WO2016155581A1 - 一种分离纯化的无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种分离纯化的无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌-A群C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法 Download PDF

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WO2016155581A1
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polysaccharide
solution
vaccine
supernatant
culture
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PCT/CN2016/077417
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陈道远
李洪光
吴强
马礼耕
陈元芬
罗力心
李靖
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成都欧林生物科技股份有限公司
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to the field of vaccine production and preparation technology, and particularly relates to a separation and purification process without isolation and purification of a cell-free white-breaking-B-type H. influenzae-type B group meningococcal combination vaccine.
  • the vaccine has played an important role in the prevention and control of these three infectious diseases.
  • DTwP whole-cell vaccination
  • countries such as Japan and the Netherlands had resisted vaccination and discontinuation, resulting in a decline in vaccination rates and the incidence of whooping cough. There was a rebound.
  • most developed countries have adopted a combination of a small cell-free DPT vaccine as a routine immunization vaccine.
  • the acellular pertussis vaccine can be divided into a co-purified vaccine and a purified vaccine in terms of production process.
  • Haemophilus Influenza (Hi) is still the main pathogen causing human invasive diseases, most of which are caused by Haemophi lus Influenza type b (Hib).
  • Hib meningitis ranks first in bacterial meningitis and has the characteristics of high incidence, high mortality and high disability rate. Another characteristic is that the age of onset is small, the infection rate of infants and young children is high, and the age of onset is mainly concentrated below 5 years old. Especially under 2 years old. The world is estimated to cause at least 3 million serious diseases each year, of which about 386,000 deaths have become a major public health problem worldwide.
  • Hib pneumonia plays an important role in childhood infectious diseases, accounting for about 20% of all childhood pneumonia, and is an important cause of death in children with pneumonia in developing countries. In the early 1990s, countries such as Western Europe and the Americas incorporated Hib combined vaccines into routine childhood immunization programs, and the incidence of Hib invasive diseases rapidly decreased or disappeared.
  • the World Health Organization the World Health Organization
  • Hib meningitis accounts for 51.7% of children with purulent meningitis, 84% of whom are children under 2 years old, and Hib pneumonia accounts for 34.3% of children. Therefore, it is necessary to use Hib conjugate vaccine in China. .
  • Epidemic cerebrospinal meningitis is an acute respiratory infection caused by Neisseria meningitidis. For more than 100 years, it has been prevalent or scattered around the world, causing sepsis and meningitis after infection with pathogens. The susceptible population is mainly children, with the highest rate of fulminant deaths, up to 40% to 60%. The incidence rate in every continent of the world is between 1/100,000 and 10/10 million, and the total case fatality rate is 5% ⁇ 15°/. Up to 20% of meningitis patients have neurological sequelae, including impaired intelligence and deafness.
  • Serological classification according to the capsular polysaccharide type can be divided into 13 serotypes, of which group A, group B, and group C account for about 90% of the epidemic group. China had five national epidemic episodes in 1938, 1949, 1959, 1967, and 1977. Among them, the most serious in the spring of 1967, the incidence rate was as high as 403/100,000, and the case fatality rate was 5.49%. In the past 90% of cases in China have been caused by group A pathogens, and now B group or group C disease books sometimes cause meningococcal outbreaks. Since 2003, the incidence of C brains has increased significantly. At present, group A and group C account for more than 50% of all serogroups, and group C still has a tendency to increase further. The most effective way to prevent meningitis is to vaccinate. Since 2007, China has included meningococcal vaccines in national immunization programs and popularized vaccination for school-age children nationwide.
  • Combined vaccines have many advantages over previous monovalent vaccines, such as fewer vaccinations, lowering infant and child trauma; improving the efficiency of national immunization schedules, reducing leakage; higher immunization coverage; lower space storage requirements; It is convenient to add new varieties of vaccines to the immunization schedule in the future. Therefore, in a sense, the combined vaccine represents the future direction of vaccine development in the prevention of infectious diseases.
  • the multi-vaccine based on the cell-free DTP vaccine is a research hotspot in recent years, and the composition of the combined vaccine is also increasing, such as the DTaP/Hib quadruple vaccine; DTaP-IPV/Hib five-link Vaccine; DTaP-IPV-HBV-Hib conjugate vaccine.
  • the object of the present invention is to overcome the disadvantages of the prior art, and provide a method for separating and purifying a cell-free white blood-breaking Haemophilus influenzae-group A C group meningococcal vaccine and a preparation method thereof, the vaccine having It is safe, effective, controllable and resistant to a single needle.
  • the preparation method is simple in operation, convenient in preparation and low in cost, and is suitable for industrial large-scale production.
  • a combination vaccine consisting of a component A and a component B:
  • the component A is a liquid formulation consisting of the following components:
  • Pertussis toxin 5 ⁇ 40 y g; filamentous hemagglutinin: 5 ⁇ 40 yg; pertussis adhesin: 2 ⁇ 10 y g; diphtheria toxoid: 10 ⁇ 25LF; tetanus toxoid: 4 ⁇ 10LF; aluminum hydroxide Og/ml; sodium chloride: 7. 5 ⁇ 9. 5g/L;
  • the component B is a lyophilized preparation which consists of the following components:
  • Group A meningitis polysaccharide conjugate 10 ⁇ 30 ⁇ ⁇ ;
  • Group C meningitis polysaccharide conjugate 10 ⁇ 30 g;
  • Bacillus polysaccharide conjugate 10 ⁇ 30 p g; lactose: 5 ⁇ 20mg.
  • a method for preparing a combination vaccine comprising the steps of:
  • each monovalent vaccine stock solution including a diphtheria toxoid stock solution, a tetanus toxoid stock solution, and a cell-free pertussis vaccine stock solution, wherein the acellular pertussis vaccine stock solution comprises pertussis toxin, filamentous hemagglutinin and pertussis adhesin;
  • the pH is adjusted to 5.8.
  • the solution is prepared by adding the solution of the pertussis toxin, the filamentous hemagglutinin, the pertussis adhesin, the diphtheria toxoid, the diphtheria toxoid, and the tetanus toxoid. ⁇ 7. 2, that is, a cell-free white broken vaccine semi-finished products;
  • each monovalent vaccine stock solution including group A meningococcal conjugate vaccine stock solution, group C meningococcal conjugate vaccine stock solution, Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine stock solution;
  • Preparation of lyophilized preparation Mix group A meningococcal conjugate vaccine, group C meningococcal conjugate vaccine, and type B Haemophilus influenzae conjugate vaccine according to 1: 1 : 1 (w/w), and mix. Add lactose and dilute with water for injection, which is a semi-finished product of AC group meningococcal baculovirus type B combined with Haemophilus influenzae;
  • the semi-finished product of the adsorbed acellular white broken combination vaccine prepared above is divided into a vial or a prefilled syringe, and the semi-finished product of the AC group meningococcal baculovirus type b-type Haemophilus influenzae is divided into a vial for vacuum freeze-drying. Then pack it separately.
  • a component is prepared by the following steps:
  • Diphtheria toxoid stock solution Open diphtheria bacilli, first transfer to the toxin-producing medium seed tube for 1 ⁇ 3 generations, then transfer to the toxin-producing medium to make seed for production; use culture tank liquid culture, the medium adopts improved forest Medium, 34 ⁇ 36 °C After raising the culture for 45 ⁇ 52h, add formaldehyde to sterilize, add ammonium sulfate to precipitate the impurity protein in the culture, and collect the supernatant by centrifugation; the supernatant is concentrated by ultrafiltration, then ammonium sulfate to precipitate and precipitate the diphtheria toxin protein, and the precipitate is collected by centrifugation.
  • Tetanus toxoid stock solution Open the Clostridium tetani, first transfer to the toxin-producing medium seed tube for 1 ⁇ 3 generations, then transfer to the toxigenic medium to prepare the production seeds; The medium is cultured in double sputum, cultured at 34 ⁇ 36 ⁇ for 62 ⁇ 72 hours; after the end of the culture, formaldehyde is added to sterilize, the culture medium is filtered to remove the bacteria, ammonium sulfate is added to precipitate the toxin protein, the precipitate is collected by centrifugation, and the sulfuric acid in the toxin is removed by ultrafiltration. Add formaldehyde to ammonium, detoxify for 30 days at 35 ⁇ 37 °C, say
  • the sterilization filtration is the tetanus toxoid stock solution
  • Acellular pertussis vaccine stock solution Open B. pertussis, inoculate in modified bag-ginger medium or activated carbon semi-integrated medium, culture at 35 ⁇ 37 °C for no more than 48 hours, then inoculate in book CPB medium for two generations.
  • the culture time is 18 to 26 hours per generation, and the expansion culture is carried out to prepare sufficient seed for production, and then inoculated into a fermenter for liquid culture.
  • the medium is cultured in CPB medium at 37 ° C for two days, and cultured at the end of the culture. 0. 01% thimerosal was added for sterilization treatment, and the harvested culture was centrifuged, and the harvested cells and supernatant were centrifuged at 2 to 8 ° C for further purification.
  • A. Isolation and purification of pertussis adhesin The cells were heat-dissipated with 60'C, concentrated by ultrafiltration, applied to Capto adhere column, and buffered with acetic acid buffer to collect the elution group containing pertussis adhesin. The sample is applied to a Capto SP column, and the acetate buffer is used as a mobile phase, and the elution peak is collected by a gradient of sodium chloride, which is a separated and purified pertussis adhesin;
  • the pertussis toxin is detoxified by using glutaraldehyde, filamentous hemagglutinin and pertussis adhesin, and is a cell-free pertussis stock solution after sterilization and filtration;
  • the pH is adjusted to 5.8.
  • the sulphate is added to the sulphate to the sulphate sulphate. ⁇ 7. 2, that is, the semi-finished product of cell-free white broken vaccine.
  • the B component is prepared by the following steps:
  • Group A meningococcal conjugate vaccine stock solution Open group A meningococcal working seed strain, inoculate to the meningitis Semi-integrated medium, temperature 35 ⁇ 37 ° C, cultured for 16 to 24 hours, and then subjected to three-generation expansion culture to prepare seed for production, inoculated into fermenter culture, temperature 35 ⁇ 37 ° C, culture time 6 ⁇ 12 After the hour, add formaldehyde sterilization; centrifuge the culture supernatant to collect the supernatant, then add hexadecanoyltrimethylammonium bromide to a final concentration of 1.0g / L, stir well, let stand overnight, centrifuge to collect polysaccharides, precipitated The polysaccharide was stirred with calcium chloride solution for 3 hours to dissociate the polysaccharide and CTAB.
