌BL312的凝乳形态；
图6是本发明的实施例中不同添加量地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶对鲜牛奶的凝乳切割形态。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
图1是本发明的实施例中地衣芽孢杆菌BL312菌落形态。
如图1所示，实施例中使用的地衣芽孢杆菌BL312的是从山东枣庄、山东青岛、山东莱阳、黑龙江穆棱、宁夏、云南、广西桂林、甘肃等地的奶牛场中运动区、牛舍、挤奶区、饮水区、厂周边、生产区中筛选得到120余株菌，以菌落在酪蛋白平板上形成的沉淀圈和水解圈为指标，初步确定其是可凝乳的菌株，随后将菌株单菌落点至酪蛋白平板上，重新记录不同时间点菌落直径、沉淀圈与水解圈直径的比值，经比较得到若干株比值较大的菌株，对这若干株菌进行发酵实验，测定其不同发酵时间凝乳酶活力、蛋白酶水解活力和凝乳后脱脂乳pH值，进行综合比较后确定菌株。
实施例一：
图2是本发明的实施例中的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法的流程图。
如图2所示，本实施例提供了一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将地衣芽孢杆菌BL312在改良培养基上涂布、划线培养14～16小时，然后接种于培养地衣芽孢杆菌产凝乳酶的改良培养基中37℃，150～170r/min震荡培养12～14小时得种子液。
改良培养基通过将15g酪蛋白胨，5g酵母浸粉，50g葡萄糖，0.2gL-胱氨酸，1gNaCl，2gNa2HPO4·12H2O，2gNaHCO3以及2％的琼脂混合后加入去离子水定容至1000mL，并在115℃下灭菌20min后得到。
步骤2，将种子液以5％接种量接种于麸皮培养基中，在温度为37℃、转速为150r/min的条件下震荡培养40～48小时后得发酵液，将该发酵液在4℃的温度下以5000r/min的转速进行10min的冷冻离心后，取上清液。
震荡培养在250ml的发酵容器中进行，发酵容器中培养基装液量为50ml。
步骤3，将上清液与硫酸铵混合来得到混合液，将混合液在4℃的温度下沉析2小时后，再在4℃的温度下以7000r/min的转速进行10min的高速冷冻离心，而后收集沉淀物，并将该沉淀物溶解于20mmol/L且pH值为7的Tris-HCl缓冲液中，透析2小时后进行冷冻干燥，得到粗酶。
步骤4，将粗酶用20mmol/L且pH值为7的Tris-HCl缓冲液溶解后在压力下透过孔径为0.22μm的滤膜，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离纯化并透析、冷冻干燥后得到地衣芽孢杆菌凝乳酶。
步骤3和步骤4中的冷冻干燥均包括在-45℃的温度下预冻180分钟、在-10℃的温度下第一次干燥400分钟以及在4℃的温度下第二次干燥400分钟。
步骤4中，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱的起始缓冲液为20mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液，流速为5ml/min。
步骤4中，透析是在4℃的温度下透析2～4小时。
将得到的地衣芽孢杆菌凝乳酶溶解于去离子水中，探究该地衣芽孢杆菌凝乳酶在后期奶酪制作过程中所具备的优良性质，优良性质包括凝乳酶纯化过程中比酶活、得率和提纯比，凝乳酶pH稳定性，金属离子对凝乳酶的影响，脱脂乳pH对酶活的影响，脱脂乳Ca2+浓度对酶活的影响，凝乳酶热稳定性。
凝乳酶活性指40min凝集lmL 10％脱脂奶粉的酶量义为—个活力单位SU(Soxhletunit)。
凝乳活力(SU)＝(供试乳数量/凝乳酶量)×2400/T×N，式中：2400为40min转化为秒为单位；N为稀释倍数；T为凝乳时间，时间单位为s。
本实施例中测凝乳酶活力(MCA)的包括如下内容：
取5mL 100g/L的脱脂乳，室温放置40min后使用，在37℃水浴中孵育10min后，将0.5ml未稀释或采用0.05mol/L、pH 7的PBS稀释一定倍数的地衣芽孢杆菌发酵上清液加入至37℃的5mL的脱脂乳溶液中(试管)，每15s将样品取出并倾斜45℃观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间，静止后开始计时，以秒为单位，当试管壁上出现凝集颗粒为止，记录时间为t。
MCA＝(2400×5×n)/(t×0.5)，式中：MCA为凝乳酶活力(SU/mL)；t为凝乳时间/s；n为稀释倍数。
图3是本发明的实施例中脱脂乳体系pH对地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶活力的影响。
如图3所示，脱脂乳溶液的pH越大，地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶的活力越低。
