JP7394065B2 - ボルデテラ属種を培養する方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／６４５，４７３号（２０１８年３月２０日出願）（その開示全体が参照により本明細書に加入される）の利益を主張し、その出願日に依る。

技術分野
本出願は、概して、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のようなボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ）を培養するための方法に関する。

背景
百日咳は、重篤な咳き込みを特徴とする肺の細菌感染症である。百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、この状態の主原因である。化学的に解毒された百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全細胞（ｗＰ）を含み、そしてジフテリア及び破傷風抗原とともに製剤化されたワクチンが何十年も利用可能である。１９９０年代から、ｗＰワクチンは多くの国において無細胞百日咳ワクチンと置き換えられてきた。無細胞百日咳（ａＰ）ワクチンは、ｗＰワクチンと比較して比較的少ない副作用を誘導し、これらは発熱の高い危険性、注射部位での反応源性及びより少ない程度でけいれんを伴う。

現在の無細胞ワクチンは、以下の病原性因子に基づく：百日咳毒素（ＰＴ）、繊維状赤血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＦＨＡ）、パータクチン（ＰＲＮ）、線毛性凝集原（ｆｉｍｂｒｉａｌ ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ）２及び線毛性凝集原３（ＦＩＭ２／３又はＦＩＭ）。いくつかの無細胞ワクチンはＰＴ及びＦＨＡのみ又はＰＴ単独を含有するが、一般に、ＰＴ、ＦＨＡ、ＰＲＮ、線毛性凝集原２及び線毛性凝集原３成分を含有する無細胞百日咳ワクチンは、現在利用可能な最も有効なａＰワクチンであると考えられている。

百日咳ａＰワクチンのための当該分野で公知の製造方法は、主に２つの段階から構成される：上流発酵プロセス及び下流精製プロセス。上流発酵プロセスは、典型的には増加する体積の一連のバイオリアクターにおけるボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）の培養を含み、ここで微生物が制御された条件下で増殖する。典型的には、ボルデテラ属種培養の制御された条件は、エネルギー源としてアミノ酸を含有する培地を含む。ボルデテラ属細胞の培養は、細胞が、炭水化物、ラクテート及び解糖中間体のような特定のエネルギー源を効率的に利用できないという点で独特である。代わりに、これらの生物はそれらの主要な炭素及びエネルギー源としてアミノ酸、典型的にはグルタミン酸を使用する。グルタメートの利用において、α－アミノ基が除去され、そして炭素骨格はα－ケトグルタレート代謝中間体に変換される。酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼにより調節されるグルタメートの酸化的脱アミノは以下の反応に従う：
グルタメート＋ＮＡＤ^＋＋Ｈ_２Ｏ＝ＮＨ_４ ^＋＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋＋α－ケトグルタレート

ボルデテラ属種によるアミノ酸の脱アミノは、培地中のアンモニアのアンモニウムイオンへの反応に起因して培養の間にｐＨの増加を生じる。増強された細胞密度は、培地のｐＨを継続的に維持することにより少なくとも部分的にボルデテラ属種培養の間に達成され得る。従って、ボルデテラ属種を培養する方法は、典型的には、より低い塩基性レベルにｐＨを維持するために、酸、典型的にはリン酸を加えることによりｐＨを制御することも含む。

培養後に細胞は上清（遠心分離液（ｃｅｎｔｒａｔｅ）としても知られる）から分離され、これは典型的には細胞フラクション及び上清フラクションを生じる培養培地の遠心分離を含み、そして必要に応じて、目的の抗原は細胞及び／又は上清フラクションからさらに単離され得る。ＦＩＭは通常は細胞フラクションから単離されるが、少量のＦＩＭは上清中にも見いだされ得る。逆に、培養の間に細胞から放出されるＰＴ、ＦＨＡ及びＰＲＮは、典型的に上清から単離される。しかし、ＰＲＮの相当な部分はしばしば細胞に付随したままであり、従って上清中には存在せず、抗原の潜在的な損失を生じる。それ故、上清中のこの抗原の量を増加させるボルデテラ属種抗原製造、特にＰＲＮ製造のより効率的な方法の必要性が依然として当該分野に存在する。

要旨
本発明者らは、上清中の増加した量のＰＲＮを生じる、ボルデテラ属種を培養するための方法を開発した。驚くべきことに、本発明者らは、上清中のＰＲＮの量が、少なくとも部分的に、培養の間ｐＨを維持するために使用される酸の種類に依存するということに気づいた。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、ｐＨ制御のために特定の酸ブレンドを使用することにより他の抗原の収量に影響を及ぼすことなく上清中でＰＲＮを増加させることができるということに気づいた。さらに、本発明者らは、強い酸又は酸ブレンドの使用がバイオマスレベルでの実質的な変化を生じないということを発見した。従って、ｐＨ制御のために使用される酸の種類の単純な変化が、下流ボルデテラ抗原製造プロセスに対して最小の影響を生じる。本方法のこれら及び他の予期せぬ利益は本明細書以下に記載される。

より詳細には、一局面において、本開示は、ボルデテラ属種、典型的には百日咳菌を培養するための方法に関し、該方法は：ボルデテラ属種を有酸素条件下で液体培地中で培養すること；及び該種の培養の間、液体培地のｐＨを維持することを含み、ここで液体培地のｐＨを維持することは：ボルデテラ属種の培養の間ｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために必要に応じて、硝酸のような強酸を液体培地に添加することを含む。

さらに、別の局面において、本開示は、ボルデテラ属種培養からの上清フラクションにおけるボルデテラ線毛性凝集原２及び線毛性凝集原３（ＦＩＭ２／３）の収量を増加させるための方法に関し、該方法は：ボルデテラ属種、典型的には百日咳菌を有酸素条件下で液体培地中で培養すること；該種の培養の間、液体培地のｐＨを維持すること、［ここで液体培地のｐＨを維持することは：ボルデテラ属種の培養の間、ｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために必要に応じて液体培地に酸を添加することを含み、ここで酸は、硝酸、塩酸又は硫酸のような水中で本質的に完全に解離する無機酸を含む］、ボルデテラ属種の培養後の液体培地を細胞フラクション及び上清フラクションに分離すること；並びに上清フラクションからＦＩＭ２／３を単離することを含む。

さらに別の局面において、本開示は、ボルデテラ属種、典型的には百日咳菌を培養するための方法に関し、該方法は：ボルデテラ属種を有酸素条件下で液体培地中で培養すること；及び該種の培養の間、液体培地のｐＨを維持することを含み、ここで液体培地のｐＨを維持することは：ボルデテラ属種の培養の間、ｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために必要に応じて液体培地に第一及び第二の酸を添加することを含み、ここで第一の酸は、硝酸、塩酸又は硫酸のような水中で本質的に完全に解離する無機酸であり、最も典型的には硝酸であり、そしてここで第二の酸は、リン酸のような１より大きい酸解離定数（ｐＫａ）を有する有機酸又は無機酸である。

いくつかの実施態様において、第一の酸及び第二の酸は溶液状態で混合され、ここで溶液は第一の酸を約２０％～約７５％、例えば約３０％～約５０％、例えば約４０％、及び第二の酸を約２５％～約８０％、例えば約５０％～約７０％、例えば約６０％（体積／体積）含む。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、液体培地からボルデテラ抗原を単離すること、例えば、ボルデテラ属種の培養後に液体培地を細胞フラクション及び上清フラクションに分離することをさらに含む。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、百日咳毒素（ＰＴ）、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）及びパータクチン（ＰＲＮ）の１つ又はそれ以上を上清フラクションから単離すること、並びにＦＩＭ２／３を細胞フラクション及び／又は上清から単離することをさらに含む。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、単離されたボルデテラ抗原をサブユニットワクチンとして製剤化することをさらに含む。

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、ｐＨ値の所定の範囲は、６．０～９．０、例えば６．８～７．３であり得る。

いくつかの実施態様において、本方法に従うボルデテラ属種の培養は、大規模製造条件下で起こる。

いくつかの実施態様において、ボルデテラ属種を培養するために使用される液体培地は、化学的に規定された液体培地、例えばジメチル－β－シクロデキストリンを追加されたＳｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地である。

本開示の適用性のさらなる領域は、本明細書以後に提供される詳細な記載から明らかとなるだろう。当然のことながら、詳細な記載及び特定の実施例は、本開示のいくつかの望ましい局面を示すが、説明の目的のみのためであり、本開示の範囲を限定することは意図されない。

