CN116333933B - 百日咳杆菌增菌组合物、增菌液及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种百日咳杆菌增菌组合物、增菌液及制备方法和应用。所述百日咳杆菌增菌组合物通过在特定的基础培养基成分中补充金属盐离子，可特效针对广谱来源的百日咳杆菌实现快速增殖生长。另外，促生长因子、杂菌抑制因子的添加进一步地提升了针对百日咳杆菌的广谱增菌效果，且能在快生长杂菌的干扰下，有效分离得到百日咳杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，尤其涉及一种百日咳杆菌增菌组合物、增菌液及制备方法和应用。
背景技术
百日咳是由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)引起的急性呼吸系统传染病，具有高度传染性，人群普遍易感，尤其是婴幼儿。百日咳是全球范围内导致儿童疾病和死亡的重要原因之一。近年来，全球百日咳发病率出现了明显的上升趋势，一些疫苗接种率较高的国家和地区也先后报道百日咳发病率再度升高，局部地区甚至出现了暴发或流行，这也引起了国内外卫生工作者的广泛关注。
百日咳杆菌的分离培养、特异性核酸检测和血清学诊断是诊断百日咳的重要方法，其中细菌的分离培养是确定感染的金标准，同时也是评价疫苗效果、研发新疫苗的必要条件。百日咳杆菌属于革兰氏阴性小杆菌，体外培养营养条件苛刻，属于苛养菌。上世纪初，Bordet和Octave Gengou研发了鲍-金氏(Bordet-Gengou，B-G)培养基。后期研究者继续研发了以木炭琼脂为基础的选择性培养基。由于百日咳生长缓慢，同时标本中耐药菌群的增加导致的选择性培养基的选择性效果减弱，培养基中的抑制剂不能很好抑制杂菌，导致临床工作者很难直接从患者的鼻、咽拭子的标本中分离到百日咳杆菌。
2019年，研究者通过对百日咳患者鼻咽拭子的宏基因组分析，荧光PCR以及培养分析发现，患者拭子标本中菌量较小是导致培养阴性的主要因素(Eur J Clin MicrobiolInfect Dis.2020Mar；39(3):501-507)。因此对标本的增菌培养是更大概率获得百日咳杆菌的有效手段。前期曾经应用的百日咳杆菌液体培养基有两种，分别是鲍-金氏液体培养基(Bordet-Gengou Fluid Medium Base，简称BGFMB)和Stainer and Scholte broth(简称SSB)。BGFMB基础成分单一，主要包括马铃薯浸粉和氯化钠，添加剂有甘油(1％)和脱纤维羊血(15％)；Stainer and Scholte broth的基础成分为L-谷氨酸钠，L-脯氨酸和氨基甲烷，同时添加盐离子成分和坏血酸、谷胱甘肽和硫酸亚铁以及头孢氨苄。目前这两类液体培养液或者运输液都不能很好的抑制标本中杂菌的生长同时促进百日咳的有效增殖，而且前期研究发现，我国部分分离菌株在BGFMB和SSB液体培养基中不能生长。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种百日咳杆菌增菌组合物、增菌液及制备方法和应用。所述百日咳杆菌增菌组合物对百日咳杆菌具有广谱增菌效果，可在初代培养中扩增目标百日咳杆菌的生长，显著提高待测样本中百日咳杆菌检出的灵敏度和特异度，显著提高发病不同时期患者鼻咽拭子标本中百日咳杆菌的检出率。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种百日咳杆菌增菌组合物，包括如下质量份的组成成分：酸水解酪蛋白8-12份、氨基甲烷1-3份、环糊精0.5-1份、乳酸钠0.5-1.5份、氯化钠1-4份、氯化钾0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.2-0.6份、氯化镁0.1-0.3份、氯化钙0.05-0.1份、硫酸亚铁0.01-0.03份、丙酮酸钠0.05-0.1份、焦亚硫酸钠0.05-0.1份。
