CN103215186B

CN103215186B - Nisin-LAB EPS乳酸菌复合发酵剂及其应用

Info

Publication number: CN103215186B
Application number: CN201310036261.4A
Authority: CN
Inventors: 弓耀忠; 王呈; 冯晓斌; 姚春孝; 梁宝爱; 巩强
Original assignee: Shanxi food quality safety supervision inspection research institute
Current assignee: Shanxi food quality safety supervision inspection research institute
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2015-12-23
Anticipated expiration: 2033-01-31
Also published as: CN103215186A

Abstract

本发明Nisin-LAB？EPS乳酸菌复合发酵剂及其应用，属于菌种发酵技术领域。所述复合发酵剂由菌1、菌2、明串珠菌Lvan04和乳酸乳球菌LA02四种菌株组成，所述各菌株之间的体积百分比为菌2∶菌1∶明串珠菌Lvan04∶乳酸乳球菌LA02＝3∶3∶6∶4；其中菌1为嗜热链球菌(Streptococcus？thermophilus)，菌2为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus？delbruecckii？subsp.bulgaricus)。本发明具有通过乳酸菌发酵产生EPS提高产品的粘度、稳定性及口感，取代传统的向产品中添加稳定剂的方法，这样不但大大降低了产品的生产成本和原料成本，同时还大大提高了产品的品质；将Nisin乳酸菌引入发酵剂，不仅大大提高了乳发酵制品的货架期和食品安全性，同时也为Nisin的应用提供了新思路的优点。

Description

Nisin-LAB EPS乳酸菌复合发酵剂及其应用

技术领域

本发明属于菌种发酵技术领域，具体涉及一种Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂及其应用。

背景技术

乳酸菌(lacticacidbacterium，LAB)是一类能发酵利用碳水化合物并产生大量乳酸的细菌。乳酸菌肽(Nisin)是乳酸乳球菌产生、由34个氨基酸组成的短肽，对革兰氏阳性菌尤其是食物中的致病菌有强烈的抑制作用，并具有较强的热稳定性，是天然的防腐剂；乳酸菌胞外多糖(LABEPS)即是这类细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液或荚膜多糖。

国外对乳酸菌细菌素的研究比较早，报道的文献资料很多。而国内则起步较晚，除了Nisin的研究外，很少见到有关其它乳酸菌细菌素的报道。到目前为止，对其的研究主要在Nisin产生菌和对Nisin提纯及如何提高产量上。将Nisin菌作为一种发酵剂研究还未见文献报导。

目前对其的研究主要在LABEPS分类、组成、适宜工艺件和应用等方面。据国内外相关资料显示，EPS高产量乳酸菌已应用于酸乳直投式发酵剂生产，但其核心技术仍处于国外商业垄断状态。目前研究的大多数产胞外多糖的乳酸菌来自于乳制品，也能从发酵肉制品中分离到。VandenBerg等从600株乳酸菌中筛选出30株产胞外多糖的乳酸菌，并对其中一株清酒乳杆菌(Lbsake0-1)及其胞外多糖进行了较深人的研究。常见的乳品工业生产菌如：菌2(德氏乳杆菌保加利亚亚种)(Lbdelbruecckiisspbulgaricus)、瑞士乳杆菌Lbhelveti-cus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lbcaselsspcasel)、马乳酒样乳杆菌(Lbkefiranofaciens)、嗜酸乳杆菌(Lbacidophilus)、菌1(嗜热链球菌)(S.therm.phihts)乳酸乳球菌乳脂亚种(Lc.lactissspCrelTIOrlS)、乳酸乳球菌(Lc.lactis)、肠膜明串珠菌(Leuc.nlesenteroides)等均能产胞外多糖。此外，乳酸菌中的片球菌属(Pediococcus)也可产胞外多糖，如β-葡聚糖，是啤酒和葡萄酒加工中的有害菌。

乳酸菌产胞外多糖(LABEPS)对乳酸菌而言是一种显著的耗能行为。目前，对乳酸菌胞外多糖的生理作用尚不完全清楚。一般认为，胞外多糖具有保护作用，如形成亲水表面防止细胞干裂、螯合重金属离子防止其毒害、使噬菌体不敏感从而防止其侵害、防止抗菌素破坏(抗菌素必须在胞外多糖中达到饱和以后才能到达细胞壁)、提供高氧张力等。此外，胞外多糖还参与金属离子吸收、营养物转运、致病性识别、起粘合作用及作为储备碳源等。

