KR20200007903A

KR20200007903A - 세균성 다당류의 생산

Info

Publication number: KR20200007903A
Application number: KR1020197036822A
Authority: KR
Inventors: 산딮 샤르마; 산? 샤르마; 니틴 쿠마르; 사르마드 하니프; 마노즈 쿠마르 치카라; 다빈더 길
Original assignee: 엠에스디 웰컴 트러스트 힐레맨 랩스 피브이티. 리미티드
Priority date: 2017-05-17
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2020-01-22
Also published as: ZA201908300B; CN110799650A; RU2019140344A; US20210254113A1; AR111939A1; WO2018211522A1; RU2019140344A3; AR112056A1

Abstract

본 발명은 특히 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 생산을 위한 배양 배지 조성물, 공급 조성물 및 발효 조건에 관한 것이다. 본 발명은 나이세리아 메닌지티디스의 생산을 위한 신속하고 산업적으로 확장 가능한 비용 효과적인 공정을 기재한다. 본 발명의 엔. 메닌지티디스 다당류는 수막 구균성 감염에 대한 경제적인 다당류 단백질 접합체 백신(들)의 생산에 사용될 수 있다.

Description

세균성 다당류의 생산

본 발명은 세균성 다당류의 개선된 생산 공정에 관한 것이다. 본 발명은 특히 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 다당류의 생산을 위한 배양 배지 조성물, 공급 조성물, 발효 조건 및 정제 공정에 관한 것이다. 본 발명의 엔. 메닌지티디스 다당류는 수막 구균성 감염에 대한 경제적인 다당류 단백질 접합체 백신(들)의 생산에 사용될 수 있다.

종종 뇌척수막염균(meningococcus)이라 지칭되는 나이세리아 메닌지티디스는 수막염(meningiitis) 및 수막구균혈증(meningococcemia)과 같은 수막 구균성 질환의 다른 형태를 일으킬 수 있는 그램-음성 세균이다.

엔. 메닌지티디스(Men)에 존재하는 캡슐 다당류의 유형에 기초하여, 13개의 혈청군(serogroup)이 동정되었고, 엔. 메닌지티디스의 13개의 동정된 캡슐 유형 중 6개(A, B, C, W135, X 및 Y)는 전세계 대부분의 수막 구균성 질환 사례를 차지한다. MenA는 아프리카와 아시아에서 가장 널리 알려진 혈청군이었지만, 북미에서는 드물고/실제로 존재하지 않는다. 유럽 및 미국에서, 혈청군 B(MenB)는 질환 및 사망의 주요 원인이며, 혈청군 MenC 및 MenW가 뒤따른다. 최근에, MenX 발생은 사하라 사막 이남의 아프리카에서 나타나기 시작했다. 다수의 혈청군은 수막 구균성 질환에 대한 범용 백신의 개발을 방해했다.

최초 수막염 다당류 백신의 생산은 이 치명적인 질환에 대항할 긴급한 필요성이 존재했기 때문에 1978년에 달성되었다. 이후, 일반적인 다당류 기반 백신은 2세 미만의 어린이에게는 매우 효과적이지 않은 것으로 관찰되었다. 이러한 관찰은 영아가 미성숙 면역계를 가지고 있고, 일반 다당류에 대한 면역 반응을 이끌어 낼 수 없음을 나타내는 추가 연구를 유도했다.

면역 반응은 T-세포 의존성(TD) 면역 반응 및 T-세포 독립적(TI) 면역 반응으로서 특징지워질 수 있다. 단백질 및 펩타이드는 헬퍼 T 림프구를 자극하고 기억 세포를 생성함으로써 TD 항원을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 대조적으로, 다당류는 T-세포 활성화를 유도하지 않고 임의의 기억 B 세포를 형성하지 않는 TI 항원에 속하며, 이는 미성숙 면역계를 갖기 때문에 영아를 다루는 동안 주요 단점이다.

따라서, 영아들 사이에서 증가된 면역원성, 연장된 보호 기간 및 뇌척수막염균의 비인두 캐리지의 감소를 특징으로 하는 T-세포 의존성 면역 반응을 유도하는 단백질 담체에 세균성 다당류를 접합시킬 필요가 있었다. 이러한 요구는 다당류-단백질 접합체 백신의 생산을 초래하는 독창적인 연구에 의해 충족되었고, 최초의 수막 구균성 접합체 백신이 1999년 영국에서 허가되었다.

