CN111265660B - 一种通用型疫苗免疫增强剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通用型疫苗免疫增强剂制备与应用。所述通用型疫苗免疫增强剂通过利用基因重组技术，将非致病大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合蛋白编码基因以及轮状病毒VP2/VP6融合蛋白类病毒粒子编码基因经过柔性linker连接，分别克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、复性折叠类病毒粒子、混合制剂等工艺，得到一种通用型疫苗免疫增强剂。所述疫苗免疫增强剂可与常规灭活疫苗、活疫苗以及核酸疫苗、亚单位疫苗、多表位疫苗、蛋白工程疫苗等基因工程疫苗抗原混和后与佐剂乳化获得免疫原性增强型疫苗。动物实验表明，疫苗免疫增强剂能够有效地提高常规疫苗体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫反应水平。

Description

一种通用型疫苗免疫增强剂
技术领域
本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种通用型疫苗免疫增强剂制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将非致病大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合蛋白编码基因以及轮状病毒VP2/VP6融合蛋白类病毒粒子编码基因分别克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、复性折叠类病毒粒子、混合制剂等工艺，得到一种通用型疫苗免疫增强剂以及该增强剂在疫苗中的应用。
背景技术
疫苗佐剂是制约新型疫苗发展的最主要瓶颈之一。理想的佐剂能显著减少抗原使用的剂量，有效诱导机体产生早期、高效和持久的免疫应答，并具有良好的安全性。因此，发现具有潜在佐剂活性的组合物，继而筛选和优化，并对佐剂的作用特点及作用机制进行研究，是研发安全、高效的疫苗、有效防控传染病的一个关键环节。
从20世纪80年代开始，已经有超过100种以上的病毒样颗粒(Virus likeparticles，VLPs)被制备且鉴定。VLPs由于具有安全性高，在结构上与病毒粒子相似，可通过与病毒粒子相同的途径激起免疫系统的有效应答等优点，近二十年来在人用、兽用疫苗及药物递送系统中的应用越来越受到关注。病毒样颗粒造成的免疫刺激主要包含：(1)由于多价的结构，通过toll样受体和模式识别受体途径刺激先天免疫。(2)诱导产生较强的体液免疫。(3)通过MHC I和MHC II类交叉提呈方式增强抗原提呈细胞摄取、加工、提呈。VLPs具有比表面积大可表面吸附具有反应基团的氨基酸(如赖氨酸、谷氨基酸等)，规则的空间结构，以及良好的生物相容性。这些特点极大地吸引了众多疫苗研发者的目光。VLPs作为免疫原有利于打破肿瘤和病毒慢性感染所产生的免疫耐受，使VLPs展示表位疫苗具备直接用于治疗的特性。因此，研发人员已开发了多种人用及动物用VLPs新型疫苗，但VLPs作为疫苗免疫增强剂的研究鲜有研发报道。
细菌的某些蛋白分子具有较强的免疫激活特性，并同时扮演着佐剂的角色，例如霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、LT-K63以及用于结核病(TB)I期临床的佐剂Eurocine L3等，它们都显示了各自的优势。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB能与大多数动物的神经节苷脂GM1特异性结合，诱导细胞膜构型改变。近年来，鞭毛蛋白的佐剂活性越来越受到关注，大肠杆菌鞭毛蛋白本身作为一种免疫刺激物，可诱导机体产生天然免疫应答和获得性免疫应答。研究发现，鞭毛蛋白具有两种可引起促炎性反应的受体，糖脂、神经节苷酯和跨膜蛋白TLR5。作为一种模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，TLR5在肺、肠上皮细胞、单核、巨噬细胞，和小肠的固有层未成熟树突状细胞上表达。鞭毛蛋白除了自身的强免疫原性外，还具有增强外源抗原免疫原性的特性，包括体液免疫和细胞免疫。
发明概述
本发明将非致病大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合蛋白编码基因以及轮状病毒VP2/VP6融合蛋白类病毒粒子编码基因分别克隆入载体，在大肠杆菌中表达后，经过蛋白纯化、复性折叠类病毒粒子、制剂等工艺，获得具有理想免疫增强效果的组合物：免疫增强剂。免疫增强剂与常规灭活疫苗、活疫苗、基因工程疫苗等按照一定比例混合乳化后免疫靶动物，可诱导更高水平的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应。