図１は、実施例１に記載されるように、ボルデテラ属種培養の間にｐＨ制御を維持するために様々な酸を使用して製造されたボルデテラ属種培養物から得られた上清フラクション又は細胞フラクション中のＰＲＮの相対量を示すウェスタンブロットを表す。 図２Ａ～２Ｄは、実施例２に記載されるように、上清からのＰＲＮ（図２Ａ）、ＰＴ（図２Ｂ）及びＦＨＡ（図２Ｃ）、並びに細胞フラクション及び上清からのＦＩＭ２／３（図２Ｄ）の収量に対する、複合培地におけるボルデテラ属種培養の間のｐＨ制御のために異なる比の３．５Ｍ硝酸及び２．５Ｍリン酸のブレンドを使用した効果を表す。 図２－１の続き。 図３Ａ～３Ｄは、実施例３に記載されるように、上清からのＰＲＮ（図３Ａ）、ＰＴ（図３Ｂ）及びＦＨＡ（図３Ｃ）、並びに細胞フラクション及び上清からのＦＩＭ２／３（図３Ｄ）の収量に対する、化学的に規定された培地におけるボルデテラ属種培養の間のｐＨ制御のために異なる比の３．５Ｍ硝酸及び２．５Ｍリン酸のブレンドを使用した効果を表す。 図３－１の続き。 図４Ａ～Ｂは、実施例４に記載されるように、２０Ｌ及び２００Ｌスケールでの上清からのＰＲＮ（図４Ａ）、並びに２００Ｌスケールでの上清（遠心分離液）からのＦＩＭ２／３（図４Ｂ）の収量に対する、複合培地におけるボルデテラ属種培養の間のｐＨ制御のために異なる比の３．５Ｍ硝酸及び２．５Ｍリン酸のブレンドを使用した効果を表す。

詳細な説明
様々な望ましい局面の以下の記載は、本来は単に例示に過ぎず、そしていかなるようにも本開示、その適用、又は使用を制限することは意図されない。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうではないと指示していなければ複数の言及を含む。従って例えば、「方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つもしくはそれ以上の方法、及び／もしくは本明細書に記載される種類の工程、並びに／又は本開示などを読むと当業者にあきらかとなるであろうものを含む。

全体をとおして使用される範囲は、範囲内である値の１つ１つ全てを記載するための簡潔な表現として使用される。範囲内のいずれの値も、範囲の境界として選択され得る。さらに、本明細書において引用される全ての参考文献は、それら全体として参照により本明細書に加入される。本開示における定義と引用される参考文献の定義における矛盾の場合には、本開示が支配する。

本明細書で使用される「ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）」は、プロテオバクテリア門の小さな（０．２～０．７μｍ）グラム陰性球桿菌の属を指す。典型的には、ボルデテラ属種は偏性好気性菌である。ボルデテラ属種はまた、高度に偏好性であり、すなわち培養が困難である。全ての種がヒトに感染することができる。

本明細書で使用される用語「培養する」又は「培養すること」は、培養における細胞の増殖を指す。本明細書で使用される用語「培養する」は、培地における細胞又は生物のいずれかの増殖を指す。用語「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」は当該分野で認識されており、そして一般に、生存細胞の培養のために使用されるいずれかの物質又は調製物を指す。細胞培養を参照して使用される用語「培地」は細胞を取り囲む環境の成分を含む。

様々な実施態様において、本発明の方法は：ボルデテラ属種を有酸素条件下で液体培地中にて培養すること；及び液体培地のｐＨを該種の培養の間維持することを含み、ここで液体培地のｐＨを維持することは：該ボルデテラ属種の培養の間ｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために必要に応じて、水中で本質的に完全に解離する無機酸、例えば硝酸を液体培地に添加することを含む。

ボルデテラ属細胞を培養するための当該分野で公知のいずれの液体培地も本発明の方法とともに使用され得る。様々な実施態様において、複合培地が使用される。本明細書において使用される「複合培地」は、植物又は動物起源のペプトン消化物又は抽出物を含有する培地を指す。本発明の方法とともに使用するために適した複合培地の例としては、例えば、Ｈｏｒｎｉｂｒｏｏｋ培地、Ｃｏｈｅｎ－Ｗｈｅｅｌｅｒ培地、Ｂ２培地、又は他の類似した液体培地が挙げられる。ジメチルβシクロデキストリン及びカザミノ酸も含む改変Ｓｔａｉｎｅｒ＆Ｓｃｈｏｌｔｅ培地は、使用に適した別の例である。しかし典型的には、以下の実施例に記載されるように、カザミノ酸を含有する複合培地は、培養の間初期に使用され、そしてその後、増殖因子及び栄養供給としてグルタミン酸一ナトリウムを含む栄養サプリメントを追加される。本明細書で使用される「カザミノ酸」は、カゼインの加水分解により得られたアミノ酸の混合物を指す。

他の実施態様において、化学的に規定された培地は、ボルデテラ属種を培養するために本発明の方法とともに使用される。化学的に規定された培地は、しばしば、化学的に規定されていない培地と異なり、化学的に規定された培地は正確な濃度の各栄養素を含有し、それ故培地の変動性を減少させ、そして発酵生成物の品質を改善するので有益であるとしばしば考えられている。本明細書で使用される用語「化学的に規定された培地」は、酵母、酵母抽出物、ペプトン、トリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎｅｓ）及びカザミノ酸のような複雑な材料を実質的に有していない培地を指す。

以下の表１は、本発明の方法とともに使用するために適した化学的に規定された培地、すなわち、Ｓｔａｉｎｅｒ＆Ｓｃｈｏｌｔｅ（ＳＳ）培地及びＳＳ培地の改変バージョン（追加ＳＳ培地）（これは、ジメチル－β－シクロデキストリン、百日咳菌（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の増殖刺激物質、及び他の小さな変更を含む）の組成の例を示す。これらの例において、複合培地中のカザミノ酸は、選択されたアミノ酸で置き換えられた。１つ又はそれ以上のさらなるアミノ酸を含んでいてもよい。

いくつかの実施態様において、液体培地はボルデテラ属種を含む。様々な実施態様において、ボルデテラ属種は、ボルデテラ・アビウム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ）、ボルデテラ・ヒンジイ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｈｉｎｚｉｉ）、ボルデテラ・トレマツム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｔｒｅｍａｔｕｍ）、ボルデテラ・ホルメシイ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｈｏｌｍｅｓｉｉ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）及び百日咳菌 （別にＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとしても知られる）からなる群より選択される種である。典型的には、ボルデテラ属種は、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌及び百日咳菌からなる群から選択される。より典型的には、ボルデテラ属種は百日咳菌である。

発酵プロセスは典型的には少なくとも２段階で進行する：（ｉ）シード増殖及び（ｉｉ）培養。第一段階は振盪フラスコで行われる。比較的小さいシード培養物が、ストック培養からの播種により最初に増殖し（例えば、ワーキングシード（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｅｅｄ））、そしてこれを増殖させて、培養物を播種するために使用する（例えば、シード培養、発酵培養）。１つより多くのシード増殖段階は、培地の播種のためにボルデテラ属種の量をスケールアップするために使用され得る。あるいは、培養段階における種の増殖は、望ましい場合、直接播種により貯蔵された培養物から直接的に進められ得る。培養段階を開始するために、シード培養物の一部又は全てが培地に播種するために使用される。１つ又はそれ以上の培養工程又は継代がある。例えば、ボルデテラ属種を２０００Ｌバイオリアクターで培養するために、シード培養物を使用して、第一の培養容器（２０Ｌ）に播種し得、これは第二の培養容器（２００Ｌ）に播種するために使用され、そしてこれは第３の培養容器（２０００Ｌ）に播種するために使用される。さらなる例として、ボルデテラ属種を２００Ｌ容器で培養するために、シード培養物を使用して、二次フラスコに播種するために使用される一次フラスコに播種し得、これを使用して２０Ｌ容器に播種し、これを今度は２００Ｌ容器に播種するために使用する。

いくつかの実施態様において、ボルデテラ属種の培養は、液体培地を例えば１、２、３又は５リットル含有する２、５又は１０リットルフラスコのような小さい容器においてボルデテラ属種を増殖させることを含む。他の実施態様において、本発明のボルデテラ属種を培養する方法は、大規模製造条件を使用する。本明細書で使用される「大規模製造条件」は、１０と１０，０００リットルとの間、２５と５０００リットルとの間、２５と２０００リットルとの間、５０と１０００リットルとの間、１００リットルと５０００リットルとの間、５００リットルと８０００リットルとの間、１５００リットルと６５００リットルとの間、約１５００～１６００リットル、約３０００～３２００リットル、約６０００～６４００リットル、２５リットルより大きいかもしくは２５リットルに等しい、例えば１００リットルより大きいかもしくは１００リットルに等しい、例えば少なくとも１００リットルかつ１０，０００リットルより小さいか又は１０，０００リットルに等しい、例えば、少なくとも１００リットルかつ８０００リットルより小さいかもしくは８０００リットルに等しい、例えば少なくとも１００リットルかつ４０００リットルより小さいかもしくは４０００リットルに等しい、又は例えば少なくとも１００リットルかつ２０００リットルより小さいかもしくは２０００リットルに等しい作業体積で、培養容器、典型的にはバイオリアクターにおいて細胞を培養することを指す。

