CN112316126B - 一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原制品的制备方法 - Google Patents
一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原制品的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制备方法,所述方法包括如下步骤:首先加入氢氧化铝溶液,再加入一定量的0.85%的氯化钠溶液,在搅拌条件下,加入PB溶液(200mmol/L),搅拌使充分反应1小时,然后按成品中抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液,充分搅拌后醋酸或氢氧化钠调节步骤(2)中溶液pH值至6.8‑7.0,使氢氧化铝与Fim蛋白充分吸附,向步骤(3)中溶液补加0.85%的氯化钠溶液至100mL,混匀后制成氢氧化铝‑Fim抗原复合物制品,密封4℃保存。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,具体的,涉及一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原制品的制备方法。
背景技术
博得特氏百日咳杆菌(Bordetella pertussis)是引起婴儿呼吸道疾病的一种烈性传染病病原体,世界范围内许多国家因接种百日咳疫苗使该疾病的死亡率和发病率大大降低。近几年,在疫苗接种率达到85%以上的发达国家,出现了因百日咳死亡和发病率升高的现象,尤其是在年龄较大的儿童和青少年中该病例仍在增加,并作为传播者向年龄太小而未接种疫苗的婴儿传播,间接证明了当前主流疫苗的一些不足。百白破疫苗在婴幼儿中长期广泛地应用改变了百日咳疾病的流行模式,即完成免疫程序的婴幼儿可获得免疫保护,由于没有相应的免疫措施致使青少年和成人的免疫保护力迅速衰减。然而这部分人群的感染,导致其成为婴幼儿感染的主要传染源。另外,尽管百日咳抗体能有效地通过母体胎盘传递给胎儿,但由于母体抗体水平过低且婴儿血清抗体迅速下降,使得新生儿得不到足够的保护。目前,呼吁对青少年进行加强免疫及在孕期接种成人百日咳疫苗是最具成本效益的方法。
目前已上市的百日咳疫苗主要抗原是百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和百日咳丝状血凝素(filamentous hemagglutmin,FHA),部分含有百日咳黏附素(pertactin,PRN)和百日咳菌毛蛋白(fimbriae,Fim)。百日咳菌毛蛋白是一类具有粘附功能的细胞外膜蛋白,有Fim2和Fim3两种血清型。近期两个不同百日咳疫苗的临床试验(来自瑞士和德国的临床试验),通过ELISA检测抗Fim抗体水平在5-8EU/mL以上显示出与感染百日咳风险的降低呈现一定相关性,因此在无细胞百日咳疫苗中增加Fim抗原具有一定的现实意义。
为了增强疫苗的免疫效果,通用方法是在疫苗配方中加入铝佐剂。目前已上市的百日咳疫苗都用含铝佐剂(氢氧化铝、磷酸铝)吸附百日咳抗原。经大量研究证实,设计含铝佐剂疫苗需考虑的关键因素在于抗原与铝佐剂的吸附方式和吸附效率。通常认为,静电吸引、疏水吸引和配基交换是铝佐剂吸附抗原的主要吸附方式,其中静电吸引最为常见。因蛋白质易发生折叠,导致构象发生变化,减少了蛋白疏水区域对水环境的暴露,因此限制了由疏水作用而产生的吸附;配基交换是氢氧化铝表面的羟基被抗原表面的磷酸基团所取代,这种吸附方式作用力最强。疫苗的免疫效果与佐剂对抗原的吸附率密切相关,而疫苗中磷酸根和氯化钠浓度等因素会影响着佐剂对抗原的吸附强度。湛琳丽的实验和Gupta等在小鼠中已经证实影响抗原免疫原性的最重要因素之一是佐剂对抗原的吸附率。吸附率越高,免疫效果越好;反之,免疫效果越差。田俊楠等在铝佐剂重组戊型肝炎疫苗中发现,随着疫苗中磷酸根含量的增加,铝佐剂对抗原的最大吸附量逐渐降低,而免疫小鼠后诱导的抗体滴度反而逐渐增高,表明在一定范围内增加磷酸根离子的浓度可降低铝佐剂对抗原的吸附强度,但提高了疫苗诱导的抗体滴度。