本发明的目的之一在于提供了一种能够激发粘膜免疫、体液免疫、细胞免疫的通用型的免疫增强组合物，此组合物可与常规灭活疫苗、活疫苗和核酸疫苗、亚单位疫苗、多表位疫苗、蛋白工程疫苗等基因工程疫苗抗原混和后与佐剂乳化获得免疫原性加强型疫苗；本发明的目的之二在于提供了所述疫苗免疫增强剂的构建及获得方法；本发明的目的之三在于提供了能够表达所述疫苗免疫增强剂的基因工程菌株；本发明的目的之四在于提供了所述疫苗免疫增强剂的制备方法；本发明的目的之五在于提供了所述疫苗免疫增强剂在疫苗配制及动物免疫中的用途。
在第一方面，本发明提供了两种重组疫苗免疫增强剂多肽及其组合物。其含有非致病大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合蛋白以及轮状病毒VP2/VP6类病毒粒子。所述融合蛋白为Flic N端、LTB和Flic C端串联所构建的FN-LTB-FC蛋白以及轮状病毒核心蛋白VP2和内衣壳蛋白VP6保守序列串联所构建的蛋白或多肽，其中VP2/VP6纯化后经过复性折叠为类病毒粒子。串联可以通过遗传工程方法或人工合成进行，疫苗免疫增强剂中除了含有大肠杆菌鞭毛蛋白Flic与不耐热肠毒素B亚单位(LTB)，轮状病毒核心蛋白VP2和内衣壳蛋白VP6的保守区域，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各多肽的连接部分，不具有免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。
因此，重组疫苗免疫增强剂FN-LTB-FC多肽氨基酸序列如下：
Figure GSB0000200592380000031
重组疫苗免疫增强剂VP2/VP6多肽氨基酸序列如下：
Figure GSB0000200592380000032
在第二方面，本发明提供了两种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的两种疫苗免疫增强剂多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成串联序列，然后经过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化获得疫苗免疫增强剂多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等，核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点。优选本发明中的FN-LTB-FC核苷酸序列如下：
Figure GSB0000200592380000041
VP2/VP6核苷酸序列如下：
Figure GSB0000200592380000042
Figure GSB0000200592380000051
在第三方面，本发明提供了两个载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码疫苗免疫增强剂的两种核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。
在第四方面，本发明提供了两种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的两个载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的疫苗免疫增强剂抗原。本发明中优选大肠杆菌BL21(DE3，Plys)作为目的蛋白表达用宿主菌。
在第五方面，本发明提供了一种疫苗免疫增强剂的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达FN-LTB-FC和VP2/VP6融合蛋白，经过粗纯化，精细纯化工艺，复性折叠病毒粒子以及后续混合制剂工艺，获得所需要的疫苗免疫增强剂。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、阴离子交换色谱、反相色谱、复性等。
在第六方面，本发明提供了一种通用型疫苗免疫增强剂，其包括本发明第一方面所述的多肽组合物以及药学上可接受的载体。所述疫苗免疫增强剂可与常规灭活疫苗、活疫苗和核酸疫苗、亚单位疫苗、多表位疫苗、蛋白工程疫苗等基因工程疫苗抗原混和后与佐剂乳化获得免疫原性加强型疫苗。本发明所述的药学上可接受的载体为佐剂。
