CN118085043B - 结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的多核苷酸、应用 - Google Patents

结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的多核苷酸、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的多核苷酸、应用，属于生物医药技术领域。本发明的结核分枝杆菌多免疫原抗原包含：免疫原I：Ag85A蛋白或其抗原性片段；免疫原II：ESAT6蛋白或其抗原性片段；免疫原III：CFP10蛋白或其抗原性片段。本发明的多核苷酸mRNA编码上述多免疫原抗原。本发明公开了上述多免疫原抗原或多核苷酸mRNA在制备预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。本发明利用结核分枝杆菌多免疫原抗原制备mRNA疫苗，能够产生较高的IFN‑γ，诱导较强的T细胞免疫应答，采用BCG初免+mRNA加强免疫后，优于BCG单独免疫效果。

Description

结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的多核苷酸、应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的多核苷酸、应用。
背景技术
结核病是一种古老的疾病，两个多世纪以来曾造成超过10亿人的死亡。当前结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tb）仍然引起全球每年大概1千万人发病。据WHO统计，2022年结核分枝杆菌感染的人数达1060万人，结核病相关死亡总数为130万例，耐药性结核病的病例已上升至41万。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）是目前唯一获准使用的结核病疫苗，自1921年首次应用于人体以来，全球已约有80%的国家将其列入免疫规划。虽然BCG在预防婴幼儿结核性脑膜炎和播散性结核病中已表现出良好的免疫效果，但是其针对青少年和成人的保护效果十分有限，并且对结核分枝杆菌的原发感染以及潜伏感染的激活也缺乏有效保护。一项对挪威出生的个人进行的回顾性调查显示，BCG对9岁以下儿童的肺结核的保护效力67%，10～19岁为63%，20～29岁下降到50%。当前尚无针对青少年和成人群体预防性和暴露后的结核疫苗。因此，迫切需要开发新型疫苗以预防结核病。
作为一种专职胞内寄生的细菌性微生物，M. tb的基因组编码超过4200个蛋白，如此庞杂的蛋白表达数量为结核疫苗的开发带来了难度。截止目前，全球正在开展临床试验的结核病疫苗共有17个，根据其设计路线可分为减毒活疫苗、灭活分枝杆菌或提取物疫苗、病毒载体疫苗以及亚单位疫苗。然而这些类型的疫苗各有缺点：减毒活疫苗和灭活疫苗存在毒力恢复的风险，并且其效果可能较难超越现有的BCG；病毒载体疫苗诱导免疫反应的能力较弱，且可供选择的病毒载体有限；亚单位疫苗安全性好且容易修饰，但因免疫原性弱，需要与佐剂联合使用，而且开发的周期长。
随着mRNA疫苗技术的不断成熟，与传统疫苗比较，mRNA疫苗具有诸多优势：①设计灵活，易于规模化生产；②安全性较好，无DNA疫苗的基因组整合风险且可通过自然途径降解；③生产过程不涉及活病毒操作，无感染性；④疫苗直接在胞内原位产生抗原蛋白，可同时诱导机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答。现有针对流感病毒、RSV、HSV、HIV、ZIKV、疟原虫（Plasmodium berghei）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等多种传染性病原微生物的mRNA疫苗的临床前或临床研究均表现出优良的免疫保护效果。因此，开发针对M. tb的mRNA疫苗有望弥补现有BCG疫苗的不足。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，能利用其制备mRNA疫苗，不仅能够产生较高的IFN-γ，还能够诱导较强的T细胞免疫应答，采用BCG初免+mRNA加强免疫后，优于BCG单独免疫效果，具有较好的临床应用价值和前景。
本发明的目的之二在于，提供一种编码上述结核分枝杆菌多免疫原抗原的多核苷酸。
本发明的目的之三在于，提供一种表达载体，其包含上述的核酸构建体。