发明内容
本发的目的在于提供一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)用注射用水分别配制200mmol/L的磷酸/磷酸盐缓冲液(Phosphere BufferedSaline,PBS)溶液、质量分数为0.85%的氯化钠溶液、5%醋酸和0.1mol/L氢氧化钠溶液,所有溶液经0.22μm滤膜除菌过滤,保存待用;
(2)首先加入氢氧化铝溶液,再加入一定量的0.85%的氯化钠溶液,按成品中Fim抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液,搅拌,室温吸附1小时后,加入200mM/L的PB溶液,充分搅拌,配制完毕后溶液制剂中氢氧化铝的终浓度以Al记为0.4mg/mL、氯化钠的终浓度0.9%、PB的终浓度为2-12mmol/L;或
首先加入氢氧化铝溶液,再加入一定量的0.85%的氯化钠溶液,在搅拌条件下,加入PB溶液(200mmol/L),搅拌使充分反应1小时,然后按成品中抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液,充分搅拌,配制完毕后溶液制剂中氢氧化铝的终浓度以Al记为0.4mg/mL、氯化钠的终浓度0.9%、PB的终浓度为2-12mmol/L;
(3)用醋酸或氢氧化钠调节步骤(2)中溶液pH值至6.8-7.0(最优pH值为7.0),使氢氧化铝与Fim蛋白充分吸附,时间为1小时;
(4)向步骤(3)中溶液补加0.85%的氯化钠溶液至100mL,混匀后制成氢氧化铝-Fim抗原复合物制品,密封4℃保存。
优选的,步骤(2)中,氢氧化铝溶液中最终铝含量是0.4mg/mL(以Al记)、PB终浓度为2-5mmol/L、pH为6.8-7.0。
优选的,步骤(2)中,Fim原液来源于百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)提取的Fim抗原原液,更优选的,所述的菌种为CMCC58003。
本发明还涉及所述的方法在制备百日咳疫苗或百白破疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于:
1.发现氢氧化铝对Fim抗原的吸附能力约为2.9mg/mgAl。
2.在配制氢氧化铝-Fim复合物时增加一定浓度的磷酸盐并适当调解pH值,可提高小鼠血清抗原特异性抗体水平。
附图说明
图1、不同磷酸盐和pH下的吸附率变化趋势图
图2、不同复合物免疫动物抗体滴度与复合物中磷浓度的关系
具体实施方式
原料说明:
菌种:百日咳博德特氏菌,菌种号为CMCC58003,由武汉生物制品研究所提供;
PB溶液:浓度是200mmol/L,pH6.5,使用注射用水配制,经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌;
氯化钠溶液:质量分数为0.85%,使用注射用水配制,经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌;
氯化钠溶液:质量分数为0.35%,使用注射用水配制,经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌;
氯化钠溶液:浓度是2mol/L,使用注射用水配制,经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌;
醋酸:质量分数为5%,使用注射用水配制,经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌;
氢氧化钠溶液:浓度是0.1mol/L,使用注射用水配制,经0.22μm的除菌滤膜过滤除菌;
