CN113151081A

CN113151081A - 一种百日咳鲍特菌培养基及其制备方法

Info

Publication number: CN113151081A
Application number: CN202110429796.2A
Authority: CN
Inventors: 邓继岿; 杨永弘; 王红梅
Original assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Current assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2021-04-21
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明公开了一种百日咳鲍特菌培养基及其制备方法，其中，百日咳鲍特菌培养基包括牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L‑脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠、烟酸、灭菌脱纤维羊血、头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素。本发明提供的百日咳鲍特菌培养基易于配置，且培养百日咳鲍特菌的效果较佳，有利于百日咳鲍特菌的分离和药敏检测等相关研究，为临床上诊断和治疗由其感染引起的急性呼吸道疾病提供条件。

Description

一种百日咳鲍特菌培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及菌落培养技术领域，尤其涉及一种百日咳鲍特菌培养基及其制备方法。

背景技术

百日咳是由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis，BP)感染引起的具有高度传染性的急性呼吸道疾病，是全球范围内导致儿童疾病和死亡的重要原因之一。对百日咳鲍特菌进行培养以及鉴别是诊断和治疗由其感染引起的急性呼吸道疾病的基础。然而，现有技术中缺少能够对百日咳鲍特菌进行有效培养的培养基配方，导致无法对该类菌株进行药敏检测等相关研究。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种百日咳鲍特菌培养基及其培养方法，旨在解决现有技术缺少能够对百日咳鲍特菌进行有效培养的培养基配方的问题。

本发明的技术方案如下：

一种百日咳鲍特菌培养基，其中，包括牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L-脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠、烟酸、灭菌脱纤维羊血、头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素。

所述的百日咳鲍特菌培养基，其中，还包括蒸馏水。

所述的百日咳鲍特菌培养基，其中，所述牛肉浸粉的浓度为10mg/ml，蛋白胨的浓度为10mg/ml、酪蛋白的浓度为5mg/ml、碳粉的浓度为4mg/ml、氯化钠的浓度为5mg/ml、氯化钙的浓度为0.02mg/ml、琼脂粉的浓度为12mg/ml、L-脯氨酸的浓度为0.24mg/ml、淀粉的浓度为10mg/ml、谷氨酸钠的浓度为3.74mg/ml、烟酸的浓度为0.001mg/ml、头孢氨苄的浓度为0.04mg/ml、两性霉素B的浓度为0.004mg/ml、万古霉素的浓度为0.008mg/ml、灭菌脱纤维羊血与蒸馏水的体积比为1:10。

一种百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其中，包括步骤：

将牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L-脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠以及烟酸溶解在蒸馏水中并进行灭菌处理，得到第一混合液；

向所述第一混合液中加入灭菌脱纤维羊血并混合，得到第二混合液；

向所述第二混合液中加入头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素并混合，得到所述百日咳鲍特菌培养基。

所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其中，所述灭菌处理为在115-125℃条件下灭菌10-20min。

所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其中，所述第一混合液的pH值为7.2-7.6。

所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其中，所述百日咳鲍特菌培养基中，牛肉浸粉的浓度为10mg/ml，蛋白胨的浓度为10mg/ml、酪蛋白的浓度为5mg/ml、碳粉的浓度为4mg/ml、氯化钠的浓度为5mg/ml、氯化钙的浓度为0.02mg/ml、琼脂粉的浓度为12mg/ml、L-脯氨酸的浓度为0.24mg/ml、淀粉的浓度为10mg/ml、谷氨酸钠的浓度为3.74mg/ml、烟酸的浓度为0.001mg/ml、头孢氨苄的浓度为0.04mg/ml、两性霉素B的浓度为0.004mg/ml、万古霉素的浓度为0.008mg/ml。

所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其中，所述百日咳鲍特菌培养基中，灭菌脱纤维羊血与蒸馏水的体积比为1:10。

有益效果：本发明提供的百日咳鲍特菌培养基易于配置，且培养百日咳鲍特菌的效果较佳，有利于百日咳鲍特菌的分离和药敏检测等相关研究，为临床上诊断和治疗由其感染引起的急性呼吸道疾病提供条件。

附图说明

图1为本发明提供的一种百日咳鲍特菌培养基的制备方法较佳实施例的流程图。

图2为采用本发明百日咳鲍特菌培养基培养得到的百日咳鲍特菌菌落图。

具体实施方式

本发明提供一种百日咳鲍特菌培养基及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

由于现有技术中缺少能够有效培养百日咳鲍特菌的培养基，基于此，本发明实施例提供了一种百日咳鲍特菌培养基，其包括牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L-脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠、烟酸、灭菌脱纤维羊血、头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素。

在本实施例中，所述烟酸是百日咳鲍特菌生长必需的营养成分；所述碳粉可以吸收培养基中对百日咳鲍特菌生长有害的物质，如有毒脂质以及一些过氧化物等；所述灭菌脱纤维羊血营养丰富，为百日咳鲍特菌生长提供了必须的营养物质；所述头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素的添加均是为了抑制其他非百日咳鲍特菌的生长，其中，头孢氨苄是为了抑制普通革兰阴性杆菌的生长，两性霉素B是为了抑制真菌生长，万古霉素是为了抑制主要的革兰阳性球菌生长。