様々な実施態様において、培養プロセスは、３２℃より高いかもしくは３２℃に等しい、３３℃より高いかもしくは３３℃に等しい、３４℃より高いかもしくは３４℃に等しい、４５℃より低いかもしくは４５℃に等しい、４２℃より低いかもしくは４２℃に等しい、４０℃より低いかもしくは４０℃に等しい、３８℃より低いかもしくは３８℃に等しい、３２℃と４５℃との間、３３℃と４２℃との間、３３℃と４０℃との間又は３３℃と３８℃との間の温度で行われる。典型的には、培養は３４℃～３８℃の範囲に及ぶ温度で行われる。

通気は、当該分野で公知のいずれかの方法により、例えば培養容器を振盪もしくは回転することにより、又はバイオリアクターのシャフトに取り付けられた１つもしくはそれ以上の羽根車の使用により達成され得る。あるいは、空気又は純粋な酸素を培養容器中に導入し得る。溶存酸素は、例えば、約２０％～４０％又は約３０％のレベルの空気飽和度に調節され得る。いくつかの実施態様において、溶存酸素のレベルは、１０μΜと１６０μΜとの間、１５μΜと１４０μΜとの間、３０μΜと１２０μΜとの間、４５μΜと１５μΜとの間、６０μΜと１００μΜとの間、又は約８０μΜである。

いくつかの実施態様において、ポリジメチルシロキサンのような消泡剤が、培養プロセスの間液体培地中に組み込まれ得る。

いくつかの実施態様において、培養期間は、９時間～５６時間、例えば２６時間もしくはそれ以下、又は４８時間もしくはそれ以下の範囲に及ぶ。培養プロセスの各工程は、それ自体の培養期間を有し得る。

強酸
様々な実施態様において、液体培地のｐＨは、生物の培養の間継続的に評価され、そして必要に応じて、生物の増殖の間、値の所定の範囲内に培地のｐＨを維持するために十分な濃度で、酸が液体培地に供給される。一般に、培養全体を通して培地が制御されるｐＨの範囲は、典型的には、約６．０～約９．０、より典型的には約６．８～約７．３、例えば、約７．０～７．２である。ｐＨの決定、及び必要な場合調整は、典型的には自動で、例えばポンプに作動可能に接続されたｐＨメーターを使用して自動的に達成され、このポンプは、所定の範囲外のｐＨ決定に応じて、液体培地に酸をポンプで送るための蠕動ポンプであり得る。

本明細書で使用される「酸」は、水溶液に添加された場合に、水分子（Ｈ_２Ｏ）にプロトンを供与する物質を指す。典型的には、強酸、例えば強無機酸が、培地のｐＨを維持するために使用される。本明細書で使用される「強酸」は、水中で本質的に完全に解離するものである。対照的に、弱（ｍｉｌｄ）又は弱（ｗｅａｋ）酸は、水中で不完全に解離する酸である。すなわち弱酸は、溶液中でその水素の全ては放出せず、そのプロトンを溶液に部分的な量しか供与しない。

強酸はまたＫａ及び／又はｐＫａ値を参照して定義されてもよい。本明細書において使用されるＫａは、解離平衡状態における平衡定数：［Ｈ^＋］［Ａ^－］／［ＨＡ］を指す。従って、Ｋａの数値は、生成物の濃度を反応物の濃度で割ったものに等しく、ここで反応物は酸（ＨＡ）であり、そして生成物は共役塩基及びＨである。本明細書で使用されるｐＫａは、ｐＫａ＝^－ｌｏｇ_１０Ｋａにより定義される定数である酸解離定数を意味する。

例えば、水（Ｈ_２Ｏ）は、ヒドロニウムイオン、Ｈ_３Ｏ^＋の塩基であり、２５℃で０のｐＫａを有する。ヒドロニウムイオンより小さいｐＫａを有する酸が強酸とみなされる。例えば塩酸（ＨＣｌ）はｐＫａ－７を有し、これはヒドロニウムイオンのｐＫａより小さい。これは、ＨＣｌがそのプロトンを本質的に完全に水に放出してＨ_３Ｏ^＋カチオンを形成するということを意味する。この理由から、ＨＣｌは水中で強酸と分類される。水溶液中のＨＣｌの全てが１００％解離されていると仮定することができ、ヒドロニウムイオン濃度及び塩化物イオン濃度の両方が加えられたＨＣｌの量に直接相当するということを意味する。

ＨＣｌに加えて、本発明のボルデテラ属種培養方法においてｐＨを制御するために使用され得る他の強酸の例としては、臭化水素酸、硫酸、硝酸、塩素酸、過塩素酸、過マンガン酸、及びヨウ化水素酸が挙げられる。しかし、塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）又は硝酸（ＨＮＯ_３）が典型的に使用される。なおより典型的には、本発明の方法で使用される強酸は硝酸（ＨＮＯ_３）である。

本明細書において開示される強酸と対照的に、「弱酸」は約１０^－１より小さいＫａ値又は１より大きいｐＫａ値を有する酸を指す。弱酸の例としては、リン酸、亜リン酸、亜硝酸及び亜硫酸が挙げられる。強酸及び弱酸の他の例並びにそれらのＫａ及びｐＫａ値を以下の表２に示す。

いくつかの実施態様において、１つの強酸のみ、１つの強無機酸、例えば硝酸のみのように１つの酸のみを含む溶液は、本発明の方法の液体培地のｐＨを維持するために使用される。すなわち、ｐＨを制御するために使用される溶液中の酸の１００％が強酸、例えば強無機酸、例えばＨＣｌ、Ｈ_２ＳＯ_４又はＨＮＯ_３である。幾つかの実施態様において、１つの強酸のみ、１つの強無機酸、例えば硝酸のみを含む溶液のモル濃度は、０．５Ｍ～５．０Ｍ、例えば１．０Ｍ～４．０Ｍ、例えば約３．５Ｍ、例えば３．５Ｍ硝酸又は３．５Ｍ ＨＣｌである。典型的には、３．５Ｍ硝酸が本発明の方法とともに使用される。

様々な実施態様において、典型的には培養の後に、例えば遠心分離を使用して培地を細胞フラクションと上清フラクションに分離する工程が続く。ＰＲＮ、ＰＴ、ＦＨＡ及びＦＩＭ２／３を含む、ボルデテラ属種培養からの１つ又はそれ以上の抗原は、当該分野で利用可能な方法を使用して細胞及び上清フラクションからさらに単離することができ、これらの方法としては、米国特許第５，８７７，２９８号（その全体として参照により本明細書に加入される）に記載されるものが挙げられる。本明細書で使用される用語「抗原」又は「免疫原」は、被験体、例えばヒトのような哺乳動物に曝露されると、その抗原に特異的な免疫応答を誘導する１つ又はそれ以上のエピトープ（鎖状、立体構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）又は両方）を含有する分子を指す。エピトープは抗原の特異的部位であり、これがＴ細胞受容体又は特異的抗体に結合し、そして典型的には約３つのアミノ酸残基から約２０のアミノ酸残基を含む。用語抗原はサブユニット抗原を指す：抗原が天然で付随している生物全体から分離されて個別の抗原。

用語「単離された」又は「単離すること」は、実質的に純粋な形態、例えば、約９５％より高い純度であるか、又は少なくとも部分的に精製されている、例えば８５％より高く純粋であるか、７５％より高く純粋であるか、もしくは５０％より高く純粋であるか、又は何らかの方法でその天然環境もしくはその増殖培地から取り出された物質を指す。従って、「単離された」又は「単離すること」へのいずれかの言及は、その液体培地から、かつ／又は全細胞細菌調製物から取り出されており、かつ実質的に又は少なくとも部分的に精製されていてもよい抗原のような薬剤を包含し、これらとしては、例えば、ボルデテラ属種培養培地の遠心分離により得られた細胞又は上清フラクションが挙げられる。用語「単離された」はまた、他の薬剤、希釈剤、賦形剤、アジュバント及び／又はタンパク質とともに溶液状態にある免疫原も包含する。

ＰＲＮのような抗原の単離は、例えば、米国特許第５，６６７，７８７号及び同第５，８７７，２９８号（これらはその全体として参照により本明細書に加入される）に記載されるような当該分野で公知のいずれかの方法により行われ得る。典型的には、単離プロセスは、上清フラクションもしくは遠心分離液としても本明細書に置いて言及される水性材料と細胞フラクションとに液体培地を分離することから始まる。分離は様々な方法により達成され得る。例えば、培養物中の固形物を重力下で沈降させることができ、ついで水性材料をデカンテーション又は吸引により除去することができる。しかし、典型的には、固形ペレット及び上清を得るために遠心分離を使用し、これらは容易に分離することができる。ペレットはボルデテラ属種細胞及び他の不溶性物質を含む。上清は培地及び培養の間に細菌により放出されたいずれかの成分を含む。