乳酸菌产胞外多糖(LABEPS)具有增加人体免疫能力、抗肿瘤和改善肠胃功能等生理作用。此外，由于其具有独特的优良特性决定的，如在低浓度下能增大粘滞性而不形成凝胶；微小的切变力，即可增大其流动性，切变力消除，粘度又很快恢复；在酸性条件下稳定性好。LABEPS可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂和持水剂应用到食品、制药及生化产品等领域。

乳酸菌生产胞外多糖(LABEPS)在某些方面具有优势。一方面，许多乳酸菌是历史悠久的食品工业生产菌，生产食品级多糖更为容易；另一方面，乳酸菌生产胞外多糖一般在厌氧条件下进行、不再有高粘溶液发酵中氧传递问题，还可节省大量的搅拌能，其放大生产相对容易；此外，采用嗜热乳酸菌无需冷却系统。已有将产黄原胶的基因簇重组到质粒载体或噬菌体上，再通过转化或转导到厌氧菌中，以正常速度表达而成为节能工程菌的报导。用乳酸菌构建食品级工程菌具有多方面的优势。可以预料，随着食品生物技术的发展，对乳酸菌胞外多糖的研究将进一步深人，有望开发出应用范围广泛的乳酸菌多糖产品。

乳酸菌Nisin和LABEPS有很多特点，已经引起广大从事乳酸菌、食品添加剂、益生素及开发新药等领域研究人员的极大兴趣，出现了研究热潮。目前的研究主要集中于新菌株和高产菌株的筛选、对已知乳酸菌Nisin和LABEPS遗传因子的鉴定及结构基因的克隆和排序、乳酸菌Nisin和LABEPS开发应用等方面。我国是一个乳酸菌资源非常丰富的国家，但对乳酸菌Nisin和LABEPS的研究起步晚，特别是开发应用方面的研究尤显不足。因而进行Nisin---LABEPS乳酸菌复合发酵剂方面的研究不仅具有重要的理论意义，而且具有广阔的应用前景。相信二十一世纪乳酸菌及乳酸菌Nisin和LABEPS将对人类健康发挥巨大的作用。

近年来，我国发酵乳产业发展迅猛，对发酵乳生产发酵剂的需求量不断增加。由于发酵乳生产发酵剂自身缺陷，使发酵乳产品时常发生粘度不足、成型不理想以及货架期短等问题，为了提高发酵乳产品的稳定性和粘稠度，为了延长产品的货架期，多以添加增稠稳定剂和防腐剂为主，其效果不很理想，增加了产品的生产成本，同时加大了食品的安全风险。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂。

本发明的另一个目的在于公开了上述复合发酵剂在乳酸菌发酵中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂，其中，所述复合发酵剂由菌1、菌2、明串珠菌Lvan04和乳酸乳球菌LA02四种菌株的菌液组成，所述各菌液之间的体积比为菌2∶菌1∶明串珠菌Lvan04∶乳酸乳球菌LA02＝3∶3∶6∶4；其中LA02CGMCCNo.1.2030，Lvan04CGMCCNo.1.2138，菌1为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)CGMCCNo.1.2471，菌2为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbruecckiisubsp.bulgaricus)CGMCCNo.1.1480。明串珠菌Lvan04(明串珠菌LeuconostoclactisLvan04)为高产LABEPS乳酸菌，乳酸乳球菌LA02(乳酸乳球菌Lactococcuslactissubsp.lactisLA02)为高产Nisin乳酸菌。

Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂，其中，所述复合发酵剂由菌1、菌2、明串珠菌Lvan04和乳酸乳球菌LA02四种菌株的菌液组成，所述各菌液之间的体积百分比为菌2∶菌1∶明串珠菌Lvan04∶乳酸乳球菌LA02＝2∶1∶3∶2。

上述技术方案中所述的Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂在制备酸奶中的应用，其中，Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂在脱脂乳培养基中发酵温度37℃，添加蔗糖的质量百分比为8％。

本发明中各菌液中含有的菌体浓度在1.0×10⁶个/mL.以上。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过乳酸菌发酵产生EPS提高产品的粘度、稳定性及口感，取代传统的向产品中添加稳定剂的方法，这样不但大大降低了产品的生产成本和原料成本，同时还大大提高了产品的品质；