SPF级CD1小鼠(ICR),20-24g、雌性,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2018-0099,饲养于武汉生物制品研究所实验动物中心。
实施例1.百日咳菌毛(Fim)抗原原液的制备
(1)发酵:取百日咳博德特氏菌工作种子批1支,接种于包姜氏固体培养基中,37℃培养72小时后,经纯菌检查和固体传代后,接种于SS液体培养基中进行发酵培养。
(2)初步提纯:经检验合格的发酵液离心收集菌体沉淀,向所述菌体沉淀中加入沉淀量(湿重)10~15倍体积PB缓冲液(50mmol/L,1mol氯化钠,pH8.0)搅拌均匀,于2~8℃浸提1-5小时(优选1.5小时),离心后分别收集浸提上清及浸提沉淀,从所述浸提沉淀中分离得到粗纯溶液,粗纯溶液经过阴离子交换层析(Capto Adhere层析柱)后收集流穿液(具体方法可参见本公司在先专利,专利号CN108570098A)。
(3)精细纯化:将初步提纯的流穿液进行一步盐析、一步Capto Adhere复合型和CHT柱层析,收集UV280大于5的蛋白峰,具体步骤为:
1)将步骤(2)得到的流穿液在2-8℃条件下,缓慢加入硫酸铵固体,使硫酸铵终浓度达到(质量体积比W/V)15-25%,缓慢搅拌1小时后完全溶解,
2)将所述溶液静置16-24小时,15000×g离心30分钟,用pH为8.0-9.0的50mMTris-HCl缓冲液溶解沉淀,充分溶解后再次离心,离心条件与上述相同,离心后收集上清溶液。
3)调节上清溶液pH和电导率分别是8.0-9.0和20-30mS/cm,过Capto Adhere层析柱后收集流穿液,得到菌毛蛋白(Fim)粗纯液;
4)收获的菌毛蛋白(Fim)粗纯液pH8.0-8.5、电导率<10mS/cm,过CHT层析柱(BIO-RAD公司,货号157-0041),用含0.5M/L氯化钠、pH8.0的洗脱液洗脱,得到Fim蛋白。
(4)SDS-PAGE检测蛋白纯度(达到95%以上),用Lowry法检测蛋白浓度合格后,用Tris缓冲液(5mmol/L,0.35%氯化钠,pH8.0)透析后,调整Fim抗原浓度,经0.22μm滤膜过滤除菌后即为Fim抗原原液。
实施例2.Fim抗原吸附特性研究
取若干支离心管,分为4组(0.06M、0.25M、0.5M和0.75M的氯化钠溶液),
每管分别加入10μL氢氧化铝(10mg Al/mL),
然后分别加入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.5mLFim抗原(280μg/mL,5mM含0.35%氯化钠的Tris缓冲溶液),
用0.35%和2M氯化钠溶液分别调节最终盐浓度分别为0.06M、0.25M、0.5M和0.75M,调pH至8.0,定容至3mL,室温吸附1小时,每隔15分钟轻轻振荡,使其充分吸附。
将吸附后的样品5000×g条件下离心10分钟,取每管上清用Lowry法测定蛋白含量。通过公式计算吸附量:
以上清蛋白含量(μg/mL)为横坐标,以吸附量(μg/mg Al)为纵坐标作图,即为抗原的吸附等温线。判断吸附等温线是否符合Langmuir吸附等温线的特点(随着抗原的增加,吸附量逐渐升高,最后到达平稳期)。如符合Langmuir吸附等温线的特点,则以上清蛋白含量(μg/mL)为横坐标,上清蛋白含量/吸附量(μg/mg Al)为纵坐标拟合直线,通过Langmuir方程,直线斜率的倒数1/k为抗原的吸附能力(μg/mg Al),直线斜率k与截距b的比值k/b则为吸附系数(mL/μg),结果见表1。结果显示,盐浓度高于0.50M时,吸附能力略有下降,但下降幅度不大。
表1 pH8.0,25℃条件下不同离子强度对Fim抗原吸附性能的影响
实施例3.磷酸盐和pH对Fim抗原吸附率的影响
(1)将Fim抗原与氢氧化铝佐剂在适当条件下(pH 8.0)进行吸附(每0.4mg佐剂吸附100μg Fim蛋白)。样品分为5组,每组加入不同量的磷酸缓冲液使磷酸根与铝的摩尔比分别为0、0.0675、0.135、0.27、0.54和0.81,将不同磷酸盐浓度的样品采用醋酸溶液或氢氧化钠溶液调整pH值至5.0、5.6、6.5、7.5与8.5,吸附48小时后,计算吸附率。