典型的にはＰＴ、ＦＨＡ及びＰＲＮを含有する上清は濾過され、ついで例えばセルロース膜を使用することにより濃縮される。ＰＴ、ＦＨＡ及びＰＲＮは、例えばパーライト分画により分離され得る。ＰＲＮはこの分離工程において使用されるカラムのランスルーで集められ得るが、ＰＴ及びＦＨＡは所望される場合カラムから溶出され得る。

いくつかの実施態様において、例えば、米国特許第５，６６７，７８７号（これはその全体として参照により本明細書に加入される）に記載されるように、３つの異なる濃度で硫酸アンモニウムを使用する３つの連続した沈殿工程でＰＲＮを沈殿させる。例えば、第一及び第三の沈殿において、ペレットは目的のフラクションであるが、第二の沈殿では上清が使用される。次いで、遠心分離により集められた最終ペレットを、例えば、１０ｍＭ ＨＣｌ Ｔｒｉｓ緩衝液に溶解し得、そしてクロマトグラフィーカラムにロードし得る。次いで生成物を最終クロマトグラフィー工程にかける前に限外濾過し、そして透析濾過し得る。最終濾過は、ＰＲＮの定量前に予備濾過工程及び滅菌濾過（０．２μｍフィルター）を含んでいてもよい。

いくつかの実施態様において、精製されたＰＲＮは、リン酸アルミニウムのようなアジュバント上に吸着される。当該分野で公知のように、アジュバントは抗原に応じて免疫系を増強するために役立つ化合物である。吸着プロセスにおいて、例えば、リン酸アルミニウム溶液を抗原に加え、そして４日間１６℃～２４℃で混合する。吸着後に、ＰＲＮは２℃～８℃で３６ヶ月まで保存され得る。

いくつかの実施態様において、１つの酸、例えば１つの強酸のみ、例えば１つの強無機酸、例えば硝酸又は塩酸のみを含む溶液、例えば１００％３．５Ｍ硝酸又は１００％３．５Ｍ塩酸を含む溶液が、本発明の方法に従うボルデテラ属種培養の間ｐＨを維持するために使用される場合、本明細書において定義されるような１つ又はそれ以上のより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）のみ、例えば１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨが維持される場合の上清におけるＰＲＮの量と比較して、ＰＲＮは上清において増加する。

いくつかの実施態様において、１つの酸のみ、例えば１つの強酸のみ、例えば強無機酸、例えば硝酸又は塩酸のみを含む溶液、例えば１００％３．５Ｍ硝酸又は１００％３．５Ｍ塩酸を含む溶液が、本発明の方法に従ってボルデテラ属種培養の間ｐＨを維持するために使用される場合、本明細書で定義されるような１つ又はそれ以上のより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）のみ、例えば１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨが維持される場合の上清中のＰＲＮの量と比較して、ＰＲＮは上清中で約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は１０倍、典型的には約３倍～６倍増加する。

いくつかの実施態様において、１つの酸のみ、例えば１つの強酸のみ、例えば１つの強無機酸、例えば硝酸又は塩酸のみを含む溶液、例えば１００％３．５Ｍ硝酸又は１００％３．５Ｍ塩酸を含む溶液が、本発明の方法に従うボルデテラ属種培養の間ｐＨを維持するために使用される場合、１つ又はそれ以上の本明細書において定義されるようなより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）、例えば１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨを維持する場合の細胞フラクション中のＰＲＮの量と比較して、ＰＲＮはそれに応じて細胞フラクション中で約１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％、典型的には５０％減少する。

本開示はまた、ボルデテラ属種培養からの上清フラクションにおける線毛性凝集原２及び線毛性凝集原３の収量を増加させるための方法に関し、該方法は：ボルデテラ属種を有酸素条件下で本明細書に記載される液体培地中にて培養すること；該種の培養の間、液体培地のｐＨを維持すること、［ここで液体培地のｐＨを維持することは：本明細書に記載されるように該ボルデテラ属種の培養の間、ｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために必要に応じて培地に酸を添加することを含み、ここで酸は水中で本質的に完全に解離する無機酸、すなわち本明細書に記載される強酸を含む］、並びにボルデテラ属種培養後に液体培地を細胞フラクション及び上清フラクション（遠心分離液）に分離すること；並びに細胞フラクション及び／又は上清フラクションから２型及び３型線毛を単離することを含む。

いくつかの実施態様において、ＦＩＭ２／３はボルデテラ属種培養物から単離される。これらの実施態様において、培養に使用される液体培地は、複合培地でも化学的に規定された培地でもよい。典型的には、これらの実施態様において、液体培地は、本明細書に記載されるような化学的に規定された培地、例えば補足ＳＳ培地である。様々な実施態様において、ＦＩＭ２／３は、本明細書に記載されるように、例えば遠心分離により液体培地を細胞フラクション及び上清フラクションに分離した後の上清及び／又は細胞フラクションから得られる。ＦＩＭ２／３は、当該分野で公知のいずれかの方法に従って上清フラクション及び／又は細胞フラクションから単離され得る。特定の実施態様において、ＦＩＭ２／３は上清フラクションから単離される。他の実施態様において、ＦＩＭ２／３は細胞フラクションから単離される。例えば、ＦＩＭ２／３は、当該分野で公知の技術（例えば、尿素、加熱又は超音波処理）を使用して細胞を溶解し、続いてＦＩＭ２／３をさらに単離することにより細胞フラクションから単離され得る。

いくつかの実施態様において、１つの酸のみ、例えば１つの強酸のみ、例えば１つの強無機酸、例えば、硝酸、硫酸、または塩酸のみを含む溶液、例えば１００％３．５Ｍ硝酸又は１００％３．５Ｍ塩酸を含む溶液が、本発明の方法に従うボルデテラ属種培養の間、ｐＨを維持するために使用される場合、本明細書において定義される１つ又はそれ以上のより弱い酸例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）、例えば１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨが維持される場合の上清におけるＦＩＭ２／３の量と比較して、ＦＩＭ２／３は上清において増加する。

いくつかの実施態様において、１つの酸のみ、例えば１つの強酸のみ、例えば１つの強無機酸、例えば硝酸、硫酸又は塩酸のみを含む溶液、例えば１００％３．５Ｍ硝酸又は１００％３．５Ｍ塩酸を含む溶液が、本発明の方法に従ってボルデテラ属種培養の間、ｐＨを維持するために使用される場合、本明細書において定義される１つ又はそれ以上のより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）のみ、例えば１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨが維持される場合の上清におけるＦＩＭ２／３の量と比較して、ＦＩＭ２／３は、上清において約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は１０倍、典型的には約３倍増加する。

酸ブレンド
本開示はまた、本明細書に記載されるように、ボルデテラ属種を培養するための方法に関し、該方法は：ボルデテラ属種を液体培地中にて本明細書に記載されるように有酸素条件下で培養すること；及び該種の培養の間、液体培地のｐＨを維持することを含み、ここで液体培地のｐＨを維持することは：該ボルデテラ属種の培養の間に、本明細書に記載されるｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために必要に応じて培地に第一及び第二の酸を添加することを含み、ここで該第一の酸は、水中で本質的に完全に解離する無機酸であり、そしてここで該第二の酸は、１より大きい酸解離定数（ｐＫａ）を有する無機酸又は有機酸である。

様々な実施態様において、液体培地のｐＨは、第一の酸及び第二の酸のブレンドを使用してボルデテラ属種培養の間維持される。ｐＨを制御するために酸ブレンドを使用するいくつかの実施態様において、液体培地は複合培地でも化学的に規定された培地でもよい。しかし典型的には、液体培地は本明細書に記載されるような化学的に規定された培地、例えば補足ＳＳ培地である。

ｐＨ制御のために酸ブレンドを使用するいくつかの実施態様において、第一の酸は強酸、すなわち本明細書において記載されるように、水中において本質的に完全に解離する酸である。より典型的には、第一の酸は臭化水素酸、硫酸、硝酸、塩素酸、過塩素酸、過マンガン酸、及びヨウ化水素酸のような強無機酸である。しかし、なおより典型的には、第一の酸は塩酸（ＨＣｌ）、硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）または硝酸（ＨＮＯ_３）である。さらになおより典型的には、強酸は硝酸（ＨＮＯ_３）である。