백신의 제조에 사용되는 다당류, 특히 항원성 다당류는 각각 1개, 2개 또는 더 많은 다당류를 함유하는 1가, 2가 및 다가 (다중) 백신일 수 있다. 이들은 다양한 미생물에 의해 유발된 특정 질환 또는 감염의 예방을 위해 시장에서 쉽게 구입할 수 있다. 다가 다당류 기반 백신은 수년 동안 사용되어 왔으며, 폐렴구균, 수막 구균 또는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 질환과 같은 질환을 예방하는 데 유용한 것으로 입증되었다.

정제된 엔. 메닌지티디스 캡슐 다당류의 생산은 담체 단백질과의 효과적인 접합 및 접합체 백신으로서의 이의 개발을 위한 가장 중요한 요건이다. 대부분의 세균 발효 배지는 전통적으로 다당류 생산을 위한 수막 구균성 세균의 성장을 위해 동물성 성분을 사용한다. 동물성 성분 부재 배지는 지역적 선호도 측면에서 이점을 제공하고, 질환, 예를 들어, 전염성 해면상 뇌병증(TSE) 및 소 해면상 뇌병증(BSE)을 유발하는 감염성 제제를 피하는 것이 목적시될 것이다. 캡슐 다당류의 생산을 위한 엔. 메닌지티디스의 배양 비용은 일반적으로 높고, 일련의 생산 및 풀질 관리 단계를 포함하기 때문에 작업 시간이 오래 걸린다. 최적화된 동물성 성분 부재 배지는 이러한 문제를 제거할 수 있다.

다당류 생산 단계에서의 개선은 효과적이고 경제적으로 실행 가능한 접합체 백신의 제형을 유도할 것이다.

다당류의 생산 및 정제 공정을 기재하는 다수의 특허 및 비특허 개시 내용이 있다. 이러한 개시 중 하나는 수막 구균성 수막염 백신을 생산하는 방법을 개시하는 특허 출원 번호 제US 12/041,745호이고, 상기 방법은 엔. 메닌지티디스 까다로운 배지(NMFM)에서 혈청군 A, C, Y 및 W-135의 캡슐 다당류를 생산하기 위해 엔. 메닌지티디스를 배양하는 단계, 배양물로부터 캡슐 다당류를 단리시키는 단계, 임의의 잔류성 세포 바이오매스의 캡슐 다당류를 정제하는 단계 및 캡슐 다당류를 기계적으로 탈중합시키는 단계를 포함한다. 인용된 기술은 정제된 캡슐 다당류의 생산에 오랜 시간을 이용한다.

다른 미국 특허 공보 번호 제US 20150299750 A1호는 나이세리아 메닌지티디스 다당류를 제조하기 위한 개선된 배양, 발효 및 정제 조건을 개시한다. 다른 미국 특허 공보 번호 제20080318285 A1호는 짧은 발효 기간 동안 캡슐 다당류의 수율을 최대화하고, 최소한의 세포 바이오매스 및 내독소를 생성하도록 설계된 나이세리아 메닌지티디스 까다로운 배지를 개시한다.

본 발명의 ACFM(동물성 성분 부재 배지)은 미국 특허 공보 번호 제US 2015/0299750호의 샨카르 피살(Shankar Pisal) 및 미국 특허 공보 번호 제US 2008/0318285호의 제리 레디(Jeeri reddy)에 의해 사용된 것과 상이하고, 상기 종래 기술 어떤 것도 셀렉트 피톤(Select phytone) 및 TC 이스톨레이트(yeastolate)를 사용하지 않았다. Select Phytone™은 식물 기원의 펩톤이다. 천연 비타민과 결합된 피톤의 질소 함량은 세균 성장을 지원한다. 피톤의 내독소 수준은 500 EU/g 이하이다. TC 이스톨레이트는 펩타이드, 아미노산, 탄수화물 및 비타민의 혼합물이다. TC 이스톨레이트 생성물은 동물성 성분 부재이고, 자동분해된 효모의 수용성 부분이다. TC 이스톨레이트, UF는 10,000 MWCO(분자량 컷오프)에서 한외 여과되었다. 그것은 내독소 값이 500 EU/g 미만이다. 그것은 세균 성장 촉진을 향상시키는 다양한 영양 보충제이다. 그것은 성장 촉진에 사용되는 대부분의 개별 성분을 대체하는 새로운 부류의 배지 성분이다. 본 발명의 본 배지 조성물은 다른 발명자들에 의해 종래 기술에서 사용된 카사미노산조차 포함하지 않는다. 동물성 성분 부재 배지의 가장 큰 장점은, 지역적 선호도로 인해, ACFM 백신(수백만 용량)이 중동, GCC(걸프 협력 회의; Gulf Cooperation Council) 국가 및 기타 국가에서 수요가 매우 높고, 추가의 이러한 백신이 BSE 및 TSE를 함유하지 않는다는 것이다.