  • the supernatant was collected by centrifugation, and the supernatant was added with ethanol to a final concentration of 25%.
  • the mixture was allowed to stand overnight at 2 to 8 ° C.
  • the supernatant was collected by centrifugation, and the supernatant was added with ethanol.
  • the concentration is 75 ⁇ 80% at the end.
  • the polysaccharide is precipitated by shaking fully, and allowed to stand for more than 18 hours.
  • the precipitate is collected by centrifugation, and then washed three times with absolute ethanol and acetone. After drying, it is a crude polysaccharide; the crude sugar is dissolved in 10 °/.
  • Group C meningococcal conjugate vaccine stock solution Open group C meningococcal working seed strain, inoculate into semi-integrated culture medium, temperature 35 ⁇ 37 °C, culture for 16 ⁇ 24 hours, then undergo three-generation amplification The seed for production is prepared, inoculated into a fermenter, and the temperature is 35 to 37 ° C. After the culture time is 6 to 12 hours, formaldehyde is added to the sterilization; the sterilized culture solution is centrifuged to collect the supernatant, and then cetyl group is added.
  • Trimethylammonium bromide to a final concentration of 1.0 g / L, stirred well, allowed to stand overnight, centrifuged to collect polysaccharides, and the precipitated polysaccharide was stirred with calcium chloride solution for 3 hours to dissolve the polysaccharide and hexadecanoyltrimethylammonium bromide.
  • Ultrafiltration membrane ultrafiltration was used to remove residual phenol and nucleic acid.
  • the ultrafiltered polysaccharide solution was added with 1 ⁇ 2ol/L NaCl solution to a final NaCl concentration of 0.3 mol/L, and then 95% ethanol was added to a final ethanol concentration of 75% ( v/v), after thoroughly mixing, stand at 2 ⁇ 8 °C overnight, precipitate the refined sugar, collect the precipitate by centrifugation, and then wash it twice with absolute ethanol and acetone, and then dry it to be refined sugar;
  • ultrafiltrate ultrafiltration membrane ultrafiltration to remove cyanogen bromide, which is a polysaccharide derivative
  • the carbodiimide maintains the reaction temperature at 5 ⁇ 3°C, pH 5.7 ⁇ 0.2, reacts for 60 minutes, then adjusts the pH to 6.9 ⁇ 0.1 to terminate the reaction.
  • the trimethylammonium bromide was dissociated, and the supernatant was collected by centrifugation. The supernatant was added with ethanol to a final concentration of 25% (v/v), and allowed to stand overnight at 2 to 8 ° C. The supernatant was collected by centrifugation, and the supernatant was added with ethanol to the end.
  • the concentration is 75 ⁇ 80% (v/v)
  • the polysaccharide is precipitated by shaking well, left to stand overnight, and the precipitate is collected by centrifugation, washed three times with absolute ethanol and acetone, and dried to be a crude polysaccharide; the crude sugar is dissolved in 10 % saturated neutral sodium acetate solution, then press Add chilled phenol solution in a ratio of 1:1 (v/v), mix well by shaking, collect the supernatant by centrifugation, extract 1 ⁇ 3 times until the supernatant is clarified, collect the supernatant, and remove the residual by ultrafiltration membrane ultrafiltration.
  • Phenol and nucleic acid 4ml/L NaCl solution was added to the ultra-filtered polysaccharide solution until the final concentration of NaCl was 0.3mol/L, then 95% ethanol was added to the final concentration of ethanol 75% (v/v), and fully mixed. Allow to stand at ⁇ 8 ° C overnight, precipitate the refined sugar, collect the precipitate by centrifugation, and then wash it twice with absolute ethanol and acetone, and then dry it to be refined sugar;
  • the carbodiimide maintains the reaction temperature at 5 ⁇ 3°C, pH 5.7 ⁇ 0.2, reacts for 60 minutes, then adjusts the pH to 6.9 ⁇ 0.1 to terminate the reaction. After clarification and filtration, 0.15 mol/L sodium chloride solution is used as the super Filtrate, ultrafiltration membrane ultrafiltration to remove carbodiimide, and then condense the polysaccharide protein conjugate solution with S-printed harose 4FF
  • Vaccine preparation Combine group A meningococcal conjugate vaccine, group C meningococcal conjugate vaccine, and Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine solution according to 1:1:1 (w/w), add lactose Diluted with water for injection, which is a semi-finished product of the AC group meningococcal baculovirus type b-Haemophilus influenzae vaccine.
  • the semi-finished product of the adsorbed cell-free DTP vaccine is divided into a vial or a prefilled syringe, 0.5 ml per bottle, and the AC group meningococcal _b-type Haemophilus influenzae combined vaccine semi-finished product is 0.5 ml/bottle. Packed in a vial.
  • the invention has the following advantages:
  • the vaccine of the invention has the characteristics of safe, effective, controllable and one-shot prevention, and the vaccine can prevent pertussis, diphtheria, tetanus, cerebrospinal fluid caused by group C meningococcus Membrane inflammation, meningitis caused by Haemophilus influenzae type b, otitis media and the like, reducing the pain and burden of multiple vaccination of the vaccine;
  • the preparation method of the invention is simple in operation, convenient in preparation, low in cost, and suitable for industrial large-scale production. The present invention will be further described below in conjunction with the embodiments, and the scope of protection of the present invention is not limited to the following.
  • Example 1 A combination vaccine consisting of component A and component B:
  • the component A is a liquid formulation which consists of the following components:
  • Pertussis toxin 5pg; filamentous hemagglutinin: 5yg; pertussis adhesin: 2yg; diphtheria toxoid: 10LF; tetanus toxoid: 4LF; aluminum hydroxide: 1.0mg/ml ; sodium chloride: 7.5g/L;
  • the component B is a lyophilized preparation which consists of the following components:
  • Example 2 A combination vaccine consisting of component A and component B:
  • the component A is a liquid formulation which consists of the following components:
  • Pertussis toxin 40p g ; filamentous hemagglutinin: 40p g ; pertussis adhesin: 10 P g; diphtheria toxoid: 25LF; tetanus toxoid: 10LF; aluminum hydroxide: 2.0mg/ml; sodium chloride: 9.5 g/L;
  • the component B is a lyophilized preparation which consists of the following components:
  • Group A meningitis polysaccharide conjugate 30 g
  • Group C meningitis polysaccharide conjugate 30 g
  • Haemophilus influenzae type B polysaccharide conjugate 30 g
  • lactose 20 mg.
  • Example 3 A combination vaccine consisting of a component A and a component B:
  • the component A is a liquid formulation which consists of the following components:
  • Pertussis toxin 15 P g; filamentous hemagglutinin: 20p g ; pertussis adhesin: 4 g; diphtheria toxoid: 16LF; tetanus toxoid: 5LF; aluminum hydroxide: l.1 ⁇ 2g/ml; sodium chloride: 8.0g/L;
  • the component B is a lyophilized preparation which consists of the following components:
  • Group A meningitis polysaccharide conjugate 16p g
  • Group C meningitis polysaccharide conjugate 18 g
  • Haemophilus influenzae type B polysaccharide conjugate 20 g
  • lactose 10 mg.
  • Example 4 A combination vaccine consisting of component A and component B:
  • the component A is a liquid formulation which consists of the following components:
  • Pertussis toxin 32 P g; filamentous hemagglutinin: 30 pg ; pertussis adhesin: 8 g; diphtheria toxoid: 22LF; tetanus toxoid: 6LF; aluminum hydroxide: 1.8 mg/ml; sodium chloride: 9. Og/L;
  • the component B is a lyophilized preparation which consists of the following components:
  • a meningococcal polysaccharide conjugates 25p g; serogroup C meningococcal polysaccharide conjugate composition: 17 g; B polysaccharide of Haemophilus influenzae type conjugate: 28 P g; Lactose: 15mg.
  • Example 5 A method for preparing a combination vaccine, which comprises the following steps:
  • preparing a monovalent vaccine stock solution comprising a diphtheria toxoid stock solution, a tetanus toxoid stock solution, a cell-free pertussis vaccine stock solution, the acellular pertussis vaccine stock solution comprising pertussis toxin, filamentous hemagglutinin and pertussis adhesin;
  • the A component is prepared by the following steps:
  • Diphtheria toxoid stock solution Open diphtheria bacilli, first transfer to the toxin-producing medium seed tube for 1 ⁇ 3 generations, then transfer to the toxin-producing medium to make seed for production; use culture medium for liquid culture, use medium The modified Lin's medium is cultured at 34 ⁇ 36 °C for 45 ⁇ 52h. After the end of the culture, formaldehyde is added to sterilize. Ammonium sulfate is added to the culture to precipitate the heteroprotein, and the supernatant is collected by centrifugation. The supernatant is concentrated by ultrafiltration and then ammonium sulfate is added.
  • Salting out and precipitating the diphtheria toxin protein collecting the precipitate by centrifugation, dissolving with physiological saline, removing ammonium sulfate from the toxin by ultrafiltration, adding formaldehyde, placing 35 ⁇ 37 ⁇ , detoxification for 30 days, and filtering and filtering is a diphtheria toxoid stock solution;
  • Tetanus toxoid stock solution Open Clostridium tetani, first transfer to the toxin-producing medium seed tube for 1 ⁇ 3 generations, then transfer to the toxigenic medium to produce seed for production; use culture tank liquid The medium is cultured in a double sputum medium, and cultured at 34 to 36 ° C for 62 to 72 hours. After the completion of the culture, formaldehyde is added to the sterilizing solution, and the culture medium is filtered to remove the bacteria, ammonium sulfate is added to precipitate the toxin protein, and the precipitate is collected by centrifugation. After removing the ammonium sulfate from the toxin, add the yeast, and detoxify for 35 days at 35 ⁇ 37 'C. The sterile solution is the tetanus toxoid solution;
  • Acellular pertussis vaccine stock solution Open B. pertussis, inoculate in modified bag-ginger medium or activated carbon semi-integrated medium, culture at 35 ⁇ 37 °C for no more than 48 hours, then inoculate in CPB medium to pass two Generation, each culture time is 18 to 26 hours, and the expansion culture is carried out to prepare sufficient production seeds, and then inoculated into the fermenter for liquid culture.
  • the culture medium is cultured in CPB medium at 37 ° C for two days, after the culture is completed. 0. 01% thimerosal was added to the culture for sterilization treatment, and the harvested culture was centrifuged, and the harvested cells and supernatant were centrifuged at 2 to 8 ° C for further purification.
