BE1022290B1 - Procede de fermentation - Google Patents

Abstract

Cette invention concerne un milieu chimiquement défini pour la culture à échelle industrielle d'espèces du genre Bordetella.

Description

PROCEDE DE FERMENTATION

CONTEXTE

Le genre Bordetella est l'agent causal d'un certain nombre de maladies bactériennes, par exemple Bordetella pertussis (également connu sous le nom d'Haemophilus pertussis) est responsable de la coqueluche, une maladie respiratoire qui peut être grave chez les nourrissons et les jeunes enfants. L'évolution clinique de la maladie est caractérisée par des quintes de toux rapides suivies d'un effort inspiratoire, souvent associé à un « chant du coq » caractéristique. Dans les cas graves, la privation d'oxygène peut conduire à des lésions du cerveau ; toutefois, la complication la plus courante reste la pneumonie secondaire.

La coqueluche est généralement considérée comme étant provoquée par B. pertussis, mais de temps en temps B. parapertussis est isolé chez des patients présentant des signes et des symptômes typiques de coqueluche. Avec 5 à 10 % de coqueluches associées à B. parapertussis (Mertsola (1985) Eur J Clin Microbiol 4 ; 123 ; Lautrop (1971) Lancet 1(7711) 1195-1198), l'infection à B. parapertussis est moins fréquente que celle à B. pertussis. B. parapertussis est associé à des symptômes cliniques modérés qui, combinés à sa réactivité croisée sérique avec B. pertussis, rend B. parapertussis difficile à diagnostiquer.

Les vaccins anticoquelucheux de première génération dirigés contre B. pertussis étaient des vaccins à germes entiers, composés de bactéries entières tuées. Ils ont été introduits dans de nombreux pays dans les années 50 et 60 et ont réussi à réduire l'incidence de la coqueluche. Le problème avec les vaccins anticoquelucheux à germes entiers dirigés contre B. pertussis est le niveau élevé de réactogénicité qui leur est associé. Les vaccins acellulaires contenant des protéines de B. pertussis purifiées sont moins réactogènes et ont été adoptés pour les programmes de vaccination dans de nombreux pays. Les vaccins acellulaires contenant typiquement une anatoxine pertussique (PT), une hémagglutinine filamenteuse (FHA), et très souvent une pertactine (PRN) sont largement utilisés et offrent une protection efficace contre les formes sévères de la coqueluche.

Les toxines de Bordetella utilisables dans ces vaccins sont générées par fermentation de Bordetella et isolement des facteurs de virulence produits, bien que les espèces du genre Bordetella soient des organismes fastidieux, difficiles à cultiver à des concentrations élevées (Doern Clin, infect, dis. 2000, 30 166-173), et qu'il soit en outre difficile d'exprimer les facteurs de virulence de Bordetella tels que la FHA (hémagglutinine filamenteuse), la pertactine (PRN) et l'anatoxine pertussique (PT) dérivées de Bordetella pertussis a des niveaux élevés.

Bordetella peut être cultivé dans des milieux chimiquement définis. Par exemple Stainer-Scholte (Journal of General Microbiology (1971), 63, 211-220) décrivent un milieu chimiquement défini simple pour la production de pertussis. La croissance dans des milieux chimiquement définis offre des avantages sur les milieux indéfinis qui peuvent avoir une teneur nutritionnelle variable conduisant à l'imprévisibilité de la croissance et de l'expression.

Le milieu chimiquement défini peut toutefois revenir cher et s'avérer difficile à produire en grandes quantités, et concevoir des milieux chimiquement définis équilibrés qui supportent des niveaux élevés de production de toxines peut en outre s'avérer difficile. De manière surprenante les présents inventeurs ont découvert qu'un certain nombre de modifications peuvent être introduites dans un milieu chimiquement défini pour l'espèce Bordetella pertussis pour obtenir des milieux simples qui supportent des niveaux élevés de production de facteurs de virulence.

BREF RESUME

Selon un premier aspect, l'invention concerne un milieu chimiquement défini pour une espèce du genre Bordetella dans lequel le milieu chimiquement défini comprend une ou plusieurs des modifications suivantes : (i) le milieu chimiquement défini comprend moins de 0,035 mM, moins de 0,030 mM, moins de 0,020 mM ou moins de 0,010 mM de sulfate ; (ii) le milieu chimiquement défini comprend une source de cystéine choisie dans le groupe constitué par la cystéine et la cystine dans lequel la source de cystéine est à une concentration inférieure à 0,50 mM, inférieure à 0,30 mM, inférieure à 0,25 mM, inférieure à 0,20 mM, inférieure à 0,15 mM, inférieure à 0,10 mM, inférieure à 0,05 mM ou inférieure à 0,03 mM ; (iii) le milieu chimiquement défini comprend une source inorganique de soufre choisie dans le groupe constitué par le thiosulfate, le trithionate, le tétrathionate, le peroxo-disulfate, le sulfure et le sulfite ; (iv) le milieu chimiquement défini ne comprend pas de source organique de soufre ; (v) le milieu chimiquement défini comprend un tampon choisi dans le groupe constitué par les tampons MOPS (acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique), MES (acide 2-(N-morpholino)-éthanesulfonique), HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine-éthanesulfonique) et PIPES (acide pipérazine-N,N'-bis(2-éthanesulfonique)) ; (vi) le milieu chimiquement défini comprend plus de 2 μΜ, plus de 3 μΜ, plus de 4 μΜ, plus de 5 μΜ, ou plus de 6 μΜ de cuivre ; (vii) le milieu chimiquement défini comprend plus de 2 μΜ, plus de 5 μΜ, plus de 10 μΜ, plus de 50 μΜ, plus de 100 μΜ ou plus de 400 μΜ de magnésium ; (viii) le milieu chimiquement défini comprend une seule source d'acide aminé ; (ix) le milieu chimiquement défini ne comprend pas de source d'acide aminé ; (x) le milieu chimiquement défini comprend un additif choisi dans le groupe constitué par le zinc, le cobalt, la thiamine, la riboflavine et le pantothénate ; (xi) le milieu chimiquement défini comprend un additif choisi dans le groupe constitué par plus de 0,4 μΜ de biotine, plus de 50 μΜ de calcium, plus de 15 μΜ de niacine, et plus de 25 μΜ d'acide ascorbique ; ou (xii) le milieu chimiquement défini comprend un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'aspartate à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, la glycine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, la méthionine à une concentration supérieure à 500 μΜ et la leucine à une concentration supérieure à 1 500 μΜ.

Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un milieu chimiquement défini pour une espèce du genre Bordetella dans lequel le milieu chimiquement défini comprend au moins deux composants et dans lequel lesdits au moins deux composants sont choisis dans le groupe constitué par : a) le carbone et le phosphore dans un rapport supérieur à 100:1, supérieur à 125:1, supérieur à 150:1, supérieur à 175:1 ou supérieur à 200:1 (carbone : phosphore) (mol/mol) ; (b) le glutamate et le phosphore dans un rapport supérieur à 20:1, supérieur à 22:1, supérieur à 24:1 ou supérieur à 25:1 ( glutamate : phosphore)· (mol/mol) ; (c) le carbone et le magnésium dans un rapport inférieur à 600:1, inférieur à 500:1, inférieur à 400:1 ou inférieur à 300:1 (carbone : magnésium) (mol/mol) ; (d) le glutamate et le magnésium dans un rapport inferieur à 115:1, inférieur à 110:1, inférieur à 105:1 ou inférieur à 100:1 (glutamate : magnésium) (mol/mol) ; (e) le carbone et le cuivre dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, ou supérieur à 4 000:1 (carbone : cuivre) (mol/mol) ; (f) le glutamate et le cuivre dans un rapport supérieur à 170:1, supérieur à 180:1, supérieur à 200:1 ou supérieur à 250:1 (glutamate : cuivre) (mol/mol) ; (g) le carbone et le fer dans un rapport supérieur à 9500:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (carbone : fer) (mol/mol) ; (h) le glutamate et le fer dans un rapport supérieur à 1 600:1, supérieur à 1800:1, supérieur à 2 000:1 ou supérieur à 2 500:1 (glutamate : fer) (mol/mol) ; (i) le carbone et la glycine dans un rapport inférieur à 500:1, inférieur à 400:1, inférieur à 300:1 ou inférieur à 250:1 (carbone : glycine) (mol/mol) ; (j) le glutamate et la glycine dans un rapport inférieur à 100:1, inférieur à 80:1, inférieur à 75:1 ou inférieur à 60:1 (glutamate : glycine) (mol/mol) ; (k) le carbone et la leucine dans un rapport inférieur à 440:1, inférieur à 400:1, inférieur à 350:1 ou inférieur à 300:1 (carbone :leucine) (mol/mol) ; (l) le glutamate et la leucine dans un rapport inférieur à 75:1, inférieur à 70:1, inférieur à 60:1 ou inférieur à 50:1 (glutamate :leucine) (mol/mol) ; (m) le carbone et la méthionine dans un rapport inférieur à 1 200:1, inférieur à 1 000:1, inférieur à 800:1 ou inférieur à 750:1 (carbone:méthionine) (mol/mol) ; (n) le glutamate et la méthionine dans un rapport inférieur à 200:1, inférieur à 175:1, inférieur à 150:1 ou inférieur à 120:1 (glutamate:méthionine) (mol/mol) ; (o) le carbone et le calcium dans un rapport supérieur à 3750:1, supérieur à 4 000:1, supérieur à 4 500:1 ou supérieur à 5 000:1 (carbone : calcium) (mol/mol) ; (p) le glutamate et le calcium dans un rapport supérieur à 620:1, supérieur à 650:1, supérieur à 675:1 ou supérieur à 750:1 (glutamate : calcium) (mol/mol) ; (q) le carbone et le cobalt dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, supérieur à 4 750:1 ou supérieur à 5 000:1 (carbone : cobalt) (mol/mol) ; (r) le glutamate et le cobalt dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (glutamate : cobalt) (mol/mol) ; (s) le carbone et le zinc dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, supérieur à 4 000:1 ou supérieur à 5 000:1 (carbone : zinc) (mol/mol) ; (t) le glutamate et le zinc dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (glutamate: zinc) (mol/mol) ; (u) le carbone et les équivalents de sulfate dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (carbone : équivalents de sulfate) (mol/mol) ; et (v) le glutamate et les équivalents de sulfate dans un rapport supérieur à 130:1, supérieur à 150:1, supérieur à 175:1 ou supérieur à 200:1 (glutamate : équivalents de sulfate) (mol/mol).

Selon un troisième aspect, l'invention concerne un procédé de fermentation pour faire croître une espèce du genre Bordetella dans un milieu chimiquement défini (CDM) comprenant (a) l'inoculation du milieu chimiquement défini selon l'invention avec l'espèce du genre Bordetella ; (b) le maintien de l'espèce du genre Bordetella dans le milieu chimiquement défini pendant une période de temps suffisante pour permettre l'accumulation d'une biomasse.

Selon un quatrième aspect, l'invention concerne un facteur de virulence pouvant être obtenu par le procédé de fermentation selon l'invention.

Selon un cinquième aspect, l'invention concerne un facteur de virulence obtenu par le procédé de fermentation selon 1'invention.

Selon un sixième aspect, l'invention concerne une composition immunogène comprenant le facteur de virulence selon l'invention.

Selon un septième aspect, l'invention concerne un vaccin comprenant la composition immunogène selon l'invention.

Selon un huitième aspect, l'invention concerne une utilisation de la composition immunogène selon l'invention ou du vaccin selon l'invention dans la prévention ou le traitement de la maladie.

Selon un neuvième aspect, l'invention concerne une utilisation de la composition immunogène selon l'invention ou du vaccin selon l'invention dans la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une maladie bactérienne.

Selon un dixième aspect, l'invention concerne une méthode de prévention ou de traitement de la maladie comprenant l'administration de la composition immunogène ou du vaccin à un patient.

DESCRIPTION DETAILLEE MILIEUX CHIMIQUEMENT DEFINIS

Les milieux chimiquement définis (CDM) sont souvent considérés comme bénéfiques dans la mesure où, à la différence des milieux chimiquement non définis, ils contiennent une concentration précise de chaque nutriment réduisant ainsi la variabilité du milieu et améliorant la qualité du produit fermenté. Toutefois il peut être difficile de créer un milieu chimiquement défini équilibré optimal dans la mesure où il est difficile de prédire les nutriments/composants du milieu requis par les différentes bactéries. Dans l'idéal le milieu chimiquement défini devrait être sensiblement équilibré, i.e. à la fin de la fermentation il ne devrait pas y avoir d'excédent d'aucun composant particulier du milieu dû à la présence d'une quantité trop importante de ce composant du milieu pour que les bactéries puissent la métaboliser, puisque les milieux équilibrés supportent une croissance plus efficace et sont plus rentables. Un milieu semi-synthétique pour Bordetella pertussis a été mis au point par Goldner (J. Gen. Microbiol. (1966), 44, 439-444), toutefois il était trop compliqué et onéreux à utiliser à l'échelle industrielle. Stainer et Schölte ont tenté de concevoir un milieu plus simple censé être plus approprié pour la fermentation à l'échelle industrielle, mais il ne s'est pas avéré optimal pour la production des facteurs de virulence (Journal of General Microbiology (1971), 63, 211-220). Les présents inventeurs ont découvert que certaines modifications peuvent être mises en œuvre pour simplifier les milieux chimiquement définis ou pour accroître significativement le rendement des facteurs de virulence obtenus à partir des Bordetella cultivés dans ces milieux.

Ces modifications sont les suivantes : (i) le milieu chimiquement défini comprend moins de 0,035 mM, moins de 0,030 mM, moins de 0,020 mM ou moins de 0,010 mM de sulfate ; (ii) le milieu chimiquement défini comprend une source de cystéine choisie dans le groupe constitué par la cystéine et la cystine dans lequel la source de cystéine est à une concentration inférieure à 0,50 mM, inférieure à 0,30 mM, inférieure à 0,25 mM, inférieure à 0,20 mM, inférieure à 0,15 mM, inférieure à 0,10 mM, inférieure à 0,05 mM ou inférieure à 0,03 mM ; (iii) le milieu chimiquement défini comprend une source inorganique de soufre choisie dans le groupe constitué par le thiosulfate, le trithionate, le tétrathionate, le peroxo- disulfate, le sulfure et le sulfite ; (iv) le milieu chimiquement défini ne comprend pas de source organique de soufre ; (v) le milieu chimiquement défini comprend un tampon choisi dans le groupe constitué par les tampons MOPS, MES, HEPES et PIPES ; (vi) le milieu chimiquement défini comprend plus de 2 μΜ, plus de 3 μΜ, plus de 4 μΜ, plus de 5 μΜ, ou plus de 6 μΜ de cuivre ; (vii) le milieu chimiquement défini comprend plus de 2 μΜ, plus de 5 μΜ, plus de 10 μΜ, plus de 50 μΜ, plus de 100 μΜ ou plus de 400 μΜ de magnésium ; (viii) le milieu chimiquement défini comprend une seule source d'acides aminés ; (ix) le milieu chimiquement défini ne comprend pas de source d'acides aminés ; (x) le milieu chimiquement défini comprend un additif choisi dans le groupe constitué par le zinc, le cobalt, la thiamine, la riboflavine et le pantothénate ; (xi) le milieu chimiquement défini comprend un additif choisi dans le groupe constitué par plus de 0,4 μΜ de biotine, plus de 50 μΜ de calcium, plus de 15 μΜ de niacine, et plus de 25 μΜ d'acide ascorbique ; ou (xii) le milieu chimiquement défini comprend un acide aminé choisi dans le groupe constitué par l'aspartate à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, la glycine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, la méthionine à une concentration supérieure à 500 μΜ et la leucine à une concentration supérieure à 1 500 μΜ.

Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un milieu chimiquement défini pour une espèce du genre Bordetella dans lequel le milieu chimiquement défini comprend une ou plusieurs des modifications décrites ci-dessus .

De plus les tentatives de formulation de nouveaux milieux chimiquement définis impliquent souvent de prendre un milieu complexe et de remplacer le composant de milieu complexe (tel qu'un hydrolysat acide de caséine) par des quantités équivalentes de composants chimiquement définis individuels. Toutefois les présents inventeurs ont découvert de manière surprenante que le rapport entre les composants du milieu peut être très important pour garantir que le milieu chimiquement défini est équilibré et supporte la production à rendement élevé des facteurs de virulence.