따라서, 엔. 메닌지티디스 혈청군의 생산에 사용되는 다양한 방법은 현재 동물성 성분 배지를 이용하고, 다당류의 배양을 위한 발효 공정에 대해 최대 20 내지 24시간 또는 그 이상의 비교적 긴 시간이 소요되어 생산 비용을 증가시키고, 비용 효율적이고 시기 적절한 방식으로 확장할 수 없고 동물성 성분을 갖기 때문에 공정을 상업적으로 덜 실현 가능하게 한다.

본 발명의 목적은 감소된 시간 및 높은 수율로 발효에 의해 엔. 메닌지티디스 다당류를 보다 잘 생산하기 위한 개선된 배양 배지 및 공급 배지를 제공하는 것이다. 상기 개선은 보다 저렴한 가격으로 다당류 단백질 접합체 백신을 유도할 것이고, 이어서 백신을 개발 도상국 어린이들이 알맞은 가격으로 이용할 수 있게 할 수 있다.

본 발명의 주요 목적은 세균성 다당류의 생산 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 나이세리아 메닌지티디스의 다양한 혈청군의 캡슐 다당류의 생산 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 동물성 성분을 함유하지 않는 최적화된 배양 배지 및 공급 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 까다로운 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 A, C, W, X 및 Y의 성장을 위한 개선된 배양 배지 및 공급 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 간단하고 효율적이며 개선되고 상업적으로 확장 가능한 방법에 의해 매우 짧은 시간에 낮은 불순물을 갖는 더 우수한 다당류 수율로 감소된 시간에 발효 공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 나이세리아 메닌지티디스 다당류를 정제하면서, 간단하고 효율적이며 개선되고 상업적으로 확장 가능한 방법에 의해 매우 짧은 시간 내에 불순물을 제거하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 관련 품질 사양을 만족시키는 고품질 생성물을 더 나은 수율로 생산하는 것이다.

본 발명은 세균성 다당류의 생산을 위한 세균, 바람직하게는 나이세리아 메닌지티디스의 성장을 위한 신속하고 산업적으로 확장 가능한 비용 효과적인 공정을 기재한다. 상기 공정은 엔. 메닌지티디스 다당류를 상당히 감소된 시간에 정제하기 위한 정제 방법을 제공한다.

본 발명은 1.00±0.5 g/L의 농도 범위의 일나트륨 글루타메이트, 3.25±1.0 g/L 범위의 인산수소이나트륨, 0.09±0.1 g/L 범위의 염화칼륨, 10.0±2.0 g/L 범위의 셀렉트 피톤, 4.0±2.0 g/L 범위의 이스톨레이트, 5.00±2.0g/L 범위의 덱스트로스, 0.03±0.1 g/L 범위의 L-시스틴, 0.60±0.5 g/L 범위의 염화마그네슘, 0.25±0.1 g/L 범위의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 1.00±0.2 g/L 범위의 염화암모늄 조성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 엔. 메닌지티디스를 위한 배양 배지를 기재한다. 상기 언급된 배양 배지 조성물은 엔. 메닌지티디스 혈청군에 최적의 성장을 제공한다.

본 발명은 또한 6.00±2.0 g/L 범위의 L-글루탐산, 20±2.0 g/L 범위의 덱스트로스, 0.50±0.1 g/L 범위의 L-세린, 0.20±0.1 g/L 범위의 L-아르기닌, 0.20±0.1 g/L 범위의 글리신, 0.20±0.1 g/L 범위의 L-트립토판, 5±2.0 g/L 범위의 TC-이스톨레이트 및 요건에 따라 L-시스틴, 염화마그네슘, 염화칼슘, 황산제일철, 염화암모늄과 같은 기타 성분을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 엔. 메닌지티디스의 공급 배지를 기재한다. 상기 언급된 공급 배지 조성물은 전술한 배양 배지와 함께 발효기 배양 동안 발효 브로스(fermentation broth)에 첨가될 때 엔. 메닌지티디스 혈청군에 대해 최적의 성장을 제공한다.