  • A. Isolation and purification of pertussis adhesin 60 cells are used. C heat release, concentrated by ultrafiltration, applied to Capto adhere column, with acetate buffer as mobile phase, collected the elution component containing pertussis adhesin, and then loaded on Capto SP column, buffered with acetic acid The liquid is a mobile phase, eluted with a gradient of sodium chloride, and the eluted peak is collected, which is a purified and purified pertussis adhesin;
  • the pertussis toxin is detoxified with formic acid using glutaraldehyde, filamentous hemagglutinin and pertussis adhesin, and is a cell-free pertussis stock solution after sterilization filtration;
  • each monovalent vaccine stock solution including group A meningococcal conjugate vaccine stock solution, group C meningococcal conjugate vaccine stock solution, Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine stock solution;
  • the B component is prepared by the following steps:
  • Group A meningococcal conjugate vaccine stock solution Open the group A strain of meningococcal working seeds, inoculate the semi-integrated medium of the meningitis, the temperature is 35 ⁇ 37 °C, culture for 16 ⁇ 24 hours, then after three generations of expansion Increasing the culture, preparing the seed for production, inoculation into the fermenter, the temperature is 35 ⁇ 37 ° C, and adding formaldehyde to the bacteria after 6 to 12 hours in the culture; the supernatant of the sterilized culture liquid is collected by centrifugation, and then added to the ten Hexamethyltrimethylammonium bromide to a final concentration of 1.0 g/L, stirred well, and allowed to stand overnight.
  • the polysaccharide was collected by centrifugation.
  • the precipitated polysaccharide was stirred with calcium chloride solution for 3 hours to dissociate the polysaccharide and CTAB, and the supernatant was collected by centrifugation.
  • the precipitate was collected by centrifugation, and then washed three times with absolute ethanol and acetone, and dried to obtain a crude polysaccharide; the crude sugar was dissolved at 10 ° /.
  • Group C meningococcal conjugate vaccine stock solution Open the group C strain of meningococcal working seeds, inoculate the semi-integrated medium of the meningitis, the temperature is 35 ⁇ 37 °C, culture for 16 ⁇ 24 hours, then three generations Amplification culture, preparation of production seeds, inoculation into fermenter culture, temperature 35 ⁇ 37 ° C, culture time 6 ⁇ 12 hours, then add formaldehyde sterilization; centrifuge the cultured liquid to collect the supernatant, then add sixteen Mercaptotrimethylammonium bromide to a final concentration of 1.0 g / L, stirred well, allowed to stand overnight, centrifuged to collect polysaccharides, and the precipitated polysaccharide was stirred with calcium chloride solution for 3 hours to bromine the polysaccharide and hexadecanolyl trimethylate.
  • the precipitate was collected by centrifugation, and then washed three times with absolute ethanol and acetone, and dried to obtain a crude polysaccharide; the crude sugar was dissolved in a 10% saturated neutral sodium acetate solution, and then added in a ratio of 1:1 (v/v).
  • Phenol solution Vortex and mix, centrifuge to collect the supernatant, extract 1 ⁇ 3 times until the supernatant is clarified, collect the supernatant, remove the residual phenol and nucleic acid by ultrafiltration membrane ultrafiltration, ultrafiltration of polysaccharide solution
  • the precipitate is collected by centrifugation, and then washed twice with absolute ethanol and acetone, respectively, and dried to be refined sugar;
  • a 0.05 mol/L sodium chloride solution is used as an ultrafiltrate, and an ultrafiltration membrane is used for ultrafiltration to remove cyanogen bromide, which is a polysaccharide derivative;
  • the carbodiimide maintains the reaction temperature at 5 ⁇ 3°C, pH 5.7 ⁇ 0.2, reacts for 60 minutes, then adjusts the pH to 6.9 ⁇ 0.1 to terminate the reaction.
  • the supernatant was then added with hexadecanoyltrimethylammonium bromide to a final concentration of 1.0 g/L, stirred well, allowed to stand overnight, and the polysaccharide was collected by centrifugation, and the precipitated polysaccharide was stirred with sodium chloride solution for 3 hours to make polysaccharide and hexahydrate. ⁇ Dissociate the trimethylammonium bromide, collect the supernatant by centrifugation, add ethanol to the final concentration of 25% (v/v), stand at 2 ⁇ 8 °C overnight, collect the supernatant by centrifugation, add the ethanol to the supernatant.
  • the final concentration is 75 ⁇ 80% (v/v), the polysaccharide is precipitated by shaking thoroughly, left to stand overnight, and the precipitate is collected by centrifugation, washed three times with absolute ethanol and acetone, and dried to be a crude polysaccharide; the crude sugar is dissolved in 10% saturated neutral sodium acetate solution, then add cold phenol solution in a ratio of 1:1 (v/v), shake and mix, centrifuge to collect the supernatant, extract 1 ⁇ 3 times until the supernatant is clarified, collect the supernatant Liquid, ultrafiltration membrane ultrafiltration to remove residual phenol and nucleic acid, ultrafiltration of polysaccharide solution was added 4mol / L NaCl solution, to a final NaCl concentration of 0.3mol / L, and then added 95% ethanol to a final concentration of 75 % (v/v), fully mixed and allowed to stand at 2 ⁇ 8 °C overnight, precipitated refined sugar, collected by centrifugation, and then washed twice with absolute ethanol and
  • the carbodiimide maintains the reaction temperature at 5 ⁇ 3°C, pH 5.7 ⁇ 0.2, reacts for 60 minutes, then adjusts the pH to 6.9 ⁇ 0.1 to terminate the reaction.
  • Vaccine preparation Combine group A meningococcal conjugate vaccine, group C meningococcal conjugate vaccine, and Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine solution according to 1:1:1 (w/w), add lactose. Diluted with water for injection, which is a semi-finished product of the AC group meningococcal baculovirus type b-Haemophilus influenzae vaccine.
  • Preparation of lyophilized preparation Mix group A meningococcal conjugate vaccine, group C meningococcal conjugate vaccine, and type B Haemophilus influenzae conjugate vaccine according to 1:1:1 (w/w), and mix. Add lactose and dilute with water for injection, which is a semi-finished product of AC group meningococcal baculovirus type B combined with Haemophilus influenzae;
  • the semi-finished product of the adsorbed cell-free DTP vaccine prepared above is divided into a vial or a prefilled syringe, 0.5 ml per bottle, and the AC group meningococcal phlebemia-type H. influenzae combined vaccine semi-finished product is 0.5 ml/bottle. Packed in a vial for vacuum freeze-drying and then packaged separately.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay should be used to detect PT, FHA, and PRN antigens, and should contain the corresponding antigen (Appendix IX S) in the Chinese Pharmacopoeia 2010 edition of the three-part "Adsorption Baibai Breaking Vaccine".
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • this product should be combined with group A meningococcal immune serum, group c meningococcal immune serum, Haemophilus influenzae type b immune serum and tetanus
  • the toxin immune serum forms a distinct sedimentation line.
  • the lyophilized preparation should be white loose body. According to the labeled amount, it should be quickly reconstituted into a white suspension after the cell-free whitening, and there is no clot or foreign matter.
  • Aluminium hydroxide content should be 1.0 ⁇ 1.5 mg/ml (Chinese Pharmacopoeia 2010 edition three, Appendix VII F). 3.4 Free formaldehyde content: should not be higher than 0.2 g / L (Chinese Pharmacopoeia 2010 edition three, Appendix VI F)
  • Glutaraldehyde content should be less than 0.01 g / L (Chinese Pharmacopoeia 2010 edition three, Appendix VI D).
  • the dose per human dose should be 10 ⁇ 15 g ("Chinese Pharmacopoeia" 2010 edition three appendix stable J).
  • the lactose was removed by ultrafiltration, and the free polysaccharide, group A and group C were determined by cold phenol method.
  • the free polysaccharide content release standard is not higher than 18%, and the effective period is not higher than 20%.
  • the content of Hib free polysaccharide should not be higher than 15%, and the effective period is not higher than 20%.
  • the molecular size of Group A, Group C polysaccharide and Hib polysaccharide was determined using an agarose CL-4B gel column (1.6 cm X 100 cm).
  • the release standard of the polysaccharide recovery rate of the K D value less than 0.20 should be not less than 65%, and the standard should be no less than 60% during the validity period ("Chinese Pharmacopoeia" 2010 edition of the three appendix ring G).
  • the immune titer per human dose should be no less than 4. 0 IU (according to Appendix 2 of the “Chinese Pharmacopoeia” 2010 edition of the “Adsorption Whitening Broken Combined Vaccine”.
  • the immune titer of diphtheria toxoid should be no less than 30 IU per human dose (Chinese Pharmacopoeia 2010 edition three, Appendix XI C)
  • the immunopotency of tetanus toxoid in every human dose should be no less than 40 IU (Chinese Pharmacopoeia 2010 edition three, Appendix XI B)
  • Each batch of vaccine was subcutaneously injected with 10 to 14 g of NIH (or BLAB/c) mice, and 10 mice of the same batch were used as controls, and a sterile PBS solution was injected. On the 1st, 14th and 28th day, subcutaneous injection was performed three times, each dose was 7. 5 ⁇ ⁇ polysaccharide ( ⁇ group, C group, Hib polysaccharide respectively 2.
  • a body weight of 250 ⁇ 350 guinea pigs no less than 4 pieces per batch, and subcutaneously inject 2. 5ml into each abdomen, and inject them on both sides, 1.25ml per side, observe for 30 days.
  • the injection site may be infiltrated and become indurated over 5 to 10 days, possibly not fully absorbed within 30 days.
  • the weight was weighed, and the body weight was increased before the injection. The local no pus, no necrosis, no tetanus, and advanced paralysis were eligible.
  • Toxicity reversal test The test sample shall be placed at 37 °C for four weeks, according to Appendix 2.6 of the “Chinese Pharmacopoeia” 2010 edition of the “Adsorption Cell-Free Baibai Breaking Vaccine”.
  • Bacterial endotoxin test The amount of human agent should be no more than 500EU per 1 time (Chinese Pharmacopoeia 2010 edition three appendix XII E).
