CN110799650A - 细菌多糖的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明尤其涉及脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)多糖的营养培养基组分、补料组分和发酵条件。本发明描述了快速、可工业规模化、成本有效的生产脑膜炎奈瑟氏球菌的方法。本发明的脑膜炎奈瑟氏菌多糖可用于生产经济型的抗脑膜炎球菌感染的多糖蛋白结合疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种改进的细菌多糖的生产方法。本发明尤其涉及生产脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)多糖的营养培养基组分、补料组分、发酵条件和纯化方法。本发明的脑膜炎奈瑟氏菌多糖可用于生产经济型的抗脑膜炎球菌感染的多糖蛋白结合疫苗。
背景技术
脑膜炎奈瑟氏菌通常称为脑膜炎球菌，是一种革兰氏阴性细菌，其可引起脑膜炎和其他形式的脑膜炎球菌疾病，例如脑膜炎球菌血症。
根据脑膜炎奈瑟氏菌(Men)上存在的荚膜多糖的类型，已鉴定出13个血清群，在13种确定的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜类型中，有6种(A、B、C、W135、X和Y)占全球脑膜炎球菌病案件的大多数。MenA是非洲和亚洲最为流行的血清群，但在北美却很少/几乎没有。在欧洲和美国，血清群B(MenB)是引起疾病和死亡的主要原因，其次是血清群MenC和MenW。最近，在撒哈拉以南非洲地区已开始出现MenX的爆发。血清群的多样性阻碍了针对脑膜炎球菌疾病的通用疫苗的开发。
由于迫切需要与这种致命疾病作斗争，1978年完成了第一种脑膜炎多糖疫苗的生产。后来发现，基于纯多糖的疫苗在两岁以下的儿童中不是很有效。这些观察结果指引了进一步的研究，研究表明婴儿的免疫系统不成熟，无法产生对纯多糖的免疫应答。
免疫应答可以表征为T细胞依赖性(TD)免疫应答和T细胞非依赖性(TI)免疫应答。已知蛋白质和肽通过刺激辅助性T淋巴细胞并产生记忆细胞来诱导TD抗原。相反，多糖属于TI抗原，不会诱导T细胞活化且不形成任何记忆B细胞，这是处理婴儿时存在的主要缺点，因为它们的免疫系统不成熟。
因此，需要将细菌多糖与诱导T细胞依赖性免疫应答的蛋白载体结合，其特征在于增加婴儿的免疫原性、延长保护时间和减少脑膜炎球菌的鼻咽携带。独创性的研究满足了这一需求，从而产生了多糖-蛋白结合疫苗，1999年英国批准第一批脑膜炎球菌结合疫苗。
用于制备疫苗的多糖，特别是抗原性多糖可以是分别包含一种、两种或多种多糖的单价、二价和多价疫苗。这些疫苗在市场上易于获得，用于预防由多种微生物引起的某些疾病或感染。这种基于多价多糖的疫苗已经使用了很多年，并且在预防诸如肺炎球菌、脑膜炎球菌或流感嗜血杆菌等疾病方面具有重要价值。
纯化的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖的生产是与载体蛋白有效结合并发展为结合疫苗的首要要求。传统上，大多数细菌发酵培养基使用动物成分来使得用于生产多糖的脑膜炎球菌生长。现需要无动物成分的培养基以在区域偏好方面提供优势，并避免传染原引发疾病，例如传染性海绵状脑病(TSE)和牛海绵状脑病(BSE)。培养用于生产荚膜多糖的脑膜炎奈瑟氏菌的成本通常很高，并且由于涉及一系列生产和质量控制步骤，因此涉及较长的工作时间。优化的无动物成分培养基可以避免这些问题。
多糖生产步骤的改进将有利于配制有效和经济上可行的结合疫苗。
有许多专利和非专利文献描述了多糖的生产和纯化方法。一篇此类文献是申请号US 12/041,745的专利，其公开了一种脑膜炎球菌性脑膜炎疫苗的生产方法，该方法包括培养脑膜炎奈瑟氏菌以在脑膜炎奈瑟氏菌精制培养基(NMFM)中生产血清群A、C、Y和W-135的荚膜多糖，从培养物中分离荚膜多糖，纯化任何残留细胞生物质的荚膜多糖；然后将荚膜多糖物理解聚。引用的现有技术使用了较长时间来生产纯化的荚膜多糖。