在第七方面，本发明提供了第六方面所述的通用型疫苗免疫增强剂的应用。免疫增强剂可以与传统灭活疫苗、活疫苗、基因工程疫苗等常规疫苗配制成新型免疫增强剂疫苗，其以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射、气雾接种动物，能够产生足够有效的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应(见实施例四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四)，刺激产生较常规疫苗更高的SIgA及IgG水平，诱导外周血T淋巴细胞增殖，IFNγ产生增加。此外，在本发明的实施方案中，通过对疫苗进行实验室安全性试验，表明本发明所述的通用型疫苗免疫增强剂是安全的(见实施例三)。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1为疫苗免疫增强剂表达质粒pRSETA-FN-LTB-FC构建图；图2为疫苗免疫增强剂表达质粒pRSETA-VP2/VP6构建图；图3为两个载体质粒酶切图，其中泳道1为DNAmarker，从上至下分子量依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道2为完整质粒pRSETA-FN-LTB-FC，泳道3为pRSETA-FN-LTB-FC酶切图，泳道4为阴性对照，泳道5为pRSETA-VP2/VP6完整质粒，泳道6为pRSETA-VP2/VP6酶切图，泳道7为阴性对照；图4为SDS-PAGE检测图，其中泳道1pRSETA-FN-LTB-FC/BL21(DE3，Plys)诱导样品，箭头所指为表达的目的蛋白，泳道2为pRSETA-FN-LTB-FC/BL21(DE3，Plys)未诱导对照样品，泳道3为蛋白Marker，从上至下依次97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、22KD、14.4KD，泳道4为pRSETA-VP2/VP6/BL21(DE3，Plys)未诱导对照样品，泳道5为pRSETA-VP2/VP6/BL21(DE3，Plys)诱导样品，箭头所指为表达的目的蛋白；图5为纯化后SDS-PAGE检测图，其中泳道为1FN-LTB-FC纯化蛋白样品，泳道2为蛋白Marker，从上至下依次97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、22KD、14.4KD，泳道3为VP2/VP6纯化蛋白样品；图6为VP2/VP6复性后形成类病毒粒子电镜图；图7为免疫增强剂与常规疫苗抗原不同配苗比例免疫动物IgG抗体滴度检测结果；图8为疫苗免疫小鼠后抗体水平检测结果；图9为疫苗刺激鼠肾细胞T淋巴细胞增殖反应；图10为SPF鸡免疫后ELISA检测抗体滴度检测结果；图11为SPF鸡HI抗体检测结果；图12为SPF鸡外周血淋巴细胞增殖检测结果；图13为鸡外周血CD4+T淋巴细胞百分含量检测结果；图14为鸡外周血CD8+T淋巴细胞百分含量检测结果；图15为免疫仔猪IgG抗体检测结果；图16为免疫仔猪IFNγ浓度检测结果；图17为特异性淋巴细胞增殖检测结果；图18为呼吸道特异性SIgA抗体检测。
具体实施方式
实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制。
实施例一 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建
1将设计好的多肽编码核苷酸(见序列表SEQ1和SEQ3)送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了BamH I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，片段合成后分别克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与设计序列一致。将重组质粒分别命名为pMD18T-FN-LTB-FC和pMD18T-VP2/VP6。用相应的限制性内切酶将质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETA质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位(NewEngland Biolabs)，加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.6kbpRSETA质粒和1.1kb FN-LTB-FC以及1.8kb VP2/VP6片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1∶2～3的比例将多表位核苷酸片段单独和表达载体混合，反应体系15μl，由T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒分别命名为pRSETA-FN-LTB-FC和pRSETA-VP2/VP6，(见图1、图2)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