本发明的目的之四在于，提供上述的结核分枝杆菌多免疫原抗原或多核苷酸或核酸构建体或表达载体在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面公开了一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，所述多免疫原抗原为嵌合抗原或混合抗原，所述多免疫原抗原包含：
免疫原I：Ag85A蛋白或其抗原性片段；
免疫原II：ESAT6蛋白或其抗原性片段；
免疫原III：CFP10蛋白或其抗原性片段；
其中，嵌合抗原为一个或多个免疫原I、II、III以串联方式形成的单链；
混合抗原为免疫原I、II、III的混合物。
本发明的部分实施方案中，所述Ag85A蛋白的抗原性片段为具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
和/或，所述ESAT6蛋白的抗原性片段为具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的肽段；
和/或，所述CFP10蛋白的抗原性片段为具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的肽段。
本发明的部分实施方案中，所述嵌合抗原具有如式①所示结构：
式①：A-L1-E-L2-C
其中，A表示结核分枝杆菌Ag85A蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
E表示结核分枝杆菌ESAT6蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
C表示结核分枝杆菌CFP10蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
L1、L2各自独立地为无，或者连接序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数。
本发明的部分实施方案中，所述A为具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的肽段；
和/或，所述E为具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的肽段；
和/或，所述C为具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的肽段。
第二方面，本发明提供了一种多核苷酸mRNA，其编码上述的结核分枝杆菌多免疫原嵌合或混合抗原。
本发明的部分实施方案中，所述多核苷酸mRNA包括如SEQ ID NO:1所示的序列；
或者，如SEQ ID NO:2所示的序列和如SEQ ID NO:3所示的序列。
本发明的部分实施方案中，所述mRNA包括以下结构：P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-poly(A)；
或者包括如下结构：P1-P2-P3-P8-poly(A)及P1-P2-P5-P6-P7-P8-poly(A)；
其中P1为5’ UTR序列，P2为信号肽序列；P3为免疫原I蛋白编码序列，P5为免疫原II蛋白编码序列，P7为免疫原III蛋白编码序列；P4、P6均为linker序列，相同或不同；P8为3’UTR序列；poly(A)为多聚腺苷酸。
本发明的部分实施方案中，所述P1为人β血红蛋白基因的5’ UTR序列；
和/或，P2为人血清免疫球蛋白κ轻链的信号肽序列；
和/或，P3为Ag85A蛋白编码序列，其mRNA序列如SEQ ID NO:16所示；
和/或，P5为ESAT6蛋白编码序列，其mRNA序列如SEQ ID NO:17所示；
和/或，P7为CFP10蛋白编码序列，其mRNA序列如SEQ ID NO:18所示；
和/或，P4和P6相同，linker序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数；
和/或，P8为人α血红蛋白基因的3’ UTR序列；
和/或，poly(A)的个数为80-200个。
作为优选的，poly(A)的个数为100。
本发明的一些实施例中，5’端UTR序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的一些实施例中，3’端UTR序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明的一些实施例中，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明的一些实施例中，linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