另一美国专利公开号US 20150299750 A1公开了用于制备脑膜炎奈瑟氏菌多糖的改进的培养、发酵和纯化条件。另一美国专利公开号20080318285 A1公开了脑膜炎奈瑟氏菌精制培养基，其被设计为在较短发酵时间内使荚膜多糖的产量最大化并产生最低的细胞生物量和内毒素。
本发明的ACFM(无动物成分的培养基)不同于Shankar Pisal在美国专利公开号No.US 2015/0299750和Jeeri reddy在美国专利公开号US 2008/0318285中所使用的培养基，以上现有技术均未使用选择性植物蛋白胨(Select phytone)和TC酵母粉。SelectPhytoneTM是植物来源的蛋白胨。植物蛋白胨中的氮成分与天然存在的维生素相结合，有助于细菌的生长。植物蛋白胨的内毒素水平小于或等于500EU/g。TC酵母粉是肽、氨基酸、碳水化合物以及维生素的混合物。TC酵母粉产品是无动物成分的，且是自溶酵母的水溶性成分。TC酵母粉UF已在10,000MWCO(截断分子量)下进行了超滤。TC酵母粉UF的内毒素值小于500EU/g。它是一种通用的营养补品，可促进细菌生长。这是一类新的培养基组分，它替代了用于促进生长的大多数单个组分。本发明的培养基组分甚至不包括其他发明人在现有技术中使用的酪蛋白氨基酸。无动物成分培养基的最大优势是，因为由于地区偏好，中东、GCC(海湾合作委员会)国家和其他国家对ACFM疫苗(数百万剂)的需求量很大，另外此类疫苗还不含BSE和TSE。
因此，目前用于生产脑膜炎奈瑟氏菌血清群的各种方法都使用动物成分培养基，且发酵方法需要相对较长的时间(高达20-24小时或更长)来培养多糖，从而增加了生产成本，并由于该方法无法以成本节约且快速的方式扩大规模且具有动物成分而使其在商业上不可行。
本发明的目的是提供改进的营养培养基和补料培养基(feed media)，以通过短时间和高产量的发酵更好地生产脑膜炎奈瑟氏菌多糖。所述改进将导致以较低的价格生产多糖蛋白结合疫苗，随后可以以实惠的价格将疫苗提供给发展中国家的儿童。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种生产细菌多糖的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产脑膜炎奈瑟氏菌的不同血清群的荚膜多糖的方法。
本发明的又一个目的是提供不含动物成分的优化培养基和补料培养基组分。
本发明的又一个目的是提供用于难养脑膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W、X和Y的生长的改良营养培养基和补料培养基组分。
本发明的又一个目的是通过简单、高效、改进和可商业规模化的方法提供在较短的时间内发酵的过程，该过程可在很短的时间内以较低的杂质获得更好的多糖产量。
本发明的又一个目的是纯化脑膜炎奈瑟氏菌多糖，同时通过简单、高效、改进和可商业推广的方法在很短的时间内消除杂质。
本发明的又一个目的是生产满足相关质量规格的具有更好产量的高质量产品。
发明内容
本发明描述了一种快速、可工业规模化、经济有效的使细菌优选地脑膜炎奈瑟氏菌的生长的方法以便生产细菌多糖。所述方法提供了一种以明显减少的时间纯化脑膜炎奈瑟氏菌多糖的纯化方法。
本发明描述了脑膜炎奈瑟氏菌的营养培养基，包括但不限于浓度为1.00±0.5g/L的味精、浓度为3.25±1.0g/L的磷酸氢二钠、浓度为0.09±0.1g/L的氯化钾、浓度为10.0±2.0g/L的选择性植物蛋白胨、浓度为4.0±2.0g/L的酵母粉、浓度为5.00±2.0g/L的葡萄糖、浓度为0.03±0.1g/L的L-胱氨酸、浓度为0.60±0.5g/L的氯化镁、浓度为0.25±0.1g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和浓度为1.00±0.2g/L的氯化铵。上述营养培养基组分为脑膜炎奈瑟菌血清群提供最佳生长。