图4是本发明的实施例中地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶的pH稳定性。
如图4所示，地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶的pH范围为3-12，并且在pH为6-10时凝乳酶活力保持稳定，在pH为7时达到最高活力。
图5是本发明的实施例中地衣芽孢杆菌BL312的凝乳形态。
如图5所示，试管中为地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶完成凝乳后的形态。
图6是本发明的实施例中不同添加量地衣芽孢杆菌BL312凝乳酶对鲜牛奶的凝乳切割形态。
如图6所示，左边为凝乳酶添加量为0.45g/L得到的鲜牛奶的凝乳切割形态，右边为凝乳酶添加量为0.75g/L得到的鲜牛奶的凝乳切割形态，随着凝乳酶添加量的增加，鲜牛奶的凝乳切割形态更加密集。
本实施例中用考马斯亮蓝法和凯氏定氮仪测定样品中的蛋白含量，其中考马斯亮蓝法包括如下内容：
将100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％的磷酸，用去离子水补充至1L，过滤即得Bradford浓染液；测定蛋白质样品标准曲线；将待测样品溶于缓冲液中；按1：5用去离子水稀释染料；每个样品加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min后在595nm波长下测定吸光度。
表1不同发酵时间凝乳酶活力值测定结果
Figure BDA0001961781460000091
如表1所示，采用本实施例的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，达到最大凝乳活力的发酵时间为48h，且最大凝乳活力为411.44SU/ml。另外，地衣芽孢杆菌BL312发酵时间缩短，产生的除凝乳酶外的杂蛋白减少，利于后期凝乳酶的纯化。
表2不同发酵时间的凝乳pH
Figure BDA0001961781460000092
如表2所示，地衣芽孢杆菌BL312在发酵过程中，凝乳pH比较稳定，基本保持在6.09。
表3纯化后的凝乳酶测定结果
Figure BDA0001961781460000101
如表3所示，采用本实施例的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法后，纯化比酶活为5291.01SU/mg，得率为39.24％，提纯比达到5.09，凝乳酶纯化后比酶活、得率和提纯比都有提高。
实施例二：
本实施例中将牛肉膏作为培养基来得到地衣芽孢杆菌凝乳酶，包括以下步骤：
步骤1，将地衣芽孢杆菌BL312在牛肉膏培养基上涂布、划线培养22～24小时，然后接种于培养地衣芽孢杆菌产凝乳酶的牛肉膏培养基中在温度为37℃，转速为150～170r/min的条件下震荡培养18～20小时得种子液。
步骤2，将种子液以5％接种量接种于30g/L麸皮培养基中37℃，150r/min震荡培养80～85小时得发酵液，将所得发酵液冷冻离心取上清。
步骤3，将上清液与硫酸铵混合，在4℃下沉析2小时后高速冷冻离心收集沉淀，并将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液中，透析2小时，冷冻干燥后得到粗酶。
步骤4，将粗酶用Tris-HCl缓冲液溶解，经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离纯化并透析、冷冻干燥后得到地衣芽孢杆菌凝乳酶。
表4不同发酵时间凝乳酶活力值测定结果
Figure BDA0001961781460000111
如表4所示，当地衣芽孢杆菌BL312以牛肉膏作为培养基，在发酵时间为84h时，凝乳活力值达到最大342.86SU/ml。并且，地衣芽孢杆菌BL312菌株的天然发酵凝乳活性较一般地衣芽孢杆菌高。
表5不同发酵时间的凝乳pH
Figure BDA0001961781460000112
如表5所示，地衣芽孢杆菌BL312在发酵过程中，凝乳pH比较稳定，基本保持在6.13。
实施例三：
本实施例的操作步骤和条件与实施例一相同，只是将步骤2中的种子液以5％接种量分别接种于20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L麸皮含量的培养基中，百分比为体积百分比。
表6不同麸皮含量对凝乳酶活力的影响
Figure BDA0001961781460000113
Figure BDA0001961781460000121
如表6所示，当地衣芽孢杆菌BL312采用改良的培养及发酵方法时，麸皮含量在20g/L-30g/L范围内，麸皮含量越高，产凝乳酶越早且活性越高，但超出这个范围，凝乳酶活力会越来越低，且麸皮培养基中的麸皮含量为30g/L得到最大凝乳酶活力。
实施例四：
本实施例的操作步骤和条件与实施例一相同，将步骤2所得上清液与不同质量硫酸铵混合，使得混合液中硫酸铵的饱和度分别为30％、40％、50％、60％和70％。