  • the dose of human A in each group should be 10 ⁇ 15 ⁇ g 11. 20 14. 26 13. 46 12. 51 Polysaccharide content C group should be 10 ⁇ 15 ⁇ g per human dose 11. 65 13. 80 14. 20 13. 60
  • the dose of Hib should be 10 ⁇ 15 ⁇ g per person. 11. 58 12. 92 13. 05 12. 57
  • Group A is not more than 20% 6% 3% in the period of validity. 4% 4% Free polysaccharides
  • Group C is not more than 20% during the validity period 11% 10% 12% 11%
  • Hib is not higher than 20% 6% 8% 7% 7% during the validity period
  • the recovery rate of the eluate of Group A with a KD value less than 0.20 should be
  • 100% 100% 100% 100% 100% level is higher than Cutoff value, no less than 80% during the validity period
  • 100% 100% 100% 100% 100% level is higher than Cutoff value, no less than 80% during the validity period
  • Test sample A group antibody geometric mean titer is equal dose
  • Sterility inspection Sterile growth Compliance with regulations Compliance with regulations Compliance with regulations Heat source inspections Compliance with regulations Compliance with regulations Compliance with regulations Pertussis vaccine
  • Sex is not higher than 8BWDU/ml
  • Mouse leukocytosis test, leukocytosis toxicity, compliance with regulations, compliance with regulations, specific toxicity test, activity is not higher than 0. 5LPU/ml
  • the activity is not higher than 0. 8HSU/ml

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Abstract

本发明公开了一种联合疫苗及其制备方法，联合疫苗由A组分和B组分组成，A组分为液体制剂，它由百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素、白喉类毒素、破伤风类毒素、氢氧化铝和氯化钠组成；B组分为冻干制剂，它由A群脑膜炎多糖结合物、C群脑膜炎多糖结合物、b型流感嗜血杆菌多糖结合物和乳糖组成。疫苗的制备方法包括制备无细胞百白破疫苗半成品、AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品、分装和包装。

Description

一种分离纯化的无细胞百白破 -b型流感嗜血杆菌 -A群 C群脑 膜炎球菌联合疫苗及其制备方法 技术领域 本发明属于疫苗生产制备技术领域， 具体涉及一种分离纯化的无细胞百白破 _b型流感嗜 血杆菌 -A群 C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法。 说
背景技术 百日咳、 白喉、 破伤风等疾病在我国流行范围广、 危害严重， 及时进行疫苗接种是有效 书
的预防保护性措施。 百日咳、 白喉和破伤风联合疫苗（DTP)作为最早纳入 WHO扩大免疫计划
(EPI ) 的疫苗， 已经在预防和控制这三种传染病方面发挥了重要作用。 20世纪 70年代， 由 于接种全细胞百白破疫苗 （DTwP )后出现了严重的不良反应， 日本及荷兰等国家出现了抵制 疫苗接种及停用的现象， 导致接种率下降， 致使百日咳的发病率出现反弹。 目前， 绝大多数 发达国家均已经采用副反应较小的无细胞百白破疫苗 （DTaP) 为基础的联合疫苗， 作为常规 免疫用疫苗。 无细胞百日咳疫苗从生产工艺来讲可分为共纯化疫苗和分离纯化疫苗。 目前中 国和日本部分企业采用的是共纯化工艺， 即细菌培养后， 盐析沉淀 PT、 FHA等保护性抗原， 然后用蔗糖密度梯度离心去除杂质， 同时收集富含 PT和 FHA的有效成分。分离纯化是采用柱 层析将不同的保护性抗原分别纯化， 然后再将各抗原定量配比成疫苗。 分离纯化法的成本较 高， 但优点是成分明确， 容易进行质量控制， 副作用更小。 目前大多数发达国家均采用柱层 析分离纯化各组份来生产无细胞百日咳疫苗。
流感嗜血杆菌 （Haemophilus Influenza, Hi )迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病 菌， 其中绝大部分由 b型流感嗜血杆菌 (Haemophi lus Influenza type b， Hib) 引起。 Hib 脑膜炎居细菌性脑膜炎的首位， 具有发病率高、 病死率高和致残率高的特点； 其另一个特点 是发病年龄小， 婴幼儿感染率高， 发病年龄主要集中在 5岁以下， 尤其是 2岁以下。 全世界 估计每年至少造成 300万例严重疾病，其中约 38. 6万人死亡， 已成为全球性的一大公共卫生 问题。在发展中国家， Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有重要地位，约占所有儿童肺炎的 20%， 是发展中国家儿童肺炎的重要死亡原因。 上世纪 90年代初，西欧、 美洲等国家将 Hib结合疫 苗纳入常规儿童免疫规划， Hib侵袭性疾病的发病率迅速降低或消失。 目前， 世界卫生组织
(WHO) 正致力于推动将其纳入其它国家的计划免疫程序中。 在我国， 3〜5岁儿童中 Hib自 然感染抗体水平低， 为 Hib感染高危人群。 我国医院临床研究提示， Hib脑膜炎在小儿化脓 性脑膜炎中占 51. 7%,其中 84%为 2岁以下儿童；儿童中 Hib肺炎占 34. 3%，因此我国有使用 Hib 结合疫苗的必要。
流行性脑脊髓膜炎是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌 (Neisseriameningitidis)引起的急性呼 吸道传染病。 一百多年来，一直在世界各地流行或散在发生，感染病原菌后可引起败血症、 脑 膜炎。 易感人群主要为儿童，以暴发型病死率最高，可达 40%〜60%。 当今世界各大洲发病率在 1/10万〜 10/10万，总病死率在 5%〜15°/。， 高达 20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症，包括智 力受损和耳聋等。根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分 13个血清型,其中 A群， B群， C群约 占流行菌群的 90%。我国于 1938年、 1949说年、 1959年、 1967年和 1977年发生过 5次全国性 流脑流行。 其中以 1967年春季最为严重，发病率高达 403/10万，病死率为 5. 49%。 我国过去 90%以上的病例是 A群病菌致病，现在 B群或 C群病菌书有时亦引起流脑暴发。 2003年开始， C群 流脑的发病率明显上升。 目前 A群和 C群共占所有血清群的 50%以上，且 C群仍有进一步增高 的趋势。 目前预防流脑最有效的方法是接种疫苗。我国从 2007年起已将流脑疫苗纳入国家免 疫规划， 在全国范围对适龄儿童普及接种。
目前在全世界可通过免疫接种来预防的疾病已经达三十多种， 其中大部分是针对儿童接 种。 自 1974年 WHO推行扩大免疫计划以来， 疫苗的接种覆盖率得到大大提高， 接种次数也不 断增加。据统计， 儿童入学前需接受预防接种 21次左右， 在未来还会有新的疫苗不断研究和 开发出来， 因此儿童免疫计划表中的疫苗种类也会随之增加。 为了在儿童期有限的时间内减 少接种次数同时又能预防更多疾病， 迫切需要研究开发联合疫苗。
联合疫苗较以往的单价疫苗有很多优势， 如更少的接种次数， 降低婴幼儿创伤； 提高国 家免疫计划表的实施效率， 减少漏种； 更高的免疫覆盖率； 更低的空间存放要求； 便于未来 增加新品种疫苗到免疫计划表中。 因此从某种意义上说， 联合疫苗在预防传染病的作用中代 表了未来疫苗的发展方向。 其中， 以无细胞百白破联合疫苗为基础的多联疫苗是近年来的研 究热点， 联合疫苗中的组成成分也越来越多， 如 DTaP/Hib四联疫苗； DTaP-IPV/Hib五联疫 苗； DTaP-IPV-HBV-Hib六联疫苗。
由于流行病分布的差异， 目前国外还未上市 DTaP-b型流感嗜血杆菌多糖结合物与 A群 C 群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的联合疫苗（简称 DTaP-Hib-AC)。 国内虽然有在研制中的相似 产品百白破 -Hib-AC联合疫苗， 但其仍然采用传统甲醛杀菌工艺制备全细胞百日咳疫苗原液， 副作用较高。 发明内容 本发明的目的在于克服现有技术的缺点， 提供一种分离纯化的无细胞百白破 _b型流感嗜 血杆菌 -A群 C群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法， 该疫苗具有安全、 有效、 可控及一针防 多病的特点， 制备方法操作简单、 制备方便、 成本低， 适宜于工业化大规模生产。
本发明的目的通过以下技术方案来实现： 一种联合疫苗， 它由 A组分和 B组分组成： 所述 A组分为液体制剂， 它由以下组分组成：
百日咳毒素： 5〜40 y g ; 丝状血凝素： 5〜40 y g; 百日咳黏附素： 2〜10 y g ; 白喉类毒 素： 10〜25LF; 破伤风类毒素： 4〜10LF; 氢氧化铝： 1. 0〜2. Omg/ml ; 氯化钠： 7. 5〜9. 5g/L;
说
所述 B组分为冻干制剂， 它由以下组分组成：
A群脑膜炎多糖结合物： 10〜30 μ β ; C群脑膜炎多糖结合物： 10〜30 g; B型流感嗜血 书
杆菌多糖结合物： 10〜30 p g ; 乳糖： 5〜20mg。
一种联合疫苗的制备方法， 它包括以下步骤：
51. 制备各单价疫苗原液： 包括白喉类毒素原液、 破伤风类毒素原液、 无细胞百日咳疫苗原 液， 所述无细胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、 丝状血凝素和百日咳黏附素；
52. 制备液体制剂： 将百日咳毒素、 丝状血凝素、 百日咳黏附素、 白喉类毒素原液、 破伤风 类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内， 调 pH至 5. 8〜7. 2， 即为无细胞百白破疫 苗半成品；
53. 制备各单价疫苗原液： 包括 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原 液、 b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
54. 制备冻干制剂： 将 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 b型流 感嗜血杆菌结合疫苗原液按照 1 : 1 : 1 (w/w)合并混匀， 加入乳糖， 用注射用水稀释， 即为 AC 群脑膜炎球菌 _b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品；
55. 分装和包装
将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射器中， AC 群脑膜炎球菌 _b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品分装于西林瓶中进行真空冷冻干燥后再独立 包装。
进一步地， A组分由以下步骤制备而成：
S1. 制备各单价疫苗原液
S11. 白喉类毒素原液： 开启白喉杆菌， 先在产毒培养基种子管中传 1〜3代， 再转至产 毒培养基制成生产用种子； 采用培养罐液体培养， 培养基采用改良林氏培养基， 34〜36 °C培 养 45〜52h， 培养结束后加入甲醛杀菌， 在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白， 离心收集上清； 上清液超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白， 离心收集沉淀， 加生理盐水溶解， 超滤去除毒素中的硫酸铵， 加入甲醛， 置 35〜37°C， 脱毒 30天， 除菌过滤即为白喉类毒素 原液；
512. 破伤风类毒素原液： 开启破伤风梭状芽孢杆菌， 先在产毒培养基种子管中传 1〜3 代，再转至产毒培养基制成生产用种子；采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基， 34〜 36Ό培养 62〜72小时； 培养结束后加入甲醛杀菌， 培养液经过滤去除菌体， 加入硫酸铵沉淀 毒素蛋白， 离心收集沉淀， 超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛， 置 35〜37 °C脱毒 30天， 说
除菌过滤即为破伤风类毒素原液；
513.无细胞百日咳疫苗原液： 开启百日咳杆菌，接种于改良包 -姜培养基或活性炭半综合 培养基，于 35〜37°C培养不超过 48小时，再接种于书 CPB培养基中传两代，每代培养时间 18〜 26小时， 进行扩增培养以制备足够的生产用种子， 然后接种到发酵罐中液体培养， 培养基采 用 CPB培养基， 37 °C培养两天， 培养结束后在培养物中加入 0. 01%硫柳汞进行杀菌处理， 将 收获的培养物离心， 离心收获的菌体和上清液 2〜8°C保存待下一歩纯化。
A. 百日咳黏附素的分离纯化:将菌体采用 60'C热释放，超滤浓缩后，上样于 Capto adhere 层析柱， 以醋酸缓冲液为流动相， 收集含百日咳黏附素的洗脱组份， 再上样于 Capto SP层析 柱， 以醋酸缓冲液为流动相， 以氯化钠梯度洗脱， 收集洗脱峰， 即为分离纯化的百日咳黏附 素；
B. 百日咳毒素和丝状血凝素的纯化： 将上清液超滤浓缩后上样于 Capto SP层析柱， 流 动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液， 以氯化钠梯度洗脱， 分别收集含百日咳毒素和丝状血凝素 的洗脱组份， 将含百日咳毒素的洗脱组份上样于 CaptoMMC层析柱， 缓冲液釆用 Tris-HCl缓 冲液， 以氯化钠梯度洗脱， 收集百日咳毒素洗脱峰； 将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷 灰石层析柱纯化， 收集洗脱峰；