本发明还描述了脑膜炎奈瑟氏菌的补料培养基，包括但不限于浓度为6.00±2.0g/L的L-谷氨酸、浓度为20±2.0g/L的葡萄糖、浓度为0.50±0.1g/L的L-丝氨酸、浓度为0.20±0.1g/L的L-精氨酸、浓度为0.20±0.1g/L的甘氨酸、浓度为0.20±0.1g/L的L-色氨酸、浓度为5±2.0g/L的TC-酵母粉，其他组分如L-胱氨酸、氯化镁、氯化钙、硫酸亚铁、氯化铵则视需要而定。当在用上述营养培养基进行发酵培养的过程中将上述补料培养基组分添加到发酵液中时，上述补料培养基组分为脑膜炎奈瑟氏菌血清群提供最佳生长。
本发明描述了在预定温度、pH、气流、溶解氧和搅拌速率下的发酵过程，使得发酵在11±3小时内完成。
本发明描述了用于产生高产量的脑膜炎奈瑟氏菌血清群W和Y荚膜多糖的纯化步骤。将发酵液中的粗多糖用MilliQ水(MQW)进行浓缩和渗滤，以形成降低杂质水平的浓缩物。将如此得到的浓缩物在预定温度下用碱例如1±0.2M的NaOH处理最佳时间。将所得的部分纯化的多糖再次用MQW进行渗滤，然后进行碳过滤，最后进行无菌过滤。
附图说明
图1描绘了摇瓶研究1(6种ACFM组分)的生长曲线
图2描绘了摇瓶研究2(5种ACFM和1种ACM组分)的生长曲线
图3描绘了用ACFM的MenA组的生长曲线
图4描绘了用ACFM的MenC组的生长曲线
图5描绘了用ACFM的MenY组的生长曲线
图6描绘了用ACFM的MenW组的生长曲线
图7描绘了用ACFM的MenX组的生长曲线
具体实施方式
本发明公开了不含动物成分的优化的营养培养基和补料培养基，其可用于在较短的时间内生长出难养的脑膜炎奈瑟氏菌。
无动物成分培养基的最大优势在于，由于ACFM疫苗的区域偏好，中东、GCC(海湾合作委员会)国家和其他国家对ACFM疫苗(数百万剂)的需求很高。此外，此类疫苗没有TSE和BSE风险。
在描述本发明的优选实施方案之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定材料，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。
本发明描述了脑膜炎奈瑟氏菌的营养培养基，包括但不限于浓度为1.00±0.5g/L的味精、浓度为3.25±1.0g/L的磷酸氢二钠、浓度为0.09±0.1g/L的氯化钾、浓度为10.0±2.0g/L的选择性植物蛋白胨、浓度为4.0±2.0g/L的酵母粉、浓度为5.00±2.0g/L的葡萄糖、浓度为0.03±0.1g/L的L-胱氨酸、浓度为0.60±0.5g/L的氯化镁、浓度为0.25±0.1g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和浓度为1.00±0.2g/L的氯化铵。
上述营养培养基组分为脑膜炎奈瑟菌血清群提供最佳生长。
在一个优选的实施方案中，本发明描述了用于脑膜炎奈瑟氏菌的营养培养基，包含浓度为1.00g/L的味精、浓度为3.25g/L的磷酸氢二钠、浓度为0.09g/L的氯化钾、浓度为10.00g/L的选择性植物蛋白胨、浓度为4g/L的TC-酵母粉、浓度为5.00g/L的葡萄糖、浓度为0.03g/L的L-胱氨酸、浓度为0.60g/L的氯化镁、浓度为0.25g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和浓度为1.00g/L的氯化铵。
说明书的表4中列出了所有上述优化的浓度。上述营养培养基组分为脑膜炎奈瑟氏菌血清群MenA、MenC、MenY、MenW和MenX提供最佳生长。氯化铵仅添加到血清群W和X ACFM中，以优化多糖的生产。