2、本发明将Nisin乳酸菌引入发酵剂，不仅大大提高了乳发酵制品的货架期和食品安全性，同时也为Nisin的应用提供了新思路；

3、本发明以自主研制的Nisin-LABEPS乳酸菌发酵剂，取代进口直投式乳酸菌发酵剂，大大降低了产品成本。

4、本发明主要将LABEPS高产量的乳酸菌和Nisin高产量的乳酸菌同时引入乳制品发酵剂，形成一种新的乳制品发酵剂。从而在不添加稳定剂、增稠剂和防腐剂的情况下，能很好的提高乳制品的稳定性和营养价值，同时降低生产成本和增强食品的安全性。

具体实施方式：

1、图1为葡萄糖标准曲线图；

2、图2为粘度与胞外多糖的含量标准曲线图；

3、图3为Nisin-LABEPS酸奶与普通酸奶粘度变化图；

4、图4为Nisin-LABEPS酸奶与普通酸奶酸度变化图；

5、图5为Nisin-LABEPS酸奶、Nisin-LABEPS酸奶加黄色微球菌、普通酸奶、普通酸奶加黄色微球菌酸度变化图。

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例来对本发明的技术作进一步的说明。

以下实施例和试验例中的菌1为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)CGMCCNo.1.2471，菌2为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbruecckiisubsp.bulgaricus)CGMCCNo.1.1480，菌1和菌2可以从中科院微生物所获得，Lvan04为明串珠菌(Leuconostoclactis)Lvan04，LA02为乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.lactis)LA02。

实施例一：Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂的制备：

一、实验所用菌株及所用试剂

所用菌株为Lvan04、LA02、菌2、菌1，所用培养基为MC培养基、MRS肉汤培养基、代血浆培养基(不加琼脂)、脱脂乳培养基。

MC培养基(乳酸菌培养用)购自北京陆桥；

MRS肉汤培养基(乳酸菌培养用)购自北京陆桥；

代血浆培养基(不加琼脂)：蔗糖130.0g、蛋白胨2.0g、KH₂PO₄0.3g、Na₂HPO₄1.4g蒸馏水1.0L，PH7.0-7.2；

脱脂乳培养基：由鲜牛乳离心脱脂获得；

鲜牛乳：由畜牧所牛场提供，鲜牛乳中各成分含量：总干物质11.50％-12.10％、无脂干物质8.25％-8.60％、蛋白质2.85％-3.25％、脂肪3.27％-3.50％。

二、实验方法及步骤：

(一)、菌种的制备：将在MC培养基上培养的Lvan04、LA02、菌2、菌1，分别接种于MRS肉汤培养基中，Lvan04、LA0232℃培养48h、菌2、菌137℃培养48h→离心→分别取沉淀物，Lvan04接种于代血浆培养基(不加琼脂)中32℃培养，LA02接种于脱脂乳培养基中32℃培养，菌2、菌1接种于脱脂乳培养基中37℃培养→Lvan04代血浆培养基(不加琼脂)变的混浊粘稠后取出，4℃保存作为菌种备用；LA02、菌2、菌1脱脂乳培养基凝固后取出，4℃保存作为菌种备用。

(二)、粘度与胞外多糖的含量的标准曲线方程校正系数k确定：

1、粘度值与胞外多糖的含量的标准曲线方程建立的方法及步骤：

(1)、将在MC培养基上培养的Lvan04、LA02分别接种于MRS肉汤培养基中，32℃培养48h；将在MC培养基上培养的菌2、菌1分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃培养48h。

(2)、将在MRS肉汤培养基中培养48h的Lvan04，离心，取沉淀物，按1％接入代血浆培养基(不加琼脂)32℃培养48h，放入4℃冰箱保存，得到发酵产物1；

将在MRS肉汤培养基中分别培养48h的LA02、LA02、菌2、菌1，离心，分别按1％取沉淀物，接种于同一脱脂乳培养基中，等脱脂乳培养基凝固，即时取出放入4℃冰箱保存，得到发酵产物2；

(3)、将发酵产物1在4℃冰箱保存12h后，用12000r/min(4℃)离心30min，取上清液1ml加蒸馏水10ml，用12000r/min(4℃)离心30min，取上清液1ml加蒸馏水10ml，于4℃下透析24h(中间要更换一次蒸馏水200ml)，得到待测液1；

(4)、将待测液1称重，用硫酸-蒽酮法测定其总糖含量，以葡萄糖作为标准(葡萄糖标准曲线见图1)。从而可得到发酵产物1的胞外多糖的含量(mg/l)；

(5)、将已知胞外多糖的含量的发酵产物1为基础，蒸馏水为稀释液，配胞外多糖的标准液，其含量分别为200mg/l、400mg/l、600mg/l、800mg/l、1000mg/l、1200mg/l。将胞外多糖的标准液在4℃冰箱保存12h后，依次取出测定其粘度值，建立粘度值与胞外多糖的含量的标准曲线方程；