2转化：将pRSETA-FN-LTB-FC和pRSETA-VP2/VP6置冰上融化，分别加入2μl连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入1mL LB培养液，37℃，静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB培养基重悬菌体；将菌液均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12～16小时，直至克隆形成。
3鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，分别使用内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，可以切出相应FN-LTB-FC和VP2/VP6大小片段的克隆，分别为1.1kb、1.8kb，可初步确定为阳性克隆(见图3)；阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。
4诱导表达。将阳性克隆过夜培养，次日早上按1∶100转接，培养3小时后，加入0.1mM IPTG，继续培养4小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——(见图4)，见到43.7KD和73.6KD特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，将挑选的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立，菌种分别命名pRSETA-FN-LTB-FC/BL21(DE3，Plys)和pRSETA-VP2/VP6/BL21(DE3，Plys)。
实施例二 工程菌的发酵、纯化与制剂
1发酵 取生产菌种pRSETA-FN-LTB-FC/BL21(DE3，Plys)和pRSETA-VP2/VP6/BL21(DE3，Plys)，分别接种于2mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养12小时活化菌种。再以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃振荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37.0℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，溶氧控制在40％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0～1.2时流加补料500mL，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.2mM)诱导表达，连续诱导5个小时后发酵结束。
2纯化 将收集到的菌体，用包含体洗液I(1％Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包含体，并用包含体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mMTris-cl PH8.0)混悬二次超声洗涤包含体，二次低温离心收集包含体。包含体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.00)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；即得重组FN-LTB-FC蛋白和VP2/VP6蛋白原液，取半成品原液做SDS-PAGE鉴定(见图5)。
3复性 对纯化的VP2/VP6蛋白进行透析复性。透析液为0.5M盐酸胍，1.2M尿素，0.5M精氨酸，100mM Tris-HCl，pH＝9.5，4℃透析48小时。期间换液四次。收集复性后的蛋白于青岛大学进行电镜检测类病毒粒子折叠情况(见图6)。视野中可见清晰的圆形类病毒粒子颗粒，直径为25nm左右。
4制剂 将纯化的FN-LTB-FC融合蛋白和VP2/VP6类病毒粒子用无菌0.22μm的Millipore滤膜过滤除菌后用灭菌的PBS稀释至100μg/mL。FN-LTB-FC和VP2/VP6纯化物按照体积比1∶1进行混合配制成通用型疫苗免疫增强剂，备用。配苗时按免疫增强剂∶疫苗＝1∶1的体积比配制，直接与佐剂按照常规比例进行乳化制备疫苗。
实施例三 通用型疫苗免疫增强剂安全性试验
1材料
1.1疫苗：免疫增强剂乳化后的乳剂由青岛明勤生物研发中心提供，批号为201701、201702、201703。