Par conséquent selon un deuxième aspect la présente invention concerne un milieu chimiquement défini pour une espèce du genre Bordetella dans lequel le milieu chimiquement défini comprend au moins deux composants choisis dans le groupe constitué par : a) le carbone et le phosphore dans un rapport supérieur à 100:1, supérieur à 125:1, supérieur à 150:1, supérieur à 175:1 ou supérieur à 200:1 (carbone:phosphore) (mol/mol) ; (b) le glutamate et le phosphore dans un rapport supérieur à 20:1, supérieur à 22:1, supérieur à 24:1 ou supérieur à 25:1 (glutamate:phosphore) (mol/mol) ; (c) le carbone et le magnésium dans un rapport inférieur à 600:1, inférieur à 500:1, inférieur à 400:1 ou inférieur à 300:1 (carbone:magnésium) (mol/mol) ; (d) le glutamate et le magnésium dans un rapport inférieur à 115:1, inférieur à 110:1, inférieur à 105:1 ou inférieur à 100:1 (glutamate :magnésium) (mol/mol) ; (e) le carbone et le cuivre dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, ou supérieur à 4 000:1 (carbone : cuivre) (mol/mol) ; (f) le glutamate et le cuivre dans un rapport supérieur à 170:1, supérieur à 180:1, supérieur à 200:1 ou supérieur à 250:1 (glutamate:cuivre) (mol/mol) ; (g) le carbone et le fer dans un rapport supérieur à 9500:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (carbone:fer) (mol/mol) ; (h) le glutamate et le fer dans un rapport supérieur à 1 600:1, supérieur à 1800:1, supérieur à 2 000:1 ou supérieur à 2 500:1 (glutamate: fer) (mol/mol) ; (i) le carbone et la glycine dans un rapport inférieur à 500:1, inférieur à 400:1, inférieur à 300:1 ou inférieur à 250:1 (carbone : glycine) (mol/mol) ; (j) le glutamate et la glycine dans un rapport inférieur à 100:1, inférieur à 80:1, inférieur à 75:1 ou inférieur à 60:1 (glutamate : glycine) (mol/mol) ; (k) le carbone et la leucine dans un rapport inférieur à 440:1, inférieur à 400:1, inférieur à 350:1 ou inférieur à 300:1 (carbone :leucine) (mol/mol) ; (l) le glutamate et la leucine dans un rapport inférieur à 75:1, inférieur à 70:1, inférieur à 60:1 ou inférieur à 50:1 (glutamate :leucine) (mol/mol) ; (m) le carbone et la méthionine dans un rapport inférieur à 1 200:1, inférieur à 1 000:1, inférieur à 800:1 ou inférieur à 750:1 (carbone:méthionine) (mol/mol) ; (n) le glutamate et la méthionine dans un rapport inférieur à 200:1, inférieur à 175:1, inférieur à 150:1 ou inférieur à 120:1 (glutamate:méthionine) (mol/mol) ; (o) le carbone et le calcium dans un rapport supérieur à 3750:1, supérieur à 4 000:1, supérieur à 4 500:1 ou supérieur à 5 000:1 (carbone : calcium) (mol/mol) ; (p) le glutamate et le calcium dans un rapport supérieur à 620:1, supérieur à 650:1, supérieur à 675:1 ou supérieur à 750:1 (glutamate : calcium) (mol/mol) ; (q) le carbone et le cobalt dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, supérieur à 4 750:1 ou supérieur à 5 000:1 (carbone:cobalt) (mol/mol) ; (r) le glutamate et le cobalt dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (glutamate : cobalt) (mol/mol) ; (s) le carbone et le zinc dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, supérieur à 4 000:1 ou supérieur à 5 000: 1 (carbone : zinc) (mol/mol) ; (t) le glutamate et le zinc dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (glutamate : zinc) (mol/mol) ; (u) le carbone et les équivalents de sulfate dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (carbone : équivalents de sulfate) (mol/mol) ; et (v) le glutamate et les équivalents de sulfate dans un rapport supérieur à 130:1, supérieur à 150:1, supérieur à 175:1 ou supérieur à 200: 1 ( glutamate : équivalents de sulfate) (mol/mol).

Le terme « milieu chimiquement défini » désigne un milieu qui est essentiellement dépourvu de substance complexe telle que la levure, un hydrolysat acide de caséine, les peptones, les tryptones, l'extrait de levure. Voir e.g., Jayme et Smith, Cytotechnology 33 (1-3):27-36 (2000). En particulier, tel qu'il est utilisé ici, un milieu chimiquement défini ne comprend pas d'hydrolysat acide de caséine (CAA) comme source d'acides aminés dans le milieu. Tel qu'il est utilisé ici, « 1'hydrolysat acide de caséine » désigne un mélange d'acides aminés obtenu par l'hydrolyse de la caséine.

Les CDM selon la présente invention sont décrits à la fois en termes positifs (ingrédient(s) ou composant(s) inclus dans le milieu) et en termes négatifs (ingrédient(s) ou composant(s) exclus du milieu).

Une « source » est un composant du milieu qui fournit au moins un ingrédient spécifique au milieu. La cystine est, e.g., une source de cystéine dans la mesure où elle fournit une cystéine qui sera utilisée par les organismes cultivés sur le milieu. Tel qu'il est utilisé ici, l'ingrédient lui-même est considéré comme une « source », e.g., le sulfate est une source de sulfate, la cystéine est une source de cystéine, etc. Une « source » peut fournir plus d'un ingrédient, e.g., un acide aminé peut être une source de carbone et une source d'azote, ainsi qu'une source d'acide aminé.

Le terme « milieu » désigne une source de nutriments suffisante pour permettre à Bordetella de croître jusqu'à des densités relativement élevées (par exemple jusqu'à obtention d'une biomasse supérieure à 1,0 g/L, supérieure à 1,5 g/L, supérieure à 2,0 g/L ou supérieure à 2,5 g/L en poids sec de cellules).

Le milieu chimiquement défini selon l'invention est destiné à la culture à l'échelle industrielle d'une espèce du genre Bordetella, le terme « culture à l'échelle industrielle » désignant la culture dans un fermenteur, dans un mode de réalisation, la « culture à l'échelle industrielle » désigne la culture dans un fermenteur ayant un volume de travail entre 5 et 10 000 litres, entre 10 et 5 000 litres, entre 20 et 2 000 litres, entre 50 et 1 000 litres, supérieur ou égal à 5 litres, supérieur ou égal à 10 litres, supérieur ou égal à 15 litres, supérieur ou égal à 20 litres, supérieur ou égal à 25 litres, supérieur ou égal à 50 litres, supérieur ou égal à 100 litres, inférieur ou égal à 10 000 litres, inférieur ou égal à 5 000 litres ou inférieur ou égal à 2 500 litres. Dans un autre mode de réalisation, la « culture à l'échelle industrielle » est une culture se prêtant à la production de plus de 10 mg/L, plus de 15 mg/L ou plus de 20 mg/L d'anatoxine pertussique.

Pendant le procédé de fermentation, le milieu chimiquement défini selon l'invention est ajouté au fermenteur en début de procédé, bien qu'éventuellement, des quantités supplémentaires de milieu puissent être ajoutées pendant le procédé de fermentation (par exemple dans une fermentation en mode discontinu) ; en variante un milieu de composition différente peut être ajouté ultérieurement dans la fermentation. Ce milieu peut également être ajouté en continu dans le milieu de culture dans le cas de systèmes tels que les chémostats ou les rétentostats. De préférence, la fermentation est une fermentation discontinue.

Le milieu chimiquement défini selon l'invention supporte de préférence un rendement de croissance de l'espèce du genre Bordetella supérieur à celui supporté par le milieu Stainer-Scholte (décrit dans Journal of General Microbiology (1971), 63:211-220). Ceci peut être déterminé par ensemencement d'une souche Bordetella, inoculation d'une fiole ou d'un fermenteur contenant le milieu Stainer-Scholte avec un premier échantillon de la souche Bordetella et inoculation d'une fiole ou d'un fermenteur contenant le milieu chimiquement défini à tester avec un second échantillon de la souche Bordetella (dans le même volume que celui choisi pour le milieu Stainer-Scholte) . La densité optique à 650 nm, DO650nm est mesurée à de multiples doubles points temporels pour les deux échantillons, ces points temporels devant inclure un point temporel juste après l'inoculation (désigné point temporel A) et un point temporel correspondant à la fin de la croissance (désigné point temporel B). La croissance est considérée comme terminée quand la concentration cellulaire entre deux points temporels consécutifs (séparés d'au moins 24 h) n'a pas augmenté de plus de 10 %. Si la différence de DO650nm entre le point temporel B et le point temporel A est plus importante pour le second échantillon que pour le premier, qui est inoculé dans le milieu Stainer-Scholte, le milieu chimiquement défini testé supporte un rendement de croissance de l'espèce du genre Bordetella supérieur à celui supporté par le milieu Stainer-Scholte .

Le milieu chimiquement défini supporte de préférence un temps de génération moyen de l'espèce du genre Bordetella inférieur à 15h, inférieur à 12h, inférieurà 10h ou inférieur à 9h. Ceci peut être vérifié à l'aide d'un procédé similaire à celui décrit dans le paragraphe précédent, bien que le temps de génération moyen soit obtenu en divisant le temps entre le point temporel A et le point temporel B par le nombre de générations entre ces deux points temporels, le nombre de générations entre les points temporels A et B étant lui-même obtenu par calcul du rapport entre la DO650nm au second point temporel et la DC>650nm au premier point temporel, converti en Log2.

Le milieu chimiquement défini supporte de préférence des niveaux de production d'anatoxine pertussique supérieurs à ceux supportés par le milieu Stainer-Scholte. Ceci peut être déterminé par inoculation d'une fiole ou d'un fermenteur contenant le milieu Stainer-Scholte avec un premier échantillon de la souche Bordetella pertussis et inoculation BE201 d'une fiole ou d'un fermenteur contenant le milieu chimiquement défini à tester (dans le même volume que celui choisi pour le milieu Stainer-Scholte) avec un second échantillon de la souche Bordetella pertussis, incubation des deux échantillons jusqu'à l'arrêt de la croissance et calcul du niveau de production d'anatoxine pertussique dans chaque échantillon. Un procédé pour déterminer le niveau de production d'anatoxine pertussique est décrit dans l'Exemple 1. Si le niveau de production d'anatoxine pertussique du second échantillon est supérieur à celui du premier échantillon, le milieu chimiquement défini supporte des niveaux de production d'anatoxine pertussique plus élevés que ceux supportés par le milieu Stainer-Scholte.

Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini selon l'invention supporte la production d'anatoxine pertussique par l'espèce du genre Bordetella à un rendement supérieur à 10 mg/L, ou supérieur à 15 mg/L, le rendement étant plus préférablement supérieur à 20 mg/L. Savoir si le milieu chimiquement défini supporte ou pas la production d'anatoxine pertussique par l'espèce du genre Bordetella à un certain rendement peut être déterminé par inoculation du milieu chimiquement défini avec un échantillon du l'espèce du genre Bordetella, et incubation des cellules jusqu'à l'arrêt de la croissance. A la fin de la croissance, le rendement d'anatoxine pertussique peut être calculé par le procédé décrit dans l'Exemple 1.

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini est un milieu sensiblement équilibré. Un milieu sensiblement équilibré est un milieu dans lequel, à la fin de la fermentation, il n'y a pas d'excédent significatif d'un nutriment particulier. Savoir si un milieu chimiquement défini est un milieu sensiblement équilibré ou pas peut être déterminé par incubation de l'espèce du genre Bordetella dans le milieu jusqu'à l'arrêt de la croissance et étude du

, . -, . .. , , . BCZU IH surnageant du milieu apres 1 arrêt de la croissance. Si les sources métaboliques (i.e. sources d'azote, de phosphore et de soufre) sont utilisées à un taux sensiblement similaire (dans les 10 % les unes des autres) , alors le milieu chimiquement défini est équilibré. Dans un mode de réalisation préféré, les concentrations finales de toutes les sources métaboliques seront au voisinage de 0 mM.

De manière générale, les milieux chimiquement définis doivent contenir au moins une source de carbone, une source de phosphore, une source d'azote, une source de soufre et un tampon. La source d'azote peut être organique ou inorganique. La source d'azote peut être un acide aminé ou un peptide, en variante, la source d'azote peut être une source d'azote qui n'est pas un acide aminé ou un peptide auquel cas, le milieu chimiquement défini est un milieu chimiquement défini qui ne comprend pas d'acide aminé. Dans un mode de réalisation, la source d'azote est inorganique. Dans un mode de réalisation, la source d'azote comprend ou consiste en un composé choisi dans le groupe constitué par les acides aminés, l'urée, les polyamines, l'ammonium (tel que le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium ou le nitrate d'ammonium), les nucléobases, les nucléosides, et les nucléotides. Dans un autre mode de réalisation, la source d'azote comprend ou consiste en du chlorure d'ammonium. La source de carbone peut comprendre ou consister en un acide aminé ou un peptide, ou peut comprendre ou consister en une source de carbone qui n'est ni un acide aminé ni un peptide auquel cas, le milieu chimiquement défini ne comprend pas d'acide aminé. Tel qu'il est utilisé ici, le terme « ne comprend pas d'acide aminé » signifie que le milieu « ne comprend pas » de peptides, ni de protéines, puisque les peptides ou les protéines sont des sources d'acides aminés. Dans un mode de réalisation, la source de carbone comprend ou consiste en un composé choisi dans le groupe constitué par les monosaccharides, les disaccharides, les polysaccharides, les polyols (alcools de sucre), les acides organiques et les acides aminés. Dans un autre mode de réalisation, la source de carbone comprend ou consiste en un composé choisi dans le groupe constitué par le glucose, le fructose, le sorbose, la galactosamine, le mannose, le saccharose, le rhamnose, le sorbitol, le mannitol, le citrate, le lactate, l'acétate, le pyruvate, le fumarate, le succinate, la proline et le glutamate. Dans un autre mode de réalisation, la source de carbone comprend un glutamate ou une proline. Dans un autre mode de réalisation, la source de carbone comprend ou consiste en un acide organique choisi dans le groupe constitué par le citrate, le lactate, l'acétate, le pyruvate, le fumurate et le succinate.

Le milieu chimiquement défini selon l'invention est destiné à la culture à l'échelle industrielle d'une espèce du genre Bordetella. Dans un mode de réalisation, le milieu comprend l'espèce du genre Bordetella. Dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella est une espèce choisie dans le groupe constitué par Bordetella petrii, Bordetella avium, Bordetella hinzii, Bordetella trematum, Bordetella holmesii, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica et Bordetella pertussis (également connu sous le nom d'Haemophilus pertussis) . De préférence, l'espèce du genre Bordetella est choisie dans le groupe constitué par Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica et

Bordetella pertussis. Plus préférablement, l'espèce du genre Bordetella est Bordetella pertussis.

SOURCES DE SOUFRE

Dans un premier mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend moins de 0,035 mM, moins de 0,030 mM, moins de 0,020 mM, moins de 0,010 mM de sulfate, de préférence moins de 0,005 mM, moins de 0,0001 mM, moins de 0,00005 mM, moins de 0, 00001 mM, entre 0,035 et 0 mM, entre

öbZUI 0,005 et 0 mH ou entre 0,00001 et 0 mM. De maniéré surprenante, les présents inventeurs ont découvert que l'élimination du sulfate du milieu chimiquement défini augmente significativement le rendement des facteurs de virulence tels que PT quand il est utilisé dans un milieu chimiquement défini pour Bordetella. WO0178462 et Lacey (I960 ; J. Hyg. 58:57-93) développent l'idée selon laquelle le sulfate peut être un inhibiteur de production des facteurs de virulence ; toutefois les milieux à basse teneur en sulfate décrits dans WO0178462 contenaient 0,001 g/L de FeSCu ajouté. Il est donc clair que les inventeurs dans WO0178462 considéraient que la présence d'au moins une certaine quantité de FeSC>4 était requise pour obtenir un milieu chimiquement défini permettant la croissance de pertussis. Il est à noter que pour obtenir des niveaux élevés de facteurs de virulence, le milieu doit supporter à la fois la production de facteur de virulence et la croissance de Bordetella jusqu'à l'obtention d'une biomasse convenable, et bien que l'on ait su que le sulfate inhibe l'expression de facteur de virulence, on ignorait que Bordetella pouvait croître jusqu'à l'obtention d'une biomasse raisonnable en l'absence de sulfate. Il est également à noter que Jebb et Tomlinson (J. Gen. Microbiol. 17, 59-68) indiquent que le sulfate n'était pas suffisant pour fournir une source de soufre, ce qui contredit d'autres techniques, et les documents ultérieurs citant Jebb et Tomlinson (tels que Licary, Siber et Swartz Journal of Biotechnology 1 20 (1991) 117-130) continuant à ajouter du sulfate aux milieux. Cette conclusion est supportée par d'autres publications sur les milieux pour Bordetella, toutes ces publications semblant en général exiger que du sulfate soit présent (par exemple, le milieu Stainer-Scholte décrit ci-dessus en contient). Les présents inventeurs ont, toutefois découvert de manière surprenante que le FeSC>4 peut être remplacé par du citrate de Fe(III) afin d'éliminer le sulfate

BE201A (réduisant ainsi l'inhibition de l'expression de facteur de virulence), qu'un milieu efficace qui supporte la croissance de Bordetella est toujours obtenu et que la réduction du sulfate à une teneur encore plus basse que celle décrite dans WO0178462 engendre une augmentation significative du rendement des facteurs de virulence tels que PT. Dans un autre mode de réalisation le milieu chimiquement défini ne comprend pas de sulfate. L'expression « ne comprend pas » un certain substrat tel que le sulfate désigne un milieu dans lequel le créateur du milieu n'a pas ajouté de quantité significative de ladite substance. Par conséquent, un milieu peut être considéré comme « ne comprenant pas » une certaine substance si le milieu comprend une petite quantité de cette substance, qui est, par exemple un contaminant. En variante, un milieu peut être considéré comme « ne comprenant pas » une certaine substance si le créateur du milieu a ajouté une très petite quantité de cette substance qui n'est pas suffisante pour altérer le rendement d'un facteur de virulence tel que l'anatoxine pertussique. Ceci peut être déterminé par culture de l'espèce du genre Bordetella en présence de la petite quantité de cette substance et en l'absence de la petite quantité de cette substance et mesure du rendement de ce facteur de virulence dans les deux cultures par ELISA. Une ELISA appropriée est décrite plus loin.

Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un milieu chimiquement défini qui comprend une source de cystéine choisie.dans le groupe constitué par la cystéine et la cystine dans lequel la source de cystéine est à une concentration inférieure à 0,50 mM, inférieure à 0,30 mM, inférieure à 0,25 mM, inférieure à 0,20 mM, inférieure à 0,15 mM, inférieure à 0,10 mM, inférieure à 0,05 mM, inférieure à 0,03 mM, inférieure à 0,01 mM, inférieure à 0,005 mM,

DtZUI 4/1 inférieure à 0,001 mM, inférieure à 0,0005 mM, inférieure à 0,0001 mM, inférieure à 0,00005 mM ou inférieure à 0,00001 mM.

La cystéine est généralement utilisée pour la synthèse de biomasse par Bordetella, toutefois quand la cystéine est présente à des concentrations élevées, elle sera catabolisée en sulfate (Bogdan et al ((2001) ; Infect. Immun. 69:6823-6830) ) . Ce sulfate ne peut pas être assimilé car la voie d'assimilation du sulfate n'est pas fonctionnelle (Parkhill et al ((2003) ; Nat. Genet. 35:32-40)). Par conséquent, l'utilisation de concentrations élevées de cystéine dans un milieu peut fournir des ions sulfate qui, comme décrit ci-dessus, inhibent l'expression de facteur de virulence. Toutefois, Bogdan et al ont admis que la cystéine était requise pour la croissance, et par conséquent les milieux décrits dans Bogdan et al (même ceux censés contenir des quantités réduites de cystéine) contiennent des concentrations relativement élevées de cystéine. De manière similaire, Jebb et Tomlinson (J. Gen. Microbiol. 17, 59-68) décrivent la présence de cystéine comme essentielle pour la croissance. Les présents inventeurs ont, toutefois, démontré pour la première fois que Bordetella peut croître en l'absence de cystéine et par conséquent que des concentrations de cystéine encore plus basses que celles décrites dans Bogdan et al. peuvent être utilisées.

La cystine est un dimère de cystéine qui peut être métabolisé de manière similaire en cystéine par Bordetella, mais apporte deux fois plus de cystéine à Bordetella.

Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini ne comprend pas de cystéine, ni de cystine. Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini ne comprend ni sulfate, ni cystéine, ni cystine.

Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend une source inorganique de soufre choisie dans le groupe constitué par le thiosulfate, le trithionate, le

BtZU tétrathionate, le peroxodisulfate, le sulfure et le sulfite. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini ne comprend pas de source organique de soufre.

Les présents inventeurs ont démontré, pour la première fois, que du soufre inorganique peut être utilisé comme source de soufre (plutôt que la cystéine) pour faire croître Bordetella.

Il apparaît d'après la technique, par exemple Jebb et Tomlinson (J. Gen. Microbiol. 17, 59-68), qu'une source organique de soufre est requise pour la croissance de Bordetella, sachant que la voie de synthèse de la cystéine à partir de sulfate et de thiosulfate n'est pas opérationnelle chez les membres du genre Bordetella (Parkhill et al ((2003) ; Nat. Genet. 35:32-40)). Toutefois, les inventeurs ont démontré pour la première fois que Bordetella peut croître en l'absence d'une source organique de soufre (du moment qu'une source inorganique de soufre telle qu'un thiosulfate est présente).

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du thiosulfate. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,005 mM, plus de 0,006 mM, plus de 0,007 mM, plus de 0,008 mM, plus de 0,010 mM, plus de 0,050 mM, plus de 0,100 mM, entre 0, 005 et 0,100 mM, entre 0,005 et 0,050 mM, entre 0,005 et 0,025 mM, environ 0,120 mM ou environ 0,011 mM de thiosulfate. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du trithionate. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,003 mM, plus de 0,004 mM, plus de 0,005 mM, plus de 0,008 mM, plus de 0,010 mM, plus de 0,020 mM, plus de 0,050 mM, entre 0, 003 et 0,500 mM, entre 0,003 et 0,100 mM, entre 0,005 et 0,010 mM, environ 0,007 mM ou environ 0,080 mM de trithionate. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du tétrathionate. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,002 mM, plus de 0,003 mM, plus de 0,004 mM, plus de 0,005 mM, plus° cfe 0,025 mM, plus de 0,050 mM, entre 0,002 et 1,000 mM, entre 0,010 et 0,100 mM, environ 0,060 mM ou environ 0,0006 mM de tétrathionate. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du peroxodisulfate. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,005 mM, plus de 0,006 mM, plus de 0,007 mM, plus de 0,008 mM, plus de 0,010 mM, plus de 0,050 mM, plus de 0,100 mM, entre 0,005 et 1,000 mM, entre 0,005 et 0,200 mM, entre 0,005 et 0,015 mM, environ 0,120 mM ou environ 0,011 mM de peroxodisulfate. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du sulfure. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,010 mM, plus de 0,012 mM, plus de 0,014 mM, plus de 0,016 mM, plus de 0,020 mM, plus de 0,100 mM, plus de 0,200 mM, entre 0,010 et 1,000 mM, entre 0,010 et 0,300 mM, entre 0,010 et 0,100 mM, environ 0,240 mM ou environ 0,022 mM de sulfure. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du sulfite. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,010 mM, plus de 0,012 mM, plus de 0,014 mM, plus de 0,016 mM, plus de 0,020 mM, plus de 0,100 mM, plus de 0,200 mM, environ 0,240 mM ou environ 0,022 mM de sulfite.

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du thiosulfate et du trithionate, du thiosulfate et du tétrathionate, du thiosulfate et du peroxodisulfate, du thiosulfate et du sulfure, du thiosulfate et du sulfite, du trithionate et du tétrathionate, du trithionate et du peroxodisulfate, du trithionate et du sulfure, du tritionate et du sulfite, du tétrathionate et du peroxodisulfate, du tétrathionate et du sulfure, du tétrathionate et du sulfite, du peroxodisulfate et du sulfure, du peroxodisulfate et du sulfite ou du sulfure et du sulfite. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend 2, 3, 4, DI^UI*1 5, 6 sources inorganiques de soufre ou plus choisies dans le groupe constitué par le thiosulfate, le trithionate, le tétrathionate, le peroxodisulfate, le sulfure et le sulfite.

Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini ne comprend pas de sulfate, de cystéine ou de cystine et comprend plus de 0,005 mM, plus de 0,006 mM, plus de 0, 007 mM, plus de 0,008 mM, plus de 0,010 mM, plus de 0, 050 mM, plus de 0,100 mM, entre 0,005 et 0,100 mM, entre 0,005 et 0,050 mM, entre 0,005 et 0,025 mM, environ 0,120 mM ou environ 0,011 mM de thiosulfate.

TAMPON

Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend un tampon choisi dans le groupe constitué par MOPS, MES, HEPES et PIPES.

De manière surprenante, les présents inventeurs ont découvert qu'un milieu chimiquement défini comprenant des tampons autres que tris et β-glycérophosphate, en particulier un tampon MOPS engendre des vitesses de croissance améliorées pour Bordetella pertussis comparé à d'autres milieux. D'autres tampons utilisables dans des milieux chimiquement définis pour Bordetella pertussis ont été explorés par Lothe et al (Journal of Biological Standardisation (1985) 13, 129-134), qui ont toutefois conclus que le β-glycérophosphate était un tampon supérieur. Les présents inventeurs ont toutefois découvert que non seulement d'autres tampons peuvent être efficaces, mais aussi que le tampon MOPS présente des avantages par rapport au β-glycérophosphate. C'est la raison pour laquelle la présente invention concerne un milieu chimiquement défini comprenant un tampon MOPS. Dans un mode de réalisation, le tampon est MOPS à une concentration supérieure à 2 mM, supérieure à 5 mM, supérieure à 7 mM, supérieure à 9 mM, supérieure à 10 mM, supérieure à 11 mM, entre 2 et 100 mM, entre 2 et 50 mM, entre 5 et 20 mM ou d'environ 12 mM.

CONCENTRATIONS ELEVEES DE CUIVRE

Il a été démontré que le cuivre n'était pas requis dans un milieu pour Bordetella (Stainer et Schölte, Journal of General Microbiology (1971), 63:211-220), toutefois les présents inventeurs ont découvert de manière surprenante que l'ajout d'une concentration relativement élevée de cuivre à un milieu chimiquement défini pour Bordetella engendre un accroissement significatif de la quantité de toxine produite par Bordetella (par exemple l'expression de l'anatoxine pertussique à partir de Bordetella pertussis) .

Par conséquent dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 2 μΜ, plus de 3 μΜ, plus de 4 μΜ, plus de 5 μΜ, plus de 6 μΜ, plus de 7 μΜ, plus de 8 μΜ, moins de 200 μΜ, moins de 150 μΜ, moins de 100 μΜ, entre 4 et 10 μΜ, entre 2 et 200 μΜ, entre 3 et 150 μΜ ou entre 5 et 100 μΜ de cuivre. Dans un mode de réalisation, la source de cuivre est choisie dans le groupe constitué par le chlorure de cuivre, le sulfate de cuivre, l'acétate de cuivre, le chlorate de cuivre et le carbonate de cuivre. Dans un autre mode de réalisation, le cuivre est sous la forme de chlorure de cuivre.

CONCENTRATIONS ELEVEES DE MAGNESIUM

Les concentrations élevées de magnésium sont connues pour moduler Bordetella, et induire la conversion de Bordetella en un état où la bactérie est moins susceptible d'exprimer des facteurs de virulence tels que l'anatoxine pertussique et la FHA ( Idigbe et al J. MED. MICROBIOL (1981) 409-418) et Lacey et al ((1960) J. Hyg. 58:57-93)). Comme expliqué ci-dessus, faire croître Bordetella dans un environnement qui induit des taux élevés d'expression de toxine est avantageux, et l'ajout de magnésium était connu pour réduire l'expression de facteur de virulence, d'où son élimination des milieux destinés à la production de vaccins anticoquelucheux. Toutefois les présents inventeurs ont découvert de manière surprenante que l'ajout de concentrations élevées de magnésium peut être utilisé dans un milieu chimiquement défini ayant des niveaux élevés d'expression de facteurs de virulence tels que PT.

Pour ces raisons, dans un mode de réalisation le milieu chimiquement défini comprend plus de 2 μΜ, plus de 5 μΜ, plus de 10 μΜ, plus de 25 μΜ, plus de 50 μΜ, plus de 75 μΜ, plus de 100 μΜ, plus de 200 μΜ, plus de 300 μΜ, plus de 400 μΜ, entre 2 et 6 000 μΜ, entre 1 000 et 6 000 μΜ, ou environ 5 000 μΜ de magnésium.

SOURCE D'ACIDES AMINES

On sait de manière générale que les milieux doivent comprendre une source d'azote et une source de carbone ; et que dans de nombreux cas, certains acides aminés sont requis pour la croissance (acides aminés essentiels). Stainer et Schölte (Stainer et Schölte, Journal of General Microbiology (1971), 63:211-220) ont essayé de créer un milieu chimiquement défini simplifié mais en sont toutefois arrivés à la conclusion qu'au moins deux acides aminés étaient requis, à savoir l'acide glutamique, la proline et la cystine.

Toutefois les présents inventeurs ont découvert de manière surprenante que Bordetella peut croître dans des milieux comprenant un seul type d'acide aminé. En particulier, les inventeurs ont démontré que Bordetella peut croître sur des milieux qui ne comprennent qu'un seul acide aminé et ne comprennent pas de cystéine, ceci étant d'autant plus surprenant que, comme décrit ci-dessus, on pensait précédemment que la cystéine était indispensable à titre de source de soufre. Cette découverte est avantageuse car, comme décrit ci-dessus, les milieux à usage commercial doivent être aussi simples que possible, afin de réduire les difficultés de fabrication du milieu, son coût et les sources potentielles de variabilité d'un lot à l'autre. C'est la raison pour laquelle, dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini ne comprend qu'une seule source d'acide aminé. L'expression « seule source d'acide aminé » désigne un composé qui apporte au milieu une source d'un seul type d'acide aminé (telle qu'une source de glutamine, ou d'asparagine ou autre acide aminé), un composé comme la cystine pouvant être considéré comme une seule source d'acide d'aminé puisque, bien ce que soit un dipeptide, il ne contient que de la cystéine et que par conséquent, un seul acide aminé est fourni. En particulier, un milieu sera considéré comme ne comprenant qu'une seule source d'acide aminé si à la fois la cystéine et la cystine sont présentes, puisque ces deux composants n'apportent que de la cystéine (seul acide aminé) au milieu. Ce terme inclut les énantiomères D et L des acides aminés. Dans un mode de réalisation, la source d'acide aminé est un énantiomère D, dans un autre mode de réalisation, la source d'acide aminé est un énantiomère L, et dans un autre mode de réalisation, la source d'acide aminé peut être soit un énantiomère L, soit un énantiomère D. Un milieu comprenant une « seule source d'acide aminé » ne comprend pas d'autres acides aminés, par exemple, un milieu comprenant de la cystéine à titre de seule source d'acide aminé ne comprend pas de glutamate, alanine, aspartate, phénylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, méthionine, asparagine, proline, glutamine, sérine, valine, tyrosine ou autre acide aminé. Gomme expliqué ci-dessus, l'expression « ne comprend pas » un certain substrat tel que certains acides aminés désigne un milieu dans lequel le créateur du milieu n'a pas ajouté une quantité significative de ladite substance. Par conséquent, un milieu peut être considéré comme « ne comprenant pas » une certaine substance si le milieu comprend une petite quantité de cette substance, qui est, par exemple un contaminant. En variante,' un milieu peut être considéré comme « ne comprenant pas » une certaine substance si le créateur du milieu a ajouté une très petite quantité de cette substance qui n'est pas suffisante pour altérer le rendement d'un facteur de virulence tel que l'anatoxine pertussique. Ceci peut être déterminé par culture de l'espèce du genre Bordetella en présence de la petite quantité de cette substance et en l'absence de la petite quantité de cette substance et mesure du rendement de ce facteur de virulence dans les deux cultures par ELISA (comme décrit ci-dessus). Dans un autre mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est une seule source d'azote.

Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est choisie dans le groupe constitué par la cystéine, la cystine, l'alanine, la glycine, le glutamate, la proline, la sérine, la glutamine, l'aspartate, la leucine, 1'isoleucine, la valine, la tyrosine, la phénylalanine, le tryptophane, l'histidine, l'arginine, l'ornithine, la lysine, la thréonine, l'asparagine et la méthionine. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est la cystéine à une concentration supérieure à 75 mM, supérieure à 100 mM, supérieure à 125 mM, entre 75 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 125 mM. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est la proline à une concentration supérieure à 75 mM, supérieure à 100 mM, supérieure à 125 mM, entre 75 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 125 mM. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est le glutamate à une concentration supérieure à 75 mM, supérieure à 100 mM, supérieure à 125 mM, entre 75 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 125 mM. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est la glutamine à une concentration supérieure à 75 mM, supérieure à 100 mM, supérieure à 125 mM, entre 75 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 125 mM. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est DL^UI4 l'aspartate à une concentration supérieure à 10 iriM, supérieure à 20 mM, supérieure à 30 mM, entre 10 et 100 mM, entre 20 et 50 mM ou d'environ 30 mM. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est l'asparagine à une concentration supérieure à 75 mM, supérieure à 100 mM, supérieure à 125 mM, entre 75 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 125 mM. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est la sérine à une concentration supérieure à 75 mM, supérieure à 100 mM, supérieure à 125 mM, entre 75 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 125 mM. Dans un mode de réalisation, la seule source d'acide aminé est l'alanine à une concentration supérieure à 75 mM, supérieure à 100 mM, supérieure à 125 mM, entre 75 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 125 mM.

Les inventeurs ont en outre démontré que, bien qu'il soit avantageux d'utiliser une seule source d'acide aminé dans un milieu chimiquement défini pour Bordetella afin de supporter une production élevée de toxines, il est également possible de créer un milieu qui ne comprend pas de source d'acide aminé du tout. Ceci donne un milieu dans lequel les sources de carbone et d'azote sont constituées par des composants distincts, ce qui permet de manipuler lesdites sources de carbone et d'azote séparément. A cet égard, Thalen et al. (Journal of Biotechnology (1999) 75: 147-159) ont rapporté qu'un rapport azote à carbone de 1:5 (comme dans le milieu de Stainer et Schölte (Journal of General Microbiology (1971), 63:211-220)) n'est pas optimal pour la croissance de Bordetella, et engendre une accumulation d'ammoniac. Thalen et al. ont montré que l'accumulation d'ammoniac pouvait être considérablement réduite en utilisant un rapport azote à carbone de 1:10. Ce rapport ne peut toutefois pas être atteint avec des acides aminés naturels, pour lesquels ce rapport est déterminé par la composition moléculaire, et varie de 1:1,5 (Arginine) à 1:9 (Tyrosine et Phénylalanine) . Pour contourner cette limitation, BE20

Thalen et al. ont manipulé le rapport carbone à azote en ajoutant une seconde source de carbone ne contenant pas d'azote (lactate, acide organique). Toutefois, cette solution est complexe en termes de flux métaboliques, ce qui à son tour complique la surveillance et la compréhension du procédé, ainsi que l'obtention d'un milieu équilibré (Neeleman et al. (Applied Microbiology and Biotechnology (2001), 57:489-493)).

Eliminer complètement les acides aminés offre une solution alternative à la manipulation précise du rapport carbone à azote, par ajustement minutieux des concentrations relatives d'une source de carbone ne contenant pas d'azote, d'une part, et d'une source d'azote ne contenant pas de carbone, d'autre part. Pour cette raison, dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini ne comprend pas de source d’acide aminé.