C. 制备无细胞百日咳原液：将百日咳毒素采用戊二醛、丝状血凝素和百日咳黏附素采用 甲醛进行脱毒， 除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；
S2. 合并及稀释： 将百日咳毒素、 丝状血凝素、 百日咳黏附素、 白喉类毒素原液、 破伤风类 毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内， 调 pH至 5. 8〜7. 2， 即为无细胞百白破疫苗 半成品。
进一步地， B组分由以下步骤制备而成：
S1. 制备各单价疫苗原液
Sl l. A群脑膜炎球菌结合疫苗原液： 开启 A群脑膜炎球菌工作种子批菌种， 接种至流脑 半综合培养基， 温度 35〜37°C， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增培养， 制备生产用种 子， 将其接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲醛杀菌； 将己杀 菌的培养液离心收集上清， 然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后静 置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌 3小时使多糖和 CTAB解离， 离心收集 上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25%， 2〜8°C静置过夜， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终 浓度为 75〜80%， 充分振摇使多糖沉淀， 静置 18小时以上， 离心收集沉淀， 然后用无水乙醇 和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10°/。饱和中性醋酸钠溶液中， 按 1:1 (v/v) 比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 抽提 1〜3次至上清液澄清， 收集 上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚说及核酸， 超滤后的多糖溶液中加入 4mol/L NaCl溶 液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L， 然后加入 95%乙醇至乙醇终浓度为 75% (v/v)， 充分混匀后 2〜8'C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后依书次用无水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥 后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 (w/w) 的比例加入溴化氰溶液， 维持 温度 23±3°C， ρΗ10.8±0.2反应 30分钟进行活化， 活化完成后， 按多糖：己二酰肼 =1： 3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23±3°C， pH8.5±0.2反应 15分钟进行衍 生， 澄清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多 糖衍生物， 按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w) 的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物 溶液中， 按多糖：碳二亚胺 =1:10 (w/w) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温 5±3°C、 pH5.7士 0.2, 反应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化 钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 0D280nm的吸收值， 收集 V0 附近的洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 A群 脑膜炎球菌结合疫苗原液；
S12. C群脑膜炎球菌结合疫苗原液： 开启 C群脑膜炎球菌工作种子批菌种， 接种至流脑 半综合培养基， 温度 35〜37°C， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增培养， 制备生产用种 子， 将其接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲醛杀菌； 将已杀 菌的培养液离心收集上清， 然后加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后静 置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌 3小时使多糖和十六垸基三甲基溴化 铵解离， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25% (v/v)， 2〜8°C静置过夜， 离心收集 上清， 上清加入乙醇至终浓度为 75〜80% (v/v)， 充分振摇使多糖沉淀， 静置 18小时以上， 离心收集沉淀， 然后用无水乙醇和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10% 饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按 1:1 (v/v)比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 抽提 1〜3次至上清液澄清， 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸， 超滤后的 多糖溶液中加入 ½ol/LNaCl溶液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L, 然后加入 95%乙醇至乙醇终 浓度为 75% (v/v)， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后依次用无 水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 (w/w) 的比例加入溴化氰溶液， 维持 温度 23±3'C， ρΗ10.8±0.2反应 30分钟进行活化， 活化完成后， 按多糖：己二酰肼 =1： 3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23±3°C， pH8.5±0.2反应 15分钟进行衍 生， 澄清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶说液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多 糖衍生物；
按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w)的比例计算破伤风类书毒素用量， 加入多糖衍生物溶液中， 按 多糖：碳二亚胺 =1:10 (w/w) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温度 5±3°C、 pH5.7±0.2， 反 应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化钠溶液 为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 Sepharose 4FF凝 胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 0D280nm的吸收值， 收集 V0附近的 洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 C群脑膜炎 球菌结合疫苗原液；
S13. b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液： 开启 b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种， 接种至 Hib综合培养基， 温度 35〜37°C， 5〜8% (¾环境中， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增 培养， 制备生产用种子， 接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲 醛杀菌；将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后静置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钠溶液搅拌 3小时使多糖和十六垸 基三甲基溴化铵解离， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25% (v/v)， 2〜8°C静置过 夜， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 75〜80% (v/v)， 充分振摇使多糖沉淀， 静置 过夜， 离心收集沉淀， 用无水乙醇和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10% 饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按 1:1 (v/v)比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 抽提 1〜3次至上清液澄清， 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸， 超滤后的 多糖溶液中加入 4mol/LNaCl溶液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L, 然后加入 95%乙醇至乙醇终 浓度为 75% (v/v)， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后依次用无 水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 (w/V)的比例加入溴化氰溶液，维持温 度 23±3°C， ρΗΙΟ.8 ±0.2反应 30分钟进行活化，活化完成后，按多糖：己二酰肼 =1:3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23±3°C， pH8.5±0.2反应 15分钟进行衍生， 澄 清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多糖衍生 物；
按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w)的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物溶液中， 按 多糖：碳二亚胺 =1:10 (w/w) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温度 5±3°C、 pH5.7±0.2， 反 应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化钠溶液 为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 S印 harose 4FF凝 说
胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 0D280nm的吸收值， 收集 V0附近的 洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 b型流感嗜 血杆菌结合疫苗原液。 书
S2. 疫苗配制： 将 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 b型流 感嗜血杆菌结合疫苗原液按照 1:1:1 (w/w)合并混匀， 加入乳糖， 用注射用水稀释， 即为 AC 群脑膜炎球菌 _b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品。
进一步地， 吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射器中， 每瓶 0.5ml， AC群脑膜炎球菌 _b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品按照 0.5ml/瓶分装于西林瓶中。
本发明具有以下优点： 本发明的疫苗具有安全、 有效、 可控及一针防多病的特点， 接种 一种疫苗可预防百日咳、 白喉、 破伤风、 由 、 C群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、 b型流感 嗜血杆菌引起的脑膜炎， 中耳炎等疾病， 减少了疫苗多次接种的痛苦与负担； 本发明的制备 方法操作简单、 制备方便、 成本低， 适宜于工业化大规模生产。 具体实 下面结合实施例对本发明做进一步的描述， 本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例 1: 一种联合疫苗， 它由 A组分和 B组分组成：
所述 A组分为液体制剂， 它由以下组分组成：
百日咳毒素： 5pg; 丝状血凝素： 5yg; 百日咳黏附素： 2yg; 白喉类毒素： 10LF; 破 伤风类毒素： 4LF; 氢氧化铝： 1.0mg/ml; 氯化钠： 7.5g/L;
所述 B组分为冻干制剂， 它由以下组分组成：
A群脑膜炎多糖结合物： lOpg; C群脑膜炎多糖结合物： 10 g; B型流感嗜血杆菌多糖 结合物： 10 g; 乳糖： 5mg。
将 A组分分装于 A瓶， B组分分装于 B瓶， A瓶和 B瓶均每瓶 0.5ml， 使用前将 A瓶和 B瓶混匀后， 用于肌内注射。
实施例 2: —种联合疫苗， 它由 A组分和 B组分组成：
所述 A组分为液体制剂， 它由以下组分组成：
百日咳毒素： 40p g; 丝状血凝素： 40p g; 百日咳黏附素： 10 P g; 白喉类毒素： 25LF; 破伤风类毒素： 10LF; 氢氧化铝： 2.0mg/ml; 氯化钠： 9.5g/L;
所述 B组分为冻干制剂， 它由以下组分组成：
A群脑膜炎多糖结合物： 30 g; C群脑膜炎多糖结合物： 30 g; B型流感嗜血杆菌多糖 结合物： 30 g; 乳糖： 20mg。
说
将 A组分分装于 A瓶， B组分分装于 B瓶， A瓶和 B瓶均每瓶 0.5ml， 使用前将 A瓶和 B瓶混匀后， 用于肌内注射。
实施例 3: —种联合疫苗， 它由 A组分和 B组分组成书：