1.2试验动物：20-25g Balb/C小白鼠购自北京华阜康。
2方法
Balb/C小白鼠，17只。每批疫苗免疫5只，共三个批次，免疫15只小白鼠，免疫方法为皮下注射，对照组以同样方法免疫生理盐水乳剂。免疫后连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。
3结果
结果如表1，免疫后，所有小鼠的食欲、精神和健康状况无异常，与对照组一致，无死亡发生，可见疫苗免疫增强剂对小白鼠是安全的，见表1。
表1疫苗免疫增强剂对小白鼠的安全性试验结果
组别 动物数量 体温 食欲 精神 健康状况 死亡数量
201701 5只 正常 正常 正常 健康状况良好 0
201702 5只 正常 正常 正常 健康状况良好 0
201703 5只 正常 正常 正常 健康状况良好 0
对照 2只 正常 正常 正常 健康状况良好 0
实施例四 通用型疫苗免疫增强剂试验动物分组、免疫、评价方法
为了尽可能多的得到通用型疫苗免疫增强剂的有效性评价参数，本发明检测了本增强剂与不同种类疫苗混合制备的增强型疫苗免疫动物所诱导的体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫水平。
1试验动物
1.1 5周龄SPF级Balb/C普通小鼠、雌性，体重20-25g，开始试验前环境适应一周。
1.2 4周龄健康仔猪(O型口蹄疫，伪狂犬，圆环病毒2型，高致病性蓝耳病抗体阴性)，试验猪在开始试验前环境适应一周。
1.3一周龄SPF鸡，预饲一周，适应环境。
2疫苗
疫苗免疫增强剂由北京明勤生物研发中心提供，猪O型口蹄疫多表位疫苗(FMD)，重组法氏囊病蛋白工程疫苗(IBD)，猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗(Mhp)，猪伪狂犬表位核酸疫苗(PR)，蓝耳病亚单位疫苗(PRRS)由青岛明勤生物研发中心制备，鸡新城疫活疫苗(LaSota株)(ND活苗)及鸡新城疫灭活疫苗(ND灭活)由永顺生物提供。各疫苗相应的免疫增强剂疫苗由北京研发中心李毅博士配制。
3试验设计与方法
3.1诱导免疫反应的配苗比例研究将疫苗免疫增强剂与猪O型口蹄疫多表位疫苗抗原按照体积比(V∶V)分别为0.5∶1，1∶1，2∶1的比例配制增强剂疫苗，与常规疫苗分别免疫小鼠，两周后加强免疫。首免后4周采血分离血清，检测抗体滴度。结果显示体积比为1∶1免疫组与2∶1免疫组抗体滴度无明显差异，但均明显高于0.5∶1免疫组(见图7)。因此，确定免疫增强剂与疫苗抗原的配苗比例为1∶1(V∶V)。
3.2免疫增强效果初步评价按照分组情况对Balb/C小鼠，首免后两周加强免疫一次。首免后4周、6周小鼠断尾采血并分离血清，并于最后一次采血后，宰杀小鼠，分离鼠肾细胞用于T淋巴细胞增殖试验。
3.3重组法氏囊病蛋白工程疫苗、鸡新城疫活疫苗(La Sota株)及鸡新城疫灭活疫苗及其免疫增强剂疫苗分别免疫SPF鸡，各5只。肌肉注射，0.2mL/只，首免后2周相同剂量加强免疫，对照组免疫PBS乳化液，0.2mL/只。分别于免疫后2周、4周翅静脉采血并用于疫苗抗体滴度检测、HI抗体滴度检测以及细胞免疫水平检测(淋巴细胞增殖测定及CD4+/CD8+T细胞亚群动态变化检测)。
3.4猪O型口蹄疫多表位疫苗、猪伪狂犬核酸疫苗、蓝耳病亚单位疫苗、及其免疫增强剂疫苗肌肉注射分别免疫仔猪，各5头，耳根后肌肉注射，1ml/头，首免后两周加强免疫。猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗及其免疫增强剂疫苗采用气雾剂喷雾免疫，各5头。雾滴颗粒为0.1～5μm，喷雾距离免疫猪只头顶上方0.5～0.8m处，人距离喷雾处2m以上，形成雾化区域，喷雾后立即关闭喷雾间，关闭时间为2h，免疫剂量为2ml/头，2周后相同免疫方法加强免疫。对照组以同样方法免疫PBS乳化液。首免后2周、4周分别采集各试验组血清和肝素化血液样品，分别用于血清学检测、IFNγ浓度检测、淋巴细胞增殖检测。同时采集猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗组及其免疫增强剂疫苗组试验动物的鼻拭子，使用猪肺炎支原体SIgA-ELISA抗体试剂盒进行SIgA检测。
实施例五 免疫增强效果初步评价一ELISA检测各疫苗IgG抗体滴度
1方法重组蛋白纯化样品用50mmol/L的CBS(PH9.6)稀释至1μg/ml，加入96孔ELISA板，每孔100μl，4℃过夜包被。PBST洗液buffer洗涤三次后，用封闭液5％马血清(PBS缓冲体系)于37℃，封闭1小时。洗涤三次后，血清样品用封闭液(5％马血清，PBS缓冲体系)进行倍比稀释1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，每孔加入100μl，两个重复，37℃孵育1小时；洗涤三次后，每孔加入稀释至1∶10000的HRP-标记二抗(羊抗鼠)，37℃孵育1小时；洗涤三次后，每孔加入50μl TMB底物，室温、避光、反应10min，加入2M H2SO4停止反应。在450nm波长下读取吸光值(BIORAD 680酶标仪)。