第三方面，本发明提供了一种体外转录（IVT）质粒，其用于生产上述多核苷酸mRNA；所述体外转录质粒包括质粒骨架序列和编码结核分枝杆菌抗原肽的DNA序列。
编码结核分枝杆菌抗原肽的DNA序列如SEQ ID NO:8所示或如SEQ ID NO:9所示或如SEQ ID NO:10所示；所述质粒骨架序列包括T7启动子序列、5’末端帽结构、5’端UTR区、信号肽序列、3’端UTR区和3’末端poly(A)尾。
所述5’末端帽结构为m7G(5’)ppp；5’端UTR区具有如SEQ ID NO:4所示序列；信号肽序列如SEQ ID NO:6所示；3’端UTR区具有如SEQ ID NO:5所示序列；3’末端poly(A)尾为80～200个A，进一步优选为100个A。
第四方面，本发明提供了上述结核分枝杆菌多免疫原嵌合或混合抗原或多核苷酸mRNA的应用，所述应用为在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
本发明的部分实施方案中，所述药物为疫苗。
本发明的部分实施方案中，所述疫苗为mRNA疫苗。
本发明的部分实施方案中，所述药物为用于增强卡介苗免疫效果的药物。
所述疫苗包括疫苗载体和上述多核苷酸mRNA。
本发明的部分实施方案中，所述疫苗载体包括阳离子脂质体、阳离子蛋白、阳离子聚合物或阳离子脂质纳米颗粒中的一种，优选为阳离子脂质体或阳离子脂质纳米颗粒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用mRNA疫苗技术可解决减毒活疫苗、灭活分枝杆菌或提取物疫苗、病毒载体疫苗以及亚单位疫苗等技术手段方面的缺点。本发明设计并实施的mRNA疫苗可以同时表达3个结核分枝杆菌抗原，无需佐剂配伍，采用LNP包裹mRNA后免疫小鼠不仅能够产生较高的体液免疫，还能够诱导较强的T细胞免疫应答，采用BCG初免+mRNA加强免疫后，优于BCG单独免疫效果，具有较好的临床应用价值和前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的结核分枝杆菌mRNA疫苗AC58、Ag85A和EC21的结构示意图；其上标注了mRNA疫苗的各个区段，其中，5’UTR表示5’端非翻译区，3’UTR表示3’端非翻译区，Poly(A)表示多聚腺苷酸尾，linker表述抗原间的连接序列。
图2为小鼠接种AC58 mRNA和AC58mix mRNA疫苗后14天血清中抗原特异性IgG滴度考察结果图。
图3为小鼠接种AC58 mRNA和AC58mix mRNA疫苗后21天血清中抗原特异性IgG滴度考察结果图。
图4为本发明实施例4中所采用的疫苗免疫小鼠程序和采样程序示意图；其中A表示mRNA两针免疫的程序示意图，B表示BCG初免+mRNA加强免疫的程序示意图，两组免疫策略中均以BCG免疫为对照。
图5为本发明实施例4中各组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数考察结果图。
图6为本发明实施例4中各组小鼠免疫mRNA疫苗后诱导的抗原特异性CD4+和CD8+百分比考察结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或试剂提供商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
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T7 RNA体外转录试剂盒：商品名T7 High Yield RNA Transcription kit，货号E131，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司提供；
RNA纯化磁珠，商品名VAHTS RNA Clean Beads，货号N412-02，南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供；
加帽试剂盒，商品名Vaccinia Capping System，货号DD4109-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供；
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小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供；
BCG菌株丹麦株（BCG Danish strain），上海晶诺生物科技有限公司提供；