본 발명은 발효가 11±3시간 내에 완료되도록 소정된 온도, pH, 기류, 용존 산소 및 진탕 속도에서의 발효 공정을 기재한다.

본 발명은 고수율의 엔. 메닌지티디스 혈청군 W 및 Y 캡슐 다당류를 생산하기 위한 정제 단계를 기재한다. 발효 브로스로부터의 미정제 다당류는 MilliQ 물(MQW)에 대해 농축 및 정용여과되어 불순물 수준이 감소된 농축물을 형성한다. 이렇게 수득된 농축물을 최적의 시간 동안 소정의 온도에서 1±0.2M의 NaOH와 같은 알칼리로 처리한다. 생성되는 부분적으로 정제된 다당류를 MQW로 다시 정용여과 한 다음, 탄소 여과하고, 최종적으로 멸균 여과를 수행한다.

도 1은 진탕 플라스크 연구(Shake Flask Study) 1(6개의 ACFM 조성물)의 성장 곡선을 도시한다.
도 2는 진탕 플라스크 연구 2(5개의 ACFM 및 1개의 ACM 조성물)의 성장 곡선을 도시한다.
도 3은 ACFM을 갖는 MenA 배치의 성장 곡선을 도시한다.
도 4는 ACFM을 갖는 MenC 배치의 성장 곡선을 도시한다.
도 5는 ACFM을 갖는 MenY 배치의 성장 곡선을 도시한다.
도 6은 ACFM을 갖는 MenW 배치의 성장 곡선을 도시한다.
도 7은 ACFM을 갖는 MenX 배치의 성장 곡선을 도시한다.

본 발명은 더 짧은 시간에 까다로운 나이세리아 메닌지티디스의 성장을 위해 동물성 성분을 함유하지 않는 최적화 배양 배지 및 공급 배지를 개시한다.

동물성 성분 부재 배지의 가장 큰 장점은 ACFM 백신의 지역적 선호도로 인해 ACFM 백신(수백만의 용량)이 중동, GCC(걸프 협력 회의) 국가 및 기타 국가에서 수요가 높다는 것이다. 또한, 이러한 백신은 TSE 및 BSE 위험을 함유하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예가 기재되기 전에, 본 발명은 다양할 수 있기 때문에 기재된 특정 재료로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님이 이해된다.

본 발명은 1.00±0.5 g/L의 농도 범위의 일나트륨 글루타메이트, 3.25±1.0 g/L 범위의 인산수소이나트륨, 0.09±0.1 g/L 범위의 염화칼륨, 10.00±2.0 g/L 범위의 셀렉트 피톤, 4.00±2.0 g/L 범위의 이스톨레이트, 5.00±2.0g/L 범위의 덱스트로스, 0.03±0.1 g/L 범위의 L-시스틴, 0.60±0.5 g/L 범위의 염화마그네슘, 0.25±0.1 g/L 범위의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 1.00±0.2 g/L 범위의 염화암모늄 조성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 엔. 메닌지티디스용 배양 배지를 기재한다. 상기 언급된 배양 배지 조성물은 엔. 메닌지티디스 혈청군에 최적의 성장을 제공한다.

상기 언급된 배양 배지 조성물은 엔. 메닌지티디스 혈청군에 최적의 성장을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 1.00 g/L 농도의 일나트륨 글루타메이트, 3.25 g/L 농도의 인산수소이나트륨, 0.09 g/L 농도의 염화칼륨, 10.00 g/L 농도의 셀렉트 피톤, 4 g/L 농도의 TC-이스톨레이트, 5.00 g/L 농도의 덱스트로스, 0.03 g/L 농도의 L-시스틴, 0.60 g/L 농도의 염화마그네슘, 0.25 g/L 농도의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 및 1.00 g/L 농도의 염화암모늄을 포함하는 엔. 메닌지티디스용 배양 배지를 기재한다.

상기 최적화된 농도는 모두 본 명세서의 표 4에 열거되어 있다. 상기 언급된 배양 배지 조성물은 엔. 메닌지티디스 혈청군 MenA, MenC, MenY, MenW 및 MenX에 최적의 성장을 제공한다. 염화암모늄은 최적의 다당류 생산을 위해 혈청군 W 및 X ACFM에만 첨가된다.