2结果
如图8所示，相比灭活疫苗、活疫苗和核酸疫苗、亚单位疫苗、多表位疫苗、蛋白工程疫苗等常规疫苗，免疫增强剂疫苗免疫小鼠后能激发更高水平的抗体免疫反应。首免后6周，免疫增强剂疫苗组抗体滴度增加幅度明显高于常规疫苗组，并呈现显著差异(P＜0.05)。
实施例六 免疫增强效果初步评价-淋巴细胞增殖检测
1方法 首免后6周进行了细胞增殖试验，以检测疫苗免疫的细胞免疫反应。将鼠肾细胞，100μl/孔(2×105细胞/孔)。随后加入100μl/培养基，或者加入经紫外照射灭活的相应的疫苗刺激抗原，混匀。伴刀豆球蛋白(5μg/ml，Sigma)作为阳性对照。肾细胞样品做三个重复。依据Bounous提供的方法，用改进的MTT比色法进行鼠肾细胞增殖活性检测：鼠肾细胞72小时，每孔加入10μl WST，孵育5小时，孵育后在490nm波长下读数。刺激指数(SI)用抗原刺激细胞孔的平均值比细胞(未刺激)孔的平均值来计算。
2结果
与对照组相比，所有常规疫苗免疫组观察了较高水平的肾细胞增殖活性，免疫增强疫苗可以检测到更高水平的肾细胞增殖活性。对照组的T淋巴细胞增殖明显低于其他免疫组(P＜0.05)，各常规疫苗的刺激指数相近，未呈现显著差异(P＞0.05)。免疫增强剂疫苗与常规疫苗组刺激指数呈现显著差异(P＜0.05)，与对照组呈现极显著差异(P＜0.01)。结果表明，本发明制备的疫苗免疫增强剂组合物能够明显提高常规疫苗的免疫反应，提高机体细胞免疫水平(见图9)。
实施例七 SPF鸡免疫后抗体滴度检测
1方法 用终点稀释ELISA检测特异性IgG抗体。微孔板(Nunc Maxisorp，NalgeNunc International，Denmark)用纯化的疫苗蛋白包被，2～8℃过夜；5％脱脂牛奶于37℃封闭1h，将采集的抗血清作1∶100倍稀释同时用免疫PBS的血清作为阴性对照，加入微孔板，100μL/孔，于37℃孵育1h，然后用兔抗鸡IgG-HRP的酶标二抗(1∶10000，Sigma)，加入微孔板，100μL/孔，于37℃孵育1h。DAB底物避光显色10min，2M H2SO4终止反应，于450nm波长下检测吸光度值。同时将检测为阳性的血清样本进行1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106，1∶107，1∶108倍稀释，按照上述方法做ELISA检测。以最高血清稀释度的倒数作为抗体滴度，其平均吸光值(≥0.2)高于免疫前血清的平均吸光值+2SD，作为cutoff值。
2结果
首免后第2周，常规疫苗免疫组和增强剂疫苗免疫组动物发生了抗体阳转，免疫增强剂组平均抗体水平均稍高于常规免疫组，但未呈现显著差异。首免后4周抗体水平显著升高，免疫增强剂疫苗组抗体明显高于常规疫苗组(见图10)。以上结果表明本发明所制备的免疫增强剂可以提高常规疫苗的体液免疫水平。
实施例八 血凝抑制(HI)抗体的检测
1方法
1.1 1％红细胞悬液的制备
采集实验组鸡血用2％的柠檬酸钠盐水抗凝，加5倍体积的生理盐水洗涤红细胞，1000rpm离心10min，连续洗三次后加入细胞压积100倍体积的生理盐水重悬红细胞，摇匀后置4℃备用。
1.2微量血凝试验(HA)
病毒血凝效价测定：取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1～12孔每孔加25μLPBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25μL PBS。吸取25μL标准新城疫抗原(北京康农兴牧科技)加入到第1列孔中，吹打3～5次充分混匀。从第1列孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25μL弃之，设第12列孔为红细胞对照。自右向左依次向各孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液。将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温(20～25℃)静置30min后观察结果，出现100％红细胞凝集的病毒最高稀释度即为该样品的病毒凝集价。
1.3微量血凝抑制试验(HI)