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抗小鼠CD4流式抗体，商品号E-AB-F1097S，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司提供；
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固定/透化试剂盒，商品号E-CK-A109，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司提供。
实施例1 结核分枝杆菌三个 mRNA构建体的mRNA编码区的序列设计
分别构建三个mRNA构建体：AC58 mRNA构建体、Ag85A mRNA构建体和EC21 mRNA构建体，该三个mRNA构建体的结构具体如附图1所示。
构建方法如下：选取结核分枝杆菌H37Rv菌株（AL123456.3）为参考序列，获取Ag85A、ESAT6和CFP10等3个抗原的野生型序列。进一步对其抗原的分子量、信号肽和跨膜域进行了预测分析，根据3个抗原的分子结构特点设计了3个mRNA抗原序列，分别为AC58 mRNA抗原、Ag58A mRNA抗原和EC21 mRNA抗原。
其中，AC58 mRNA抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，其中1-338位：Ag85A的氨基酸序列；339-353位：linker的氨基酸序列；354-448位：ESAT6的氨基酸序列；449-463位：linker的氨基酸序列；364-563位：CFP10的氨基酸序列。
Ag58A mRNA抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
EC21 mRNA抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。其中，1-22位：信号肽的氨基酸序列；23-117位：ESAT6的氨基酸序列；118-217位：CFP10的氨基酸序列。
然后对AC58 mRNA抗原、Ag58A mRNA抗原和EC21 mRNA抗原以人为宿主进行密码子优化，获得AC58 mRNA抗原、Ag58A mRNA抗原和EC21 mRNA抗原的DNA编码序列。其中，AC58mRNA抗原的DNA编码序列如SEQ ID NO:8所示，Ag58A mRNA抗原的DNA编码序列SEQ ID NO:9所示，EC21 mRNA抗原的DNA编码序列SEQ ID NO:10所示。
编码AC58抗原的mRNA序列，由Ag85A、ESAT6和CFP10串联组成，具体如SEQ ID NO:1所示。其中1-1014位：Ag85A抗原的mRNA序列；1015-1059位：linker的mRNA序列；1060-1344位：ESAT6抗原的mRNA序列；1345-1389位：linker的mRNA序列；1390-1695位：CFP10抗原的mRNA序列。
编码Ag85A抗原的mRNA序列如SEQ ID NO:2所示。
编码EC21抗原的mRNA序列，是由ESAT6和CFP10串联组成，具体如SEQ ID NO:3所示。其中1-66位：信号肽序列，67-351位：ESAT6抗原的mRNA序列，352-657：CFP10的mRNA序列。
实施例2 mRNA体外转录与脂质纳米颗粒包装
1. mRNA表达质粒构建
选择本单位自主设计的pIVT-D2作为质粒载体，通过常规分子生物学手段引入mRNA疫苗的抗原编码序列和其他DNA表达元件。pIVT-D2质粒包括质粒骨架序列和编码结核分枝杆菌抗原肽的DNA序列。所述质粒骨架序列包括复制起点Ori、T7启动子序列、5’端UTR区、Kozak序列、3’端UTR区和3’末端poly(A)尾。按照从上游到下游的顺序依次包括：
（1）T7启动子；
（2）在编码区上游的5’端UTR序列（三种mRNA疫苗的5’端UTR序列相同，均为如SEQID NO:4所示序列）；
（3）信号肽编码序列（如SEQ ID NO:4）；
（4）疫苗抗原的DNA编码序列（AC58 mRNA抗原如SEQ ID NO:8所示、Ag85A mRNA抗原如SEQ ID NO:9所示和EC21 mRNA抗原如SEQ ID NO:10所示）；
（5）下游的3’端UTR序列（几种mRNA疫苗的3’端UTR序列相同，均为如SEQ ID NO:5所示序列）；
（6）和多聚腺苷酸尾（polyA-tail）。最终得到pIVT-D2-Ag85A、pIVT-D2-EC21、pIVT-D2-AC58 三种mRNA疫苗的表达质粒。
2. mRNA的体外转录与加帽