様々な実施態様において、第二の酸もまた、培地のｐＨを維持するために使用される。典型的には、第二の酸は第一の酸よりも弱い酸である。第一の酸を第二の酸と混合して共役酸－塩基対を生じ、この共役酸－塩基対において、より弱い酸である第二の酸は、第一の酸からの水素イオン（Ｈ^＋）を受容する塩基として有効に機能する。様々な実施態様において、この第二の酸は、約１０^－１未満のＫａ値または１より大きいｐＫａ値を有する酸の群から選択される。本発明の方法とともに使用するための弱酸の例を表２に示す。典型的には、弱酸としては亜塩素酸、アジ化水素酸、フッ化水素酸、硫化水素酸、次亜硫酸、次亜臭素酸、次亜塩素酸、次亜リン酸、ヨウ素酸、亜硝酸、リン酸、亜リン酸、ピロリン酸、及び亜硫酸のような無機酸が挙げられる。より典型的には、弱酸はリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）である。

いくつかの実施態様において、弱酸は有機酸である。有機酸は無機酸よりもゆっくりと、より不完全に解離する傾向がある。本発明の方法とともに使用するための、第一の酸、すなわち強酸と組み合わせられ得る約１０^－１未満のＫａ値または１より大きいｐＫａ値を有する有機酸の例も表２に示す。適切な有機酸としては、例えば、酢酸、乳酸及びアスコルビン酸が挙げられる。例えば、酢酸（ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ）はヒドロニウムイオンより大きいが水自体、すなわち１４（２５℃）よりは小さい、ｐＫａ４．７５を有する。これは、酢酸が水中で解離するがわずかな程度までだけであることを意味する。従って、酢酸は弱酸として分類され、そしてボルデテラ属種培養の間液体培地のｐＨを維持するために本開示の強酸と組み合わされ得る。

いくつかの実施態様において、ブレンドされた酸溶液は、約９９％まで、例えば約９８％、例えば約９７％、例えば約９５％、例えば約９０％、例えば約８０％、例えば約７５％、例えば約７０％、例えば約６０％、例えば約５５％、例えば約５０％、例えば約４５％、例えば約４０％、例えば約３５％、例えば約３０％、例えば約２５％、例えば約２０％、例えば約１０％、例えば約５％、例えば約１％の強酸を含み、ここでブレンドされた酸溶液の残りはより弱い酸（体積／体積）、すなわち１より大きいｐＫａを有する酸を含む。

いくつかの実施態様において、ブレンドされた酸溶液は、約９９％まで、例えば約９８％、例えば約９７％、例えば約９５％、例えば約９０％、例えば約８０％、例えば約７５％、例えば約７０％、例えば約６０％、例えば約５５％、例えば約５０％、例えば約４５％、例えば約４０％、例えば約３５％、例えば約３０％、例えば約２５％、例えば約２０％、例えば約１０％、例えば約５％、例えば約１％の、１より大きいｐＫａを有する弱酸を含み、ここでブレンドされた酸溶液の残りは、強酸（体積／体積）、すなわち水中で本質的に完全に解離する酸を含む。

典型的に、ブレンドされた酸溶液は、３０％と５０％との間、例えば約４０％の本明細書において定義された強酸、例えば強無機酸、例えば硝酸、硫酸または塩酸、及び５０％と７０％、例えば約６０％の１より大きいｐＫａ値を有するより弱い酸（体積／体積）を含む。典型的に、１より大きいｐＫａを有する第二の酸はリン酸である。

いくつかの実施態様において、本発明のブレンドされた酸溶液において使用される本明細書において定義される強酸、例えば強無機酸、例えば硝酸を含む溶液のモル濃度は、０．５Ｍ～５．０Ｍ、例えば１．０Ｍ～４．０Ｍ、例えば３．５Ｍ、例えば３．５Ｍの硝酸または３．５Ｍ ＨＣｌ、典型的には３．５Ｍ硝酸の範囲に及ぶ。

いくつかの実施態様において、ブレンドされた酸溶液において使用される本明細書において定義された弱酸、例えば無機又は有機弱酸、例えばリン酸を含む溶液のモル濃度は、０．５Ｍ～５．０Ｍ、例えば１．０Ｍ～４．０Ｍ、例えば３．５Ｍ、例えば２．５Ｍ、例えば２．５Ｍ リン酸の範囲に及ぶ。いくつかの実施態様において、ブレンドされた酸溶液は、３０％と５０％との間の３．５Ｍ ＨＣｌ又は３．５Ｍ ＨＮＯ_３及び５０％と７０％との間の２．５Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４を含む。典型的には、ブレンドされた酸溶液は、約４０％３．５Ｍ ＨＣｌ又は３．５Ｍ ＨＮＯ_３及び約６０％２．５Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４を含む。なおより典型的には、ブレンドされた酸溶液は約４０％３．５Ｍ ＨＮＯ_３及び約６０％２．５Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４を含む。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載される第一及び第二の酸を含む溶液、例えば、約４０％３．５Ｍ硝酸及び約６０％２．５Ｍリン酸を含む溶液が、本発明の方法に従うボルデテラ属種培養の間ｐＨを維持するために使用される場合、本明細書において定義される１つ又はそれ以上のより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）のみ、例えば１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨが維持される場合の上清中のＰＲＮの量と比較して、ＰＲＮは上清において約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は１０倍、典型的には約２倍～３倍増加する。

いくつかの実施態様において、上清中で観察されるＰＲＮの増加は、上清中の他の抗原の量の減少を伴わない。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に記載される第一及び第二の酸を含む溶液、例えば約４０％３．５Ｍ硝酸及び約６０％２．５Ｍリン酸を含む溶液が、本発明に従うボルデテラ属種培養の間ｐＨを維持するために使用される場合、本明細書において定義される１つ又はそれ以上のより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）のみ、例えば１００％２．５Ｍリン酸を使用してｐＨが維持される場合の上清中のＰＴ又はＦＨＡの量と比較して、上清中のＰＴ又はＦＨＡが付随して減少することも実質的に減少することもなく、ＰＲＮは上清中で増加する。

いくつかの実施態様において、上清において観察されるＰＲＮの増加は、細胞フラクションにおける他の抗原の量の減少を伴わない。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に記載される第一及び第二の酸を含む溶液、例えば約４０％３．５Ｍ硝酸及び約６０％２．５Ｍリン酸を含む溶液が、本発明の方法に従うボルデテラ属種培養の間ｐＨを維持するために使用される場合、本明細書において定義される１つ又はそれ以上のより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）のみ、例えば１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨが維持される場合の細胞フラクションにおけるＦＩＭ２／３の量と比較して、細胞フラクション中のＦＩＭ２／３が付随して減少することも実質的に減少することもなく、上清中のＰＲＮが増加する。

ボルデテラ抗原の量に関連して本明細書で使用される「実質的に減少することなく」は、本明細書に記載されるブレンドされた酸溶液が、上清及び細胞フラクションが得られたボルデテラ属種培養のｐＨを維持するために使用されない場合、例えば２．５Ｍリン酸の溶液又は本明細書に記載される別の弱酸の溶液が培養の間にボルデテラ属種液体培地のｐＨを維持するために使用される場合のボルデテラ属種培養から観察されるか又は単離されるボルデテラ抗原の量と比較して、約２５％もしくはそれ以下、例えば２０％もしくはそれ以下、例えば１５％もしくはそれ以下、例えば１０％もしくはそれ以下、例えば５％もしくはそれ以下又は例えば２％もしくはそれ以下の減少を意味する。

当該分野で公知のいずれかの方法を使用して、本明細書に記載されるように第一及び第二の酸がｐＨ制御のために使用される本発明の方法に従うボルデテラ属種の培養の後に、抗原ＰＲＮ、ＰＴ、ＦＨＡ及びＦＩＭ２／３が得られ得る。以前に示したように、ＰＲＮは当該分野で公知の方法に従って単離することができる。

ＰＴは、例えば米国特許第５，８７７，２９８号（その全体が参照により本明細書に加入される）の実施例２において記載されるように単離され得る。ＰＴはまた、例えば米国特許第５，０８５，８６２号、ＷＯ９６／３４６２３、米国特許第４，７０５，８６８号、ＥＰ０３３６７３６、ＷＯ９１１５５０５、ＥＰ０３０６３１８、ＥＰ０３２２５３３、ＥＰ０３９６９６４、ＥＰ０２７５６８９、ＷＯ９１／１２０２０、ＥＰ０４２７４６２、ＷＯ９８１９７０２及び米国特許第４，７８４，５８９号（これらはそれぞれその全体として参照により本明細書に加入される）に記載される方法を使用して単離され得る。