Le milieu doit contenir une source de carbone si le milieu ne contient pas de source d'acide aminé, la source de carbone étant de préférence un acide organique. Dans un mode de réalisation, l'acide organique est choisi dans le groupe constitué par le citrate, le lactate, l'acétate, le pyruvate, le fumarate et le succinate. Les présents inventeurs ont démontré que les acides organiques sont des substituts convenables au glutamate à titre de source de carbone pour Bordetella supportant des niveaux raisonnables de croissance.

Dans un mode de réalisation, si le milieu chimiquement défini comprend une seule source d'acide aminé, ou ne comprend pas de source d'acide aminé, le milieu chimiquement défini comprend au moins un des composants de milieu chimiquement défini comprenant 1'hydrogénophosphate de potassium, le chlorure de potassium, le magnésium, le calcium, le citrate de Fe(III), le tampon MOPS, la niacine, la diméthyl-β- cyclodextrine, le cuivre, ou le cobalt, de préférence le milieu comprend 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 de ces composants.

Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend tous ces composants. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini peut également comprendre du sodium, du zinc, de la biotine, de la riboflavine, du panthothénate de calcium. De préférence le milieu comprend du sodium, du zinc, de la biotine, de la riboflavine et du panthothénate de calcium.

Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend une seule source d'acide aminé ou ne comprend pas de source d'acide aminé, et le milieu chimiquement défini comprend entre 250 et 750 mg/L de KH2PO4, entre 100 et 300 mg/L de KC1, entre 500 et 1 500 mg/L de MgCl2.6H20, entre 50 et 150 mg/L de CaCl2.2H20, entre 10 et 30 mg/L de citrate de Fe (III) . 3H2O, entre 1 000 et 5 000 mg/L de MOPS, entre 4 et 8 mg/L de niacine, entre 500 et 2 000 mg/L de diméthyl-β-cyclodextrine, entre 0,5 et 2 mg/L de CUCI2.2H2O et entre 0,1 et 1 mg/L de C0CI2.H2O. Dans un autre mode de réalisation, le milieu comprend en outre entre 1 et 25 mg/L de ZnCl2, entre 0,01 et 1,00 mg/L de biotine, entre 0,01 et 1,00 mg/L de riboflavine, entre 1 et 10 mg/L de panthothénate de calcium et entre 5 000 et 1 500 mg/L de NaCl.

AUTRES ADDITIFS BENEFIQUES

Comme décrit ci-dessus, il importe qu'un milieu chimiquement défini contienne au moins une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore, une source de soufre et un tampon. En général, il est avantageux de concevoir un milieu chimiquement défini qui soit simple (ne contenant pas trop de composants) pour réduire le coût et la complexité de la fabrication. Toutefois les présents inventeurs ont démontré que l'ajout d'un additif choisi dans le groupe constitué par le zinc, le cobalt, la thiamine, la riboflavine, le pantothénate, plus de 0,4 μΜ de biotine, plus de 50 μΜ de calcium, plus de 15 μΜ de niacine, et plus de 25 μΜ d'acide ascorbique peut significativement améliorer le rendement de l'expression des facteurs de virulence tels que l'anatoxine pertussique. C'est la raison pour laquelle, dans un mode de réalisation le milieu chimiquement défini comprend un additif choisi dans le groupe constitué par le zinc, le cobalt, la thiamine, la riboflavine et le pantothénate. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend un additif choisi dans le groupe constitué par plus de 0,4 μΜ de biotine, plus de 50 μΜ de calcium, plus de 15 μΜ de niacine, et plus de 25 μΜ d'acide ascorbique.

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 de ces additifs. Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend tous les additifs de zinc, cobalt, riboflavine, thiamine, pantothénate, plus de 0,4 μΜ de biotine, plus de 0,05 mM de calcium, plus de 15 μΜ de niacine, et plus de 25 μΜ d'acide ascorbique. Dans un mode de réalisation, la concentration de l'additif dans le milieu chimiquement défini est suffisante pour que l'additif augmente le niveau de production des facteurs de virulence par Bordetella (ce qui peut être vérifié à l'aide du dosage décrit précédemment pour mesurer si l'ajout d'un additif altère ou pas le rendement d'anatoxine pertussique).

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,1 μΜ, plus de 1 μΜ, plus de 5 μΜ, plus de 10 μΜ, plus de 20 μΜ, plus de 30 μΜ, plus de 40 μΜ, plus de 50 μΜ, plus de 60 μΜ, plus de 70 μΜ, plus de 100 μΜ, plus de 200 μΜ, plus de 400 μΜ, plus de 600 μΜ, plus de 700 μΜ, entre 10 et 2 000 μΜ, entre 20 et 1 000 μΜ, entre 30 et 100 μΜ, ou environ 75 μΜ de zinc. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,05 μΜ, plus de 0,10 μΜ, plus de 0,15 μΜ, entre 0,10 et 0,30 μΜ, entre 0,10 et 0,20 μΜ, ou environ 0,18 μΜ de cobalt. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,05 μΜ, plus de 0,10 μΜ, plus de 0,15 μΜ, entre 0,05 et 5,00 μΜ, entre 0,10^¾^ 1,00 μΜ, ou entre 0,15 et 0,50 μΜ de thiamine. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,1 μΜ, plus de 0,2 μΜ, plus de 0,3 μΜ, plus de 0,4 μΜ, plus de 0,5 μΜ, plus de 0,6 μΜ, plus de 0,8 μΜ, entre 0,1 et 10 μΜ, entre 0,5 et 1,0 μΜ, ou environ 0,8 μΜ de riboflavine. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,10 μΜ, plus de 0,5 μΜ, plus de 1,0 μΜ, plus de 1,5 μΜ, plus de 2,0 μΜ, plus de 5,0 μΜ, plus de 8,0 μΜ, entre 0,5 et 100 μΜ, entre 0,5 et 25,0 μΜ, entre 5,0 et 10,0 μΜ, ou environ 8,0 μΜ de pantothénate. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,4 μΜ, plus de 0,5 μΜ, plus de 0,6 μΜ, plus de 0,8 μΜ, entre 0,5 et 100 μΜ, entre 0,5 et 25,0 μΜ, entre 5,0 et 10,0 μΜ, ou environ 8,0 μΜ de biotine. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 100 μΜ, plus de 120 μΜ, plus de 140 μΜ, entre 50 et 1 000 μΜ, entre 50 et 500 μΜ, entre 100 et 200 μΜ, ou environ 140 μΜ de calcium. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 20 μΜ, plus de 30 μΜ, plus de 35 μΜ, entre 15 et 500 μΜ, entre 15 et 100 μΜ, entre 25 et 75 μΜ, ou environ 50 μΜ de niacine. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 50 μΜ, plus de 7 5 μΜ, plus de 100 μΜ, plus de 1 000 μΜ, plus de 2 000 μΜ, plus de 3 000 μΜ, entre 25 et 10 000 μΜ, entre 10 000 et 5 000 μΜ, ou environ 3 500 μΜ d'acide ascorbique.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend plus de 0,01 mM de zinc, plus de 0,0005 mM de cobalt, plus de 0,005 mM de thiamine, plus de 0,0001 mM de riboflavine, plus de 0,005 mM de pantothénate, plus de 0,4 μΜ de biotine, plus de 0,05 mM de calcium, plus de 15 μΜ de niacine et plus de 25 μΜ d'acide ascorbique.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend plus de 700 μΜ de zinc, plus de

DCZU I 0,15 μΜ de cobalt, plus de 29 μΜ de thiamine, plus de 0,8 μΜ de riboflavine, plus de 8,0 μΜ de pantothénate, plus de 0,8 μΜ de biotine, plus de 140 μΜ de calcium, plus de 35 μΜ de niacine, et plus de 3 000 μΜ d'acide ascorbique.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend entre 10 et 150 μΜ de zinc, entre 0,10 et 0,30 μΜ de cobalt, entre 25 et 200 μΜ de thiamine, entre 0,1 et 10 μΜ de riboflavine, entre 0,5 et 100 μΜ de pantothénate, entre 0,5 et 100 μΜ de biotine, entre 50 et 1 000 μΜ de calcium, entre 1 et 500 μΜ de niacine, et entre 25 et 10 000 μΜ d'acide ascorbique.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend entre 30 et 80 μΜ de zinc, entre 0,10 et 0,20 μΜ de cobalt, entre 25 et 50 μΜ de thiamine, entre 0,5 et 1,0 μΜ de riboflavine, entre 5,0 et 10,0 μΜ de pantothénate, entre 5,0 et 10,0 μΜ de biotine, entre 100 et 200 μΜ de calcium, entre 25 et 75 μΜ de niacine, et entre 10 000 et 5 000 μΜ d'acide ascorbique.

CONCENTRATIONS D'ACIDES AMINES

Les présents inventeurs ont en outre démontré que les milieux de l'état de la technique tels que Staine-Scholte peuvent être améliorés par ajout de niveaux élevés d'aspartate, de glycine, de méthionine et de leucine. Par conséquent, dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un milieu chimiquement défini qui comprend une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué par l'aspartate à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, la glycine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, la méthionine à une concentration supérieure à 500 μΜ et la leucine à une concentration supérieure à 1 500 μΜ.

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de l'aspartate à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 2 000 μΜ, supérieure à 2450 μΜ, BE201 supérieure à 3 000 μΜ, supérieure à 3 500 μΜ, entre 1 000 et 10 000 μΜ, entre 1 000 et 5 000 μΜ, ou d'environ 4 000 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la glycine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ, supérieure à 1750 μΜ, entre 500 et 5 000 μΜ, entre 500 et 2 500 μΜ ou d'environ 2 000 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la méthionine à une concentration supérieure à 100 μΜ, supérieure à 300 μΜ, supérieure à 500 μΜ, supérieure à 600 μΜ, supérieure à 700 μΜ, entre 100 et 2 000 μΜ, entre 100 et 1 000 μΜ ou d'environ 775 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la leucine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ, supérieure à 2 000 μΜ, supérieure à 2 500 μΜ, supérieure à 3 000 μΜ, entre 500 et 10 000 μΜ, entre 500 et 5 000 μΜ, entre 3 000 et 4 000 μΜ, ou d'environ 3300 μΜ. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend au moins 2, 3 ou 4 acides aminés parmi l'aspartate à une concentration supérieure à 100 μΜ, la glycine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, la méthionine à une concentration supérieure à 500 μΜ et la leucine à une concentration supérieure à 1 500 μΜ. Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend de l'aspartate à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, de la glycine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, de la méthionine à une concentration supérieure à 500 μΜ et de la leucine à une concentration supérieure à 1 500 μΜ.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend du glutamate à une concentration supérieure à 50 μΜ, supérieure à 75 μΜ, supérieure à 90 μΜ, supérieure à 100 μΜ, supérieure à 110 μΜ, entre 50 et 500 mM, entre 50 et 250 mM, entre 100 et 150 mM ou d'environ 120 mM. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement BE20 défini comprend de l'alanine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ, supérieure à 2 000 μΜ, supérieure à 2 500 μΜ, supérieure à 3 000 μΜ, entre 1 000 et 10 000 μΜ, entre 1 000 et 5 000 μΜ, entre 3 000 et 4 000 μΜ ou d'environ 3400 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la phénylalanine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 750 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 250 μΜ, supérieure à 1400 μΜ, entre 500 et 10 000 μΜ, entre 500 et 5 000 μΜ, entre 1 000 et 2 000 μΜ ou d'environ 1400 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de l'histidine à une concentration supérieure à 50 μΜ, supérieure à 100 μΜ, supérieure à 150 μΜ, supérieure à 200 μΜ, entre 50 et 1 000 μΜ, entre 50 et 500 μΜ, entre 150 et 250 μΜ ou d'environ 200 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de 1'isoleucine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ, supérieure à 1750 μΜ, entre 500 et 5 000 μΜ, entre 500 et 2 500 μΜ, entre 1 000 et 2 000 μΜ ou d'environ 1800 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la lysine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ, supérieure à 2 000 μΜ, entre 500 et 10 000 μΜ, entre 500 et 5 000 μΜ, entre 1 500 et 2 500 μΜ ou d'environ 2 100 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la proline à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 3 000 μΜ, supérieure à 4 000 μΜ, supérieure à 5 000 μΜ, supérieure à 6 000 μΜ, supérieure à 7 000 μΜ, entre 1 000 et 50 000 μΜ, entre 1 000 et 10 000 μΜ, entre 7 000 et 8 000 μΜ ou d'environ 7600 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la sérine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ, supérieure à 1 700 μΜ, entre 500 et 10 000 μΜ, entre BE2014 500 et 5 000 μΜ, entre 1 000 et 2 000 μΜ ou d'environ 1 700 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la valine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 2 000 μΜ, supérieure à 2 500 μΜ, supérieure à 3 000 μΜ, entre 1 000 et 10 000 μΜ, entre 1 000 et 5 000 μΜ, entre 3 000 et 4 000 μΜ ou d'environ 3400 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la tyrosine à une concentration supérieure à 25 μΜ, supérieure à 50 μΜ, supérieure à 75 μΜ, supérieure à 100 μΜ, supérieure à 150 μΜ, supérieure à 175 μΜ, entre 25 et 1 000 μΜ, entre 25 et 500 μΜ, entre 100 et 200 μΜ ou d'environ 180 μΜ. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de la glutathione à une concentration supérieure à 100 μΜ, supérieure à 200 μΜ, supérieure à 400 μΜ, supérieure à 500 μΜ, supérieure à 600 μΜ, supérieure à 700 μΜ, entre 100 et 5 000 μΜ, entre 100 et 2 500 μΜ, entre 100 et 1 000 μΜ ou d'environ 750 μΜ. Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend du glutamate à une concentration supérieure à 50 mM, de l'alanine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, de l'aspartate à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, de la phénylalanine à une concentration supérieure à 500 μΜ, de la glycine à une concentration supérieure à 500 μΜ, de l'histidine à une concentration supérieure à 50 μΜ, de l'isoleucine à une concentration supérieure à 500 μΜ, de la lysine à une concentration supérieure à 500 μΜ, de la leucine à une concentration supérieure à 500 μΜ, de la méthionine à une concentration supérieure à 100 μΜ, de la proline à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, de la sérine à une concentration supérieure à 500 μΜ, de la valine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, de la tyrosine à une concentration supérieure à 25 μΜ et de la glutathione à une concentration supérieure à 700 μΜ. Dans un autre mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend du BE201 glutamate à une concentration supérieure à 110 mM, de l'alanine à une concentration supérieure à 3 000 μΜ, de l'aspartate à une concentration supérieure à 3 500 μΜ, de la phénylalanine à une concentration supérieure à 1400 μΜ, de la glycine à une concentration supérieure à 1750 μΜ, de l'histidine à une concentration supérieure à 200 μΜ, de l'isoleucine à une concentration supérieure à 1750 μΜ, de la lysine à une concentration supérieure à 2 000 μΜ, de la leucine à une concentration supérieure à 3 000 μΜ, de la méthionine à une concentration supérieure à 700 μΜ, de la proline à une concentration supérieure à 7 000 μΜ, de la sérine à une concentration supérieure à 1 700 μΜ, de la valine à une concentration supérieure à 3 000 μΜ, de la tyrosine à une concentration supérieure à 175 μΜ et de la glutathione à une concentration supérieure à 700 μΜ.

Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend de l'aspartate à une concentration entre 1 000 et 10 000 μΜ, de la glycine à une concentration entre 500 et 5 000 μΜ, de la méthionine à une concentration entre 100 et 2 000 μΜ, de la leucine à une concentration entre 500 et 10 000 μΜ, du glutamate à une concentration entre 50 et 500 mM, de l'alanine à une concentration entre 1 000 et 10 000 μΜ, de la phénylalanine à une concentration entre 500 et 10 000 μΜ, de l'histidine à une concentration entre 50 et 1 000 μΜ, de l'isoleucine à une concentration entre 500 et 5 000 μΜ, de la lysine à une concentration entre 500 et 10 000 μΜ, de la proline à une concentration entre 1 000 et 50 000 μΜ, de la sérine à une concentration entre 500 et 10 000 μΜ, de la valine à une concentration entre 1 000 et 10 000 μΜ, de la tyrosine à une concentration entre 25 et 1 000 μΜ et de la glutathione à une concentration entre 100 et 5 000 μΜ.

Dans un mode de réalisation préféré, le milieu chimiquement défini comprend de l'aspartate à une

BE2C concentration entre 1 000 et 5 000 μΜ, de la glycine à une concentration entre 500 et 2 500 μΜ, de la méthionine à une concentration entre 100 et 1 000 μΜ, de la leucine à une concentration entre 3 000 et 4 000 μΜ, du glutamate à une concentration entre 100 et 150 mM, de l'alanine à une concentration entre 3 000 et 4 000 μΜ, de la phénylalanine à une concentration entre 1 000 et 2 000 μΜ, de l'histidine à une concentration entre 150 et 250 μΜ, de l'isoleucine à une concentration entre 1 000 et 2 000 μΜ, de la lysine à une concentration entre 1 500 et 2 500 μΜ, de la proline à une concentration entre 7 000 et 8 000 μΜ, de la sérine à une concentration entre 1 000 et 2 000 μΜ, de la valine à une concentration entre 3 000 et 4 000 μΜ, de la tyrosine à une concentration entre 100 et 200 μΜ et de la glutathione à une concentration entre 100 et 1 000 μΜ.