(6)、将发酵产物2在4℃冰箱保存12h后，取出用第二阶段实验报告中的3.3.1、3.3.2的方法，测定发酵产物2胞外多糖的含量Y₁，并测定其粘度值x₂。将粘度值x₂代入粘度值与胞外多糖的含量的标准曲线方程，得到胞外多糖的含量Y₂，U₁-Y₂＝k，k为粘度值与胞外多糖的含量的标准曲线方程的校正系数。

2、粘度值与胞外多糖的含量的标准曲线方程：

根据表1中的胞外多糖与粘度之间的数值关系，制作得到图2所示的粘度与胞外多糖的含量的标准曲线图，由图2可得粘度与胞外多糖的含量的标准曲线方程为y＝90.581e^1.1025x+k，k为校正系数。

表1胞外多糖与粘度之间的数值关系

胞外多糖的含量(mg/l)	200	400	600	800	1000	1200
							粘度(mPa·s)	8.3	13.6	18.4	21.5	23.6	25.2

(三)、复合发酵剂中四种菌株的接种比例的实验方案采用正交实验法，选用L₁₆(4)⁴正交表安排实验，考察因素、水平见表2，实验所用培养基为脱脂乳培养基，蔗糖添加量为8％，发酵温度为37℃。

表2正交实验因素及水平

三、实验结果：

1、粘度与胞外多糖的含量的标准曲线方程校正系数k确定和产品粘度底线的界定：

测定发酵产物2胞外多糖的含量Y₁＝1387mg/l；测定发酵产物2粘度值x₂＝23.4，将x₂代入y＝90.581e^0.1025x，得Y₂＝997mg/l，Y₁-Y₂＝390，校正系数k＝390，则标准曲线方程为y＝90.581e^01025x+390。

产品中LABEPS≥800mg/L，即x＝x₀＝800mg/L，则对应的粘度Y₀＝14.8mPa·s，14.8mPa·s为本次实验产品粘度底线。

2、正交实验综合评定标准及综合评定结果：

样品发酵凝固后要即时取出，放入4℃冰箱，保存12h后进行评定。

综合评定标准：粘度(mPa·s)×10+抑菌圈直径(mm)×10-A所得值为其得分。综合评定标准成立的条件：粘度(mPa·s)≥14.8抑菌圈直径≥13mm，A的取值条件：当样品的凝固时间(t)5～8h，A＝t×10；当样品的凝固时间≤5h或＞8h，A＝100

综合评定结果见表3所示：

表3乳酸发酵综合评定结果

正交试验结果分析见表4所示，其中表4中的A为菌2菌1接种比例，B为菌2菌1混合接种量％，C为Lvan04接种量％，D为LA02接种量％；K1为本列1的总和，为平均数K1/4：

表4正交试验结果分析

经过计算后，得到综合评定结果得分填入正交实验结果分析表右侧评定结果一栏内，分别计算4个因素在各水平的得分平均值和极差R。

从正交实验结果分析表可看出，影响样品品质主次因素顺序是C、D、B、A，由直观分析，得出最优组合为C₄D₃B₄A₂，即菌2菌1接种比列1∶1，菌2菌1混合接种量3％，Lvan04接种量3％，LA02接种量2％，其中百分比均为质量百分比，复合发酵剂中四种菌株的接种比例为菌2∶菌1∶Lvan04∶LA02＝3∶3∶6∶4。

实施例二：工业生产中Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂的制备：

在实际生产中，作为发酵剂的乳杆菌和乳球菌的比例对产品的风味起重要作用，本实施例通过以下实验来确定两者的比例以及发酵条件。

一、实验所用菌株及所用试剂：

同实施例一中内容。

二、实验方法

1、菌种的制备：同实施例一中的菌种制备。

2、实验方案：采用正交实验法，选用L₉(3)³正交表安排实验，考察因素、水平见表5。实验所培养基为脱脂乳培养基，四种菌株的接种量为菌2菌1混合接种量3％、Lvan04接种量3％、LA02接种量2％。。

表5正交实验因素及水平

3、正交实验综合评定标准见表6：

表6产品感观综合评定标准(总分100分)