例えばＦＨＡは、米国特許第５，８７７，２９８号（その全体として参照により本明細書に加入される）の実施例２に記載されるように単離され得る。例えばＦＨＡはまた、ＷＯ９０１３３１３、ＥＰ０４８４６２１、ＷＯ９６３４６２３、ＥＰ０３３６７３６、ＷＯ９１１５５０５、米国特許第４，７８４，５８９号、及びＷＯ９００４６４１（これらはそれぞれその全体として参照により本明細書に加入される）に記載されるように単離され得る。

ＦＩＭ２／３は、例えば、米国特許第５，８７７，２９８号（その全体として参照により本明細書に加入される）に記載されるように細胞フラクションから単離され得る。ＦＩＭ２／３はまた、例えば、米国特許第４，７８４，５８９号、米国特許第６，４７５，７５４号、ＥＰ０５５５８９４、ＷＯ９８５８６６８、及びＷＯ０２０７７６４（これらはそれぞれその全体として参照により本明細書に加入される）に記載されるように単離され得る。

いくつかの実施態様において、ＦＩＭ２／３は細胞フラクションよりむしろ上清から単離される。典型的には、これらの実施態様において、本発明の培養方法は、複合液体培地よりもむしろ化学的に規定された液体培地を含む。

いくつかの実施態様において、本明細書に記載される第一及び第二の酸を含む溶液、例えば約４０％３．５Ｍ硝酸及び約６０％２．５Ｍリン酸を含む溶液が、本発明の方法に従うボルデテラ属種培養の間にｐＨを維持するために使用される場合、本明細書において定義される１つ又はそれ以上のより弱い酸、例えばリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）、例えば、１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液を使用してｐＨが維持される場合の上清におけるＦＩＭ２／３の量と比較して、ＦＩＭ２／３は上清において約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は１０倍、典型的には約３倍増加する。

ワクチンの製剤化
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される単離された抗原の１つ又はそれ以上は、免疫原性組成物又はサブユニットワクチンに製剤化される。本明細書で使用される「サブユニットワクチン」は、目的の病原体、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、又は真菌様生物から誘導されるか、それらと相同であるか、又はそれら由来の（全ての抗原ではないが）１つ又はそれ以上の抗原を含むワクチンの型を指す。このようなワクチンは、インタクトな病原細胞もしくは病原性粒子、又はそのような細胞もしくは粒子の溶解物も実質的に含まない。従って、サブユニットワクチン又はサブユニット組成物は、病原体から少なくとも部分的に精製されたか、又は実質的に精製された免疫原性ポリペプチド又はそれらのアナログから製造され得る。サブユニットワクチンにおける抗原を得る方法としては、標準的な精製技術、組み換え産生、又は化学合成が挙げられる。従って「サブユニットワクチン」は、ウイルス、細菌、又は他の免疫原の規定された抗原性成分からなるワクチンを指す。

様々な実施態様において、１つ又はそれ以上の抗原が、サブユニットワクチンのヒト用量へと製剤化される。本明細書で使用される「ヒト用量」は、単回投与でヒトに投与されるワクチンの量を指す。典型的には、この量は０．１～２ミリリットル、例えば０．２～１ミリリットル、典型的には０．５ミリリットルの体積で存在する。従って、示される量は、例えば、０．５ミリリットルのバルクワクチンあたりマイクログラムの濃度で存在し得る。特定の実施態様において、従って（単回）ヒト用量は０．５ミリリットルに等しい。

いくつかの実施態様において、ワクチンに製剤化される１つ又はそれ以上の抗原は、ＰＴ及びＦＨＡを含む。いくつかの実施態様において、ワクチンに製剤化される１つ又はそれ以上の抗原は、ＰＴ、ＦＨＡ、及びＦＩＭ２／３、並びにＰＲＮを含む。

いくつかの実施態様において、ワクチンへのＰＴの組み込みはＰＴの解毒を含む。ＰＴは化学的に解毒されても遺伝子的に解毒されてもよい。例えば、化学的解毒は、ホルムアルデヒド、過酸化水素、テトラニトロメタン、又はグルタルアルデヒドでの処理のような、様々な従来の化学的解毒方法のいずれか１により行われ得る。例えば、解毒は米国特許第５，８７７，２９８号（その全体として参照により本明細書に加入される）の実施例３に記載されるように行われ得る。

特定の実施態様において、ＰＴは遺伝子的に解毒される。これは、例えば、米国特許第７，１４４，５７６号、同第７，６６６，４３６号、及び同第７，４２７，４０４号（これらはそれぞれその全体として参照により本明細書に加入される）に記載されたように、百日咳毒素遺伝子を変異させて百日咳毒素の触媒サブユニットＳ１の酵素活性を不活化することにより達成され得る。

特定の実施態様において、本発明の抗原のワクチンへの製剤化は、ヒト用量あたり２～５０μｇ、５～４０μｇ、１０～３０μｇ、又は２０～２５μｇの範囲に及ぶ量のＰＴを組み込むことを含む。

特定の実施態様において、本発明の抗原のワクチンへの製剤化は、ヒト用量あたり２～５０μｇ、５～４０μｇ、１０～３０μｇ、又は２０～２５μｇの範囲に及ぶ量のＦＨＡを組み込むことを含む。

特定の実施態様において、本発明の抗原のワクチンへの製剤化は、ヒト用量あたり０．５～１００μｇ、１～５０μｇ、２～２０μｇ、３～３０μｇ、５～２０μｇ、又は６～１０μｇの範囲に及ぶ量のＰＲＮを組み込むことを含む。

特定の実施態様において、ワクチンへと製剤化され得るＦＩＭ２対ＦＩＭ３の質量比、は、約１：３～約３：１、例えば約１：１～約３：１、例えば約１．５：１～約２：１である。特定の実施態様において、本発明の抗原をワクチンへと製剤化することは、ヒト用量あたり１～１００μｇ、例えばヒト用量あたり３～５０μｇ、又は３～３０μｇ、例えば５μｇの範囲に及ぶ量のＦＩＭ２／３を組み込むことを含む。

特定の実施態様において、免疫原性組成物又はワクチンへと製剤化される抗原はさらに、ボルデテラ属種以外の１つ又はそれ以上の病原体由来の抗原とともに製剤化され得る。例えば、特定の実施態様において、製剤は以下の１つ又はそれ以上を含む： 破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型オリゴ糖又は多糖抱合体（Ｈｉｂ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及び／又は不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）。

免疫原性組成物又はワクチンとして製剤化される本発明の抗原は、注射剤として、液剤又は乳剤として製剤化され得る。例えば、本発明のボルデテラ抗原は、抗原と適合性である薬学的に許容しうる賦形剤と混合され得る。このような賦形剤としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。免疫原性組成物及びワクチンは、それらの有効性を増強するための湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、又はアジュバントのような補助物質をさらに含有し得る。

一般的に、リン酸緩衝化食塩水中０．００５～０．５パーセント溶液として使用されるアジュバントと抗原が同時投与される場合、免疫原性は有意に改善され得る。アジュバントは、抗原の免疫原性を増強するが、免疫原性自体は必ずしも必要ではない。アジュバントは、免疫系の細胞への抗原の遅い持続した放出を促進するデポー効果を生じるために投与部位に局所的に近くに抗原を保持することにより作用し得る。アジュバントはまた、免疫系の細胞を抗原デポーに誘引することができ、そしてこのような細胞を刺激して免疫応答を惹起し得る。典型的には、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム（集合的にミョウバンと一般的に呼ばれる）は、本発明のボルデテラ属種培養方法から製造されるワクチンを処方するために使用され得る。

実施例１． 強酸はボルデテラ属種培養からの上清中のＰＲＮ収量を増加する
１００ｘ増殖因子溶液（表４）５ｍＬを含むブロス（改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地、表３）５００ｍＬをそれぞれ入れた２Ｌ振盪フラスコにおいて作業シード（２．５ｍＬ）を播種した。培養物を４４時間インキュベーター振盪機で増殖させ、そして増殖因子溶液（表４）を追加したブロス１１５０ｍＬ（改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地、表３）を入れた２Ｌ発酵器／バイオリアクター（２Ｌ ＢＩＯＳＴＡＴ Ｂ発酵器（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種するために使用した。

培養期間の間、グルタミン酸一ナトリウム及び増殖因子、グルタチオン、硫酸第一鉄、アスコルビン酸、ニコチン酸及びシステインのフィーディングサプリメントを、抗原収量を増加させるためにバイオリアクターに継続的に添加した。サプリメント溶液の添加は、バッチ培養段階の間、初期炭素源の消費後に起こる溶存酸素（ＤＯ）レベルの急な増加及び撹拌の急な減少をきっかけにして開始した。温度（３６℃±２℃）、溶存酸素（３５％）、撹拌（１００～６７５ｒｐｍ）及びｐＨ（７．２）レベルに関して同じ操作条件下でそれぞれバイオリアクターを動作させ、そして継続的にモニタリングして制御した。２．５Ｍリン酸、３．５Ｍ硝酸又は３．５Ｍ塩酸を、各バイオリアクターのｐＨを維持するために使用した。消泡剤を泡制御のために継続的に添加した。培養時間は約４８時間であった。