RAPPORTS DES COMPOSANTS

Les présents inventeurs ont découvert de manière surprenante que si certains rapports de composés sont utilisés, le milieu chimiquement défini engendrera des rendements améliorés de facteurs de virulence tels que l'anatoxine pertussique et la FHA. C'est la raison pour laquelle l'invention concerne un milieu chimiquement défini qui comprend au moins deux composants et dans lequel lesdits au moins deux composants sont choisis dans le groupe constitué par : (a) le carbone et le phosphore dans un rapport supérieur à 100:1, supérieur à 125:1, supérieur à 150:1, supérieur à 175:1 ou supérieur à 200:1 (carbone‘.phosphore) (mol/mol) ; (b) le glutamate et le phosphore dans un rapport supérieur à 20:1, supérieur à 22:1, supérieur à 24:1 ou supérieur à 25:1 (glutamate:phosphore) (mol/mol) ; BE2Q14 (c) le carbone et le magnesium dans un rapport inferieur a 600:1, inférieur à 500:1, inférieur à 400:1 ou inférieur à 300:1 (carbone:magnésium) (mol/mol)· ; (d) le glutamate et le magnésium dans un rapport inférieur à 115:1, inférieur à 110:1, inférieur à 105:1 ou inférieur à 100:1 (glutamate:magnésium) (mol/mol) ; (e) le carbone et le cuivre dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, ou supérieur à 4 000:1 (carbone : cuivre) (mol/mol) ; (f) le glutamate et le cuivre dans un rapport supérieur à 170:1, supérieur à 180:1, supérieur à 200:1 ou supérieur à 250:1 (glutamate : cuivre) (mol/mol) ; (g) le carbone et le fer dans un rapport supérieur à 9500:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (carbone : fer) (mol/mol) ; (h) le glutamate et le fer dans un rapport supérieur à 1 600:1, supérieur à 1800:1, supérieur à 2 000:1 ou supérieur à 2 500:1 (glutamate : fer) (mol/mol) ; (i) le carbone et la glycine dans un rapport inférieur à 500:1, inférieur à 400:1, inférieur à 300:1 ou inférieur à 250:1 (carbone : glycine) (mol/mol) ; (j) le glutamate et la glycine dans un rapport inférieur à 100:1, inférieur à 80:1, inférieur à 75:1 ou inférieur à 60:1 (glutamate : glycine) (mol/mol) ; (k) le carbone et la leucine dans un rapport inférieur à 440:1, inférieur à 400:1, inférieur à 350:1 ou inférieur à 300:1 (carbone :leucine) (mol/mol) ; (l) le glutamate et la leucine dans un rapport inférieur à 75:1, inférieur à 70:1, inférieur à 60:1 ou inférieur à 50:1 (glutamate :leucine) (mol/mol) ; (m) le carbone et la méthionine dans un rapport inférieur à 1 200:1, inférieur à 1 000:1, inférieur à 800:1 ou inférieur à 750:1 (carbone:méthionine) (mol/mol) ; , BE201' (n) le glutamate et la méthionine dans un rapport inférieur à 200:1, inférieur à 175:1, inférieur à 150:1 ou inférieur à 120:1 (glutamate-.méthionine) (mol/mol) ; (o) le carbone et le calcium dans un rapport supérieur à 3750:1, supérieur à 4 000:1, supérieur à 4 500:1 ou supérieur à 5 000:1 (carbone: calcium) (mol/mol) ; (p) le glutamate et le calcium dans un rapport supérieur à 620:1, supérieur à 650:1, supérieur à 675:1 ou supérieur à 750:1 (glutamate : calcium) (mol/mol) ; (q) le carbone et le cobalt dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, supérieur à 4 750:1 ou supérieur a 5 000:1 (carbone : cobalt) (mol/mol) ; (r) le glutamate et le cobalt dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (glutamate : cobalt) (mol/mol) ; (s) le carbone et le zinc dans un rapport supérieur à 3 000:1, supérieur à 3 500:1, supérieur à 4 000:1 ou supérieur à 5 000:1 (carbone : zinc) (mol/mol) ; (t) le glutamate et le zinc dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (glutamate : zinc) (mol/mol) ; (u) le carbone et les équivalents de sulfate dans un rapport supérieur à 750:1, supérieur à 1 000:1, supérieur à 1 250:1 ou supérieur à 1 500:1 (carbone : équivalents de sulfate) (mol/mol) ; et (v) le glutamate et les équivalents de sulfate dans un rapport supérieur à 130:1, supérieur à 150:1, supérieur à 175:1 ou supérieur à 200:1 (glutamate : équivalents de sulfate) (mol/mol).

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou les 22 composants (a), (b), (c) , (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (1), (m) , (n) , (o) , BE201 (p) , (q) , (r) , (s) , (t) , (u) et (v) . Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du carbone et du phosphore dans un rapport supérieur à 200:1 (carbone : phosphore) (mol/mol), du glutamate et du phosphore dans un rapport supérieur à 25:1 (glutamate:phosphore) (mol/mol), du carbone et du magnésium dans un rapport inférieur à 300:1 (carbone:magnésium) (mol/mol), du glutamate et du magnésium dans un rapport inférieur à 100:1 (glutamate : magnésium) (mol/mol), du carbone et du cuivre dans un rapport supérieur à 4 000:1 (carbone : cuivre) (mol/mol), du glutamate et du cuivre dans un rapport supérieur à 250:1 (glutamate : cuivre) (mol/mol), du carbone et du fer dans un rapport supérieur à 1 500:1 (carbone : fer) (mol/mol), du glutamate et du fer dans un rapport supérieur à 2 500:1 (glutamate : fer) (mol/mol), du carbone et de la glycine dans un rapport inférieur à 250:1 (carbone : glycine) (mol/mol), du glutamate et de la glycine dans un rapport inférieur à 250:1 (carbone : glycine) (mol/mol), du carbone et de la leucine dans un rapport inférieur à 300:1 (carbone :leucine) (mol/mol), du glutamate et de la leucine dans un rapport inférieur à 50:1 (glutamate :leucine) (mol/mol), du carbone et de la méthionine dans un rapport inférieur à 750:1 (carbone:méthionine) (mol/mol), du glutamate et de la méthionine dans un rapport inférieur à 120:1 (glutamate.-méthionine) (mol/mol), du carbone et du calcium dans un rapport supérieur à 5 000:1 (carbone : calcium) (mol/mol), du glutamate et du calcium dans un rapport supérieur à 750:1 (glutamate : calcium) (mol/mol), du carbone et du cobalt dans un rapport supérieur à 5 000:1 (carbone:cobalt) (mol/mol), du glutamate et du cobalt dans un rapport supérieur à 1 500:1 (glutamate : cobalt) (mol/mol), du carbone et du zinc dans un rapport supérieur à 5 000:1 (carbone : zinc) (mol/mol), du glutamate et du zinc dans un rapport supérieur à 1 500:1 (glutamate : zinc) (mol/mol), du carbone et des équivalents de sulfate dans un rapport

BE2C supérieur à 1 500 : 1 (carbone : équivalents de sulfate) et du glutamate et des équivalents de sulfate dans un rapport supérieur à 200:1 (glutamate : équivalents de sulfate).

Le terme « équivalents de sulfate » désigne le sulfate inorganique ou des composés inorganiques dont le catabolisme engendre la production de sulfate (comprenant entre autres la cystéine, la cystine et la glutathione). MILIEU COMPRENANT DU FE(III)

Les milieux pour Bordetella ont tendance à inclure du fer sous forme d'ions Fe(II) comme le milieu Stainer-Scholte qui comprend du FeS04 (Stainer et Schölte, Journal of General Microbiology (1971), 63:211-220), toutefois les présents inventeurs ont démontré que des ions Fe(III) peuvent également être utilisés dans un milieu pour Bordetella, et en outre qu'un milieu comprenant des ions Fe(III) (tel que le citrate de Fe(III)) engendre des niveaux de production de facteurs de virulence tels que l'anatoxine pertussique plus élevés qu'un milieu comprend des ions Fe(II) (tel que FeS04) .

Par conséquent, dans un mode de réalisation le milieu chimiquement défini comprend des ions Fe(III). De manière similaire, dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du Fe(II) ou Fe(III) complexé par un composé organique, de préférence le milieu chimiquement défini comprend du Fe(III) complexé par un composé organique. Dans un mode de réalisation, le composé organique est un composé organique choisi dans le groupe constitué par l'hème, l'hémoglobine, la myoglobine, la transferrine, la ferritine, la lactoferrine, 1'entérobactine, 1'aérobactine, 1'alcaligine, une substance coprogène, le ferrichrome, la desferrioxamine, la ferroxamine, 1'hydroxamate, le citrate et la dihydroxy-benzoylsérine. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du Fe(III) complexé par un citrate. Dans un autre mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend plus de 10 μΜ, plus de 20 W1 plus de 30 μΜ, plus de 40 μΜ, plus de 50 μΜ, entre 10 et 500 μΜ, entre 10 et 100 μΜ, entre 25 et 75 μΜ, ou environ 60 μΜ de citrate de Fe(III).

AUTRES COMPOSANTS DU MILIEU

Le milieu selon l'invention peut comprendre d'autres composants que ceux décrits ci-dessus. Par exemple, le milieu chimiquement défini peut comprendre du chlorure. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du chlorure à une concentration inférieure à 45 mM, inférieure à 40 mM, inférieure à 35 mM, inférieure à 30 mM, inférieure à 25 mM, inférieure à 20 mM ou inférieure à 15 mM, entre 0,1 et 500 mM, entre 10 et 20 mM ou d'environ 16 mM. Le milieu chimiquement défini peut comprendre de l'acétate. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend de l'acétate à une concentration supérieure à 1 mM, supérieure à 2 mM, supérieure à 3 mM, supérieure à 4 mM, entre 1 et 100 mM, entre 4 et 6 mM, ou d'environ 5 mM. Le milieu chimiquement défini peut comprendre du potassium. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend du potassium à une concentration supérieure à 1 mM, supérieure à 2 mM, supérieure à 3 mM, supérieure à 4 mM, supérieure à 5 mM, supérieure à 6 mM, entre 1 et 100 mM, entre 5,5 et 7 mM, ou d'environ 6,5 mM. Le milieu chimiquement défini peut comprendre une source de phosphore. Dans un mode de réalisation, la source de phosphore comprend du phosphate à une concentration supérieure à 0,5 mM, à une concentration supérieure à 1 mM, à une concentration supérieure à 1,5 mM, à une concentration supérieure à 2 mM, à une concentration supérieure à 2,5 mM, entre 0,5 et 100 mM, entre 3 et 4 mM, ou d'environ 3,6 mM. Le milieu chimiquement défini peut comprendre une dimdthyl-ß-cyclodextrine. Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini comprend une BE201 diméthyl-p-cyclodextrine à une concentration supérieure à 0,1 mM, supérieure à 0,2 mM, supérieure à 0,3 mM, supérieure à 0,4 mM, supérieure à 0,5 mM, supérieure à 0,6 mM, entre 0,01 et 10 mM, entre 0,7 et 0,8 mM, ou d'environ 0,75 mM.

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini ne comprend pas de sulfate, de cystéine ou de cystine et comprend plus de 0, 008 mM de thiosulfate, plus de 11 mM de MOPS, plus de 6 μΜ de cuivre, plus de 400 μΜ de magnésium, plus de 700 μΜ de zinc, plus de 0,15 μΜ de cobalt, plus de 29 μΜ de thiamine, plus de 0,8 μΜ de riboflavine, plus de 8,0 μΜ de pantothénate, plus de 0,8 μΜ de biotine, plus de 140 μΜ de calcium, plus de 35 μΜ de niacine, plus de 3 000 μΜ d'acide ascorbique, du glutamate à une concentration supérieure à 110 mM, de l'alanine à une concentration supérieure à 3 000 μΜ, de l'aspartate à une concentration supérieure à 3 500 μΜ, de la phénylalanine à une concentration supérieure à 1400 μΜ, de la glycine à une concentration supérieure à 1750 μΜ, de l'histidine à une concentration supérieure à 200 μΜ, de l'isoleucine à une concentration supérieure à 1750 μΜ, de la lysine à une concentration supérieure à 2 000 μΜ, de la leucine à une concentration supérieure à 3 000 μΜ, de la méthionine à une concentration supérieure à 700 μΜ, de la proline à une concentration supérieure à 7 000 μΜ, de la sérine à une concentration supérieure à 1 700 μΜ, de la valine à une concentration supérieure à 3 000 μΜ, de la tyrosine à une concentration supérieure à 175 μΜ, de la glutathione à une concentration supérieure à 700 μΜ, moins de 15 mM de chlorure, plus de 4 mM d'acétate, plus de 6 mM de potassium, plus de 0,6 mM de diméthyl-p-cyclodextrine et plus de 2,5 mM de phosphate ; éventuellement le milieu chimiquement défini comprend en outre du sodium et plus de 50 μΜ de citrate de Fe(III).

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini ne comprend pas de sulfate, de cystéine ou de cystine et BE2 comprend entre 0,005 et 0,100 mM de thiosulfate, entre 2 et 100 mM de MOPS, entre 2 et 200 pM de cuivre, entre 2 et 6 000 pM de magnésium, entre 10 et 150 pM de zinc, entre 0,10 et 0,30 pM de cobalt, entre 25 et 200 pM de thiamine, entre 0,1 et 10 pM de riboflavine, entre 0,5 et 100 pM de pantothénate, entre 0,5 et 100 pM de biotine, entre 50 et 1 000 pM de calcium, entre 1 et 500 pM de niacine, entre 25 et 10 000 pM d'acide ascorbique, de 11aspartate à une concentration entre 1 000 et 10 000 pM, de la glycine à une concentration entre 500 et 5 000 pM, de la méthionine a une concentration entre 100 et 2 000 pM, de la leucine à une concentration entre 500 et 10 000 pM, du glutamate à une concentration entre 50 et 500 mM, de l'alanine à une concentration entre 1 000 et 10 000 pM, de la phénylalanine à une concentration entre 500 et 10 000 pM, de l'histidine à une concentration entre 50 et 1 000 pM, de 1 ' isoleucine à une concentration entre 500 et 5 000 pM, de la lysine à une concentration entre 500 et 10 000 pM, de la proline à une concentration entre 1 000 et 50 000 pM, de la sérine à une concentration entre 500 et 10 000 pM, de la valine à une concentration entre 1 000 et 10 000 pM, de la tyrosine à une concentration entre 25 et 1 000 pM, de la glutathione a une concentration entre 100 et 5 000 pM, entre 0,1 et 500 mM de chlorure, entre 1 et 100 mM d'acétate, entre 1 et 100 mM de potassium, ente 0,01 et 10 mM de diméthyl-p-cyclodextrine et entre 0,5 et 100 mM de phosphate ; éventuellement le milieu chimiquement défini comprend en outre du sodium et entre 10 et 500 pM de citrate de Fe(III).

Dans un mode de réalisation, le milieu chimiquement défini ne comprend pas de sulfate, de cystéine ou de cystine et comprend entre 0,005 et 0,025 mM de thiosulfate, entre 5 et 20 mM de MOPS, entre 4 et 10 pM de cuivre, entre 1 000 et 6 000 pM de magnésium, entre 30 et 80 pM de zinc, entre 0,10 et 0,20 pM de cobalt, entre 25 et 50 pM de thiamine, entre 0,5 BE20 et 1,0 μΜ de riboflavine, entre 5,0 et 10,0 μΜ de pantothénate, entre 5,0 et 10,0 μΜ de biotine, entre 100 et 200 μΜ de calcium, entre 25 et 75 μΜ de niacine, entre 1 000 et 5 000 μΜ d'acide ascorbique, de l'aspartate à une concentration entre 1 000 et 5 000 μΜ, de la glycine à une concentration entre 500 et 2 500 μΜ, de la méthionine à une concentration entre 100 et 1 000 μΜ, de la leucine à une concentration entre 3 000 et 4 000 μΜ, du glutamate à une concentration entre 100 et 150 mM, de l'alanine à une concentration entre 3 000 et 4 000 μΜ, de la phénylalanine à une concentration entre 1 000 et 2 000 μΜ, de l'histidine à une concentration entre 150 et 250 μΜ, de 1 ' isoleucine à une concentration entre 1 000 et 2 000 μΜ, de la lysine à une concentration entre 1 500 et 2 500 μΜ, de la proline à une concentration entre 7 000 et 8 000 μΜ, de la sérine à une concentration entre 1 000 et 2 000 μΜ, de la valine à une concentration entre 3 000 et 4 000 μΜ, de la tyrosine à une concentration entre 100 et 200 μΜ, de la glutathione à une concentration entre 100 et 1 000 μΜ, entre 10 et 20 mM de chlorure, entre 4 et 6 mM d'acétate, entre 5,5 et 7 mM de potassium, ente 0,7 et 0,8 mM de diméthyl-O-cyclodextrine et entre 3 et 4 mM de phosphate ; éventuellement le milieu chimiquement défini comprend en outre du sodium et entre 25 et 75 μΜ de citrate de Fe(III).

PROCEDE DE FERMENTATION

Cette invention concerne en outre un procédé de fermentation pour faire croître une espèce du genre Bordetella dans un milieu chimiquement défini (CDM) comprenant (a) l'inoculation du milieu chimiquement défini selon, l'invention avec l'espèce du genre Bordetella ; (b) le maintien de l'espèce du genre Bordetella dans le milieu chimiquement défini pendant une période de temps suffisante pour permettre l'accumulation d'une biomasse. BE20

Le terme « procédé de fermentation » désigne un procédé à l'échelle industrielle pour faire croître des cellules et/ou exprimer un facteur de virulence à partir de ces cellules. Le terme « échelle industrielle » désigne un procédé dans un fermenteur. Dans un mode de réalisation, le « procédé à l'échelle industrielle » désigne un procédé dans un fermenteur ayant un volume de travail entre 5 et 10 000 litres, entre 10 et 5 000 litres, entre 20 et 2 000 litres, entre 50 et 1 000 litres, supérieur ou égal à 5 litres, supérieur ou égal à 10 litres, supérieur ou égal à 15 litres, supérieur ou égal à 20 litres, supérieur ou égal à 25 litres, supérieur ou égal à 50 litres, supérieur ou égal à 100 litres, inférieur ou égal à 10 000 litres, inférieur ou égal à 5 000 litres ou inférieur ou égal à 2 500 litres. Dans un autre mode de réalisation, le « procédé à l'échelle industrielle » est un procédé se prêtant à la production de plus de 10 mg/L, plus de 15 mg/L ou plus de 20 mg/L d'anatoxine pertussique.