본 발명은 또한 6.00±2.0 g/L 범위의 L-글루탐산, 20.00±2.0 g/L 범위의 덱스트로스, 0.50±0.1 g/L 범위의 L-세린, 0.20±0.1 g/L 범위의 L-아르기닌, 0.20±0.10 g/L 범위의 글리신, 0.20±0.1 g/L 범위의 L-트립토판, 5.00±2.0 g/L 범위의 TC-이스톨레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 엔. 메닌지티티스용 공급 배지를 기재한다. 상기 언급된 공급 배지 조성물은 엔. 메닌지티디스 혈청군에 최적의 성장을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 6.00 g/L 농도의 L-글루탐산, 20.00 g/L 농도의 덱스트로스, 0.50 g/L 농도의 L-세린, 0.20 g/L 농도의 L-아르기닌, 0.20 g/L 농도의 글리신, 0.20 g/L 농도의 L-트립토판, 5.00 g/L 농도의 TC-이스톨레이트를 포함하는 엔. 메닌지티디스용 공급 배지를 기재한다. 상기 언급된 공급 배지 조성물은 엔. 메닌지티디스 혈청군 MenA, MenC, MenY, MenW 및 MenX에 최적의 성장을 제공한다. 최적화된 공급 조성물은 본 명세서의 표 6에 열거되어 있다.

최적화된 배양 배지를 갖는 플라스크에서 세균의 성장 후, 세균은 본 명세서의 실시예 5 및 실시예 6에 개시된 바와 같이 발효시킨다. 발효 조건은 생성되는 발효 수확물(harvest)(브로스)이 높은 다당류 수율 및 낮은 수준의 불순물을 갖도록 최적화 되고, 발효 공정은 11±3시간 내에, 보다 바람직하게는 10 내지 12시간 내에 완료된다.

바람직한 구현예에서, 발효는 150 내지 600 rpm 범위의 rpm으로 36±1℃의 온도 범위로 수행되고, 발효기의 기류는 0.2 내지 0.8l/m으로 유지되고, 산소의 부분압(PO₂)은 pH 7.2±0.1과 함께 발효 전반에 걸쳐 20%로 유지된다.

따라서, 본 발명은 나이세리아 메닌지티디스에 최대 성장을 제공하는 최적화된 배양 배지 및 공급 배지로 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 MenA, MenC, MenY, MenW 및 MenX의 생산을 위한 신속하고 산업적으로 확장 가능하고 비용 효율적인 공정을 제공한다.

위에서 상세히 기재된 본 발명의 다양한 양태가 이제 비제한적인 실시예와 함께 예시된다:

실시예 1: ACFM 최적화를 위한 진탕 플라스크 실험

진탕 플라스크 연구 1:

각각 표 1에 개시된 동물성 성분 부재 배지(ACFM)의 상이한 조성물을 갖는 6개의 진탕 플라스크를 나이세리아 메닌지티디스 혈청군 W(MenW)의 배지 최적화를 위해 사용한다. 플라스크 배양물의 OD_550㎚은 6개 플라스크 모두에 대해 12시간까지 2시간 마다 기록한다. 성장 곡선은 도 1에 제시되어 있다. 배양 샘플을 1% v/v 포르말린으로 10시간에 불활성화시키고, 6개 플라스크 모두에 대해 억제 ELISA를 사용하여 다당류(PS) 농도에 대해 시험한다. 10시간 후 6개 진탕 플라스크 모두에서 OD_550㎚가 감소되기 때문에, 10시간째 샘플(세균 성장의 후기 로그 상)이 실시예 2에서 이하 기재된 바와 같이 억제 ELISA에 의한 PS 농도의 추정용으로 선택된다. ACFM 1 및 ACFM 3이 높은 PS 농도를 제공함이 관찰된다. 또한, ACFM 3은 ACFM 1과 비교하여 높은 OD_550nm와 함께 높은 PS 농도를 제공한다. 6개의 ACFM 모두의 PS 농도는 표 2에 기재되어 있다. 적은 배지 성분의 요건 이외에, 높은 PS 농도 및 높은 OD_550㎚의 조합에 기초하여, ACFM 3은 MenW 진탕 플라스크 실험으로부터 리드 배지로서 짧게 나열된다.