本实施例提供的百日咳鲍特菌培养基培养百日咳鲍特菌的效果较佳，有利于百日咳鲍特菌的分离和药敏检测等相关研究，为临床上诊断和治疗由其感染引起的急性呼吸道疾病提供条件。

在一些实施方式中，所述百日咳鲍特菌培养基中还包括蒸馏水。

在一些具体的实施方式中，所述百日咳鲍特菌培养基中，牛肉浸粉的浓度为10mg/ml，蛋白胨的浓度为10mg/ml、酪蛋白的浓度为5mg/ml、碳粉的浓度为4mg/ml、氯化钠的浓度为5mg/ml、氯化钙的浓度为0.02mg/ml、琼脂粉的浓度为12mg/ml、L-脯氨酸的浓度为0.24mg/ml、淀粉的浓度为10mg/ml、谷氨酸钠的浓度为3.74mg/ml、烟酸的浓度为0.001mg/ml、头孢氨苄的浓度为0.04mg/ml、两性霉素B的浓度为0.004mg/ml、万古霉素的浓度为0.008mg/ml、灭菌脱纤维羊血与蒸馏水的体积比为1:10。

在一些实施方式中，还提供一种百日咳鲍特菌培养基的制备方法，如图1所示，其包括步骤：

S10、将牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L-脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠以及烟酸溶解在蒸馏水中并进行灭菌处理，得到第一混合液；

S20、向所述第一混合液中加入灭菌脱纤维羊血并混合，得到第二混合液；

S30、向所述第二混合液中加入头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素并混合，得到所述百日咳鲍特菌培养基。

具体来讲，本实施例先配置碳琼脂培养基(即第一混合液)，然后依次向所述碳琼脂培养基中加入灭菌脱纤维羊血以及抗生素，最终制得所述百日咳鲍特菌培养基。本实施例提供的百日咳鲍特菌培养基的制备方法简单易操作，制得的百日咳鲍特菌培养基用于培养百日咳鲍特菌时，其效果较佳，有利于百日咳鲍特菌的分离和药敏检测等相关研究，为临床上诊断和治疗由其感染引起的急性呼吸道疾病提供条件。

在一些实施方式中，所述第一混合液的pH值为7.2-7.6。

在一些实施方式中，所述灭菌处理为在115-125℃条件下灭菌10-20min。

在一些实施方式中，所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法中，牛肉浸粉的浓度为10mg/ml，蛋白胨的浓度为10mg/ml、酪蛋白的浓度为5mg/ml、碳粉的浓度为4mg/ml、氯化钠的浓度为5mg/ml、氯化钙的浓度为0.02mg/ml、琼脂粉的浓度为12mg/ml、L-脯氨酸的浓度为0.24mg/ml、淀粉的浓度为10mg/ml、谷氨酸钠的浓度为3.74mg/ml、烟酸的浓度为0.001mg/ml、头孢氨苄的浓度为0.04mg/ml、两性霉素B的浓度为0.004mg/ml、万古霉素的浓度为0.008mg/ml；所述百日咳鲍特菌培养基中，灭菌脱纤维羊血与蒸馏水的体积比为1:10。

在一些具体的实施方式中，将30g培养基干粉完全溶解于500ml蒸馏水中，121℃高温高压灭菌15分钟，凉至50℃，得到第一混合液，所述培养基干粉包括牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L-脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠以及烟酸；

向所述第一混合液中加入50ml灭菌脱纤维羊血并轻轻混匀，得到第二混合液，备用；

取头孢氨苄(20.0mg)，两性霉素B(2.0mg)，万古霉素(4.0mg)三支抗生素加入到凉却至50℃的第二混合液，轻轻混匀后倾注无菌平皿(7cm或9cm平皿均可，厚度>4mm，6mm为宜)，得到所述百日咳鲍特菌培养基，将所述百日咳鲍特菌培养基置于4-8℃冰箱密封保存，防止水分流失。

下面通过具体实施例对本发明一种百日咳鲍特菌培养基、百日咳鲍特菌的培养、鉴定及结果判断做进一步的解释说明：

实施例1

一种百日咳鲍特菌培养基，其包括牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L-脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠、烟酸、灭菌脱纤维羊血、头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素，其中，牛肉浸粉的浓度为10mg/ml，蛋白胨的浓度为10mg/ml、酪蛋白的浓度为5mg/ml、碳粉的浓度为4mg/ml、氯化钠的浓度为5mg/ml、氯化钙的浓度为0.02mg/ml、琼脂粉的浓度为12mg/ml、L-脯氨酸的浓度为0.24mg/ml、淀粉的浓度为10mg/ml、谷氨酸钠的浓度为3.74mg/ml、烟酸的浓度为0.001mg/ml、头孢氨苄的浓度为0.04mg/ml、两性霉素B的浓度为0.004mg/ml、万古霉素的浓度为0.008mg/ml；所述百日咳鲍特菌培养基中，灭菌脱纤维羊血与蒸馏水的体积比为1:10。