所述 A组分为液体制剂， 它由以下组分组成：
百日咳毒素： 15 P g; 丝状血凝素： 20p g; 百日咳黏附素： 4 g; 白喉类毒素： 16LF; 破伤风类毒素： 5LF; 氢氧化铝： l.½g/ml; 氯化钠： 8.0g/L;
所述 B组分为冻干制剂， 它由以下组分组成：
A群脑膜炎多糖结合物： 16p g; C群脑膜炎多糖结合物： 18 g; B型流感嗜血杆菌多糖 结合物： 20 g; 乳糖： 10mg。
将 A组分分装于 A瓶， B组分分装于 B瓶， A瓶和 B瓶均每瓶 0.5ml， 使用前将 A瓶和 B瓶混匀后， 用于肌内注射。
实施例 4: 一种联合疫苗， 它由 A组分和 B组分组成：
所述 A组分为液体制剂， 它由以下组分组成：
百日咳毒素： 32 P g; 丝状血凝素： 30pg; 百日咳黏附素： 8 g; 白喉类毒素： 22LF; 破伤风类毒素： 6LF; 氢氧化铝： 1.8mg/ml; 氯化钠： 9. Og/L;
所述 B组分为冻干制剂， 它由以下组分组成：
A群脑膜炎多糖结合物： 25p g; C群脑膜炎多糖结合物： 17 g; B型流感嗜血杆菌多糖 结合物： 28 P g; 乳糖： 15mg。
将 A组分分装于 A瓶， B组分分装于 B瓶， A瓶和 B瓶均每瓶 0.5ml， 使用前将 A瓶和 B瓶混匀后， 用于肌内注射。
实施例 5: —种联合疫苗的制备方法， 它包括以下步骤：
S1. 制备各单价疫苗原液： 包括白喉类毒素原液、 破伤风类毒素原液、 无细胞百日咳疫苗原 液， 所述无细胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、 丝状血凝素和百日咳黏附素； A组分由以下步骤制备而成：
1. 制备各单价疫苗原液
(1) . 白喉类毒素原液： 开启白喉杆菌， 先在产毒培养基种子管中传 1〜3代， 再转至产 毒培养基制成生产用种子； 采用培养罐液体培养， 培养基采用改良林氏培养基， 34〜36 °C培 养 45〜52h， 培养结束后加入甲醛杀菌， 在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白， 离心收集上清； 上清液超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白， 离心收集沉淀， 加生理盐水溶解， 超滤去除毒素中的硫酸铵， 加入甲醛， 置 35〜37Ό， 脱毒 30天， 除菌过滤即为白喉类毒素 原液；
说
(2) . 破伤风类毒素原液： 开启破伤风梭状芽孢杆菌， 先在产毒培养基种子管中传 1〜3 代，再转至产毒培养基制成生产用种子；采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基， 34〜 36°C培养 62〜72小时； 培养结束后加入甲醛杀菌， 培书养液经过滤去除菌体， 加入硫酸铵沉淀 毒素蛋白， 离心收集沉淀， 超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲酵， 置 35〜37 'C脱毒 30天， 除菌过滤即为破伤风类毒素原液；
(3) . 无细胞百日咳疫苗原液： 开启百日咳杆菌， 接种于改良包-姜培养基或活性炭半综 合培养基， 于 35〜37°C培养不超过 48小时， 再接种于 CPB培养基中传两代， 每代培养时间 18〜26小时， 进行扩增培养以制备足够的生产用种子， 然后接种到发酵罐中液体培养， 培养 基采用 CPB培养基， 37 °C培养两天， 培养结束后在培养物中加入 0. 01%硫柳汞进行杀菌处理， 将收获的培养物离心， 离心收获的菌体和上清液 2〜8 °C保存待下一步纯化。
A. 百日咳黏附素的分离纯化:将菌体采用 60。C热释放，超滤浓缩后，上样于 Capto adhere 层析柱， 以醋酸缓冲液为流动相， 收集含百日咳黏附素的洗脱组份， 再上样于 Capto SP层析 柱， 以醋酸缓冲液为流动相， 以氯化钠梯度洗脱， 收集洗脱峰， 即为分离纯化的百日咳黏附 素；
B. 百日咳毒素和丝状血凝素的纯化： 将上清液超滤浓缩后上样于 Capto SP层析柱， 流 动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液， 以氯化钠梯度洗脱， 分别收集含百日咳毒素和丝状血凝素 的洗脱组份， 将含百日咳毒素的洗脱组份上样于 CaptoMMC层析柱， 缓冲液采用 Tri s-HCl缓 冲液， 以氯化钠梯度洗脱， 收集百日咳毒素洗脱峰； 将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷 灰石层析柱纯化， 收集洗脱峰；
C. 制备无细胞百日咳原液：将百日咳毒素采用戊二醛、丝状血凝素和百日咳黏附素采用 甲酸进行脱毒， 除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；
S2. 合并及稀释： 将百日咳毒素、 丝状血凝素、 百日咳黏附素、 白喉类毒素原液、 破伤风类 毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内， 调 PH至 5. 8〜7. 2， 即为无细胞百白破疫苗 半成品。
52. 制备液体制剂： 将百日咳毒素、 丝状血凝素、 百日咳黏附素、 白喉类毒素原液、 破伤风 类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内， 调 pH至 5.8〜7.2， 即为无细胞百白破疫 苗半成品；
53. 制备各单价疫苗原液： 包括 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原 液、 b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
B组分由以下步骤制备而成：
1. 制备各单价疫苗原液
说
(1) A群脑膜炎球菌结合疫苗原液： 开启 A群脑膜炎球菌工作种子批菌种， 接种至流脑 半综合培养基， 温度 35〜37°C， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增培养， 制备生产用种 子， 将其接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时书间 6〜12小时后加入甲醛杀菌； 将己杀 菌的培养液离心收集上清， 然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后静 置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌 3小时使多糖和 CTAB解离， 离心收集 上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25%， 2〜8°C静置过夜， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终 浓度为 75〜80%， 充分振摇使多糖沉淀， 静置 18小时以上， 离心收集沉淀， 然后用无水乙醇 和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10°/。饱和中性醋酸钠溶液中， 按 1:1 (v/v) 比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 抽提 1〜3次至上清液澄清， 收集 上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸， 超滤后的多糖溶液中加入 4mol/L NaCl溶 液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L， 然后加入 95%乙醇至乙醇终浓度为 75% (v/v)， 充分混匀后 2〜8'C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后依次用无水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥 后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 (w/w) 的比例加入溴化氰溶液， 维持 温度 23±3°C， ρΗ10.8±0.2反应 30分钟进行活化， 活化完成后， 按多糖：己二酰肼 =1： 3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23±3°C， pH8.5±0.2反应 15分钟进行衍 生， 澄清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多 糖衍生物， 按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w) 的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物 溶液中， 按多糖：碳二亚胺 =1:10 (w/w) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温 5±3°C、 pH5.7士 0.2, 反应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化 钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 0D280nm的吸收值， 收集 V0 附近的洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 A群 脑膜炎球菌结合疫苗原液；
(2) . C群脑膜炎球菌结合疫苗原液： 开启 C群脑膜炎球菌工作种子批菌种， 接种至流脑 半综合培养基， 温度 35〜37°C， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增培养， 制备生产用种 子， 将其接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲醛杀菌； 将已杀 菌的培养液离心收集上清， 然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后静 置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌 3小时使多糖和十六垸基三甲基溴化 铵解离， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25% (v/v)， 2〜8°C静置过夜， 离心收集 上清， 上清加入乙醇至终浓度为 75〜80°/。（v/v)， 充分振摇使多糖沉淀， 静置 18小时以上， 说
离心收集沉淀， 然后用无水乙醇和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10% 饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按 1:1 (v/v)比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 抽提 1〜3次至上清液澄清， 收集上清液， 用超滤膜包书超滤去除残余的苯酚及核酸， 超滤后的 多糖溶液中加入 ½ol/LNaCl溶液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L, 然后加入 95%乙醇至乙醇终 浓度为 75% (v/v)， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后依次用无 水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 (w/w) 的比例加入溴化氰溶液， 维持 温度 23±3°C， ρΗ10.8±0.2反应 30分钟进行活化， 活化完成后， 按多糖：己二酰肼 =1： 3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23±3°C， pH8.5±0.2反应 15分钟进行衍 生， 澄清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多 糖衍生物；
按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w)的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物溶液中， 按 多糖：碳二亚胺 =1:10 (w/w) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温度 5±3°C、 pH5.7±0.2， 反 应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化钠溶液 为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 Sepharose 4FF凝 胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 0D280nm的吸收值， 收集 V0附近的 洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 C群脑膜炎 球菌结合疫苗原液；
(3) . b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液： 开启 b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种， 接种至 Hib综合培养基， 温度 35〜37°C， 5〜8% (¾环境中， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增 培养， 制备生产用种子， 接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲 醛杀菌；将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后静置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钠溶液搅拌 3小时使多糖和十六垸 基三甲基溴化铵解离， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25% (v/v)， 2〜8°C静置过 夜， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 75〜80% (v/v)， 充分振摇使多糖沉淀， 静置 过夜， 离心收集沉淀， 用无水乙醇和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10% 饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按 1:1 (v/v)比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 抽提 1〜3次至上清液澄清， 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸， 超滤后的 多糖溶液中加入 4mol/LNaCl溶液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L, 然后加入 95%乙醇至乙醇终 浓度为 75% (v/v)， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后依次用无 水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精糖；