在本发明中，酸水解酪蛋白、氨基甲烷、环糊精和乳酸钠作为特定的基础培养基成分，为百日咳杆菌的增菌培养提供氮源和碳源；尤其是酸水解酪蛋白、环糊精和乳酸钠的选取，更有利于百日咳杆菌的增菌效果。氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、硫酸亚铁、丙酮酸钠和焦亚硫酸钠为金属盐离子补充剂，可特效针对广谱来源的百日咳杆菌实现快速增殖生长；尤其是丙酮酸钠和焦亚硫酸钠的添加，对百日咳杆菌的增菌有明显促进作用。
在本发明中，所述酸水解酪蛋白的用量为8-12份，优选为10份；所述氨基甲烷的用量为1-3份，优选为2份；所述环糊精的用量为0.5-1份，优选为1份；所述乳酸钠的用量为0.5-1.5份，优选为1份；所述氯化钠的用量为1-4份，优选为4份；所述氯化钾的用量为0.1-0.3份，优选为0.2份；所述磷酸氢二钾的用量为0.2-0.6份，优选为0.6份；所述氯化镁的用量为0.1-0.3份，优选为0.3份；所述氯化钙的用量为0.05-0.1份，优选为0.1份；所述硫酸亚铁的用量为0.01-0.03份，优选为0.03份；所述丙酮酸钠的用量为0.05-0.1份，优选为0.1份；所述焦亚硫酸钠的用量为0.05-0.1份，优选为0.1份。本发明对上述各组分的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。本发明各组分在优选用量情况下，获得的百日咳杆菌增菌组合物对百日咳杆菌的增菌效果表现更佳。
进一步的，本发明所述百日咳杆菌增菌组合物的组成成分优选还包括促生长因子；所述促生长因子优选自血清、谷胱甘肽、复合维生素中的一种或者多种。更优选为血清、谷胱甘肽和复合维生素的组合。其中，所述血清优选为胎牛血清。
在本发明中，所述促生长因子的添加能进一步地提升百日咳杆菌的增殖速率，使其能在初代培养的24h内，实现指数增长。
在本发明中，所述血清的用量优选为30-50份，更优选为30-40份；所述谷胱甘肽的用量优选为0.015-0.3份，更优选为0.3份；所述复合维生素的用量优选为0.006-0.02份，更优选为0.02份。本发明对所述各促生长因子的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明更具体的实施方式中，所述血清选自胎牛血清，可购买自进口的GIBICO(cat#10099044)，TBD(cat#TBD11HT)，HYcolne(cat#2050)或者国产的四季青(cat#1108611)，凯基生物(cat#TN500)等；所述复合维生素可选自如下来源：Solarbio(A8100)，BD(232210)，兰博利德(N4126)，SIGMA(PHR1008)，Biotopped(cat#S0606)等。
进一步的，本发明所述百日咳杆菌增菌组合物的组成成分优选还包括杂菌抑制因子；所述杂菌抑制因子优选自万古霉素、两性霉素B、放线菌酮、头孢氨苄中的一种或者多种。更优选为万古霉素、两性霉素B、放线菌酮和头孢氨苄的组合。
在本发明中，所述杂菌抑制因子可在不影响目标菌株生长的情况下，有效抑制待测样品中杂菌(包括革兰氏阳性菌、真菌等)的生长。
在本发明中，所述万古霉素的用量优选为0.01-0.02份，更优选为0.01份；所述两性霉素B的用量优选为0.008-0.012份，更优选为0.008份；所述放线菌酮的用量优选为0.01-0.02份，更优选为0.02份；所述头孢氨苄的用量优选为0.015-0.02份，更优选为0.02份。本发明对所述各杂菌抑制因子的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。本发明所述杂菌抑制因子针对百日咳杆菌生长缓慢、待测样品中其它杂菌耐药生长快、耐药强等特点，在优选组合和用量的情况下能最大程度的帮助实现百日咳杆菌的分离培养。