培養期間の終わりに、ブロスを遠心分離して細胞フラクション及び上清フラクションを得た。各フラクションをＰＲＮについてＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法により検定した。ＰＲＮ、ＰＴ及びＦＨＡ ＥＬＩＳＡ分析のための上清サンプルを、サンプルをＰＲＮについて１／１００と１／２００との間、ＦＨＡについて１／２０と１／４０との間、そしてＰＴについて１／４０の間の希釈倍率で希釈することにより調製した。ＰＲＮ ＥＬＩＳＡのための細胞ペレット可溶化液サンプルを、最終濃度０．５％まで加えたＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び０．２５ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む溶解緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁することにより調製した。サンプル可溶化液をＥＬＩＳＡアッセイのために１／１００希釈した。

上清フラクション中のＰＲＮの相対量を表５（以下）及び図１に示す。２．５Ｍリン酸をｐＨ制御のために３．５Ｍ硝酸又は３．５Ｍ塩酸のような別の溶液で置き換えた場合、バイオリアクター収穫物の上清におけるＰＲＮ収量は約４～５ｍｇ／Ｌから１５～３０ｍｇ／Ｌに増加した。バイオリアクター収穫物からのサンプルのウェスタンブロット法による細胞フラクションに付随し、そして上清中に存在するＰＲＮの相対量の調査は、ＰＲＮ百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全体的な発現は、バイオリアクターｐＨ制御のためにリン酸の酸代替物の使用に応じて実質的に増加しなかったかもしれないが、代わりに、上清中のＰＲＮの増加は、収穫された細胞に付随していた量の減少に相当する（すなわち、細胞から上清中により多く放出された）ということを示していた。

しかしながら、表６は、上清中の他の抗原の収量が２．５Ｍリン酸に対する酸代替物の使用で増加しなかったことを示す。例えば、表６は、２．５Ｍリン酸が使用された場合の収量（３３．２ｍｇ／Ｌ、ＰＴ；１９４．１ｍｇ／Ｌ、ＦＨＡ）と比較して、バイオリアクターｐＨ制御のためにそれぞれ３．５Ｍ硝酸又は３．５Ｍ塩酸を使用した培養後のＥＬＩＳＡにより測定してＰＴ（約１９～２４．５ｍｇ／Ｌ）及びＦＨＡ（約１２０～１２４ｍｇ／Ｌ）のより低い収量を示す。

実施例２． 酸ブレンドはＰＴ及びＦＨＡの損失を軽減しながらボルデテラ属種培養からの上清におけるＰＲＮ及びＦＩＭ２／３の収量を増加する。

硝酸及びリン酸の異なる比での酸ブレンドをバイオリアクターｐＨ制御のために使用した事以外は実施例１について上で記載されたように培養物を製造した。ＰＲＮ、ＰＴ、ＦＨＡ及びＦＩＭ２／３抗原を、抗原製造に対する酸ブレンドの効果を評価するために単離した。培養期間の終わりに、収穫物を遠心分離して細胞フラクション及び上清フラクションを得た。上清フラクションをＥＬＩＳＡによりＰＲＮ、ＰＴ、ＦＨＡ及びＦＩＭ２／３抗原についてアッセイした。細胞ペレットを注射用水（ＷＦＩ）中に再懸濁し、そして８Ｍ尿素で処理して細胞を溶解し、そしてＥＬＩＳＡによる分析のためにＦＩＭ２／３を遊離した。

図２Ａ～２Ｄは、複数回のバイオリアクター実行についてのバイオリアクター収穫物におけるＥＬＩＳＡにより測定した各抗原の収量を示す。図２Ａは、ｐＨ制御のために１００％３．５Ｍ硝酸を含む溶液が２．５Ｍリン酸を含む溶液の代わりに使用された場合に、バイオリアクター収穫物の上清におけるＰＲＮ収量が増加した（４ｍｇ／Ｌから１２～２０ｍｇ／Ｌへ）ということを裏付ける。図２Ｄはまた、上清中のＦＩＭ２／３収量が、１００％３．５Ｍ硝酸を１００％２．５Ｍリン酸の代わりに使用した場合に、約４ｍｇ／Ｌから１２ｍｇ／Ｌに有意に増加したことを実証した。

しかし、図２Ｄはまた、１００％３．５Ｍ硝酸を含む溶液が１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液の代わりにｐＨ制御のために使用される場合、細胞フラクションにおけるＦＩＭ２／３の収量の減少が観察された（約５０％減少）ということを示す。さらに２ｂ～ｃはまた、バイオリアクター収穫物の上清中のＰＴ及びＦＨＡの収量もまた、１００％３．５Ｍ硝酸で有意に減少した、すなわちそれぞれ２１ｍｇ／Ｌから１５ｍｇ／Ｌ及び１９０ｍｇ／Ｌから８０～１２０ｍｇ／Ｌに減少したことを示す。

しかし、バイオリアクターｐＨ制御に使用したブレンド中の硝酸の比が低くなるにつれて、上清フラクションにおけるＰＴ及びＦＨＡの収量並びに細胞フラクションにおけるＦＩＭ２／３の収量の減少が軽減された。図２Ｂ～Ｄを参照のこと。さらに３０～５０％３．５Ｍ硝酸及び７０％～５０％２．５Ｍリン酸では、バイオリアクター収穫物の上清フラクションにおけるＰＲＮ及びＦＩＭ２／３収量に対する改善は、１００％２．５Ｍリン酸のみを含む溶液をｐＨ制御に使用した場合の収量と比較してなお観察された（それぞれ図２Ａ及び２Ｄ、７～１０ｍｇ／Ｌ及び５～９ｍｇ／Ｌ）。

実施例３． 酸ブレンド及び化学的に規定された培地は、ＰＴ及びＦＨＡの損失を軽減しながら、ボルデテラ属種培養からの上清におけるＰＲＮ及びＦＩＭ２／３の収量をさらに増加する。

化学的に規定された培地を複合培地の代わりに使用したこと以外は、実施例１について上で記載されたように培養物を製造した。実施例２に記載されるような様々な比の硝酸及びリン酸のブレンドをバイオリアクターｐＨ制御に使用した。ＰＲＮ、ＰＴ、ＦＨＡ及びＦＩＭ２／３抗原を実施例２について上で記載されたように単離した。

図３は、複数回のバイオリアクター実行についてのバイオリアクター収穫物におけるＥＬＩＳＡにより測定された各抗原の収量を示す。図３Ａ～Ｄはまた、１００％３．５Ｍ硝酸が１００％２．５Ｍリン酸の代わりにｐＨ制御のために称された場合に、バイオリアクター収穫物の上清フラクションにおけるＰＲＮ収量が増加した（５～７ｍｇ／Ｌから１４～２２ｍｇ／Ｌ）ことも裏付ける。さらに、図３はまた、１００％３．５Ｍ硝酸を含む溶液を１００％２．５Ｍリン酸を含む溶液の代わりにｐＨ制御のために使用した場合に上清フラクションにおけるＦＩＭ２／３収量が約４ｍｇ／Ｌから１６ｍｇ／Ｌに有意に増加したことを裏付ける。

さらに、図３は、１００％２．５Ｍリン酸に対して１００％３．５Ｍ硝酸溶液をｐＨ制御に使用した場合に細胞フラクションに付随するＦＩＭ２／３の減少を裏付けた（１０～１４ｍｇ／Ｌから３～６ｍｇ／Ｌまで）。実施例２に同様に示されるように、バイオリアクター収穫物の上清フラクションにおけるＰＴ及びＦＨＡの収量はまた、１００％３．５Ｍ硝酸を用いてそれぞれ約２４～２７ｍｇ／Ｌから１２～１５ｍｇ／Ｌに、そして１４５～２８０ｍｇ／Ｌから８５～１９０ｍｇ／Ｌに有意に減少した。

しかし、バイオリアクターｐＨ制御のために使用されたブレンドにおける硝酸の比率が低くなるにつれて、上清フラクションにおけるＰＴ及びＦＨＡ並びに細胞フラクションにおけるＦＩＭ２／３の収穫収量の減少は軽減された。図３Ｂ～Ｄを参照のこと。さらに、３０～５０％３．５Ｍ硝酸及び７０％～５０％２．５Ｍリン酸では、バイオリアクター収穫物の上清フラクションにおけるＰＲＮ及びＦＩＭ２／３の収量に対する改善は、１００％２．５Ｍリン酸のみを含む溶液をｐＨ制御に使用した場合の収量と比較してなお観察された（図３Ａ及び３Ｄ、それぞれ１０～１５ｍｇ／Ｌ及び８～１２ｍｇ／Ｌ）。