本发明还描述了脑膜炎奈瑟氏菌的补料培养基，包括但不限于浓度为6.00±2.0g/L的L-谷氨酸、浓度为20±2.0g/L的葡萄糖、浓度为0.50±0.1g/L的L-丝氨酸、浓度为0.20±0.1g/L的L-精氨酸、浓度为0.20±0.1g/L的甘氨酸、浓度为0.20±0.1g/L的L-色氨酸、浓度为5±2.0g/L的TC-酵母粉。上述补料培养基组分为脑膜炎奈瑟氏菌血清群提供最佳生长。
在一个优选的实施方案中，本发明还描述了脑膜炎奈瑟氏菌的补料培养基，包含浓度为6.00g/L的L-谷氨酸、浓度为20.00g/L的葡萄糖、浓度为0.50g/L的L-丝氨酸、浓度为0.20g/L的L-精氨酸、浓度为0.20g/L的甘氨酸、浓度为0.20g/L的L-色氨酸、浓度为5.00g/L的TC-酵母粉。上述补料培养基组分为脑膜炎奈瑟氏菌血清群MenA、MenC、MenY、MenW和MenX提供最佳生长。优化的补料组成列于说明书的表6中。
在具有优化的营养培养基的摇瓶中培养细菌后，如说明书的实施例5和实施例6中所述对细菌进行发酵。使发酵条件最优化，以使得所得的发酵产物(液)具有较高的多糖产量和低水平的杂质，并且在11±3小时内、更优选在10至12小时内完成发酵过程。
在一个优选的实施方案中，在36±1℃的温度范围内以150至600rpm的转数进行发酵，在整个发酵过程中，发酵器的空气流量保持在0.2至0.8l/m，氧分压(PO2)保持在20％，pH为7.2±0.1。
因此，本发明提供了一种使用优化的营养培养基和补料培养基来快速、可工业规模化、经济有效地生产脑膜炎奈瑟氏菌血清群MenA、MenC、MenY、MenW和MenX的方法，其为脑膜炎奈瑟氏菌提供了最大程度的生长。
现在通过非限制性实施例来说明以上详细描述的本发明的各个方面：
实施例1：通过摇瓶实验进行ACFM优化
摇瓶研究1：
如表1所示，六个摇瓶分别具有不同的无动物成分培养基(ACFM)组分，用于脑膜炎奈瑟氏菌血清群W(MenW)的培养基优化。每2小时记录一次所有六个摇瓶的摇瓶培养物的OD550nm，直到第12小时为止。生长曲线如图1所示。在第10小时用1％v/v福尔马林灭活培养物样品，并使用抑制ELISA检测所有六个摇瓶的多糖(PS)浓度。由于第10小时后所有六个摇瓶的OD550nm均下降，因此选择第10小时(细菌生长的对数生长后期)的样品，用于通过抑制ELISA估算PS浓度，如以下实施例2中所述。观察到ACFM 1和ACFM 3具有高PS浓度。此外，与ACFM 1相比，ACFM 3具有高OD550nm、高PS浓度。表2中描述了所有六个ACFM的PS浓度。基于高PS浓度和高OD550nm的结合，除了需要较少的培养基组分外，ACFW 3还被选为MenW摇瓶实验的主要培养基。
表1：摇瓶研究1(ACFM组分)
NA-不适用
表2：摇瓶中的PS浓度
摇瓶研究2：
摇瓶研究2是针对MenC ACFM优化而进行的，其中使用了六种不同的培养基组成(表3)，其中五种含有ACFM，一种含有动物成分培养基(ACM)。所有六个摇瓶每两小时记录一次OD550nm，直到第10个小时为止。生长曲线在图2中描述，培养基组成在表3中描述。与摇瓶研究2的其他培养基相比，ACFM A(类似于摇瓶研究1的ACFM3)具有最高的OD550nm。
根据摇瓶研究1和药瓶研究2，选择药瓶研究1的ACFM 3(与药瓶研究2的ACFMA类似)进行A、C、Y、W和X血清群的规模化/发酵实验。与支持良好生长和PS生产的其他ACFM相比，所述培养基组分相对更简单且更具成本效益。
表3：摇瓶研究2(5种ACFM和1种ACM的组份)
实施例2：抑制ELISA方案
采用抑制ELISA法测定细菌液体培养基中多糖的含量，将含有脑膜炎球菌荚膜多糖的样品与血清群特定的多克隆抗体(一抗)一起孵育，从而在抗体和样品中的抗原之间形成复合物。然后将这些复合物添加到固定同源竞争抗原的容器中。不与来自多糖测试样品的免疫原复合的抗体结合至这些固定的竞争抗原。然后通过添加酶标记的二抗来检测与固定的竞争抗原(在常规洗涤步骤等之后)结合的抗体，二抗与一抗结合。该标记用于利用发色底物鉴定固定的一抗与二抗的反应。与对照孔(无任何测试样品)相比，测试孔中吸光度的降低证实了测试样品中存在特定抗原，以及测试样品中的抗体的抑制百分比与多糖浓度成正比。