本发明所述百日咳杆菌增菌组合物在使用时，能方便地溶解于无菌水中，配制得到百日咳杆菌培养液，以进行百日咳杆菌的初代培养。
第二方面，本发明提供了一种百日咳杆菌增菌液，所述百日咳杆菌增菌液包括所述百日咳杆菌增菌组合物，还包括无菌水。
在本发明中，所述无菌水优选为无菌去离子水或者无菌双蒸水，所述无菌水的质量份优选为950-970份，更优选为940-950份。在所述百日咳杆菌增菌液中，血清的用量按体积百分比计，优选为所述百日咳杆菌增菌液体积的3-5％。
本发明提供的百日咳杆菌增菌液能更方便的配制使用。尤其是在本发明优选方案下得到的百日咳杆菌增菌液，能直接用于百日咳杆菌的初代培养。
第三方面，本发明提供了一种百日咳杆菌增菌液的制备方法，包括如下步骤(1)；或者，包括如下步骤(1)和步骤(2)：
(1)将所需质量份的酸水解酪蛋白、氨基甲烷、环糊精、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、硫酸亚铁、丙酮酸钠、焦亚硫酸钠溶于无菌水中，得到混合溶液；
(2)将所述促生长因子和/或所述杂菌抑制因子加入步骤(1)所述混合溶液中，混匀。
第四方面，本发明提供了所述百日咳杆菌增菌组合物，或者所述百日咳杆菌增菌液，或者所述制备方法制备得到的百日咳杆菌增菌液在非疾病诊断目的的百日咳杆菌分离培养中的应用。
例如，可应用本发明所述百日咳杆菌增菌液，针对待测食品样品进行百日咳杆菌的分离培养。若分离培养得到百日咳杆菌，则能确定待测食品中含有百日咳杆菌，不符合食品安全要求。
第五方面，本发明提供了所述百日咳杆菌增菌组合物，或者所述百日咳杆菌增菌液，或者所述制备方法制备得到的百日咳杆菌增菌液在非疾病诊断目的的百日咳杆菌鉴定中的应用。使用本发明所述日咳杆菌增菌液对待测样品进行培养，在正常培养条件下，若培养14天后仍未出现疑似百日咳杆菌的菌落，则判断该待测样品为百日咳杆菌阴性。
有益效果：
本发明提供了一种百日咳杆菌增菌组合物、增菌液及制备方法和应用。所述百日咳杆菌增菌组合物通过在基础培养基成分中补充金属盐离子，可特效针对广谱来源的百日咳杆菌实现快速增殖生长。另外，促生长因子、杂菌抑制因子的添加进一步地提升了针对百日咳杆菌的广谱增菌效果，且能在快生长杂菌的干扰下，有效分离得到百日咳杆菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1是本发明实施例1中部分菌株在麦氏浊度为1时不同稀释度的百日咳活菌计数结果照片；其中，各编号-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8代表不同稀释梯度的初始菌液，依次为原始菌液的1:1，1:102，1:103，1:104，1:105，1:106，1:107，1:108。
图2是本发明实施例1中两种国际标准菌株在BGFMB中增殖48h的打点计数结果照片。
图3是本发明实施例1中部分菌株在SSB和ICDC-BP中增殖36h的打点计数对比结果照片。
图4是本发明实施例2中SSB液体培养基和ICDC-BP基础培养基在加入杂菌抑制因子后的增殖差异比较结果照片。
图5是本发明实施例3中部分菌株在麦氏浊度为1时，第7个稀释度(1:107)100ul菌悬液的菌落计数结果照片。
图6是本发明实施例3中部分菌株在不同增菌时间的增菌结果照片(左边是ICDC-BP在增菌不同时间增菌效果，右边是SSB不同时间增菌效果)。
图7是本发明实施例3中显示的不同增菌液(红色、绿色为ICDC-BP增菌液，蓝色为SSB增菌液)对不同初始浓度的百日咳杆菌在增菌不同时间的增菌效果。