说
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 (w/w)的比例加入溴化氰溶液，维持温 度 23±3°C， ρΗΙΟ.8 ±0.2反应 30分钟进行活化，活化完成后，按多糖：己二酰肼 =1:3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23±3°C，书 pH8.5±0.2反应 15分钟进行衍生， 澄 清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多糖衍生 物；
按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w)的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物溶液中， 按 多糖：碳二亚胺 =1:10 (w/w) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温度 5±3°C、 pH5.7±0.2， 反 应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化钠溶液 为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 S印 harose 4FF凝 胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 0D280nm的吸收值， 收集 V0附近的 洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 b型流感嗜 血杆菌结合疫苗原液。
2. 疫苗配制： 将 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 b型流 感嗜血杆菌结合疫苗原液按照 1:1:1 (w/w)合并混匀， 加入乳糖， 用注射用水稀释， 即为 AC 群脑膜炎球菌 _b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品。
54. 制备冻干制剂： 将 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 b型流 感嗜血杆菌结合疫苗原液按照 1:1:1 (w/w)合并混匀， 加入乳糖， 用注射用水稀释， 即为 AC 群脑膜炎球菌 _b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品；
55. 分装和包装
将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射器中， 每 瓶 0.5ml, AC群脑膜炎球菌 _b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品按照 0.5ml/瓶分装于西林瓶中 进行真空冷冻干燥后再独立包装。
实施例 6: 成品检定 1 鉴别试验
采用酶联免疫法检测 PT、 FHA、 PRN抗原， 应含有相应抗原 （ 《中国药典》 2010版三部 "吸附百白破联合疫苗"中附录 IX S) 。 采用絮状试验 （ 《中国药典》 2010版三部 "吸附百 白破联合疫苗" 中附录 XI DS) ， 本品应与白喉抗毒素、 破伤风抗毒素出现絮状反应。 采用 免疫双扩散法 （《中国药典》 2010年版三部附录 W C), 本品应与 A群脑膜炎球菌免疫血清、 c群脑膜炎球菌免疫血清、 b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀 线。
2物理检查
2.1 外观： 冻干制剂应为白色疏松体说， 按标示量加入吸附无细胞百白破后应迅速复溶为 白色混悬液， 无摇不散的凝块或异物。
2.2装量： 依法检査 （ 《中国药典》 2010版三部书， 附录 IA) ， 应不低于标示量。
3化学检査
3.1 pH值： 应为 5.8〜7.2
3.2 氯化钠含量： 应为 7·5〜9·5 g/L (《中国药典》 2010版三部， 附录 VII G)。
3.3 氢氧化铝含量： 应为 1.0〜1.5 mg/ml (《中国药典》 2010版三部， 附录 VII F)。 3.4游离甲醛含量： 应不高于 0.2 g/L(《中国药典》 2010版三部， 附录 VI F)
3.5 戊二醛含量： 应小于 0.01 g/L (《中国药典》 2010版三部， 附录 VI D)。
3.6 水分： 应不高于 3.0% (《中国药典》 2010版三部， 附录 VII D)。
3.7 多糖含量
按标示量用纯化水复溶后， 取 10ml超滤去乳糖后， 用容量瓶定容至 10ml。
取处理后的溶液， 以 D核糖为对照， 按核糖含量计算供试品中 Hib多糖含量， 每 1次人 用剂量应为 10〜15 g(《中国药典》 2010年版三部附录穩 J)。
取处理后的溶液， 测定其中总磷含量 （《中国药典》 2010年版三部附录 VII Α), 将 Hib多 糖含量按比例（Hib多糖含量： 磷含量为 11.40:1)计算出 Hib多糖中磷含量， 再将总磷含量 减去 Hib多糖中磷含量， 得到 A群多糖磷含量， 按比例（A群多糖含量： 磷含量为 1000: 80) 计算出 A群多糖含量， 每 1次人用剂量应为 10〜15 μ g。
取处理后的溶液， 测定 C群多糖 N-乙酰神经氨酸含量 （《中国药典》 2010年版三部附录 VI C) ，再根据比例 （C群多糖含量： N-乙酰神经氨酸含量为 1000: 800) 计算出 C群多糖含 量， 每 1次人用剂量应为 10〜15μ g
3.8游离多糖含量
按标示量用纯化水复溶后， 采用超滤去除乳糖， 再用冷酚法测定游离多糖， A群和 C群 的游离多糖含量放行标准为不高于 18%，有效期内不高于 20%。Hib游离多糖含量应不高于 15%， 有效期内不高于 20%。
3. 9多糖分子大小测定
用纯化水复溶后， 采用琼脂糖 CL-4B凝胶柱（1. 6cmX 100cm)测定 A群、 C群多糖和 Hib 多糖的分子大小。 KD值小于 0. 20的洗脱液多糖回收率放行标准均应不低于 65%， 有效期内标 准均应不低于 60% (《中国药典》 2010年版三部附录環 G)。
4. 效价测定
4. 1无细胞百日咳疫苗
说
每 1次人用剂量中的免疫效价应不低于 4. 0IU (按 《中国药典》 2010版三部 "吸附百白 破联合疫苗" 中附录 2进行。
4. 2 白喉疫苗 书
每 1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于 30IU ( 《中国药典》 2010版三部， 附 录 XI C)
4. 3 破伤风疫苗
每 1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于 40IU ( 《中国药典》 2010版三部， 附录 XI B)
5. 效力试验
每批疫苗皮下注射体重 12〜14g NIH (或 BLAB/c ) 小鼠 10只， 另取同批小鼠 10只作为 对照， 注射灭菌 PBS溶液。于第 1、 14和 28天皮下注射三次， 每次注射剂量为含 7. 5μβ多糖 (Α群、 C群、 Hib多糖分别为 2. 5με) 的 Α群 C群脑膜炎球菌 -b型流感嗜血杆菌 （结合） 联 合疫苗， 于第 35〜42天经眼眶后静脉采血， 分离血清； 以 ELISA法测定抗 A群和抗 C群脑膜 炎球菌多糖 IgG抗体， 以灭菌 PBS溶液对照组小鼠血清的 A值求出 Cutoff值， 放行标准为 供试品组应有 90%以上小鼠的血清抗 Hib、 抗 A群和抗 C群脑膜炎球菌多糖 IgG抗体水平高 于 Cuttoff值， 有效期内标准不低于 80%。 A群 C群多糖抗体几何平均滴度 （GMT) 为等剂量 A群和 C群脑膜炎球菌多糖对照组的 8倍以上为合格。
6. 无菌检査： 依法检査 （ 《中国药典》 2010版三部， 附录 XII A) ，应符合规定。
7. 热原检査
依法检査（《中国药典》 2010年版三部附录 ΧΠ D),注射剂量按家兔体重每 1kg注射 3. (^g 多糖 （分别含 A群多糖 1. 0με， 含 C群多糖 1. 0μ ， Hib多糖 1. (^g) 应符合规定。
8特异性毒性检查
8. 1 无细胞百日咳疫苗 按《中国药典》 2010版三部 "吸附无细胞百白破联合疫苗"附录 2. 5项进行。
8. 2 白喉、 破伤风疫苗
用体重 250〜350豚鼠， 每批制品不少于 4只， 每只腹部皮下注射 2. 5ml， 分两侧注射， 每侧 1. 25ml， 观察 30天。注射部位可有浸润， 经 5〜10天变成硬结， 可能 30天不完全吸收。 在第 10、 第 20、 第 30天称体重， 到期体重比注射前增加， 局部无化脓、 无坏死、 无破伤风 及晚期麻痹症者为合格。
9.毒性逆转试验： 供试品置 37°C四周， 按 《中国药典》 2010版三部 "吸附无细胞百白 破联合疫苗" 附录 2. 6项进行。
10. 细菌内毒素检查： 每 1次人用剂说量应不高于 500EU (《中国药典》 2010年版三部附录 XII E)。
将实施例 1-4制备的联合疫苗采用上述方法进行书检测， 实验结果如表 1所示：
表 1 : 实施例 1-4制备的联合疫苗的检测结果
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A群每 1次人用剂量应为 10〜15 μ g 11. 20 14. 26 13. 46 12. 51 多糖含量 C群每 1次人用剂量应为 10〜15 μ g 11. 65 13. 80 14. 20 13. 60
Hib每 1次人用剂量应为 10〜15 μ g 11. 58 12. 92 13. 05 12. 57
A群有效期内不高于 20% 6% 3% 4% 4% 游离多糖含
C群有效期内不高于 20% 11% 10% 12% 11% 量
Hib有效期内不高于 20% 6% 8% 7% 7%
A群 KD值小于 0. 20的洗脱液回收率应
不低于 65%， 效期内不低于 60%
88% 84% 84% 87% 多糖分子大 C群 KD值小于 0. 20的洗脱液回收率应
93% 91% 95% 92% 小测定 不低于 65%, 效期内不低于说 60%
89% 91% 93% 90% Hib KD值小于 0. 20的洗脱液回收率应
不低于 65%， 效期内不低于 60%
书
百曰咳 6IU 7IU 6IU 6IU 效价测定 白喉 35IU 32IU 39IU 37IU 破伤风 55IU 60IU 62IU 60IU 应有 90%以上小鼠血清抗 A群 IgG抗体
100% 100% 100% 100% 水平高于 Cutoff值，效期内不低于 80%
100% 100% 100% 100% 应有 90%以上小鼠血清抗 C群 IgG抗体
100% 100% 100% 100% 水平高于 Cutoff值，效期内不低于 80%
效力试验
供试品 A群抗体几何平均滴度为等剂量
A群脑膜炎球菌多糖对照组的 8倍以上 56倍 60倍 52倍 57倍 供试品 c群抗体几何平均滴度为等剂量 60倍 56倍 56倍 58倍
C群脑膜炎球菌多糖对照组的 8倍以上
无菌检査 无菌生长 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 热原检查 应符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 百日咳疫苗
小鼠体重减轻试验， 体重减轻毒性的活
性不高于 8BWDU/ml
小鼠白细胞增多试验， 白细胞增多毒性 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 特异毒性检 的活性不高于 0. 5LPU/ml
査 小鼠组织胺致敏试验， 组织胺致敏毒性
的活性不高于 0. 8HSU/ml
白喉、 破伤风疫苗
观察 30天豚鼠应全部健存，无晚期麻痹 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 及破伤风症状， 体重增加 毒性逆转试 小鼠组织胺致敏毒性的活性不高于
0. 4 0. 3 0. 3 0. 4 验 0. 8HSU/ml
细菌内毒素
不高于 500EU <250EU < 250EU <250EU < 250EU 检査
说
书

Claims

权 利 要 求 书
1.一种联合疫苗， 其特征在于， 它由 A组分和 B组分组成- 所述 A组分为液体制剂， 它由以下组分组成：
百曰咳毒素： 5〜40μ g; 丝状血凝素： 5〜40μ g; 百日咳黏附素： 2〜10μ g; 白喉类毒素： 10〜25LF; 破伤风类毒素： 4〜10LF; 氢氧化铝： 1.0〜2.0mg/ml; 氯化钠： 7.5〜9.5g L; 所述 B组分为冻干制剂， 它由以下组分组成：
A群脑膜炎多糖结合物： 10〜30μ § ; C群脑膜炎多糖结合物： 10〜30μ g; B型流感嗜血 杆菌多糖结合物： 10〜30μ g; 乳糖： 5〜20mg。
2. 如权利要求 1所述的一种联合疫苗的制备方法， 其特征在于， 它包括以下步骤-
51. 制备各单价疫苗原液： 包括白喉类毒素原液、 破伤风类毒素原液、 无细胞百日咳疫苗原 液， 所述无细胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、 丝状血凝素和百日咳黏附素；
52. 制备液体制剂： 将百日咳毒素、 丝状血凝素、 百日咳黏附素、 白喉类毒素原液、 破伤风 类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内， 调 pH至 5.8〜7.2， 即为无细胞百白破疫 苗半成品；
53. 制备各单价疫苗原液： 包括 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原 液、 b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
54. 制备冻干制剂： 将 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 b型 流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照 1 : 1 : 1 (w/w ) 合并混匀， 加入乳糖， 用注射用水稀释， 即为 AC群脑膜炎球菌 -b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品；
55. 分装和包装
将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射器中， AC群 脑膜炎球菌 -b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品分装于西林瓶中进行真空冷冻干燥后再独立包 装。
3. 如权利要求 2所述的一种联合疫苗， 其特征在于， A组分由以下步骤制备而成：
S 1. 制备各单价疫苗原液