简而言之，进行ELISA，其中用100μl具有等体积的含PS和mHSA的涂层溶液对板A进行涂覆，并在2-8℃下孵育过夜。无抗原的对照作为对照。室温下用200μl封闭缓冲液封闭涂层板。将明确浓度的质量控制多糖(标准)连续稀释3倍，细菌培养上清液(测试样品)进行同样稀释，并在37℃下在板B中与血清群特异性多克隆一抗孵育1小时。将来自板B的抗原-抗体混合物转移至封闭的板A中，并进一步温育2小时(在37℃下1.5小时和在室温下半小时)。将板与二抗一起进一步孵育1小时，并使用100μlTMB底物进行反应并孵育10分钟。每孔用50μl 2M H2SO4终止反应，然后在450nm处观察OD，参照630nm。抑制百分比是根据标准或测试样品稀释液中OD对无抗原对照孔的OD的抑制来计算的。从质量控制稀释液的抑制百分比生成标准曲线，该曲线用于使用Combistat软件推测测试样品中多糖的浓度。
实施例3：优化的ACFM组分
将根据研究1和2摇瓶实验选择的ACFM组分用于A、C、Y、W和X血清群的规模化/发酵实验(2.5L规模)。所有的血清群都生长良好(图3-7)。最终的ACFM营养培养基组成在下表4中描述。血清群W和X ACFM通过添加氯化铵可实现最佳生长。
表4：最终ACFM营养培养基组成
实施例4：补料组成
在使用表5所公开的ACM 2进行发酵实验后，设计补料组成以生产MenX(MenX的其他几种培养基优化实验中没有提供最佳的生长和/或多糖产量)。表6中定义了最终ACFM补料组分。ACFM补料组分引用MenX ACM 2实验和ACFM发酵培养基的补料成分并据此设计。ACFM补料组分具有成本效益，是最佳细菌生长所必需的。
表5：用于MenX发酵实验的ACM 2组分
表6：最终ACFM补料培养基组分
| 序号 | 组分 | 浓度(g/L) |
| 1 | L-谷氨酸 | 6.00 |
| 2 | 葡萄糖 | 20.00 |
| 3 | L-丝氨酸 | 0.50 |
| 4 | L-精氨酸 | 0.20 |
| 5 | 甘氨酸 | 0.20 |
| 6 | L-色氨酸 | 0.20 |
| 7 | TC-酵母粉 | 5.00 |
表6中所列的上述ACFM补料组分是独特的，与现有技术的发明人所使用的组分(Shankar Pisal，US 2015/0299750和Jeri Reddy，US 2008/0318285)不同并支持所有血清群(MenA、MenC、MenY、MenW和MenX)的更好生长。
本发明中使用的营养发酵培养基和补料组分导致细胞生物质产量低，内毒素水平低，因此导致多糖在所获的发酵液中具有最小的杂质水平。
实施例5：发酵过程：
将来自工作细胞库的一个小瓶解冻，并划线到ACFM琼脂平板上。将平板在36±1℃和5±1％CO2下孵育过夜。制备ACFM平板的培养基组分与表4中所述相同，添加浓度为15g/L的琼脂。
平板孵育过夜后，将ACFM琼脂平板上的培养物接种到ACFM摇瓶中，在36±1℃、5±1％CO2和150rpm下孵育，直到出现生长。当生长达到1±0.1的OD550nm时，将摇瓶培养物无菌接种到发酵器中，并按照实施例6中所述的预设条件开始发酵。
当发酵罐中培养物的OD达到1±0.1(通常在发酵的最初2.5-3小时后)时，以1±0.2ml/min的速度添加补料。制备用于2.5L发酵培养基的总计500-600ml补料，并在接下来的8-10小时发酵中使用。总发酵时间通常在11±3小时的范围内。每两小时监测OD550nm以观察生长情况。
实施例6：发酵条件：
发酵在如以下表7所示的优化条件下进行：
表7：发酵器条件
实施例7：灭活和收集发酵液