Dans un mode de réalisation, le procédé de fermentation a un temps de génération moyen inférieur à 15h, inférieur à 12h, inférieur à 10h ou inférieur à 9h. Le procédé de détermination du temps de génération moyen est décrit plus haut.

Dans un autre mode de réalisation, le procédé de

fermentation produit plus de 10 mg/L, 15 mg/L ou 20 mg/L d'anatoxine pertussique. Le procédé de détermination des rendements d'anatoxine pertussique est décrit plus haut.

Dans un mode de réalisation, le procédé de fermentation est mis en œuvre à une température supérieure ou égale à 32 °C, supérieure ou égale à 33 °C, supérieure ou égale à 34 °C, inférieure ou égale à 45 °C, inférieure ou égale à 42 °C, inférieure ou égale à 40 °C, inférieure ou égale à 38 °C, entre 32 et 45 °C, entre 33 et 42 °C, entre 33 et 40 °C ou entre 33 et 38 °C.

Dans un mode de réalisation, un agent antimousse est utilisé pendant le procédé de fermentation. Dans un autre mode de réalisation, l'agent antimousse est un polydiméthfy?-siloxane.

Dans un mode de réalisation, le niveau d'oxygène dissous est entre 1 et 160 μΜ, entre 15 et 140 μΜ, entre 30 et 120 μΜ, entre 45 et 110 μΜ, entre 60 et 100 μΜ, ou d'environ 80 μΜ.

Dans un mode de réalisation, le pH du procédé de fermentation est entre pH 6,0 et 7,5, entre pH 6,5 et 7,0 ou d'environ pH 7,2.

EXPRESSION ET PURIFICATION DES FACTEURS DE VIRULENCE

Dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime au moins un facteur de virulence comprenant l'anatoxine pertussique (PT), 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA), la pertactine (PRN), 1'agglutinogène 2 ou 1'agglutinogène 3. Dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime PT, dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime FHA, dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime PRN, dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime PT et FHA, dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime PT et PRN, dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime PRN et FHA, dans un mode de réalisation, l'espèce du genre Bordetella exprime PT, PRN et FHA. PT, FHA et PRN sont bien connus dans l'art.

Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre une étape c) de purification du facteur de virulence pour obtenir un facteur de virulence purifié. Le facteur de virulence purifié peut être une anatoxine pertussique (PT) , une hémagglutinine filamenteuse (FHA), une pertactine (PRN), une agglutinogène 2 ou une agglutinogène 3 purifiée. Le facteur de virulence purifié peut être altéré après la purification, par exemple l'anatoxine pertussique peut être chimiquement détoxifiée après la purification. Voir également EP 427462 et WO 91/12020 pour la préparation d'antigènes pertussiques. Dans un mode de réalisation, l'étape c) implique une purification cellulaire par chromatographie. Dans un mode de réalisation, la technique de chromatographie est la chromatographie d'affinité, la filtration sur gel, la chromatographie haute pression en phase liquide (HPLC) ou la chromatographie échangeuse d'ions. Eventuellement, la chromatographie d'affinité utilise une colonne de purification par affinité avec des étiquettes, une colonne de purification par des anticorps, une colonne d'affinité de lectines, une colonne de purification de prostaglandines ou une colonne de strepavidine. La HPLC utilise éventuellement une colonne d'échange d'ions, une colonne à phase inverse ou une colonne d'exclusion. Eventuellement, la colonne échangeuse d'ions est une colonne échangeuse d'anions ou une colonne échangeuse de cations.

Le procédé peut en outre comprendre une étape d) de formulation d'une composition immunogène comprenant le facteur de virulence purifié.

Le procédé peut en outre comprendre une étape e) d'ajout d'au moins un antigène supplémentaire à la composition immunogène. Dans un mode de réalisation, ledit au moins antigène supplémentaire est choisi dans le groupe constitué par l'anatoxine pertussique, 1'hémagglutinine filamenteuse, la pertactine, un agglutinogène fimbrial, le toxoïde diphtérique, le toxoïde tétanique, au moins un antigène saccharidique conjugué dérivé de N. meningitidis, un antigène de surface d'Hepatitis B, le virus inactivé de la polio (IPV) et un antigène saccharidique conjugué dérivé d'Haemophilus influenzae b. Ledit au moins antigène saccharidique conjugué dérivé de N. meningitidis peut être MenC, MenY, MenA et MenW (par ex. A+C, A+Y, A+W, C+Y, C+W, Y+W, A+C+Y, A+C+W, A+Y+W, C+Y+W, A+C+Y+W) ; éventuellement MenC et/ou MenY sont/est inclus, éventuellement les quatre sont inclus.

En variante ou en plus des antigenes meningococciques ci-dessus, la composition immunogène peut comprendre un ou plusieurs oligosaccharide ou polysaccharide capsulaire pneumococcique conjugué à une protéine porteuse.

Les ol'igosaccharides ou polysaccharides capsulaires pneumococciques (de préférence, ces derniers) typiquement représentés dans les compositions selon l'invention comprennent les antigènes dérivés d'au moins quatre sérotypes de pneumocoque. De préférence, les quatre sérotypes comprennent 6B, 14, 19F et 23F. Plus préférablement, au moins 7 sérotypes sont compris dans la composition, par exemple ceux dérivés des sérotypes 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, et 23F. Mieux encore, au moins 11 sérotypes sont compris dans la composition (11-valente), par exemple ceux dérivés des sérotypes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, au moins 13 de ces antigènes pneumococciques conjugués sont compris, bien que des antigènes supplémentaires, par exemple 23-valents (tels que les sérotypes 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F et 33F), soient également envisagés par l'invention.

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation, le procédé de fermentation comprend une étape f) d'ajout d'un excipient pharmaceutiquement acceptable à la composition immunogène.

Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend un adjuvant tel qu'un phosphate d'aluminium ou un hydroxyde d'aluminium. Dans un mode de réalisation, le procédé de fermentation comprend une étape g) d'ajout d'un adjuvant à la composition immunogène. Des procédés d'adsorption d'antigènes DTPa et DTPw sur des adjuvants de type aluminium sont connus dans la technique. Voir par exemple WO 93/24148 et WO 97/00697. Généralement les composants adsorbés sur un adjuvant y sont laissés pendant au moins 10 minutes à température ambiante à un pH approprié pour adsorber la majorité et de préférence tout l'antigène avant incorporation des antigènes par mélange dans les compositions immunogènes combinées selon la présente invention. D'autres composants sont de préférence non adsorbés (comme IPV) ou adsorbés spécifiquement sur d'autres adjuvants l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) étant de préférence adsorbé sur du sulfate d'aluminium (comme décrit dans.WO 93/24148) avant mélange avec les autres composants.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un facteur de virulence pouvant être obtenu par le procédé. Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne un facteur de virulence obtenu par le procédé.

Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une composition immunogène comprenant le facteur de virulence et un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation, la composition immunogène comprend au moins un antigène supplémentaire. Dans un mode de réalisation, ledit au moins antigène supplémentaire est choisi dans le groupe constitué par l'anatoxine pertussique, 1'hémagglutinine filamenteuse, la pertactine, un agglutinogène fimbrial, le toxoïde diphtérique, le toxoïde tétanique, au moins un antigène saccharidique conjugué dérivé de N. meningitidis, un antigène de surface d'Hepatitis B, le virus inactivé de la polio (IPV) et un antigène saccharidique conjugué dérivé d'Haemophilus influenzae b (éventuellement conjugué au toxoïde tétanique). Ledit au moins antigène saccharidique conjugué dérivé de N. meningitidis peut être MenC, MenY, MenA et MenW (par ex. A+C, A+Y, A+W, C+Y, C+W, Y+W, A+C+Y, A+C+W, A+Y+W, C+Y+W, A+C+Y+W) ; éventuellement MenC et/ou MenY sont/est inclus, éventuellement les quatre sont inclus. Dans un mode de réalisation, le vaccin comprend le toxoïde diphtérique, le toxoïde tétanique, et au moins un facteur de virulence parmi1 PT, FHA et PRN (un vaccin DTPa).

Dans un mode de réalisation, l'invention concerne un vaccin comprenant la composition immunogène.

La préparation des vaccins est décrite de manière générale dans Vaccine Design - The Subunit and adjuvant approach Ed Powell et Newman ; Pellum Press. De manière avantageuse, le vaccin combiné selon l'invention est un vaccin pédiatrique.

La quantité d'antigène polysaccharidique ou oligosaccharidique conjugué dans chaque vaccin est choisie en tant que quantité qui induit une réponse immunoprotectrice sans effets secondaires significatifs chez les vaccinés typiques Cette quantité variera suivant les immunogènes spécifiques utilisés. Généralement chaque dose devrait comprendre de 1 à 1 000 pg de polysaccharide ou oligosaccharide conjugué (exprimé en quantité de saccharide) , de préférence de 2 à 100 pg, plus préférablement de 4 à 40, 2 à 15, ou 3 à 10 pg, de manière préférée entre toutes environ ou exactement 5 pg.

La teneur en antigènes protéiques dans le vaccin sera typiquement dans la plage de 1 à 100 pg, de préférence de 5 à 50 pg, plus typiquement dans la plage de 5 à 25 pg.

Une quantité convenable d'antigène pour un vaccin particulier peut être déterminée par des études standards impliquant l'observation des titres d'anticorps et autres réponses chez les sujets. Après une vaccination initiale, les sujets peuvent recevoir une ou deux injections de rappel à environ 4 semaines d'intervalle ou plus.

Les préparations vaccinales selon la présente invention peuvent être utilisées pour protéger ou traiter un mammifère (de préférence humain) susceptible d'infection, par administration dudit vaccin par voie systémique ou muqueuse. Ces administrations peuvent comprendre l'injection par voies intramusculaire, intrapéritonéale, intradermique ou sous-cutanée .

Selon un autre aspect, l'invention concerne la composition immunogène ou le vaccin tel que décrit précédemment utilisable dans la prévention ou le traitement de la maladie.

Selon un autre aspect, l'invention concerne la composition immunogène ou le vaccin tel que décrit précédemment utilisable dans la prévention ou le traitement de la coqueluche.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une utilisation de la composition immunogène ou du vaccin tel que décrit précédemment utilisable dans la prévention ou le traitement de la maladie.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une utilisation de la composition immunogène ou du vaccin tel que décrit précédemment dans la préparation d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'une maladie bactérienne.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode destinée à prévenir ou traiter une maladie comprenant l'administration de la composition immunogène ou du vaccin tel que décrit précédemment à un patient.

Dans un mode de réalisation, la maladie est la coqueluche.

Le terme « anatoxine pertussique » désigne l'anatoxine pertussique ou en variante une forme toxoïde génétique de l'anatoxine pertussique. Dans un mode de réalisation, l'anatoxine pertussique n'est pas un toxoïde génétique de l'anatoxine pertussique.

Le terme « comprenant », « comprennent/comprendre » et « comprend » peut être remplacé dans tous les cas par les termes « constitué par/consistant en », « constitué par/consister en » et « constitué par/consiste en ». Le terme « comprend » signifie « inclut ». Ainsi, sauf indications contraires, on entendra que le terme « comprend », et ses variantes telles que « comprennent/comprendre », et « comprenant » impliquent l'inclusion du composé ou de la composition indiqué(e) (e.g., acide nucléique, polypeptide, antigène) ou d'une étape, ou d'un groupe de composés ou

DÇZU I d'étapes, mais pas l'exclusion de tout autre composé, composition, étape, ou groupe. Le terme « constitué par/consiste en » signifie « contient » exclusion faite de tout autre composé, composition, étape, ou groupe, etc.

Sauf indications contraires, les termes singuliers « un », « une », et « le », « la » comprennent les référents pluriels. De manière similaire, et sauf indications contraires, le terme « ou » est destiné à inclure « et ». Le terme « pluralité » fait référence à deux ou plus. On comprendra en outre que toutes les tailles des bases ou tailles d'acides aminés, et toutes les valeurs de poids moléculaires ou de masses moléculaires, indiquées pour les acides nucléiques ou les polypeptides sont approximatives, et sont indiquées à des fins descriptives. De plus, les limites numériques indiquées par rapport aux concentrations ou aux niveaux d'une substance, telle qu'un antigène, sont destinées à être approximatives. Ainsi, quand il est indiqué qu'une concentration est d'au moins (par exemple) 200 pg, on comprendra que la concentration est au moins approximativement (ou « environ » ou « ~ ») de 200 pg.

Exemple 1 - Fermentation à l’échelle 20L de Bordetella pertussis dans des milieux chimiquement définis basiques

Un milieu chimiquement défini (CDM), basé sur la composition du milieu de Stainer & Schölte (SS ; Stainer et Schölte, J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971)) a été conçu, contenant des compléments en acides aminés ainsi qu'une diméthyl-p-cyclodextrine. Le Tableau 1 compare la composition du milieu de Stainer & Schölte (SS) original, une version modifiée du milieu SS contenant une dimdthyl-ß-cyclodextrine -stimulant de croissance de B. pertussis (Imaizumi et al., J. Clin. Microbiol. 17:781-786 (1983)) - et d'autres altérations mineures (SS-cyclo), et le milieu chimiquement défini basique (B-CDM).

Les milieux SS-cyclo et B-CDM ont été évalués dans des fermentations COQ467 et COQ365, respectivement. Pour les deux fermentations, une première pré-culture en fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM) a été inoculée avec 109 CFÜ de B. pertussis et incubée à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24 h (+/-lh) . La première préculture a été utilisée pour inoculer une deuxième pré-culture en fiole sous agitation contenant 100 ml de milieu frais (B-CDM) . La deuxième pré-culture a été incubée à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24 h (+/-lh), et utilisée pour inoculer deux fioles sous agitation contenant chacune IL de milieu frais (SS-cyclo pour COQ467 et B-CDM pour COQ365 ; voir composition dans le Tableau 1) . Après croissance à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 40 h (+/-4h) , les deux fioles sous agitation de la troisième pré-culture ont été regroupées. La pré-culture regroupée a été utilisée pour inoculer un fermenteur dès l'arrêt de la troisième pré-culture.

Un fermenteur de 20L (Biolafitte) a été utilisé. 10L de milieu (« SS cyclo » pour COQ467 et « B-CDM » pour COQ365) ont été transférés dans des conditions aseptiques dans le fermenteur. Les conditions suivantes ont été utilisées pour établir le niveau d'oxygène dissous (OD) à 100 % : température (35 °C) et pression de tête (0,4 bar) . L'inoculation a été pratiquée par ajout de 1,5L de pré-culture regroupée.

Pendant la fermentation, la température (35 °C), la pression de tête (0,4 bar), et le débit d'air (20 L min-1) ont été maintenus constants. Le moussage a été contrôlé par ajout automatique d'une émulsion de polydiméthylsiloxane via un contrôleur de mousse. Le niveau d'oxygène dissous a été établi à 25 % et régulé par accélération de l'agitation quand l'OD descendait au-dessous de 25 %. La vitesse d'agitation minimale a été établie à 50 tours/mn et la vitesse d'agitation maximale à 1 000 tours/mn. Le pH a été régulé à 7,2 par ajout d'acide phosphorique à 50 % (p/v) dans COQ467 (SS-cyclo) et par ajout d'acide acétique à 50 % (p/v) dans COQ365 (B-CDM).

Pendant la fermentation, la croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la densité optique à 650 nm (DO650nm) . A la fin de la fermentation (définie par le moment où la consommation d'oxygène décroît - suite à l'épuisement du glutamate, engendrant une réduction de la vitesse d'agitation), la production d'anatoxine pertussique (PT) dans le surnageant de culture a été déterminée par Elisa. Le Tableau 2 compare le rendement biomassique, le rendement PT, et le temps de génération moyen de la fermentation COQ365 (B-CDM) et COQ467 (SS-cyclo). Détermination de la concentration de PT. La concentration de PT dans les surnageants de culture a été déterminée par un dosage par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) . Les puits de plaques de microdilution en polystyrène (4-39454 ; Nunc) ont été revêtus pendant toute une nuit à 4 °C avec 100 μΐ d'antisérum polyclonal anti-PT de cobaye purifié (dilution à 1:16,000 dans un tampon carbonate 50 mM, pH 9,6). La plaque a été lavée trois fois avec du DPBST (solution salée à tampon phosphate de Dubelcco sans Ca ni Mg, contenant 0,1 % (v/v) de

Tween 20). Des dilutions successives de références PT purifiées et de surnageants de culture (dans du DPBST) ont ensuite été ajoutées à chaque puits (100 μΐ par puits) . Après incubation pendant 30 minutes à température ambiante, la plaque a été lavée trois fois avec du DPBST. Un antisérum anti-PT de chèvre (dilution à 1:500 dans du DPBST) et un sérum de cobaye sans anti-PT (dilution à 1:1 000 dans du DPBST) ont ensuite été ajoutés à chaque puits (100 μΐ par puits) . Après incubation pendant 30 minutes à température ambiante, la plaque a été lavée trois fois avec du DPBST. Une immunoglobuline G anti-chèvre de lapin conjuguée à une phosphatase alcaline (Zymed ; dilution à 1:1 000 dans du DPBST) a ensuite été ajoutée à chaque puits (100 μΐ par puits). Après incubation pendant 30 minutes à température ambiante, la plaque a été lavée trois fois avec du DPBST. La plaque a été révélée par ajout d'une solution à 10 g/L de p-nitrophényl-phosphate (Calbiochem) dans un tampon diéthanolamine (diéthanolamine 9,7 % (v/v), azoture de sodium 0,2 g/L, MgCl2.6H20 0,214 g/L, pH 9,8) à chaque puits (100 μΐ par puits). La révélation couleur a été effectuée à température ambiante, et arrêtée par ajout de 50 μΐ de NaOH 3M à chaque puits. L'absorbance des puits a été lue à 405 nm dans l'heure qui a suivil'ajout du NaOH, à l'aide d'un lecteur de microplaque Versamax (Molecular Devices).