진탕 플라스크 연구 2:

플라스크 연구 2는 6개의 상이한 배지 조성물(표 3)에 의한 MenC ACFM 최적화를 위해 수행되며, 이 중 5개의 조성물은 ACFM을 갖고, 하나는 동물성 성분 함유 배지(ACM)를 가졌다. 6개의 플라스크 모두에 대해 10시간까지 2시간 마다 OD_550nm를 기록한다. 성장 곡선은 도 2에 기재되어 있고, 배지 조성물은 표 3에 기재되어 있다. ACFM A(진탕 플라스크 연구 1의 ACFM 3과 유사)는 진탕 플라스크 연구 2의 다른 배지 조성물과 비교하여 최고 OD_550nm를 제공했다.

진탕 플라스크 연구 1 및 연구 2에 기초하여, 연구 2의 ACFM A와 유사한 연구 1의 ACFM 3이 모든 혈청군 A, C, Y, W 및 X에 대한 스케일 업/발효 실험용으로 선택된다. 상기 배지 조성물은 우수한 성장 및 PS 생산을 지원하는 다른 ACFM에 비해 비교적 간단하고 비용 효과적이다.

실시예 2: 억제 ELISA 프로토콜

세균 배양 브로스에서 다당류 함량을 추정하기 위해 억제 ELISA 방법을 사용하였다. 여기서, 수막 구균성 캡슐 다당류를 함유하는 샘플을 혈청군 특이적 다클론성 항체(1차 항체)와 함께 배양하여 샘플에서 항체와 항원 사이에 복합체가 형성되도록 한다. 이어서, 이들 복합체는 경쟁자 상동성 항원이 고정된 용기에 첨가한다. 다당류 시험 샘플로부터의 면역원과 복합체화되지 않은 항체는 이들 고정된 경쟁자 항원에 결합한다. 이어서, 고정된 경쟁자 항원에 결합된 항체(일반적인 세척 단계 등 후)는 1차 항체에 결합하는 효소 표지된 2차 항체를 추가하여 검출할 수 있다. 표지는 발색 기질을 사용하여 고정된 1차 항체와 2차 항체의 반응을 동정하는 데 사용된다. 대조군 웰(임의의 시험 샘플 없음)과 비교하여 시험 웰에서 흡광도의 감소는 시험 샘플에서 특정 항원의 존재를 확인하고 항체의 억제 백분율은 시험 샘플에서 다당류 농도에 직접 비례한다.

간략하게, ELISA가 수행되고, 여기서 플레이트 A는 동일한 용적의 내부 PS 및 mHSA를 갖는 100㎕의 코팅 용액으로 코팅되고, 2 내지 8℃에서 밤새 배양한다. 항원 부재 대조군이 대조군으로서 포함된다. 코팅된 플레이트를 실온에서 200μl의 차단 완충제로 차단한다. 정의된 농도의 품질 관리 다당류(표준)는 세균 배양 상청액(시험 샘플)과 같이 연속적으로 3배 희석되고, 37℃에서 1시간 동안 혈청군 특이적 다클론성 1차 항체와 함께 플레이트 B에서 배양된다. 플레이트 B로부터의 항원-항체 혼합물을 차단된 플레이트 A로 옮기고, 2시간 동안(37℃에서 1.5시간 및 실온에서 30분) 추가로 배양한다. 플레이트를 1시간 동안 2차 항체와 함께 추가로 배양하고, 반응은 TMB 기질 100㎕를 사용하여 발생시키고, 10분 동안 배양한다. 반응은 630㎚를 참조로 450nm에서 OD가 관찰되기 전에 웰당 50㎕의 2M H₂SO₄로 정지시킨다. 억제 백분율은 항원 부재 대조군 웰의 OD와 관련하여 표준 또는 시험 샘플 희석물에서 OD의 억제로부터 계산된다. 표준 곡선은 Combistat 소프트웨어를 사용하여 시험 샘플의 다당류 농도를 추정하는데 사용되는 품질 관리 희석액에 대한 억제 백분율로부터 생성된다.

실시예 3: 최적화된 ACFM 조성물

연구 1 및 2 진탕 플라스크 실험에 기초하여 선택된 ACFM 조성물은 각각 Men A, C, Y, W 및 X 혈청군에 대한 스케일-업/발효 실험(2.5L 스케일)을 위해 취한다. 모든 혈청군은 양호한 성장을 일으켰다(도 3 내지 7). 최종 ACFM 배양 배지 조성물은 하기 표 4에 기재되어 있다. 혈청군 W 및 X는 ACFM은 염화암모늄의 첨가로 최적 성장을 제공했다.