使用限制性内切酶BspQI对上述三种mRNA疫苗的表达质粒进行酶切，将其线性化；使用采用磁珠法对其进行DNA纯化；对纯化的线性DNA采用Nano-drop测定浓度，取200～300ng进行凝胶电泳检测其酶切效率。接下来，基于线性DNA模板，使用T7 RNA体外转录试剂盒进行体外转录，获得体外转录mRNA（为了降低mRNA的免疫原性，采用N1-甲基假尿嘧啶替代尿嘧啶）；然后使用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）对线性化的DNA模板进行消化处理；接着采用磁珠法对mRNA进行纯化以获得提纯的体外转录mRNA。
使用加帽试剂盒对提纯的体外转录mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件；其后，采用磁珠法对加帽后的mRNA进行纯化，获得纯化的、经5’端加帽修饰的mRNA。
3. 脂质体包装mRNA
将氨基阳离子脂质SM-102、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、胆固醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（DMG-PEG2000）按照50:10:38.5:1.5的摩尔比进行混合，然后使用迈安纳公司生产的纳米药物生产系统INanoTML，将混合物与上述5’端加帽修饰的mRNA（体积比1:3）进行混合、包装，分别得到脂质体包装的蛋白Ag85A mRNA-LNP、EC21mRNA-LNP和AC58 mRNA-LNP。包装完成后，使用透析的方法更换缓冲溶液为PBS。
最后，使用Thermo Fisher公司的Quan-iT Ribo green RNA reagent试剂盒对mRNA包装效率进行鉴定，同时使用zeta电位分析仪和马尔文粒度分析仪分别测定mRNA疫苗的电位和粒径，使得包装效率、电位和粒径符合mRNA疫苗的标准。
表1 mRNA-LNP疫苗的质量指标
4. AC58mix mRNA-LNP的制备
为制备Ag85A mRNA-LNP和EC21 mRNA-LNP的mRNA混合苗AC58mix mRNA-LNP，将通过上述方法制备和包装的Ag85A mRNA-LNP、EC21 mRNA-LNP按1:1的质量比进行混和，得到AC58mix mRNA-LNP。
实施例3 肺结核mRNA疫苗接种剂量探究实验
1. 实验动物免疫和样品采集
本实施例中，使用6～8周龄的BALB/c品系的小鼠进行动物实验；
实验分组：实验组分为mRNA疫苗免疫组和阴性对照组。其中mRNA疫苗免疫组包括：AC58 mRNA疫苗组以及混合mRNA疫苗AC58 mix免疫组；其中，AC58 mRNA疫苗组包括1μg免疫剂量组（G1）、5μg免疫剂量组（G2）和25 μg免疫剂量组（G3）；混合mRNA疫苗AC58 mix免疫组包括1μg免疫剂量组（G4）、5μg免疫剂量组（G5）和25μg免疫剂量组（G6）；阴性对照组为PBS免疫对照组（G7）。每组4只小鼠，雌雄各半。
mRNA疫苗免疫组的所有小鼠在第0天和第14天分别免疫接种一剂实施例2中所制备的AC58 mRNA疫苗或者实施例2中所制备的混合mRNA疫苗AC58mix，接种部位为后腿肌肉，接种剂量设3个梯度，分别为每只小鼠每次接1、5和25 μg mRNA疫苗（体积为100 μL）。阴性对照组的小鼠则在同样的时间经后腿肌肉注射100 mL PBS溶液。分别在每次接种疫苗后1～4 d 内观察小鼠的临床表现；在接种疫苗后第14天和第21天采集小鼠血清样本，用于检验免疫血清的结合抗体滴度和中和抗体滴度。
观察小鼠的临床表现发现，接种疫苗后小鼠多表现为饮水减少、被毛粗乱、扎堆和粪便干燥的症状，AC58mix组的小鼠症状持续3天，而PBS仅在注射后的0.5天出现轻微的症状，1天后即可恢复；随着疫苗接种剂量的增加，小鼠临床症状的也表现越为严重，并且持续时常也增大，其中25 μg接种剂量的小鼠多持续长达3天，而1 μg基本都在1天后恢复，如表2所示。
表2 mRNA疫苗免疫后小鼠的临床症状
2. 肺结核mRNA疫苗免疫小鼠血清的抗原特异性IgG检测
（1）包被：使用PBS将大肠杆菌重组表达的蛋白（Ag85A、EC21和AC58，上海晶诺生物科技有限公司提供）稀释至2 μg/ml，使用排枪按照每孔100 μl加入96孔酶标板中，4℃包被过夜；
（2）封闭：每孔使用150μl的磷酸缓冲液（PBST）清洗3次，拍干板中液体。使用1mg/ml的牛血清血蛋白（BSA）溶液加入96孔酶标板于37℃封闭1.5h；