图8是本发明实施例4中不同组成的增菌液在不同初始浓度情况下，目标菌株增菌后菌落计数的增菌曲线结果图。
图9是本发明实施例5中直接划线选择性培养基的部分结果照片，因快生长杂菌较多，检测结果为阴性。
图10是本发明实施例5中直接划线选择性培养基的个别阳性结果照片，阳性菌落不明显，易忽略。
图11是本发明实施例5中增菌培养后直接涂抹培养的阳性结果照片，平皿菌落经鉴定皆为百日咳杆菌。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了一种命名为ICDC-BP增菌液的百日咳杆菌增菌液，其制备方法如下：
称取酸水解酪蛋白10g、氨基甲烷2g、环糊精1g、乳酸钠1g、氯化钠4g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、氯化镁0.3g、氯化钙0.1g、硫酸亚铁0.03g、丙酮酸钠0.1g、焦亚硫酸钠0.1g，溶于970ml的无菌水中，充分溶解后，121℃高压15min。待液体冷却至45℃-50℃时，加入血清30ml、谷胱甘肽0.3g、复合维生素0.02g。3ml/支分装，4℃冷藏待用。
本实施例应用实验室纯培养菌株对上述制备得到的ICDC-BP增菌液及传统的BGFMB和SSB液体培养基的增菌作用进行比较分析。其中，BGFMB液体培养基选择山东拓普生物工程有限公司产品(cat#M2301B)，按照说明，添加了1％的甘油和15％的去纤维绵羊血，其主要组分为马铃薯浸粉、氯化钠和甘油等。SSB液体培养基选择山东拓普生物工程有限公司的产品(cat#3343B)和该产品说明中对应的添加剂，其主要组分为L-谷氨酸钠，L-脯氨酸，氨基甲烷等。
用于百日咳杆菌增菌分析的实验室纯培养菌株如表1所示。
表1用于百日咳杆菌增菌分析的菌株
其中，序号1菌株9797、序号2菌株1925和序号3菌株ATCC9340均为国际标准菌株，可直接在ATCC购买得到。序号4-20菌株为国内患者分离株，均冻存保藏于在中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。
百日咳杆菌稀释后活菌计数及增菌培养实验如下：
(1)木炭琼脂是目前通用的百日咳的固体培养基，Karmali是难培养病原常用的固体培养基。经前期验证，不同固体培养基(木炭琼脂和Karmali)百日咳纯菌生长状态相差不大，故本实验选用Karmali固体培养基进行复苏培养：将上述验证用的20株百日咳菌株分别接种在适用于难培养菌生长的Karmali(OXOID，CM0935)固体培养基进行菌株的复苏培养，37℃培养24h；
(2)分别收集对数生长期的细菌，将菌体重悬于1ml生理盐水，调菌液麦氏浊度为1；用无菌的生理盐水或者PBS将菌悬液依次进行10倍梯度稀释，稀释至第7-8个梯度，稀释后不同初始菌液浓度依次为原始菌液的1:1，1:102，1:103，1:104，1:105，1:106，1:107，1:108；
(3)以上的每个稀释度，取30ul的菌悬液打点接种于固体培养基(重复打点2次)。液滴吸收后将培养基倒置，放到5％二氧化碳的培养箱中，37℃培养3-4天后进行菌落计数，确定不同稀释度百日咳活菌的数量。
图1展示了部分菌株在麦氏浊度为1时，10倍系列梯度稀释后取30ul打点结果。其中，不同菌株麦氏浊度为1，第7个稀释度的计数结果为3-25个CFU/30ul。
(4)根据活菌打点计数的结果，取第七个稀释度菌悬液30ul(1:107，含3-25个CFU菌量)加到3ml的BGFMB、SSB和ICDC-BP液体培养基中，充分混匀，放到5％二氧化碳的培养箱中，以180rpm/min，37℃摇菌培养36h，取30ul菌液打点接种于固体培养基(重复打点2次)。液滴吸收后将培养基倒置，37℃培养3-4天后进行菌落计数。