実施例４． 酸ブレンドは、より大規模でのボルデテラ属種培養からの上清におけるＰＲＮ及びＦＩＭ２／３収量を増加する。

硝酸及びリン酸のブレンドの効果が小規模培養の人為的影響ではないことを確実にするために、２０Ｌ及び２００Ｌバイオリアクタースケールの両方で実験を行った。２０Ｌスケールでは、シード増殖を１００ｘ増殖因子溶液（表４）を追加した改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（表３）１００ｍＬを入れた５００ｍＬ振盪フラスコで開始し、そして４４時間培養した。この一次フラスコを、１００ｘ増殖因子溶液（表４）を追加した改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（表３）５００ｍＬを入れた４つの２Ｌフラスコに播種するために使用し、そして４４時間培養した。これらの二次フラスコを使用して、１００ｘ増殖因子溶液（表４）を追加した改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（表３）１１．５Ｌを入れた２０Ｌ ＢＩＯＳＴＡＴ^（Ｒ） Ｃｐｌｕｓバイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ、Ｂｏｈｅｍｉａ、ＮＹ、ＵＳＡ）に播種するために使用した。第一フェーズを振盪フラスコで行った。比較的少量のシード培養物を最初にストック培養物（例えばワーキングシード）からの播種により増殖させ、そしてこれを培養物（例えば、シード培養、発酵培養）を播種するために使用した。

消泡試薬をより高い濃度で使用した事以外は、全ての培養パラメーターを２Ｌフラスコと同様のやり方で同じ試薬を使用して制御した。２０Ｌバイオリアクター実行において、０、４０％、及び１００％（体積／体積）のいずれかの３．５Ｍ硝酸を含有し残りは２．５Ｍリン酸の溶液を使用してｐＨを制御した。

２００Ｌスケールでは、シード増殖を１００ｘ増殖因子溶液（表４）を追加した改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（表３）１００ｍＬを使用して２５０ｍＬ振盪フラスコにおいて開始した。この一次フラスコを使用して、１００ｘ増殖因子溶液（表４）を追加した改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（表３）１Ｌを入れた４Ｌフラスコに播種し、続いて２０Ｌ及び２００Ｌバイオリアクターで継代した。２００Ｌバイオリアクターの作業体積は１６０Ｌである。消泡試薬をより高い濃度で使用した事以外は、全ての培養パラメーターを２Ｌフラスコと同様のやり方で同じ試薬を使用して制御した。２００Ｌバイオリアクター実行において、０及び４０％（体積／体積）のいずれかの７Ｍ硝酸及び残りは５Ｍリン酸を含有する溶液を使用してｐＨを制御した。

図４Ａは、２０Ｌ及び２００Ｌスケールの両方で２Ｌスケールで生じた結果と同様のやり方でｐＨ制御のために使用される硝酸の比率を増加させるにつれて、収穫物上清におけるＰＲＮの収量が増加するということを示す。２０Ｌ及び２００Ｌスケールでのこれらの実験において、ＰＲＮ収量は、１００％２．５Ｍ及び５Ｍリン酸をｐＨ制御に使用した場合５～７ｍｇ／Ｌであり、４０％（体積／体積）３．５Ｍ及び７Ｍ硝酸を、それぞれ残りの２．５ｍ及び５Ｍリン酸とブレンドしてｐＨ制御に使用した場合１１～１３ｍｇ／Ｌに増加し、そして１００％３．５Ｍ硝酸を２０ＬスケールでｐＨ制御に使用した場合に１６ｍｇ／Ｌに増加した。

さらに、図４Ｂは、１００％２．５Ｍリン酸に対して４０％（体積／体積）７Ｍ硝酸及び残りは５Ｍリン酸をｐＨ制御に使用した場合、２００Ｌ収穫物の上清中のＦＩＭ２／３の増加（５．０ｍｇ／Ｌに対して９．９ｍｇ／Ｌ）を裏付けた。

２０００Ｌ製造プロセスからスケールダウンされたバイオリアクター、一次回収及び精製プロセスを使用して２０Ｌ及び２００Ｌスケールの両方で収穫された上清からもＰＲＮを精製し、そして様々な分析方法を使用して特徴づけした。２０Ｌ材料についての表６における要約は、様々な異なる分析方法を使用して特徴づけされた場合の精製されたＰＲＮの品質が、同じスケールでの対照実行（１００％２．５Ｍリン酸）からのＰＲＮ又は２０００Ｌ製造プロセス（これもｐＨ制御に１００％２．５Ｍリン酸を使用する）を使用して製造されたＰＲＮの両方と比較した場合に、酸ブレンド（４０％硝酸／６０％リン酸）を使用した場合、実質的に異なっていなかったことを示す。

１つ又はそれ以上の例となる実施態様が本明細書に記載されたが、当業者には当然のことながら、形態及び詳細における様々な変更が、以下の特許請求の範囲により定義される本発明の概念の精神及び範囲から逸脱することなく、それらに為され得る。

Claims (15)

1. ボルデテラ属種を培養する方法であって、該方法は：
   ボルデテラ属種を液体培地中にて有酸素条件下で培養すること；及び
   該種の培養の間、液体培地のｐＨを維持することを含み、ここで液体培地のｐＨを維持することは：
   該ボルデテラ属種の培養の間にｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために液体培地に第一及び第二の酸を添加することを含み、
   ここで該第一の酸は、硝酸であり、
   ここで該第二の酸は、リン酸であり、
   ここで第一の酸及び第二の酸は溶液状態で混合され、該溶液は、第一の酸を３０％～５０％及び第二の酸を５０％～７０％（％体積／体積）含み、第一の酸の濃度は、３．５Ｍであり、第二の酸の濃度は、２．５Ｍであり、そして
   ここで上記ｐＨ値の所定の範囲は６．０～９．０である、
   上記方法。
2. 該溶液は、第一の酸４０％及び第二の酸６０％（体積／体積）を含む、請求項１に記載の方法。
3. 上記方法は、液体培地からボルデテラ抗原を単離することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. ボルデテラ抗原を単離することは：
   ボルデテラ属種の培養後に液体培地を細胞フラクション及び上清フラクションに分離すること；
   百日咳毒素（ＰＴ）、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）及びパータクチン（ＰＲＮ）の１つ又はそれ以上を上清フラクションから単離すること、並びに
   ２型及び３型線毛を細胞フラクションから単離すること
   を含む、請求項３に記載の方法。
5. 上記方法は、単離された抗原をサブユニットワクチンとして製剤化することを更に含む
   、請求項４に記載の方法。
6. ボルデテラ属種を培養する方法であって、該方法は：
   ボルデテラ属種を有酸素条件下で液体培地中にて培養すること；及び液体培地のｐＨを該種の培養の間維持することを含み、ここで液体培地のｐＨを維持することは：
   該ボルデテラ属種の培養の間ｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために液体培地に硝酸を添加することを含み、
   ここで上記ｐＨ値の所定の範囲は６．０～９．０である、
   上記方法。
7. 上記方法は、液体培地からボルデテラ抗原を単離することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. ボルデテラ抗原を単離することは：
   ボルデテラ属種の培養後に液体培地を細胞フラクション及び上清フラクションに分離すること；
   ボルデテラ抗原を上清フラクションから単離することを含み、ここで単離されたボルデテラ抗原はパータクチンを含む、請求項７に記載の方法。
9. 上記方法は、単離されたボルデテラ抗原をサブユニットワクチンとして製剤化することをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
10. ボルデテラ属種培養からの上清フラクションにおけるボルデテラ線毛性凝集原２及び線毛性凝集原３（ＦＩＭ２／３）の収量を増加させるための方法であって、該方法は：
    ボルデテラ属種を有酸素条件下で液体培地中にて培養すること；
    該種の培養の間、液体培地のｐＨを維持することであって、ここで液体培地のｐＨを維持することは：
    該ボルデテラ属種の培養の間、ｐＨ値の所定の範囲内に液体培地のｐＨを維持するために液体培地に酸を添加することを含み、
    ここで酸は硝酸を含む；
    ボルデテラ属種培養後に液体培地を細胞フラクション及び上清フラクションに分離すること；並びに
    上清フラクションからＦＩＭ２／３を単離すること
    を含み、
    ここで上記ｐＨ値の所定の範囲は６．０～９．０である、
    上記方法。
11. 上記ボルデテラ属種は百日咳菌である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 上記ｐＨ値の所定の範囲は６．８～７．３である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 上記ボルデテラ属種の培養は大規模製造条件下で起こる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 液体培地は化学的に規定された液体培地である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 上記化学的に規定された液体培地は、ジメチル－β－シクロデキストリンを追加されたＳｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地である、請求項１４に記載の方法。

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