Les conditions B-CDM ont engendré des rendements et des vitesses de croissance plus élevées que le SS-cyclo. La production de PT avait également significativement augmenté. (Voir Tableau 2)

SS = milieu de Stainer & Schölte B-CDM = milieu chimiquement défini basique

Tris = tris(hydroxyméthyl)aminométhane * Concentration de biomasse initiale calculée basée sur la DO650nm

mesurée de la pré-culture, i.e. 1,5*DOpré-cuiture/ll, 5. ** Le rendement a été calculé comme la différence entre DOgsonm à la fin de la fermentation et DOesonm au début de la fermentation. *** Le temps de fermentation total est défini comme le moment où la consommation d'oxygène décroît (suite à l'épuisement du glutamate), engendrant une réduction de la vitesse d'agitation **** Temps de génération moyen calculé comme suit. D'abord, le nombre de générations est calculé sous forme de rapport entre DOesonm à la fin de la fermentation et DOgsonm au début de la fermentation, converti en log2. Le temps de génération moyen est ensuite calculé en divisant le temps de fermentation total par le nombre de générations.

Exemple 2 - Effet de la source de fer sur la fermentation à l'échelle 20L de Bordetelle pertussis dans un milieu chimiquement défini

Le citrate ferrique a été évalué à titre d'alternative au sulfate ferreux dans la fermentation COQ348.

Une première pré-culture en fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM ; voir composition dans le

Tableau 1) a été inoculée avec 109 CFU de B. pertussis et incubée à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24 h ( + /-lh) . La première pré-culture a été utilisée pour inoculer une deuxième pré-culture en fiole sous agitation contenant 100 ml de milieu frais (B-CDM). La deuxième pré-culture a été incubée à 35 °C ( + / —1 °C) et 150 tours/mn pendant 24 h ( + /-lh) , et utilisée pour inoculer deux fioles sous agitation contenant chacune IL de milieu frais (B-CDM modifié pour contenir 10 mg/L de citrate de Fe(III) trihydraté, sans FeSCh) . Après croissance à 35 °C (+/-1 °C) et 150 tours/mn pendant 40 h (+/-4h), les deux fioles sous agitation de la troisième préculture ont été regroupées. La pré-culture regroupée a été utilisée pour inoculer un fermenteur dès l'arrêt de la troisième pré-culture.

Un fermenteur de 20L (Biolafitte) a été utilisé. 10L de milieu (B-CDM modifié pour contenir 10 mg/L de citrate de Fe(III) trihydraté, sans FeSCu) ont été transférés dans des conditions aseptiques dans le fermenteur. Les conditions suivantes ont été utilisées pour établir le niveau d'oxygène dissous (OD) à 100 % : température (35 °C) et pression de tête (0,4 bar). L'inoculation a été pratiquée par ajout de 1,5L de la pré-culture regroupée.

Pendant la fermentation, la température (35 °C) , la pression de tête (0,4 bar), et le débit d'air (20 L min-1) ont été maintenus constants. Le moussage a été contrôlé par ajout automatique d'une émulsion de polydiméthylsiloxane via un contrôleur de mousse. Le niveau d'oxygène dissous a été établi à 25 % et régulé par accélération de l'agitation quand 1 ' OD descendait au-dessous de 25 %. La vitesse d'agitation minimale a été établie à 50 tours/mn et la vitesse d'agitation maximale à 1 000 tours/mn. Le pH a été régulé à 7,2 par ajout d'acide phosphorique à 50 % (p/v).

Pendant la fermentation, la croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la densité optique à 650 nm (DOesonm) . A la fin de la fermentation (définie par le moment où consommation d'oxygène décroît - suite à l'épuisement du glutamate, engendrant une réduction de la vitesse d'agitation), la production d'anatoxine pertussique (PT) dans le surnageant de culture a été déterminée par Elisa.

Le Tableau 3 compare le rendement biomassique, le rendement PT, et le temps de génération moyen de la fermentation COQ352 (B-CDM modifié pour contenir 10 mg/L de citrate de Fe(III) trihydraté, sans FeSCL) et la fermentation COQ365 (B-CDM contenant du FeSCu ; voir Exemple 1).

Le rendement et la vitesse de croissance étaient similaires entre les deux conditions, en termes de concentration maximale de biomasse, indiquant que le sulfate inorganique peut être omis de la composition du milieu, et que le fer peut être fourni sous forme de Fe(II) ou Fe(III) sans affecter la croissance de B. pertussis. La production de PT a également significativement augmenté quand le citrate ferrique a été utilisé comme source de fer, à la place du sulfate ferreux.

* Concentration de biomasse initiale calculée basée sur la D06sonm mesurée de la pré-culture, i.e. 1,5*D0pré-cuiture/H , 5 . ** Le rendement a été calculé comme la différence entre DO650nm à la fin de la fermentation et DO650nm au début de la fermentation. *** Le temps de fermentation total est défini comme le moment où la consommation d'oxygène décroît (suite à l'épuisement du glutamate), engendrant une réduction de la vitesse d'agitation **** Temps de génération moyen calculé comme suit. D'abord, le nombre de générations est calculé sous forme de rapport entre DC>650nm à la fin de la fermentation et DO650nm au début de la fermentation, converti en log2. Le temps de génération moyen est ensuite calculé en divisant le temps de fermentation total par le nombre de générations. BE2(

Exemple 3 - Thiosulfate comme source de soufre pour la croissance de Bordetella pertussis

Sur la base de la littérature, la croissance de B. pertussis n'est possible qu'en présence d'une source organique de soufre, qui peut être fournie sous forme de cystine, cystéine, et/ou glutathione (Jebb et Tomlinson (1957) J. Gen. Microbiol. 17:59).

Des dosages ont été réalisés pour déterminer si des sources inorganiques de soufre étaient capables de supporter la croissance de B. pertussis. Une fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM modifié pour contenir 0,604 g/L de niacine) a été inoculée avec 109 CFU de B. pertussis et incubée à 35 °C (+/-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h ( + /-5h) . Les cellules ont été récoltées par centrifugation, lavées deux fois avec NaCl 0,9% (p/v) , et remises en suspension dans du milieu frais ne contenant pas de source S (voir composition dans le Tableau 4) à une DO650nm théorique de 0,5, calculée à partir de la DC>65onm de la culture avant récolte. 20 μΐ de cette suspension cellulaire ont été utilisés pour inoculer chaque puits d'une plaque de microtitrage 96 puits remplis de 180 μΐ de milieu frais ne contenant pas de source S (voir composition dans le Tableau 4) . A chacun des puits, 20 μΐ d'une solution de complément, contenant un des composés indiqués dans le Tableau 5, ont été ajoutés. Seuls les puits intérieurs de la plaque ont été utilisés pour les cultures, afin de réduire l'évaporation au minimum, et un témoin a été inclus, dans lequel la solution de complément était remplacée par de l'eau. La plaque a ensuite été incubée pendant 53 heures à 35 °C dans un lecteur Biotek Synergy Hl sous agitation constante, et la croissance a été surveillée automatiquement toutes les 10 minutes par l'intermédiaire de la DOösonm. Les résultats du dosage de croissance sont indiqués dans le Tableau 5.

Le sulfate inorganique et le sulfite n'ont pas é^;^C capables de supporter la croissance de B. pertussis. Toutefois, une croissance a été observée en présence du thiosulfate comme seule source de soufre dans le milieu. Ces résultats démontrent i) que le sulfate peut être omis du milieu, et ii) qu'une source organique de soufre telle que la cystine, la cystéine, ou la glutathione n'a pas nécessairement besoin d'être présente, du moment qu'un composé qui supporte la croissance comme le thiosulfate est présent.

*calculé comme la différence entre la DO650nm après 53h et la DOgsonm initiale ** + , rendement biomassique supérieur ou égal au témoin négatif ; -, rendement biomassique inférieur ou égal au témoin négatif

Exemple 4 - Criblage pour identifier des tampons alternatifs utilisables dans le milieu chimiquement défini

Un criblage a été réalisé pour identifier des alternatives au tampon Tris dans le milieu B-CDM. Une première pré-culture en fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM) a été inoculée avec 109 CFU de B. pertussis et incubée à 35 °C ( + / —1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h ( + /-lh) . La première pré-culture a été utilisée pour inoculer une seconde pré-culture en fiole sous agitation contenant 100 ml de milieu frais (B-CDM) . La seconde pré-culture a été incubée à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h ( + /-lh) . Les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation, lavées dans du NaCl 0,9 % et remises en suspension dans du NaCl 0.9%. Cette suspension cellulaire a été utilisé pour inoculer un ensemble de 9 fioles sous agitation, contenant chacune 50 ml de milieu frais (B-CDM) ou un milieu dans lequel le tampon Tris dans le CDM a été remplacé par un autre milieu parmi ceux indiqués dans le Tableau 6. Les fioles ont été incubées à 35 °C et 150 tours/mn pendant 48h. La croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la DOssonm après 24h et 48h. Les résultats sont présentés dans le Tableau 6.

Les tampons β-glycérophosphate et MOPS ont tous deux été capables de supporter la croissance de B. pertussis dans le B-CDM. Dans l'ensemble, MOPS s'est avéré supérieur au ß-glycérophosphate en termes de vitesse de croissance (rendement biomassique après 24h) et rendement (rendement biomassique après 48h) . Avec les deux tampons, des concentrations plus basses ont engendré une croissance plus rapide et un rendement biomassique final plus élevé. A la plus basse concentration testée (2,5 g/L), MOPS a démontré un effet bénéfique sur la vitesse de croissance (rendement biomassique après 24h) , comparé aux conditions témoins utilisant Tris comme tampon.

*Le rendement biomassique est exprimé par rapport aux conditions témoins (tampon Tris) au même temps d'incubation

Exemple 5 - Impact de l'ajout de Cu2+ sur la. fermentation à l'échelle 20L de Bordetella pertussis dans un milieu chimiquement défini L'effet d'un complément en Cu2+ a été évalué dans la fermentation COQ348.

Une première pré-culture en fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM ; voir composition dans le Tableau 1) a été inoculée avec 109 CFU de B. pertussis et incubée à 35 °C (+/-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h (+/-lh). La première pré-culture a été utilisée pour inoculer une deuxième pré-culture en fiole sous agitation contenant 100 ml de milieu frais (B-CDM). La deuxième pré-culture a été incubée à 35 °C (+/—1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h (+/-lh) et utilisée pour inoculer deux fioles sous agitation contenant chacune 1 L de milieu frais (B-CMD complété par 1,28 mg/L (7,5 μΜ) de CUCI2.2H2O). Après croissance à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 40 h (+/-4h), les deux fioles sous agitation de la troisième pré-culture ont été regroupées. La pré-culture regroupée a été utilisée pour inoculer un fermenteur dès l'arrêt de la troisième pré-culture. Un fermenteur de 20L (Biolafitte) a été utilisé. 10L de milieu (B-CMD complété par 1,28 mg/L (7,5 μΜ) de CUCI2.2H2O) ont été transférés dans des conditions aseptiques dans le fermenteur. Les conditions suivantes ont été utilisées pour établir le niveau d'oxygène dissous (OD) à 100 % : température (35 °C) et pression de tête (0,4 bar). L'inoculation a été pratiquée par ajout de 1,5L de la pré-culture regroupée. Pendant la fermentation, la température (35 °C), la pression de tête (0,4 bar), et le débit d'air (20 L min-1) ont été maintenus constants. Le moussage a été contrôlé par ajout automatique d'une émulsion de polydiméthylsiloxane via un contrôleur de mousse. Le niveau d'oxygène dissous a été établi à 25 % et régulé par accélération de l'agitation quand 1 ' OD descendait au-dessous de 25 %. La vitesse d'agitation minimale a été établie à 50 tours/mn et la vitesse d'agitation maximale à 1 000 tours/mn. Le pH a été régulé à 7,2 par ajout d'acide acétique à 50 % (p/v).

Pendant la fermentation, la croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la densité optique à 650 nm (DO650nm) · A la fin de la fermentation (définie par le moment où la consommation d'oxygène décroît - suite à l'épuisement du glutamate, engendrant une réduction de la vitesse d'agitation), la production d'anatoxine pertussique (PT) dans le surnageant de culture a été déterminée par Elisa. Le Tableau 7 compare le rendement biomassique, le rendement PT, et le temps de génération moyen de la fermentation COQ348 (B-CDM avec complément en Cu) et la fermentation COQ365 (B-CDM sans complément en Cu ; voir Exemple 1). L'ajout du CuCl2 au milieu chimiquement défini a engendré une augmentation significative du rendement biomassique. La vitesse de croissance et le rendement PT ont également été positivement affectés.

* Concentration de biomasse initiale calculée basée sur la DOesonm mesurée de la pré-culture, i.e. 1,5*D0pré-cuiture/ll, 5 . ** Le rendement a été calculé comme la différence entre DC>650nm à la fin de la fermentation et DOesonm au début de la fermentation. *** Le temps de fermentation total est défini comme le moment où la consommation d'oxygène décroît (suite à l'épuisement du glutamate), engendrant une réduction de la vitesse d'agitation **** TertlpS de génération moyen calculé comme suit. D'abord, le nombre de générations est calculé sous forme de rapport entre DOesonm à la fin de la fermentation et D06sonm au début de la fermentation, converti en logo- Le temps de génération moyen est ensuite calculé en divisant le temps de fermentation total par le nombre de générations.

Exemple 6 - Fermentation à 1'échelle 20L de Bordetella. pertussis dans un milieu chimiquement défini amélioré

Une formulation améliorée du CDM basique (B-CDM) a été évaluée dans la fermentation COQ426.

Une première pré-culture en fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM ; voir composition dans le Tableau 1) a été inoculée avec 109 CFU de B. pertussis et incubée à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h (+/-lh) . La première pré-culture a été utilisée pour inoculer une deuxième pré-culture en fiole sous agitation contenant 100 ml de milieu frais (B-CDM). La deuxième pré-culture a été incubée à 35 °C ( + / —1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h ( + /-lh) et utilisée pour inoculer deux fioles sous agitation contenant chacune 1 L de milieu frais (CMD amélioré ; voir composition dans le Tableau 8) . Après croissance à 35 °C ( + /-1 °C) et 150 tours/mn pendant 40 h ( + /-4h) , les deux fioles sous agitation de la troisième pré-culture ont été regroupées. La pré-culture regroupée a été utilisée pour inoculer un fermenteur dès l'arrêt de la troisième pré-culture. Un fermenteur de 20L (Biolafitte) a été utilisé. 10L de milieu ont été transférés dans des conditions aseptiques dans le fermenteur. Les conditions suivantes ont été utilisées pour établir le niveau d'oxygène dissous (OD) à 100 % : température (35 °C) et pression de tête (0,4 bar) . L'inoculation a été pratiquée par ajout de 1,5L de pré-culture regroupée. Pendant la fermentation, la température (35 °C) , la pression de tête (0,4 bar), et le débit d'air (20 L min-1) ont été maintenus constants. Le moussage a été contrôlé par ajout automatique d'une émulsion de polydiméthylsiloxane via un contrôleur de mousse. Le niveau d'oxygène dissous a été établi à 25 % et régulé par accélération de l'agitation quand 1 ' OD descendait au-dessous de 25 %. La vitesse d'agitation minimale a été établie à 50 tours/mn et la vitesse d'agitation maximale à 1 000 tours/mn. Le pH a été régulé à 7,2 par ajout d'acide phosphorique à 50 % (p/v).

Pendant la fermentation, la croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la densité optique à 650 nm (DO650nm) . A la fin de la fermentation (définie par le moment où la consommation d'oxygéné décroît - suite a 1'épuisement du glutamate, engendrant une réduction de la vitesse d'agitation), la production d'anatoxine pertussique (PT) dans le surnageant de culture a été déterminée par Elisa.

Le Tableau 9 compare le rendement biomassique, le rendement PT, et le temps de génération moyen de la fermentation COQ426 (CDM amélioré) et la fermentation COQ365 (B-CDM ; voir Exemple 1).

Les conditions CDM améliorées ont engendré un rendement de croissance légèrement inférieur comparé au CDM basique. La vitesse de croissance était elle aussi légèrement plus basse. Toutefois, la production de PT était considérablement augmentée (+170 %).

* Concentration de biomasse initiale calculée basée sur la DOesonm mesurée de la pré-culture, i.e. 1,5*D0pré-cuiture/H, 5.