图2展示了两种国际标准菌株在BGFMB中增殖48h的打点计数结果(图中A1和A2分别表示ICDC-BP液体培养基中初始菌量分别为100CFU和10-1CFU；B1和B2分别表示BGFMB液体培养基中初始菌量分别为100CFU和10-1CFU；另，为方便增菌后的菌量计数，图中分别对增菌后不同稀释度进行了打点计数；其中，1:100稀释度菌落可数，菌落计数采用2次打点的平均数)。根据图2结果可知：菌株在BGFMB液体培养基中不增殖生长，而在ICDC-BP液体培养基中可以增殖生长。
图3展示了部分菌株在SSB和ICDC-BP中增殖36h的打点计数对比结果(为了方便计数，需要对菌液进行1:10稀释。图3中标注ICDC-BP的两组打点代表了不同的稀释度，下一行是上一行的1:10稀释)。根据图3结果可知：与SSB液体培养基相比，所有菌株在ICDC-BP增菌液中具有显著的增菌效果(只有菌株1和菌株3在SSB中有生长，菌株1只有2个菌落，菌株3在SSB的增菌效果与ICDC-BP比，相差约3个数量级)。
(5)增菌效果的计算：初始的活菌菌量为3-25个CFU/30ul，加入到3ml(3000ul)的增菌液中，混合后计算浓度应为3-25个CFU/3ml(增菌液的初始活菌浓度，约为加入菌液浓度稀释1：100倍的稀释)；增菌后取30ul的菌液进行活菌计数，根据计数结果，计算增菌效果(增菌倍数)。
计算公式如下：
增菌倍数＝(增菌后菌量-加入总菌量)÷加入总菌量。
其中，增菌后菌量按3ml增菌液的总菌量计，增菌后菌量＝每个计数点的菌落数×100倍。加入总菌量约为3-25个CFU，可根据不同菌株加入时实际测算的菌落数确定，亦可直接代入平均数，以14个CFU计。本实施例采取实际测算值计算增菌倍数。
结果如表2所示。
表2三种液体培养基增菌培养效果(增菌倍数)
实施例2
本实施例提供了一种添加有抑菌因子(万古霉素10mg、放线菌酮20mg、两性霉素B8mg、头孢氨苄20mg)的ICDC-BP增菌液，其制备方法如下：
称取酸水解酪蛋白10g、氨基甲烷2g、环糊精1g、乳酸钠1g、氯化钠4g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钾0.6g、氯化镁0.3g、氯化钙0.1g、硫酸亚铁0.03g、丙酮酸钠0.1g、焦亚硫酸钠0.1g，溶于970ml的无菌水中，充分溶解后，121℃高压15min。待液体冷却至45℃-50℃时，加入血清30ml、谷胱甘肽0.3g、复合维生素0.02g、万古霉素10mg、两性霉素B 8mg、放线菌酮20mg、头孢氨苄20mg。3ml/支分装，4℃冷藏待用。
本实施例还将杂菌抑制因子(万古霉素10mg、放线菌酮20mg、两性霉素B 8mg、头孢氨苄20mg)添加至SSB液体培养基(来源同实施例1)中，用于比较分析杂菌抑制因子的添加对不同培养液的增菌效果有何影响。
添加杂菌抑制因子的主要目的是抑制标本中快生长杂菌对于目标菌种的影响，由于菌株在BGFMB液体培养基中没有发现显著增殖，因此本部分只对SSB液体培养基和实施例1所述ICDC-BP基础培养基在加入杂菌抑制因子后的增殖差异进行分析。具体步骤如下：
(1)不同百日咳菌株活菌计数方法：同实施例1，稀释后取第7个稀释度的菌液30ul，加入到掺入杂菌抑制因子组合的两种培养液中培养36h。
(2)添加杂菌抑制因子后，不同培养液的增菌效果分析：同实施例1。
SSB液体培养基和实施例1所述ICDC-BP增菌液在加入杂菌抑制因子后的增殖差异比较结果如图4所示(图4中标注不同菌株在SS液体培养基和ICDC-BP增菌液中增菌36h的两组打点计数结果。图中数字代表不同培养基及培养基中添加的不同浓度的杂菌抑制因子)。由图4可知：即使SSB液体培养基不加杂菌抑制因子，对多数菌株不具有增菌效果。ICDC-BP加入不同浓度、不同种类的杂菌抑制因子，增菌效果有差异。高浓度的抗生素可能抑制百日咳杆菌的增殖。ICDC-BP增菌液加入适宜浓度的杂菌抑制因子仍具有增菌效果。