S 11. 白喉类毒素原液： 开启白喉杆菌， 先在产毒培养基种子管中传 1〜3代， 再转至产毒培 养基制成生产用种子； 采用培养罐液体培养， 培养基采用改良林氏培养基， 34〜36 °C培养 45〜52h， 培养结束后加入甲醛杀菌， 在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白， 离心收集上清； 上清液超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白， 离心收集沉淀， 加生理盐水溶解， 超滤去除毒素中的硫酸铵， 加入甲醛， 置 35〜37°C， 脱毒 30天， 除菌过滤即为白喉类毒素 原液； 权 利 要 求 书
512. 破伤风类毒素原液： 开启破伤风梭状芽孢杆菌， 先在产毒培养基种子管中传 1〜3代， 再转至产毒培养基制成生产用种子； 采用培养罐液体培养， 培养基采用双胨培养基， 34〜 36°C培养 62〜72 小时； 培养结束后加入甲醛杀菌， 培养液经过滤去除菌体， 加入硫酸铵沉 淀毒素蛋白， 离心收集沉淀， 超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛， 置 35〜37 °C脱毒 30 天， 除菌过滤即为破伤风类毒素原液；
513.无细胞百日咳疫苗原液： 开启百日咳杆菌， 接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养 基， 于 35〜37°C培养不超过 48小时， 再接种于 CPB培养基中传两代， 每代培养时间 18〜 26 小时， 进行扩增培养以制备足够的生产用种子， 然后接种到发酵罐中液体培养， 培养基 采用 CPB 培养基， 37 °C培养两天， 培养结束后在培养物中加入 0.01%硫柳汞进行杀菌处 理， 将收获的培养物离心， 离心收获的菌体和上清液 2〜8°C保存待下一步纯化；
百日咳黏附素的分离纯化： 将菌体采用 60 °C热释放， 超滤浓缩后， 上样于 Capto adhere层析 柱， 以醋酸缓冲液为流动相， 收集含百日咳黏附素的洗脱组份， 再上样于 Capto SP层析 柱， 以醋酸缓冲液为流动相， 以氯化钠梯度洗脱， 收集洗脱峰， 即为分离纯化的百日咳黏附 素；
百曰咳毒素和丝状血凝素的纯化： 将上清液超滤浓缩后上样于 Capto SP层析柱， 流动相采 用含尿素的磷酸盐缓冲液， 以氯化钠梯度洗脱， 分别收集含百日咳毒素和丝状血凝素的洗脱 组份， 将含百日咳毒素的洗脱组份上样于 CaptoMMC层析柱， 缓冲液采用 Tris-HCl 缓冲 液， 以氯化钠梯度洗脱， 收集百日咳毒素洗脱峰； 将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰 石层析柱纯化， 收集洗脱峰；
制备无细胞百日咳原液： 将百日咳毒素采用戊二醛、 丝状血凝素和百日咳黏附素采用甲醛进 行脱毒， 除菌过滤后即为无细胞百日咳原液；
S2. 合并及稀释： 将百日咳毒素、 丝状血凝素、 百日咳黏附素、 白喉类毒素原液、 破伤风类 毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内， 调 pH至 5.8〜7.2， 即为无细胞百白破疫苗 半成品。
4. 如权利要求 2所述的一种联合疫苗的制备方法， 其特征在于， B 组分由以下步骤制备而 成：
S1. 制备各单价疫苗原液
Sll. A群脑膜炎球菌结合疫苗原液： 开启 A群脑膜炎球菌工作种子批菌种， 接种至流脑半 综合培养基， 温度 35〜37°C， 培养 16〜24 小时， 然后经过三代扩增培养， 制备生产用种 子， 将其接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲醛杀菌； 将已 权 利 要 求 书
杀菌的培养液离心收集上清， 然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后 静置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌 3小时使多糖和 CTAB解离， 离心 收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25%， 2〜8°C静置过夜， 离心收集上清， 上清加入乙醇 至终浓度为 75〜80%， 充分振摇使多糖沉淀， 静置 18小时以上， 离心收集沉淀， 然后用无 水乙醇和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10%饱和中性醋酸钠溶液中， 按 1: 1 ( v/v ) 比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 抽提 1〜3 次至上清液澄 清， 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸， 超滤后的多糖溶液中加入 4mol/L NaCl 溶液， 至 NaCl 终浓度为 0.3mol/L， 然后加入 95%乙醇至乙醇终浓度为 75% (v/v), 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后依次用无水乙醇、 丙 酮各洗涤两次， 干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 ( w/w ) 的比例加入溴化氰溶液， 维持温度 23 ± 3 °C， pH10.8 ±0.2反应 30分钟进行活化， 活化完成后， 按多糖：己二酰肼 =1:3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23 ± 3°C， pH8.5 ±0.2反应 15分钟进行衍生， 澄 清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多糖衍生 物， 按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 ( w/w ) 的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物溶液 中， 按多糖：碳二亚胺 =1: 10 ( w/w ) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温 5 ± 3 ° (：、 pH5.7土 0.2， 反应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9 ±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化 钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 OD280nm的吸收值， 收集 V0 附近的洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 A 群脑膜炎球菌结合疫苗原液；
S12. C群脑膜炎球菌结合疫苗原液： 开启 C群脑膜炎球菌工作种子批菌种， 接种至流脑半综 合培养基， 温度 35〜37°C， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增培养， 制备生产用种子， 将其接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲醛杀菌； 将已杀菌 的培养液离心收集上清， 然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L， 充分搅拌后静置 过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌 3小时使多糖和十六垸基三甲基溴化铵 解离， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25% (v/v ), 2〜8°C静置过夜， 离心收集上 清， 上清加入乙醇至终浓度为 75〜80% (v/v), 充分振摇使多糖沉淀， 静置 18 小时以上， 离心收集沉淀， 然后用无水乙醇和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗糖溶解于 10% 饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按 1:1 ( v/v) 比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清 权 利 要 求 书
液， 抽提 1〜3 次至上清液澄清， 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸， 超 滤后的多糖溶液中加入 4mol/L NaCl溶液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L， 然后加入 95%乙醇 至乙醇终浓度为 75% (v/v)， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收集沉淀， 然后 依次用无水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 ( w/w ) 的比例加入溴化氰溶液， 维持温度 23 ± 3 °C， pH10.8 ±0.2反应 30分钟进行活化， 活化完成后， 按多糖：己二酰肼 =1:3.5 (w/w) 的比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23 ± 3°C， pH8.5 ±0.2反应 15分钟进行衍生， 澄 清过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多糖衍生 物；
按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w) 的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物溶液中， 按多糖：碳二亚胺 =1: 10 (w/w) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温度 5 ± 3 ° (：、 pH5.7 ±0.2， 反应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9 ±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化钠溶液 为超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 Sepharose 4FF凝 胶层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 OD280nm的吸收值， 收集 V0附近 的洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 C 群脑 膜炎球菌结合疫苗原液；
S13. b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液： 开启 b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种， 接种至 Hib 综合培养基， 温度 35〜37°C， 5〜8% C02环境中， 培养 16〜24小时， 然后经过三代扩增培 养， 制备生产用种子， 接种至发酵罐培养， 温度 35〜37°C， 培养时间 6〜12小时后加入甲 醛杀菌； 将己杀菌的培养液离心收集上清， 然后加入十六垸基三甲基溴化铵至终浓度 1.0g/L, 充分搅拌后静置过夜， 离心收集多糖， 沉淀的多糖用氯化钠溶液搅拌 3 小时使多糖 和十六垸基三甲基溴化铵解离， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 25% (v/v ) , 2〜 8°C静置过夜， 离心收集上清， 上清加入乙醇至终浓度为 75〜80% (v/v ), 充分振摇使多糖 沉淀， 静置过夜， 离心收集沉淀， 用无水乙醇和丙酮各洗三次， 干燥后即为粗制多糖； 将粗 糖溶解于 10%饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按 1:1 (v/v) 比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离 心收集上清液， 抽提 1〜3 次至上清液澄清， 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚 及核酸， 超滤后的多糖溶液中加入 4mol/L NaCl溶液， 至 NaCl终浓度为 0.3mol/L， 然后加 入 95%乙醇至乙醇终浓度为 75% (v/v) , 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀精糖， 离心收 集沉淀， 然后依次用无水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精糖；
将精糖溶解于注射用水中， 按多糖:溴化氰 =1:0.5 (w/w) 的比例加入溴化氰溶液,维持温度 23 权 利 要 求 书
± 3 °C， pH10.8 ±0.2反应 30分钟进行活化,活化完成后， 按多糖：己二酰肼 =1:3.5 ( w/w) 的 比例加入 2.8%己二酰肼溶液， 维持温度 23 ±3 °C， pH8.5 ±0.2反应 15分钟进行衍生， 澄清 过滤后， 用 0.05mol/L氯化钠溶液为超滤液， 用超滤膜包超滤去除溴化氰， 即为多糖衍生 物；
按多糖：蛋白 =1:0.8〜1.2 (w/w) 的比例计算破伤风类毒素用量， 加入多糖衍生物溶液中， 按 多糖:碳二亚胺 =1:10 (w/w ) 的比例加入碳二亚胺， 维持反应温度 5 ± 3 °C、 pH5.7 ± 0.2， 反 应 60分钟， 然后调节 pH至 6.9±0.1终止反应， 经澄清过滤后， 用 0.15mol/L氯化钠溶液为 超滤液， 用超滤膜包超滤去除碳二亚胺， 然后将多糖蛋白结合物溶液用 Sepharose 4FF凝胶 层析柱纯化， 以 0.15mol/L NaCl溶液为流动相， 监测 OD280nm的吸收值， 收集 V0附近的 洗脱峰， 合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物， 经除菌过滤后， 即为 b 型流感 嗜血杆菌结合疫苗原液；
S2. 疫苗配制： 将 A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、 b型流感 嗜血杆菌结合疫苗原液按照 1: 1: 1 (w/w)合并混匀， 加入乳糖， 用注射用水稀释， 即为 AC 群脑膜炎球菌 -b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品。
5. 如权利要求 2所述的一种联合疫苗的制备方法， 其特征在于， 吸附无细胞百白破联合疫 苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射器中， 每瓶 0.5ml， AC群脑膜炎球菌 -b 型流感嗜血 杆菌联合疫苗半成品按照 0.5ml/瓶分装于西林瓶中。
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