** Le rendement a été calculé comme la différence entre DOesonm à la fin de la fermentation et DOesonm au début de la fermentation. *** Le temps de fermentation total est défini comme le moment où la consommation d'oxygène décroît (suite à l'épuisement du glutamate), engendrant une réduction de la vitesse d'agitation **** Temps de génération moyen calculé comme suit. D'abord, le nombre de générations est calculé sous forme de rapport entre DOêsonm à la fin de la fermentation et DOesonm au début de la fermentation, converti en log2. Le temps de génération moyen est ensuite calculé en divisant le temps de fermentation total par le nombre de générations.

Exemple 7 - Fermentation à l'échelle 20L de Bordetella pertussis dans un milieu chimiquement défini amélioré contenant du thiosulfate comme source de soufre

Une formulation modifiée du CDM amélioré (Exemple 6) a été évaluée dans la fermentation COQ454. Dans ce milieu, la cystéine a été remplacée par du thiosulfate à titre de source de soufre.

Une première pré-culture en fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM ; voir composition dans le

Tableau 1) a été inoculée avec 109 CFü de B. pertussis et incubée à 35 °C (+/-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h (+/-lh). La première pré-culture a été utilisée pour inoculer une deuxième pré-culture en fiole sous agitation contenant 100 ml de milieu frais (B-CDM). La deuxième pré-culture a été incubée à 35 °C (+/—1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h (+/-lh) et utilisée pour inoculer deux fioles sous agitation contenant chacune 1 L de milieu frais (CMD amélioré avec le thiosulfate ; voir composition dans le Tableau 10). Après croissance à 35 °C (+/-1 °C) et 150 tours/mn pendant 40 h (+/-4h), les deux fioles sous agitation de la troisième préculture ont été regroupées. La pré-culture regroupée a été utilisée pour inoculer un fermenteur dès l'arrêt de la troisième pré-culture. Un fermenteur de 20L (Biolafitte) a été utilisé. 10L de milieu ont été transférés dans des conditions aseptiques dans le fermenteur. Les conditions suivantes ont été utilisées pour établir le niveau d'oxygène dissous (OD) à 100 % : température (35 °C) et pression de tête (0,4 bar). L'inoculation a été pratiquée par ajout de 1,5L de la préculture regroupée.

Pendant la fermentation, la température (35 °C), la pression de tête (0,4 bar), et le débit -d'air (20 L min-1) ont été maintenus constants. Le moussage a été contrôlé par ajout automatique d'une émulsion de polydiméthylsiloxane via un contrôleur de mousse. Le niveau d'oxygène dissous a été établi à 25 % et régulé par accélération de l'agitation quand 1 'OD descendait au-dessous de 25 %. La vitesse d'agitation minimale a été établie à 50 tours/mn et la vitesse d'agitation maximale à 1 000 tours/mn. Le pH a été régulé à 7,2 par ajout d'acide phosphorique à 50 % (p/v).

Pendant la fermentation, la croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la densité optique à 650 nm (DOôsonm) . A la fin de la fermentation (définie par le moment où la consommation d'oxygène décroît - suite à l'épuisement du glutamate, engendrant une réduction de la vitesse d'agitation), la production d'anatoxine pertussique (PT) dans le surnageant de culture a été déterminée par Elisa. Le Tableau 11 compare le rendement biomassique, le rendement PT, et le temps de génération moyen de la fermentation COQ454 (CDM amélioré avec le thiosulfate), la fermentation COQ426 (CDM amélioré ; voir Exemple 6), et la fermentation COQ365 (B-CDM ; voir Exemple 1).

Le rendement biomassique dans le « CDM amélioré avec le thiosulfate » était légèrement inférieur comparé au CDM basique, mais a engendré une vitesse de croissance plus élevée et une production de PT plus élevée (+310 %). Comparé au « CDM amélioré », le milieu « CDM amélioré avec le thiosulfate » a engendré un rendement biomassique similaire, une vitesse de croissance plus élevée, et une production de PT plus élevée ( + 52 %) .

* Concentration de biomasse initiale calculée basée sur la DOgsonm mesurée de la pré-culture, i.e. 1,5*DOPré-cuiture/H# 5. ** Le rendement a été calculé comme la différence entre DO650nm à la fin de la fermentation et DOgsonm au début de la fermentation. *** Le temps de fermentation total est défini comme le moment où la consommation d'oxygène décroît (suite à l'épuisement du glutamate), engendrant une réduction de la vitesse d'agitation **** Temps de génération moyen calculé comme suit. D'abord, le nombre de générations est calculé sous forme de rapport entre DOesonm à la fin de la fermentation et DOgsonm au début de la fermentation, converti en log2- Le temps de génération moyen est ensuite calculé en divisant le temps de fermentation total par le nombre de générations.

Exemple 8 - Croissance de B. pertussis dans un milieu minimal contenant un seul acide aminé

Des dosages ont été réalisés afin de déterminer si la croissance de B. pertussis est possible dans un milieu minimal contenant un seul acide aminé à titre de seule source de carbone et d'azote. Une fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM contenant 0,604 g/L de niacine) a été inoculée avec 109 CFU de B. pertussis et incubée à 35 °C (+/-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h (+/-lh). Les cellules ont été récoltées par centrifugation, lavées deux fois avec NaCl 0,9 % (p/v) , et remises en suspension dans du milieu frais (voir composition dans le Tableau 12) à une DOôsonm théorique de 0,5, calculée à partir de la DOôsonm de la culture avant récolte. 1 ml de cette suspension cellulaire a été utilisé pour inoculer des fioles sous agitation contenant 30 ml du milieu décrit dans le Tableau 12, complété par un seul acide aminé (L-cystéine 125 mM, L-proline 125 mM, L-glutamate 125 mM, L-glutamine 125 mM, L-aspartate 30 mM, L-asparagine 125 mM, L-sérine 125 mM, ou L-alanine 125 mM) comme source de C et de N, et du thiosulfate 0,25 mM comme source de S (exception faite pour le milieu complété en L-Cys, où aucun thiosulfate n'a été ajouté). Le même milieu avec du chlorure d'ammonium (25 mM) et du thiosulfate (0,25 mM) , mais sans acide aminé, a été utilisé à titre de témoin négatif. Les fioles sous agitation ont ensuite été incubées pendant environ 10 jours à 35 °C sous agitation constante (150 tours/mn). La croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la DOssonm. Les résultats du dosage de croissance sont illustrés sur la Figure 1.

Tous les acides aminés testés ont été capables de supporter la croissance de B. pertussis à titre de seule source de C et de N, à condition qu'une source de S (thiosulfate) soit présente. Quand L-Cys a été utilisé à titre d'acide aminé, aucune source supplémentaire de soufre n'a été requise.

Exemple 9 - Croissance de B. pertussis dans un milieu minimal ne contenant pas d’acide aminé

Des dosages ont été réalisés afin de déterminer si la croissance de B. pertussis est possible dans un milieu minimal dans lequel l'azote était fourni uniquement sous forme d'ammoniac inorganique, le soufre sous forme de thiosulfate, et le carbone sous forme d'acide organique. Une fiole sous agitation contenant 7,5 ml de milieu frais (B-CDM contenant 0, 604 g/L de niacine) a été inoculée avec 109 CFÜ de B. pertussis et incubée à 35 °C (+/-1 °C) et 150 tours/mn pendant 24h (+/-5h). Les cellules ont été récoltées par centrifugation, lavées deux fois avec NaCl 0, 9 % (p/v) , et remises en suspension dans du milieu frais (voir composition dans le Tableau 13) à une DOësonm théorique de 0,5, calculée à partir de la DC>650nm de la culture avant récolte. 1 ml de cette suspension cellulaire a été utilisé pour inoculer des fioles sous agitation contenant 30 ml du milieu décrit dans le Tableau 13, complété par un seul acide organique (citrate 100 mM, L-lactate 100 mM, acétate 100 mM, pyruvate 100 mM, fumarate 100 mM, ou succinate 100 mM) . Le même milieu sans complément en acide organique a été utilisé à titre de témoin négatif. Les fioles sous agitation ont ensuite été incubées pendant environ 10 jours à 35 °C sous agitation constante (150 tours/mn). La croissance a été surveillée par l'intermédiaire de la DO650nm. Les résultats du dosage de croissance sont illustrés sur la Figure 2.

Tous les acides organiques testés ont été capables de supporter la croissance de B. pertussis à titre de seule source de C.

Claims (18)

1. REVENDICATIONS

   1. Milieu chimiquement défini pour la culture à l'échelle industrielle d'une espèce du genre Bordetella comprenant : (i) un composant de fer choisi dans le groupe constitué par le Fe(II) complexé par un composé organique et le Fe(III) complexé par un composé organique, où le composé organique est choisi parmi l'hème, l'hémoglobine, la myoglobine, la transferrine, la ferritine, la lactoferrine, 1'entérobactine, 1'aérobactine, 1'alcaligine, une substance coprogène, le ferrichrome, la desferrioxamine, la ferroxamine, 1'hydroxamate, le citrate et la dihydroxybenzoylsérine ; (ii) un acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) ; (iii) une dimdthyl-ß-cyclodextrine ; et (ii) un acide amine choisi dans le groupe constitué par l'aspartate à une concentration de 1 000 μΜ ou plus, la glycine à une concentration de 1 000 μΜ ou plus, la méthionine à une concentration de 500 μΜ ou plus et la leucine à une concentration de 1 500 μΜ ou plus, dans lequel ledit milieu chimiquement défini ne comprend pas de FeS04 ou de tris(hydroxyméthyl)aminométhane.
2. 2. Milieu chimiquement défini selon la revendication 1, comprenant en outre (vi) 2 μΜ ou plus, 3 μΜ ou plus, 4 μΜ ou plus, 5 μΜ ou plus, ou 6 μΜ ou plus de cuivre ; (vii) 2 μΜ ou plus, 5 μΜ ou plus, 10 μΜ ou plus, 50 μΜ ou plus, 100 μΜ ou plus, ou 400 μΜ ou plus de magnésium ; (x) un additif choisi dans le groupe constitué par le zinc, le cobalt, la thiamine, la riboflavine et le pantothénate ; (xi) un additif choisi dans le groupe constitué par 0,4 μΜ ou plus de biotine, 50 μΜ ou plus de calcium, 15 μΜ ou plus de niacine, et 25 μΜ ou plus d'acide ascorbique.
3. 3. Milieu chimiquement défini selon la revendication 1 ou 2, comprenant une source inorganique de soufre choisie dans le groupe constitué par le thiosulfate, le trithionate, le tétrathionate, le peroxodisulfate, le sulfure et le sulfite, et dans lequel ledit milieu ne comprend pas de source organique de soufre.
4. 4. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 0,005 mM, plus de 0,006 mM, plus de 0,007 mM, plus de 0,008 mM, plus de 0,010 mM, plus de 0,050 mM, plus de 0,100 mM, environ 0,120 mM ou environ 0,011 mM de thiosulfate.
5. 5. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 0,003 mM, plus de 0,004 mM, plus de 0,005 mM, plus de 0,008 mM, plus de 0,010 mM, plus de 0,020 mM, plus de 0,050 mM, environ 0,007 mM ou environ 0,080 mM de trithionate.
6. 6. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 0,002 mM, plus de 0,003 mM, plus de 0,004 mM, plus de 0,005 mM, plus de 0,025 mM, plus de 0,050 mM, environ 0,060 mM ou environ 0,0006 mM de tétrathionate.
7. 7. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 0,005 mM, plus de 0,006 mM, plus de 0,007 mM, plus de 0,008' mM, plus de 0,010 mM, plus de 0,050 mM, plus de 0,100mM, environ 0,120 mM ou environ 0,011 mM de peroxodisulfate.
8. 8. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 0,010 mM, plus de 0,012 mM, plus de 0,014 mM, plus de 0,016 mM, plus de 0,020 mM, plus de 0,100 mM, plus de 0,200 mM, environ 0,240 mM ou environ 0,022 mM de sulfure.
9. 9. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant plus de 0,010 mM, plus de 0,012 mM, plus de 0,014 mM, plus de 0,016 mM, plus de 0,020 mM, plus de 0,100 mM, plus de 0,200 mM, environ 0,240 mM ou environ 0,022 mM de sulfite.
10. 10. Milieu chimiquement défini selon la revendication 1 comprenant un tampon MOPS. à une concentration supérieure à 2 mM, supérieure à 5 mM, supérieure à 7 mM, supérieure à 9 mM, supérieure à 10 mM ou supérieure à 11 mM.
11. 11. Milieu chimiquement défini selon la revendication 2 comprenant du cuivre sous la forme de chlorure de cuivre.
12. 12. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant une source inorganique d'azote choisie parmi un sel d'ammonium et un chlorure d'ammonium.
13. 13. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant une source de carbone choisie dans le groupe constitué par le glutamate, la proline, le citrate, le lactate, l'acétate, le pyruvate, le fumarate et le succinate.
14. 14. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre un composant choisi dans le groupe constitué par : (i) plus de 0,1 μΜ, plus de 1 μΜ, plus de 50 μΜ, plus de 100 μΜ, plus de 200 μΜ, plus de 300 μΜ, plus de 400 μΜ, plus de 500 μΜ, plus de 600 μΜ ou plus de 700 μΜ de zinc ; (ii) plus de 0,05 μΜ, plus de 0,10 μΜ, ou plus de 0,15 μΜ de cobalt ; (iii) plus de 100 μΜ, plus de 120 μΜ ou plus de 140 μΜ de calcium ; (iv) plus de 20 μΜ, plus de 30 μΜ ou plus de 35 μΜ de niacine ; (v) plus de 50 μΜ, plus de 75 μΜ, plus de 100 μΜ, plus de 1 000 μΜ, plus de 2 000 μΜ ou plus de 3 000 μΜ d'acide ascorbique ; (vi) plus de 0,1 μΜ, plus de 1 μΜ, plus de 5 μΜ, plus de 10 μΜ ou plus de 25 μΜ de thiamine ; (vii) plus de 0,4 μΜ, plus de 0,5 μΜ, plus de 0,6 μΜ ou plus de 0,8 μΜ de biotine ; (viii) plus de 0,1 μΜ, plus de 0,2 μΜ, plus de 0,3 μΜ, plus de 0,4 μΜ, plus de 0,5 μΜ, plus de 0,6 μΜ ou plus de 0,8 μΜ de riboflavine ; et (ix) plus de 0,1 μΜ, plus de 0,5 μΜ, plus de 1,0 μΜ, plus de 2,0 μΜ, plus de 5,0 μΜ, ou plus de 7,0 μΜ de pantothénate.
15. 15. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant un acide aminé choisi dans le groupe constitué par : (i) le glutamate à une concentration supérieure a 50 mM, supérieure à 75 mM, supérieure à 90 mM, supérieure à 100 mM ou supérieure à 110 mM ; (ii) l'alanine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ, supérieure à 2 000 μΜ, supérieure à 2 500 μΜ ou supérieure à 3 000 μΜ ; (iii) la phénylalanine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 750 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 250 μΜ ou supérieure à 1 400 μΜ ; (iv) l'histidine à une concentration supérieure à 50 μΜ, supérieure à 100 μΜ, supérieure à 150 μΜ ou supérieure à 200 μΜ ; (v) l'isoleucine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ ou supérieure à 1 750 μΜ ; (vi) la lysine à une concentration supérieure à 500 μΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ ou supérieure à 2 000 μΜ ; (vii) la proline à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 3 000 μΜ, supérieure à 4 000 μΜ, supérieure à 5 000 μΜ, supérieure à 6 000 μΜ ou supérieure à 7 000 μΜ ; (viii) la sérine à une concentration supérieure à 500 μπιΜ, supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 1 500 μΜ ou supérieure à 1 700 μΜ ; (ix) la valine à une concentration supérieure à 1 000 μΜ, supérieure à 2 000 μΜ, supérieure à 2 500 μΜ ou supérieure à 3 000 μΜ ; et (x) la tyrosine à une concentration supérieure à 25 μΜ, supérieure à 50 μΜ, supérieure à 75 μΜ, supérieure à 100 μΜ, supérieure à 150 μΜ ou supérieure à 175 μΜ.
16. 16. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre une glutathione à une concentration supérieure à 100 μΜ, supérieure à 200 μΜ, supérieure à 400 μΜ, supérieure à 500 μΜ, supérieure à 600 μΜ ou supérieure à 700 pmM.
17. 17. Milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre un composant choisi dans le groupe constitué par : (i) le chlorure à une concentration inférieure à 45 mM, inférieure à 40 mM, inférieure à 35 mM, inférieure à 30 mM, inférieure à 25 mM, inférieure à 20 mM, entre 10 et 20 mM ou d'environ 16 mM ; (ii) l'acétate à une concentration supérieure à 1 mM, supérieure à 2 mM, supérieure à 3 mM, supérieure à 4 mM, entre 4 et 6 mM ou d'environ 5 mM ; et (iii) le potassium à une concentration supérieure à 1 mM, supérieure à 2 mM, supérieure à 3 mM, supérieure à 4 mM, supérieure à 5 mM, supérieure à 6 mM, entre 5,5 et 7 mM ou d'environ 6,5 mM.
18. 18. Procédé de fermentation pour faire croître une espèce du genre Bordetella dans un milieu chimiquement défini (CDM) .comprenant (a) l'inoculation d'un milieu chimiquement défini selon l'une quelconque des revendications précédentes avec une espèce du genre Bordetella ; et (b) le maintien de l'espèce du genre Bordetella dans le milieu chimiquement défini pendant une période de temps suffisante pour permettre l'accumulation d'une biomasse.