实施例3
本实施例以实施例1所述ICDC-BP增菌液为实验材料，对不同初始浓度的ICDC-BP增菌液增菌效果进行分析，具体步骤如下：
(1)将不同的百日咳杆菌菌株复苏后接种Karmali固体培养，37℃培养24h；
(2)收集对数生长期的细菌，将菌体重悬于1ml生理盐水，调菌液麦氏浊度为1；用无菌的生理盐水或者PBS将菌悬液依次进行10倍梯度稀释，稀释至第7-8个梯度，稀释后不同初始菌液浓度依次为原始菌液的1:1，1:102，1:103，1:104，1:105，1:106，1:107，1:108。
(3)以上的每个稀释度，取100ul的菌悬液直接涂抹接种于固体培养基，37℃培养3天后进行菌落计数，确定不同稀释度百日咳活菌的数量。
图5为不同菌株麦氏浊度为1时，10倍系列梯度稀释后，第7个稀释度(1:107)100ul菌悬液的菌落计数结果。根据图5可知：第7个稀释度的活菌数量约为5-12个CFU/100ul。
(4)根据活菌打点计数的结果，取第6个和第7个稀释度菌悬液30ul加到3ml的SSB和ICDC-BP液体培养基中，充分混匀，37℃摇菌培养24-48h，取培养不同时间的菌液100ul涂抹接种于固体培养基，37℃培养3-4天后进行菌落计数。
图6为部分菌株在不同增菌时间的增菌结果。根据图6可知：只有ICDC-BP对百日咳具有明显的增菌作用，即使在初始浓度很低(10-1CFU/mL)的情况下，增菌36h后增菌效果仍可达1000倍。
(5)本实施例还依据初始浓度101CFU/mL的SSB增菌液、初始浓度101CFU/mL的ICDC-BP’增菌液和初始浓度100CFU/mL的ICDC-BP增菌液在不同增菌时间的增菌结果，绘制出曲线图，即图7。图7表明：ICDC-BP对百日咳具有明显的增菌作用，SSB无增菌效果。
实施例4
本实施例提供了多种不同组成的ICDC-BP增菌液，具体如条件1-8所示。
条件1：实施例1所述ICDC-BP增菌液，含完整生长因子(血清30ml、谷胱甘肽0.3g、复合维生素0.02g)，无杂菌抑制因子，初始菌浓度100CFU/3ml；
条件2：实施例2所述ICDC-BP增菌液，含完整生长因子(血清30ml、谷胱甘肽0.3g、复合维生素0.02g)，高浓度杂菌抑制因子(万古霉素10mg、放线菌酮20mg、两性霉素B 8mg、头孢氨苄20mg)，初始菌浓度101CFU/3ml；
条件3：实施例1所述ICDC-BP增菌液，初始菌浓度10-1CFU/3ml；
条件4：同实施例1所述ICDC-BP增菌液的区别在于：缺失部分促生长因子(未添加复合维生素)，初始菌浓度100CFU/3ml；
条件5：实施例2所述ICDC-BP增菌液，初始菌浓度100CFU/3ml；
条件6：同实施例1所述ICDC-BP增菌液的区别在于：缺失部分促生长因子(未添加谷胱甘肽)，初始菌浓度10-1CFU/3ml；
条件7：同实施例2所述ICDC-BP增菌液的区别在于：杂菌抑制因子添加量不同(万古霉素10mg、两性霉素B 5mg、放线菌酮10mg、头孢氨苄8mg)，初始菌浓度10-1CFU/3ml；
条件8：同实施例2所述ICDC-BP增菌液的区别在于：缺失部分促生长因子(未添加血清)，初始菌浓度10-1CFU/3ml。
本实施例以国际标准菌株9797，ATCC9340以及临床分离株BJSY2022BRK001为检测菌株，对不同组成的ICDC-BP增菌液效果差异进行分析。具体步骤为：取对数生长期细菌，使用生理盐水调至麦氏浊度为1，10倍系列稀释，取第5，6和7个稀释度菌悬液100ul加入至3ml不同组成的ICDC-BP增菌液中(上述条件1-8)，将不同组成的ICDC-BP增菌液置于37℃培养，每隔24h取20ul菌液进行打点。