실시예 4: 공급 조성물

공급 조성물은 (최적 성장 및/또는 다당류 수율을 제공하지 않은 MenX를 위한 다수의 다른 배지 최적화 실험으로부터) MenX의 생산을 위해 표 5에 개시된 ACM 2를 사용하여 발효 실험을 수행한 후 설계된다. 최종 ACFM 공급 성분은 표 6에 정의되어 있다. ACFM 공급 성분은 MenX ACM 2 실험의 공급 성분 및 ACFM 발효 배지로부터 참조되고, 이를 사용하여 설계된다. ACFM 공급 성분은 비용 효과적이며, 최적의 세균 성장에 필요하다.

표 6에 나열된 상기 언급된 ACFM 공급 조성물은 독특하고, 종래 기술 분야에서 발명자(샨카르 피살, US 2015/0299750 및 제리 레디, US 2008/0318285)에 의해 사용된 것과 상이하고, 모든 혈청군(MenA, MenC, MenY, MenW 및 MenX)의 더 우수한 성장을 지원한다.

본 발명에서 사용되는 영양소 발효 배지 및 공급 성분은 낮은 내독소 수준으로 낮은 세포 바이오매스 생산을 유도하고, 따라서 수확된 발효 브로스에 최소 수준의 불순물을 갖는 다당류를 유도한다.

실시예 5: 발효 절차:

작업 세포 은행으로부터의 하나의 바이알을 해동하고, ACFM 한천 플레이트에 스트리킹한다. 플레이트를 36±1℃ 및 5±1%의 CO₂에서 밤새 배양한다. ACFM 플레이트의 제조를 위한 배지 조성물은 15g/L의 농도로 한천의 첨가와 함께 표 4에 기재된 바와 동일하다.

플레이트의 밤새 배양 후, ACFM 플라스크는 ACFM 한천 플레이트로부터의 배양물을 접종하고, 성장이 나타날 때까지 36±1℃, 5±1% CO₂ 및 150 rpm에서 배양한다. 성장이 1±0.1의 OD_550nm에 도달할 때, 플라스크 배양물을 발효기에 무균 접종하고, 발효는 실시예 6에 언급된 바와 같은 소정의 조건으로 시작했다.

발효기에서 배양물의 OD가 1±0.1에 도달하면(일반적으로 발효의 초기 2.5 내지 3시간 후), 공급물을 1±0.2ml/분의 속도로 첨가한다. 2.5L 발효 배지에 대한 총 500 내지 600ml 공급물을 제조하고, 발효의 다음 8 내지 10시간 이내에 사용한다. 총 발효 시간은 일반적으로 11±3시간 범위내이다. OD_550nm는 2시간 마다 모니터링하여 성장을 관찰한다.

실시예 6: 발효 조건:

발효는 하기 표 7에 열거된 바와 같은 최적화 조건에서 수행된다:

실시예 7: 발효 브로스의 불활성화 및 수확

발효를 불활성화시키는 지표는 피크에 도달한 후 OD_550nm의 감소 또는 pH의 증가 또는 둘 다이다. 불활성화는 36±1℃에서 4±1시간 동안 1±0.2% v/v 포르말린을 사용하여 수행하고, 수확은 10550 xg에서 30분 동안 원심분리에 의해 수행된다. 상청액을 수집하고, 2 내지 8℃에서 저장하고, 바람직하게는 PS의 정제를 위해 수확 직후 24시간 이내에 사용한다.

동물성 성분 함유 배지(ACM)는 발효기 배양물 중 MenA 혈청군을 위한 ACFM과 비교한다. 동물성 성분 부재 배지(ACFM)는 MenA 발효가 ACM 조성물과 비교하여 ACFM 조성물을 사용하여 수행될 때 더 높은 수율을 제공했다. ACFM을 사용하는 MenA에 대한 평균 정제된 PS 수율은 699㎎/L인 반면, ACM을 사용하는 발효 브로스는 330mg/L이다. 다양한 혈청군에 대한 ACFM의 OD_550㎚는 ACM을 사용하는 경우와 비교할 때 일반적으로 더 높다.

모든 혈청군에 대해 상이한 시간 간격으로 발효 브로스 중의 다당류 농도를 분석했고, 억제 ELISA에 의한 MenX에 대한 결과는 하기 표 8에 제시되어 있다.