(2)按照2015年版《中华人民共和国药典》三部“吸附无细胞百白破联合疫苗中”3.1.2进行吸附率检查。具体操作是将实施例3中1)吸附的样品5000×g离心10分钟,小心吸取上清,同时取样品进行适当稀释,用Lowry法(通则0731第二法福林酚法)测定蛋白含量,通过以下公式计算吸附率,应不低于95%。
式中P(%)为吸附率;
Cs为供试品上清液的蛋白含量,μg/mL;
Ct为供试品的蛋白含量,μg/mL;
吸附率结果见表2和图1。
结果显示,
(1)pH为5.0-7.5时,吸附效率较好;
(2)随着P含量的增加,吸附效率下降,所有条件下Fim吸附率保持在90%以上。
表2在不同磷酸盐浓度与pH值对Fim吸附率的影响
a:表示P与Al的摩尔浓度比;
实施例4.氢氧化铝吸附Fim抗原制剂的制备
(1)先吸附后加磷酸盐法制备:向烧杯中首先加入4mL氢氧化铝溶液,再加入一定量的0.85%的氯化钠溶液,按成品中抗原终浓度为10μg/mL加入百日咳菌毛(Fim)抗原原液,搅拌,吸附1小时后,加入不同体积的200mmol/L的PB溶液,使得每个制品中磷铝摩尔比(P/Al)比分别为0、0.135、0.270、0.540和0.810,充分搅拌,用0.85%氯化钠溶液定容,调制剂pH7.0,样品编号分别记为Y1、Y2、Y3、Y4和Y5;
(2)先加磷酸盐后吸附法制备:向烧杯中首先加入4mL氢氧化铝溶液,再加入一定量的0.85%的氯化钠溶液,在搅拌条件下,先加入不同体积的200mmol/L的PB溶液,使得每个制品中P/Al比分别为0.135、0.270、0.540和0.810,充分搅拌反应1小时后,按成品中抗原终浓度为10μg/mL加入百日咳菌毛蛋白(Fim)原液,充分搅拌,吸附1小时,用0.85%氯化钠溶液定容,调制剂pH7.0,样品编号分别记为Y6、Y7、Y8和Y9;
实施例5.小鼠体内Fim抗体滴度测定
(1)血清抗体检测:选用CD1小鼠,样品为实施例4中配制的氢氧化铝-Fim抗原复合物,每个制品稀释5倍后,腹腔注射,0.5mL/只,免疫后第28天眼眶丛静脉采血,分离血清后利用ELISA间接法进行实验,用百日咳国际标准血清(97/642)检测血清抗体滴度,结果见图2,黑色长方形为不加磷酸盐,白色长方形为先吸附后加磷酸盐,阴影长方形为先加磷酸盐后吸附方法。
结果显示,Y6-Y9组样品相比与Y1-Y4组样品,有更好的免疫激活效果,且两组样品的免疫激活效果,都强于不加磷酸盐的样品。
最后需要说明的是,以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质,不用于限定本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种氢氧化铝佐剂吸附百日咳菌毛(Fim)抗原的制备方法,所述方法包括如下步骤:
(1)配置氢氧化铝溶液,并在其中加入0.85%的氯化钠溶液;
(2)在搅拌条件下,加入PB溶液,使得制品中P/Al摩尔比为0.135或0.270,搅拌并充分反应1小时,配制完毕后溶液制剂中氢氧化铝的终浓度以Al记为0.4mg/mL;
(3)按成品中抗原终浓度为10μg/mL加入Fim原液,充分搅拌,吸附1小时;
(4)补加0.85%的氯化钠溶液定容,调节溶液pH值至7.0。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,
步骤(3)中,Fim原液来源于菌种为CMCC58003的百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)提取的Fim抗原原液。
3.权利要求1或2所述的方法在制备百日咳疫苗或百白破疫苗中的应用。
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