不同组成的增菌液在不同初始浓度情况下，目标菌株增菌后菌落计数的增菌曲线结果如图8所示。根据图8可知：
①当菌株的初始浓度为10-1CFU/ml时，各增菌液仍可获得较好的增菌效果；目标菌株的初始浓度增大后(100CFU/ml，101CFU/ml或者更多)，增菌效果更好。
②增菌时间达到24h后，百日咳杆菌增菌效果指数增长。
③完整的促生长因子(血清30ml、谷胱甘肽0.3g、复合维生素0.02g)的添加可有效促进不同初始浓度菌株的增菌；在相同的初始浓度下，条件1所述增菌液的增菌效果优于条件4；条件3所述增菌液的增菌效果优于条件6。
④适宜浓度的杂菌抑制因子不会影响百日咳杆菌增殖生长。
实施例5
本实施例对临床百日咳患者标本进行直接培养与增菌培养分析，具体步骤如下：
(1)标本采集：按照百日咳监测的病例定义，收集某医院疑似百日咳患者鼻咽拭子标本(30份)。将采集好的鼻咽拭子直接浸入装有2ml采集液的试管中反复捻动洗脱拭子，在管壁反复捻压后(保证拭子残留物充分洗脱至采集液中)，将拭子取出。混匀样本用于分离培养检测和或者PCR检测。
(2)ICDC-BP增菌液制备：称取酸水解酪蛋白12g、氨基甲烷2g、环糊精0.5g、乳酸钠0.5g、氯化钠3g、氯化钾0.1g、磷酸氢二钾0.2g、氯化镁0.1g、氯化钙0.05g、硫酸亚铁0.02g、丙酮酸钠0.05g、焦亚硫酸钠0.05g，溶于970ml的无菌水中，充分溶解后，121℃高压15min。待液体冷却至50℃时，加入血清50ml、谷胱甘肽0.2g，复合维生素0.01g、万古霉素15mg、两性霉素B10mg、放线菌酮10mg，头孢氨苄15mg。3ml/支分装，4℃冷藏待用。
(3)检测步骤：
直接划线培养：用10μl取菌环或者棉签，三区划线法接种样本于百日咳选择性培养基。37℃静置培养3-7天，通常培养3天后才会出现疑似单菌落，挑选带有光泽的针尖大小的菌落，14天内仍无疑似菌落生长，则视为培养阴性。培养过程中每天观察，如果看到典型菌落，需进一步分离和鉴定。
ICDC-BP增菌培养：取100ul的样本混合液加入到3ml的ICDC-BP增菌培养液中，充分混匀，放入37℃孵箱内，震荡或者静置培养36h-48h，取出增菌培养物，充分混匀。划线培养或者取100uL的增菌培养物，用无菌涂布棒直接涂布接种于百日咳固体培养基上(Karmali培养基)培养3-7天，通常培养3天后才可出现疑似单菌落，14天内仍无疑似菌落生长，则视为培养阴性。
荧光PCR检测：应用商用的百日咳杆菌荧光PCR检测试剂盒试剂，按照试剂盒的方法，检测所有培养标本。
30份临床样本检测结果参见表3。
表3 30份临床患者标本检测结果
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由表3可知：30份标本中有9份荧光PCR检测阳性，检出率为30％；30份标本直接划线选择性培养基培养结果只有1份为阳性(检出率为3.3％)；30份标本的增菌培养阳性9份，检出率为30％。9份荧光PCR检测阳性标本中有8份增菌培养阳性。1份标本增菌培养阳性，但荧光PCR检测结果为阴性。
部分划线培养及增菌培养菌落特征结果见图9-11。
其中，图9表示直接划线选择性培养基培养结果为阴性，快生长杂菌较多；图10表示直接划线选择性培养基培养结果为阳性，箭头标记菌落为百日咳菌落，不明显且易忽略；图11表示增菌培养后直接涂抹培养的阳性结果，平皿菌落经鉴定皆为百日咳杆菌。说明ICDC-BP增菌液增菌培养可以有效从百日咳患者标本中分离到百日咳杆菌。