발효 공정 후 수확시 억제 ELISA에 의해 수득된 수율은 하기 표 9에 제시되어 있다.

따라서, 본 발명은 높은 수율로 감소된 시간에 발효에 의해 엔. 메닌지티디스 다당류의 보다 나은 생산을 위한 개선된 배양 및 공급 배지를 제공한다.

Claims

향상된 수율로 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 신속한 성장을 위한 개선된 동물성 성분 부재 배양 배지, 개선된 동물성 성분 부재 공급 배지 및 개선된 발효 공정 파라미터(fermentation process parameter)로 혈청군(serogroup) A, C, Y, W 및 X의 나이세리아 메닌지티디스 다당류를 생산하는 공정.
제1항에 있어서, 혈청군 A, C 및 X의 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 생산을 위한 상기 개선된 동물성 성분 부재 배양 배지가 다음으로부터 선택된 둘 이상의 성분의 조합을 포함하고, 상기 조합이 향상된 수율로 혈청군 A, C 및 X의 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 신속한 성장을 제공하는, 공정:
- 일나트륨 글루타메이트
- 인산수소이나트륨
- 염화칼륨
- 셀렉트 피톤(Select phytone)
- TC-이스톨레이트
- 덱스트로스
- L-시스틴
- 염화마그네슘
- 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 상기 배양 배지가 다음 농도 범위로 다음을 포함하는, 공정:
성분 농도(g/L)
일나트륨 글루타메이트 1.00±0.5
인산수소이나트륨 3.25±1
염화칼륨 0.09±0.1
셀렉트 피톤 10.0±2
TC-이스톨레이트 4.0±2
덱스트로스 5.00±2
L-시스틴 0.03±0.1
염화마그네슘 0.60±0.5
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 0.25±0.1
제1항에 있어서, 혈청군 Y 및 W의 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 생산을 위한 상기 개선된 동물성 성분 부재 배양 배지가 다음 중 둘 이상의 조합을 포함하고, 상기 조합이 향상된 수율로 혈청군 Y 및 W의 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 신속한 성장을 제공하는, 공정:
- 일나트륨 글루타메이트
- 인산수소이나트륨
- 염화칼륨
- 셀렉트 피톤
- TC-이스톨레이트
- 덱스트로스
- L-시스틴
- 염화마그네슘
- 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드
- 염화암모늄.
제4항에 있어서, 상기 배양 배지가 다음 농도 범위로 다음을 포함하는, 공정:
성분 농도(g/L)
일나트륨 글루타메이트 1.00±0.5
인산수소이나트륨 3.25±1
염화칼륨 0.09±0.1
셀렉트 피톤 10.0±2
TC-이스톨레이트 4.0±2
덱스트로스 5.00±2
L-시스틴 0.03±0.1
염화마그네슘 0.60±0.5
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 0.25±0.1
염화암모늄 1.00±0.2.
제1항에 있어서, 혈청군 A, C, Y, W 및 X의 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 생산을 위한 상기 개선된 공급 배지가 다음 중 둘 이상의 조합을 포함하고, 상기 조합이 향상된 수율로 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 신속한 성장을 제공하는, 공정:
- L-글루탐산
- 덱스트로스
- L-세린
- L-아르기닌
- 글리신
- L-트립토판
- TC-이스톨레이트.
제6항에 있어서, 상기 공급 배지가 다음 농도 범위로 다음을 포함하는, 공정:
성분(발효 브로스; fermentation broth) 농도(g/L)
L-글루탐산 6.00±2
덱스트로스 20.00±2
L-세린 0.50±0.1
L-아르기닌 0.20±0.1
글리신 0.20±0.1
L-트립토판 0.20±0.1
TC-이스톨레이트 5.00±2.
제1항에 있어서, 상기 배양 배지 및 공급 배지가 다음 농도의 혈청군 A, C, Y, W 및 X의 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 향상된 수율을 제공하는, 공정:
제1항에 있어서, 상기 발효 공정이 다음 공정 파라미터 범위로 수행되는, 공정:
제9항에 있어서, 상기 발효 공정이 11±3시간 이내에 신속하게 달성되는, 발효 공정.
제1항에 있어서, 상기 공정이 수막 구균성 감염에 대한 경제적인 다당류 단백질 접합체 백신(들)의 생산에 사용될 수 있는 엔. 메닌지티디스 다당류를 생성하는, 나이세리아 메닌지티디스 다당류의 생산 공정.