发酵失活的指标是达到峰值后OD550nm下降或pH升高或两者兼有。在36±1℃下使用1±0.2％v/v福尔马林进行灭活4±1小时，并通过以10550×g离心30分钟进行收集。收集上清液并在2-8℃下保存，在24小时内使用，优选在收集后立即用于PS的纯化。
在发酵器培养物中，将针对MenA血清群的含动物成分的培养基(ACM)与ACFM进行比较。与ACM组分相比，使用ACFM组分进行MenA发酵时，无动物成分培养基(ACFM)获得更高的产量。使用ACFM的MenA的平均纯化PS产量为699mg/L，而使用ACM为330mg/L发酵液。与ACM相比，用于各种血清群的ACFM的OD550nm通常更高。
分析所有血清群在不同时间间隔的发酵液中的多糖浓度，通过抑制ELISA的MenX的结果如下表8所示。
表-8
发酵过程后收集时通过抑制ELISA获得的产量如表9所示。
表9
因此，本发明提供了改进的培养基和补料培养基，用于通过发酵以减少的时间、较高的产量更好地生产脑膜炎奈瑟氏菌多糖。
Claims (11)
1.一种生产血清群A、C、Y、W和X的脑膜炎奈瑟氏菌多糖的方法，所述方法采用改良的无动物成分的营养培养基、改良的无动物成分的补料培养基和改进的发酵过程参数，使得脑膜炎奈瑟氏菌快速生长和产量提高。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述改良的无动物成分的营养培养基包含选自以下的两种或多种成分的组合：
-味精
-磷酸氢二钠
-氯化钾
-选择性植物蛋白胨
-TC-酵母粉
-葡萄糖
-L-胱氨酸
-氯化镁
-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
其中所述组合使得血清群A、C和X的脑膜炎奈瑟氏菌多糖快速生长和产量提高。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述营养培养基包含以下浓度范围的成分：
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述改良的无动物成分的营养培养基包含以下两种或多种成分的组合：
-味精
-磷酸氢二钠
-氯化钾
-选择性植物蛋白胨
-TC-酵母粉
-葡萄糖
-L-胱氨酸
-氯化镁
-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
-氯化铵
其中所述组合使得血清群Y和W的脑膜炎奈瑟氏菌多糖快速生长和产量提高。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述改良的无动物成分的营养培养基包含以下浓度范围的成分：
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述改良的补料培养基包含以下两种或多种的组合：
-L-谷氨酸
-葡萄糖
-L-丝氨酸
-L-精氨酸
-甘氨酸
-L-色氨酸
-TC-酵母粉
其中所述组合使得脑膜炎奈瑟氏菌多糖快速生长和产量提高。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述改良的无动物成分的补料培养基包含以下浓度范围的成分：
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述营养培养基和补料培养基使得血清群A、C、Y、W和X的脑膜炎奈瑟氏菌多糖具有以下提高的产量：
。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵过程按照以下过程参数范围进行：
。
10.根据权利要求9所述的发酵过程，其中所述发酵过程在11±3小时内快速完成。
11.根据权利要求1所述的生产脑膜炎奈瑟氏菌多糖的方法，其中所述方法产生脑膜炎奈瑟氏菌多糖，所述多糖可用于生产经济型的抗脑膜炎菌感染的多糖蛋白结合疫苗。
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