在v型96孔血凝抑制板每排的第1到第11孔加入25μL PBS溶液，第12孔加入50μLPBS溶液作为阴性对照；在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25μL，设第11孔为病毒对照，第12孔为红细胞对照。在第1～11孔各加入25μL 4单位抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温下静置30min。自右向左依次向各孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液。将反应板置于微量振荡器上振荡1min，室温(20～25℃)静置40min后观察结果，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。所得数值通过Microsoft Excel进行平均值及标准差计算。
2结果
所有免疫组的HI抗体水平随着时间逐渐升高，至免疫后4周，对照组未检测到HI抗体。常规疫苗免疫组及免疫增强剂组试验动物的HI抗体滴度均超过7.5，且免疫增强剂组明显高于常规疫苗免疫组(见表2及图11)。
表2不同时间段的HI抗体水平检测
组别 2周 4周
IBD 3.0±0.82 7.6±1.22
IBD+免增 3.6±1.21 8.8±1.53
ND活苗 3.4+0.85 8.2±1.05
ND活苗+免增 4.6±0.93 9.2±1.84
ND灭活 2.4±0.66 7.2±1.13
ND灭活+免增 3.6±1.14 8.6±1.26
实施例九 SPF鸡淋巴细胞增殖测定
1方法 免疫后2周、4周SPF鸡外周抗凝血2mL，并与等体积的Hank′s液轻轻混匀，将稀释了的抗凝血缓慢加入含有4mL淋巴细胞分离液的离心管。常温下，2000rpm离心15min。用移液器小心转移位于离心管中间的白色细胞层。用无菌RPMI1640营养液洗2遍，每分钟1500rpm，离心，15min。台盼蓝染色，细胞统计，活细胞大于90％后，用RPMI 1640营养液调整细胞浓度为2.5×106个/ml，加入到96孔板中，每孔80μL，再加20μL PHA，每孔终体积为100μL。置于5％CO2培养箱，39.5℃培养44h后，每孔加入20μL 5.0mg/mL MTT溶液，继续培养4h后，每孔加裂解液100μL，将细胞版置于微量振荡器上，振荡5分钟，使其完全溶解，在酶联免疫仪上检测570nm处的吸光值，作为T淋巴细胞增殖的指标。
2结果
与对照相比，常规疫苗与免疫增强剂疫苗均具有增强淋巴增殖的作用。免疫后4周，免疫组试验动物A570值均显著高于对照组(P＜0.01)。免疫后2周免疫增强剂疫苗组明显高于常规疫苗组，免疫后4周，免疫增强剂组与常规组呈现显著差异(P＜0.05)(见表3及图12)。结果表明本发明所述通用型疫苗免疫增强剂能够有效刺激细胞免疫，具有刺激增强淋巴细胞增殖的作用。
表3鸡外周血淋巴细胞增殖检测
组别 2周 4周
IBD 0.195±0.037 0.381±0.045
IBD+免增 0.232±0.024 0.462±0.038
ND活苗 0.227±0.015 0.428±0.055
ND活苗+免增 0.279±0.031 0.532±0.046
ND灭活 0.202±0.024 0.374±0.028
ND灭活+免增 0.247±0.032 0.488±0.052
对照组 0.175±0.019 0.154±0.023
实施例十 鸡外周血T细胞亚群动态变化检测
1预处理 取抗凝血0.1ml，加8ml红细胞裂解液，室温作用10分钟，1 500r/min离心10分钟，弃上清液，加5ml PBS，混悬，1500r/min离心10分钟，重复2次。
2荧光标记 FITC标记单克隆抗体(0.1mg/ml)，稀释10倍(0.01mg/ml)。每管取细胞悬液0.5ml，分别稀释单抗10μl(0.1μg)，4℃作用1小时，PBS缓冲液洗1遍，将管底细胞用1mlPBS悬浮并测样。
3统计分析 FACS检测3000个细胞，所得数据进行统计学处理，计算其平均值。
4结果
外周血CD4+与CD8+T淋巴细胞百分含量的变化常规疫苗免疫组和免疫增强剂疫苗免疫组外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞数整体趋势为随免疫时间逐渐增加。免疫后两周所有免疫组外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞数显著高于对照组细胞数(P＜0.05)，免疫后四周免疫组与对照组外周血CD4+与CD8+T淋巴细胞百分含量的变化呈现极显著差异(P＜0.01)。常规疫苗组和免疫增强剂疫苗免疫组成呈现显著差异(P＜0.05)(表4、表5及图13、图14)。结果表明，本发明所提供的免疫增强剂与常规疫苗制剂免疫动物后可以有效提高外周血CD4+与CD8+T淋巴细胞的百分含量。
表4外周血CD4+T淋巴细胞百分含量变化
接种后时间 2周 4周
IBD 20.58±3.36 31.07±5.25
IBD+免增 28.74±3.92 42.36±4.43
ND活苗 22.18±3.03 34.25±3.64