表7发酵上清液经不同饱和度硫酸铵沉析后凝乳酶活力值测定结果
Figure BDA0001961781460000122
如表7所示，当地衣芽孢杆菌BL312采用改良的培养及发酵方法时，沉析的最佳硫酸铵饱和度为60％。
实施例的作用与效果
根据实施例一与实施例二可知，相比与利用牛肉膏作为培养基来得到地衣芽孢杆菌凝乳酶，本发明的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法利用改良的培养及发酵方法来得到地衣芽孢杆菌凝乳酶，使得凝乳酶达到最大凝乳活力的发酵时间大大缩短，为48h，且凝乳活力提高为411.44SU/ml，且凝乳酶纯化后比酶活、得率和提纯比都有提高。
根据实施例三可知，在本发明的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法中，步骤2中的麸皮培养基中的麸皮含量最佳为30g/L。
根据实施例四可知，在本发明的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法中，步骤3中混合液的最佳硫酸铵饱和度为60％。
综上所述，根据实施例中所涉及的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，因为筛选的地衣芽孢杆菌所产凝乳酶活性高，纯化后比酶活、得率和提纯比较高，并且在制备方法上简化了制备工艺，提升了凝乳酶的纯化效率，大幅度缩短了发酵周期，提高了生产速度，降低了生产成本，所以能够更好地满足后期干酪生产的要求,对于细菌凝乳酶的工业化生产具有重要意义。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，其特征在于，采用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BL312进行制备，所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL312已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15009，所述地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法包括以下步骤：
步骤1，将所述地衣芽孢杆菌BL312涂布、划线培养14～16小时后接种于改良培养基中，并在温度为37℃、转速为150～170r/min的条件下震荡培养12～14小时后得到种子液；
步骤2，将所述种子液以5％接种量接种于麸皮培养基中，在温度为37℃、转速为150r/min的条件下震荡培养40～48小时后得发酵液，将该发酵液在4℃的温度下以5000r/min的转速进行10min的冷冻离心后，取上清液；
步骤3，将所述上清液与硫酸铵混合来得到混合液，将该混合液在4℃的温度下沉析2小时后，再在4℃的温度下以7000r/min的转速进行10min的高速冷冻离心，而后收集沉淀物，并将该沉淀物溶解于20mmol/L且pH值为7的Tris-HCl缓冲液中，透析2～4小时后进行冷冻干燥，得到粗酶；
步骤4，将所述粗酶用20mmol/L且pH值为7的所述Tris-HCl缓冲液溶解后在压力下透过滤膜，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离纯化并透析、冷冻干燥后得到所述地衣芽孢杆菌凝乳酶，
其中，所述步骤1中，改良培养基通过将15g酪蛋白胨，5g酵母浸粉，50g葡萄糖，0.2gL-胱氨酸，1gNaCl，2gNa2HPO4·12H2O，2gNaHCO3以及2％的琼脂混合后加入去离子水定容至1000mL，并在115℃下灭菌20min后得到。
2.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，其特征在于：
其中，所述步骤2中，震荡培养在250ml的发酵容器中进行，所述发酵容器中培养基装液量为50ml。
3.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，其特征在于：
其中，所述步骤4中，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱的起始缓冲液为20mmol/L、pH值为7.0的Tris-HCl缓冲液，流速为5ml/min。
4.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，其特征在于：
其中，所述步骤3和所述步骤4中的冷冻干燥均包括在-45℃的温度下预冻180分钟、在-10℃的温度下第一次干燥400分钟以及在4℃的温度下第二次干燥400分钟。
5.根据权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，其特征在于：
其中，所述步骤4中，透析是在4℃的温度下透析2～4小时。
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