4、正交实验综合评定结果及结果分析：

样品发酵凝固后要即时取出，放入4℃冰箱，保存12h后进行评定。正交实验综合评定选用10位一定经验的人员对样品进行评定，取平均数作为该样品的得分。综合评定结果见表7。

表7正交实验发酵综合评定结果

表8发酵正交试验结果分析

表8为发酵正交试验结果分析表，其中表8中A为菌2菌1接种比列，B为发酵温度(℃)，C为蔗糖添加量(％)；K1为本列1的总和，为平均数K1/4从正交实验结果分析表可看出，影响样品品质主次因素顺序是A、B、C，由直观分析，得出最优组合为A₂B₁C₂，即菌2菌1接种比例为2∶1。

综上所述，复合发酵剂菌株的配比关系为菌2∶菌1∶Lvan04∶LA02＝2∶1∶3∶2复合发酵剂应用时其发酵温度37℃，蔗糖添加量8％。

以下通过试验例来具体说明采用本发明的复合发酵剂发酵所得的酸奶与市售普通凝固性酸奶相比所具有的优点。

试验例一：Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂酸奶与普通凝固型酸奶的比较

选用Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂发酵酸奶(以下为Nisin-LABEPS酸奶)与市售普通凝固型酸奶进行对比。以粘度、酸度、感官评定结果为指标，考察28天内两种产品各个指标的变化情况。

1、粘度变化情况比较：

产品于4℃存放，每周测产品粘度，结果见图3，由图3可见，Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂发酵酸奶的粘度在考察期内从3500mPa·s升到4000mPa·s，变化平稳，普通凝固型酸奶的粘度从3500mPa·s降到1470mPa·s，粘度损失很大；这与Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂发酵酸奶中含有产胞外多糖菌株有关。

2、酸度变化情况比较：

产品于4℃存放，每周测产品酸度，结果见图4，可见，Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂发酵酸奶的酸度在考察期内从78.870T升到86.340T，变化7.470T，普通凝固型酸奶的酸度从80.920T升到91.750T，变化10.830T。这与Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂发酵酸奶中含有产Nisin菌株有关。

3、感官评定结果比较：

产品于4℃存放，每周取样进行感官评定，比较结果见表9：

表9Nisin-LABEPS酸奶与普通酸奶感官比较

由表1可见，Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂发酵酸奶的口感及状态在考察期内变化平稳，普通凝固型酸奶的感官在考察期内口感及状态变化较大。这与Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂发酵酸奶中含有产胞外多糖菌株和产Nisin菌株有关。

试验例二：Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂酸奶与普通凝固型酸奶对黄色微球菌NCIB8166的抑制作用比较：

本试验中添加有害菌黄色微球菌NCIB8166的目的是为了反映复合发酵剂对有害菌抑制能力。

在制作Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂酸奶与普通凝固型酸奶的同时，分别在其中加入黄色微球菌NCIB8166(中科院微生物所提供)，产品于4℃存放，每周测产品酸度，结果见图5所示，可见，Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂酸奶对黄色微球菌NCIB8166的抑制作用持久，普通凝固型酸奶对黄色微球菌NCIB8166的抑制作用甚微。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂，其特征在于：所述复合发酵剂由菌1、菌2、明串珠菌(Leuconostoclactis)Lvan04和乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.lactis)LA02四种菌株的菌液组成，所述各菌液之间的体积比为菌2∶菌1∶明串珠菌Lvan04∶乳酸乳球菌LA02＝3∶3∶6∶4；其中LA02CGMCCNo.1.2030，Lvan04CGMCCNo.1.2138，菌1为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)CGMCCNo.1.2471，菌2为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbruecckiisubsp.bulgaricus)CGMCCNo.1.1480。

2.Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂，其特征在于：所述复合发酵剂由菌1、菌2、明串珠菌(Leuconostoclactis)Lvan04和乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.lactis)LA02四种菌株的菌液组成，所述各菌液之间的体积比为菌2∶菌1∶明串珠菌Lvan04∶乳酸乳球菌LA02＝2∶1∶3∶2；其中LA02CGMCCNo.1.2030，Lvan04CGMCCNo.1.2138，菌1为嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)CGMCCNo.1.2471，菌2为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbruecckiisubsp.bulgaricus)CGMCCNo.1.1480。

3.权利要求1或2所述的Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂在制备酸奶中的应用，其特征在于，Nisin-LABEPS乳酸菌复合发酵剂在脱脂乳培养基中发酵温度37℃，添加蔗糖的质量百分比为8％。