百日咳杆菌的分离培养及菌株的获得对于疫苗的应用以及疫苗效果的评价，临床治疗等具有重要的价值。当前临床实验室检测及疾病监测中常用的百日咳杆菌的培养方法主要是包姜氏选择性培养基或者木炭琼脂的选择性培养基直接划线培养法。由于百日咳发病时间迁延，不同发病时间标本中目标菌的菌量差异过大，同时由于百日咳杆菌的生长缓慢(比大肠杆菌、金葡菌等慢10倍多，大肠杆菌生长几个小时的量，百日咳需要4天以上)，培养过程中其它耐药菌群快速生长会掩盖目的菌种的获得。本本发明提供的百日咳杆菌增菌液及其应用方法可在初代培养中扩增目标菌种(百日咳杆菌)的生长，同时抑制杂菌的扩增，与增菌后的固体培养基的交叉性杂菌的抑制作用相结合，能显著提高标本中百日咳杆菌检出的灵敏度和特异度。本发明提供的百日咳杆菌增菌液可以在鼻咽拭子的样本中只有1个菌落的基础上，通过增菌培养后与固体培养(菌落可视化)相结合，提高样本中百日咳的检出限，最低检出限低至100CFU/ml。应用本增菌培养液及增菌培养方法进行百日咳患者鼻咽拭子标本的初代分离培养，其分离培养率与荧光PCR(以多拷贝基因为靶位)的检出率基本一致，显著高于目前常用的选择性培养基的划线培养方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.百日咳杆菌增菌组合物，其特征在于，由如下质量份的组成成分：酸水解酪蛋白8-12份、氨基甲烷1-3份、环糊精0.5-1份、乳酸钠0.5-1.5份、氯化钠1-4份、氯化钾0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.2-0.6份、氯化镁0.1-0.3份、氯化钙0.05-0.1份、硫酸亚铁0.01-0.03份、丙酮酸钠0.05-0.1份、焦亚硫酸钠0.05-0.1份、血清30-50份、谷胱甘肽0.015-0.3份、复合维生素0.006-0.02份、万古霉素0.01-0.02份、两性霉素B 0.008-0.012份、放线菌酮0.01-0.02份和头孢氨苄0.015-0.02份。
2.百日咳杆菌增菌液，其特征在于，所述百日咳杆菌增菌液由权利要求1所述百日咳杆菌增菌组合物和无菌水组成。
3.根据权利要求2所述百日咳杆菌增菌液，其特征在于，在所述百日咳杆菌增菌液中，血清的用量按体积百分比计，为所述百日咳杆菌增菌液体积的3-5%。
4.权利要求2所述百日咳杆菌增菌液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤（1）和步骤（2）：
（1）按质量份数计，将酸水解酪蛋白8-12份、氨基甲烷1-3份、环糊精0.5-1份、乳酸钠0.5-1.5份、氯化钠1-4份、氯化钾0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.2-0.6份、氯化镁0.1-0.3份、氯化钙0.05-0.1份、硫酸亚铁0.01-0.03份、丙酮酸钠0.05-0.1份、焦亚硫酸钠0.05-0.1份溶于无菌水中，得到混合溶液；
（2）将促生长因子和杂菌抑制因子加入步骤（1）所述混合溶液中，混匀；按质量份数计，所述促生长因子为：血清30-50份、谷胱甘肽0.015-0.3份和复合维生素0.006-0.02份；所述杂菌抑制因子为：万古霉素0.01-0.02份、两性霉素B 0.008-0.012份、放线菌酮0.01-0.02份和头孢氨苄0.015-0.02份。
5.权利要求1所述百日咳杆菌增菌组合物，或者权利要求2-3任意一项所述百日咳杆菌增菌液，或者权利要求4所述制备方法制备得到的百日咳杆菌增菌液在非疾病诊断目的的百日咳杆菌分离培养中的应用。
6.权利要求1所述百日咳杆菌增菌组合物，或者权利要求2-3任意一项所述百日咳杆菌增菌液，或者权利要求4所述制备方法制备得到的百日咳杆菌增菌液在非疾病诊断目的的百日咳杆菌鉴定中的应用。
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