ND活苗+免增 29.56±3.38 45.17±5.24
ND灭活 19.46±2.19 30.89±3.58
ND灭活+免增 28.34±3.15 44.74±5.56
对照组 14.33±1.74 14.19±1.22
表5外周血CD8+T淋巴细胞百分含量变化
接种后时间 2周 4周
IBD 21.62±3.07 28.09±4.41
IBD+免增 26.38±2.59 41.65±5.36
ND活苗 23.85±3.44 30.38±3.67
ND活苗+免增 27.11±3.25 43.09±4.28
ND灭活 20.29±2.37 27.54±3.65
ND灭活+免增 26.01±1.95 38.83±4.69
对照组 10.56±1.38 11.74±2.66
实施例十一 仔猪免疫后IgG抗体检测
用商业化ELISA(IDEXX，porland)检测血清，分析抗体的产生。通过对实验动物疫苗免疫后2周、4周的血清抗体IgG检测结果见图15。结果显示常规疫苗组及免疫增强剂疫苗组试验动物在免疫后4周均可以检测到外周血内含有较高浓度的免疫抗体IgG，与2周的试验结果相比呈现显著差异(p＜0.05)。此外免疫增强剂疫苗免疫组试验动物的IgG水平明显高于常规疫苗免疫组，相比对照组，差异均极显著(p＜0.01)。检测结果表明本发明提供的通用型疫苗免疫增强剂能够明显提高常规疫苗免疫体液免疫水平。
实施例十二 免疫动物IFNγ浓度检测
常规方法采集免疫后2周、4周试验动物血清，按照羊抗猪IFNγELISA检测试剂盒说明书对采集的血清进行IFNγ浓度检测。结果显示，疫苗免疫后，随着免疫时间增加，IFNγ浓度持续上升，免疫后4周持续在较高浓度；免疫增强剂疫苗组试验动物的IFNγ浓度明显高于常规疫苗组，而对照组的试验猪IFNγ浓度始终保持较低的浓度(见图16)。
实施例十三 特异性淋巴细胞增殖检测
1方法 免疫所激发的针对不同疾病抗原的细胞调节免疫反应通过ELISPOT方法检测，以统计PBMC群(peripheral blood mononuclear cells)中病毒特异性IFNγ-SC。猪PBMC分离自新鲜的静脉血，用5mM肝素抗凝血。不同免疫组及对照组动物抗原特异性细胞免疫反应的程度用IFNγELISPOT定量。
2结果
为了评价免疫增强剂对常规疫苗在细胞免疫水平的增强作用，我们对实验动物分离来的PBMC进行IFNγ产生检测。带有记忆性抗原刺激的PBMC培养物导致的IFNγ-SC的频率高于对照组表明抗原特异性IFNγ-SC的产生。免疫后2周、4周每组特异性(记忆抗原刺激)产生频率平均值见图17。与对照组IFNγ产生细胞水平相比，各常规疫苗免疫组及其免疫增强剂组可以检测到高水平的特异性IFNγ反应，与对照组形成极显著差异(P＜0.01)。免疫增强剂组与常规疫苗免疫相比可以检测到更高水平的特异性IFNγ产生，且形成显著差异(P＜0.05)。这表明本发明提供的免疫增强剂可以有效提高常规疫苗的细胞免疫水平。
实施例十四 免疫后呼吸道特异性SIgA抗体检测
采集常规疫苗组及其免疫增强剂组2周、4周的鼻拭子，使用猪肺炎支原体SIgA-ELISA抗体试剂盒检测。通过检测发现，在免疫后2周两组免疫动物均可以检测出猪支原体肺炎黏膜抗体SIgA，免疫后4周保持高水平的SIgA(见图18)，免疫增强剂组试验动物SIgA高于多表位黏膜免疫常规疫苗组，且呈现显著差异(p＜0.05)。
Figure ISA0000201386800000011
Figure ISA0000201386800000021
Figure ISA0000201386800000031

Claims (4)

1.一种通用型疫苗免疫增强剂，其由一种融合蛋白和一种复性折叠后的类病毒粒子混合制剂而成，其中融合蛋白为FN-LTB-FC，类病毒粒子为VP2/VP6；
所述的融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.2；
所述的类病毒粒子氨基酸序列为SEQ ID No.4；
所述的融合蛋白和类病毒粒子制剂的体积比为1∶1；
所述的类病毒粒子复性折叠条件为：0.5M盐酸胍，1.2M尿素，0.5M精氨酸，100mM Tris-HCl，pH＝9.5，4℃透析48小时，期间换液四次。
2.权利要求1所述的通用型疫苗免疫增强剂在动物疫苗配制中的应用。
3.根据权利要求2所述的通用型疫苗免疫增强剂在动物疫苗配制中的应用，其特征在于：疫苗配制时按免疫增强剂和疫苗体积比为0.5～2∶1的比例进行配制。
4.根据权利要求3所述的通用型疫苗免疫增强剂在动物疫苗配制中的应用，其特征在于：疫苗配制时按免疫增强剂和疫苗体积比为1∶1的比例进行配制。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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