鼻咽拭子采集与接种：

1、固定患儿头部及四肢，将拭子贴鼻孔壁，沿垂直于耳垂方向慢慢转动进入病人一鼻孔内，至鼻腭处(深度约为鼻尖至耳垂距离)，然后边擦拭边旋转慢慢取出；取左右两侧，一支床旁接种至实施例1所述的百日咳鲍特菌培养基中，一支接种于转运培养基，立即送检并35℃普通孵箱(湿度60-70％)孵育。

若不能做到床旁接种，需立即将鼻咽拭子放入转运培养基管内(之前配好待用)送微生物室，普通35℃孵箱孵育3小时后接种至实施例1所述的百日咳鲍特菌培养基内，35℃普通孵箱(湿度60-70％)孵育。

百日咳鲍特菌的培养、鉴定及结果判断：

孵育周期及菌落特点：接种孵育40小时后即开始观测培养平皿中菌落生长情况，每两天观测一次，结果如图2所示，百日咳鲍特菌菌落为细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落。

百日咳鲍特菌鉴定试验：

1、革兰染色：镜下百日咳鲍特菌为革兰阴性、短小的球杆菌。

2、触酶实验：取少许可疑菌落均匀涂于含3％H₂O₂的触酶试剂的玻片上，有气泡产生为阳性。

3、血清凝集实验为确证实验：

实验前准备：0.85％盐水；洁净玻片；接种环；酒精灯或本生灯；明亮光源及黑色背景；计时器。

在玻片上两端各滴1滴盐水(每滴约40ul)，接种环取疑似菌落在盐水中乳化均匀，在其中一个菌落混悬液上滴一滴盐水作为阴性对照，另一个菌落混悬液上滴一滴百日咳鲍特菌抗血清(R30165501)并混匀，轻轻摇动玻片约1分钟后观察在黑色背景下有无细小凝集颗粒，盐水对照无凝集，百日咳鲍特菌抗血清出现凝集即为百日咳鲍特菌。

重复以上操作，但滴加的抗血清更换为副百日咳鲍特菌抗血清(R30165601)，盐水对照无凝集，副百日咳鲍特菌抗血清凝集则为副百日咳鲍特菌；若两次检测操作均未见凝集则为未检出鲍特菌。若百日咳鲍特菌血清凝集反应阳性，副百日咳血清凝集反应阴性，即可判断此菌为百日咳鲍特菌。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种百日咳鲍特菌培养基，其特征在于，包括牛肉浸粉、蛋白胨、酪蛋白、碳粉、氯化钠、氯化钙、琼脂粉、L-脯氨酸、淀粉、谷氨酸钠、烟酸、灭菌脱纤维羊血、头孢氨苄、两性霉素B以及万古霉素。

2.根据权利要求1所述的百日咳鲍特菌培养基，其特征在于，还包括蒸馏水。

3.根据权利要求2所述的百日咳鲍特菌培养基，其特征在于，所述牛肉浸粉的浓度为10mg/ml，蛋白胨的浓度为10mg/ml、酪蛋白的浓度为5mg/ml、碳粉的浓度为4mg/ml、氯化钠的浓度为5mg/ml、氯化钙的浓度为0.02mg/ml、琼脂粉的浓度为12mg/ml、L-脯氨酸的浓度为0.24mg/ml、淀粉的浓度为10mg/ml、谷氨酸钠的浓度为3.74mg/ml、烟酸的浓度为0.001mg/ml、头孢氨苄的浓度为0.04mg/ml、两性霉素B的浓度为0.004mg/ml、万古霉素的浓度为0.008mg/ml、灭菌脱纤维羊血与蒸馏水的体积比为1:10。

4.一种百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其特征在于，包括步骤：

5.根据权利要求4所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其特征在于，所述灭菌处理为在115-125℃条件下灭菌10-20min。

6.根据权利要求4所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其特征在于，所述第一混合液的pH值为7.2-7.6。

7.根据权利要求4所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其特征在于，所述百日咳鲍特菌培养基中，牛肉浸粉的浓度为10mg/ml，蛋白胨的浓度为10mg/ml、酪蛋白的浓度为5mg/ml、碳粉的浓度为4mg/ml、氯化钠的浓度为5mg/ml、氯化钙的浓度为0.02mg/ml、琼脂粉的浓度为12mg/ml、L-脯氨酸的浓度为0.24mg/ml、淀粉的浓度为10mg/ml、谷氨酸钠的浓度为3.74mg/ml、烟酸的浓度为0.001mg/ml、头孢氨苄的浓度为0.04mg/ml、两性霉素B的浓度为0.004mg/ml、万古霉素的浓度为0.008mg/ml。

8.根据权利要求4所述百日咳鲍特菌培养基的制备方法，其特征在于，所述百日咳鲍特菌培养基中，灭菌脱纤维羊血与蒸馏水的体积比为1:10。