（3）加样：每孔使用150μl的PBST清洗3次，拍干板中液体。将实施例3中的各组小鼠血清样本按照1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200的稀释梯度进行倍比稀释，再按照每孔100μl将稀释的血清加入96孔酶标板中，37℃孵育2h；
（4）二抗孵育：每孔使用150μl的有PBST清洗4次，拍干板中液体。使用1mg/ml的BSA将羊抗鼠IgG二抗按照1:50000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h；
（5）显色：每孔使用100μl的PBST（含0.1%吐温20）清洗3次，拍干板中液体。加入100μl TMB显色液，室温避光显色10～20 min；
（6）终止：每孔加入100μl的2M HCl终止显色，使用酶标仪于450nm读数；
（7）采用终点稀释度（Endpoint dilution）来评价抗原特异性IgG的滴度，即血清产生的吸光度(如上所述，450nm的吸光度)大于背景值2.1倍时对应的血清稀释倍数。
免疫小鼠血清的抗原特异性IgG检测结果如图2（14天）和图3（21天）所示。结果表明：
AC58 mRNA-LNP疫苗免疫14天、21天后，1μg剂量条件下Ag85A、ESAT6-CFP10、AC58蛋白抗原特异性抗体滴度均无明显上升，5μg剂量条件下Ag85A、EC21抗原特异性抗体滴度与PBS组相比有明显上升，25μg剂量条件下Ag85A、ESAT6-CFP10、AC58蛋白抗原特异性抗体滴度有显著上升；
AC58mix mRNA-LNP疫苗免疫14天、21天后，1μg剂量条件下Ag85A、ESAT6-CFP10、AC58抗原特异性抗体滴度均无明显上升，5μg剂量条件下Ag85A抗原特异性抗体滴度与PBS组相比有明显上升，25μg剂量条件下Ag85A、ESAT6-CFP10、AC58抗原特异性抗体滴度有显著上升。
AC58 mRNA-LNP和AC58 mix mRNA-LNP具有相同的抗原组成，二者在单一抗原特异性IgG具有相同的水平。然而，考虑到后期开发工艺，AC58 mix mRNA-LNP涉及到2个抗原的表达质粒，而AC58 mRNA-LNP仅涉及单个质粒，因此，AC58 mRNA-LNP较AC58 mix mRNA-LNP更具有下游开发的优势。
实施例4 肺结核mRNA疫苗的免疫学评价
通过上述mRNA疫苗免疫剂量的探究证实，以5μg/只的小鼠接种剂量较为合适。同时从抗原特异性IgG的滴度和血清中细胞因子的分泌情况来看，AC58 mRNA-LNP和AC58mixmRNA-LNP的效果差异不明显，结合后期开发工艺，拟选择AC58开展进一步研究。
1. 实验动物免疫和样品采集
本实施例中，使用6～8周龄的BALB/c品系的小鼠进行动物实验；实验组分为AC58mRNA-LNP疫苗2针免疫组、BCG初免+AC58 mRNA-LNP疫苗加强免疫组、BCG阳性对照组。
AC58 mRNA-LNP疫苗的接种部位为后腿肌肉，接种剂量为5μg AC58 mRNA-LNP疫苗（体积为100μl）；BCG的接种部位为腹股沟皮下注射，每只小鼠的接种剂量为1ⅹ106CFU（体积为100 μl）。AC58 mRNA-LNP疫苗2针免疫组和对应的BCG阳性对照组在接种疫苗后第28 d采集小鼠脾脏样本，加强免疫组和对应的BCG阳性对照组则在免疫后第42 d采集小鼠脾脏样本，用于检验细胞免疫应答。具体的免疫小鼠及采样程序如图4所示。
2. 小鼠脾脏样品处理
（1）无菌取脾脏后用预冷的PBS溶液清洗2次，置于200目的筛网上用注射器的推头研磨，研磨过程中要确保脾脏始终在RPMI 1640培养液中，充分研磨后的细胞；将研磨后的细胞悬液收集至15ml离心管中，短暂离心去上清后加入2ml红细胞裂解液；
（2）将脾细胞用红细胞裂解液裂解2min后，加入2倍体积的RPMI 1640培养液洗清洗1遍，留离心后的底层细胞；
（3）加入10ml的Ficoll淋巴细胞分离液，吹打混匀后2200rpm室温离心20min，进一步分离云雾层的脾淋巴细胞；
（4）将Ficoll分离后的脾脏细胞，用RPMI 1640培养液洗两遍，1500rpm，室温下离心10min；
（5）弃上清，用1mL小鼠完全培养基重悬细胞，显微镜下细胞计数，将细胞浓度调整至5×106个细胞/ml浓度备用。
3. ELISpot检验
（1）用稀释好的抗小鼠IFN-γ coating antibody包被96孔PVDF板，每孔加入100μL，4℃包被过夜。
（2）每孔加200μL完全培养基（含有10%FBS、1%双抗、1%L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养液）洗1次板，用200μL完全培养基于室温条件下封闭2h，备用。
（3）弃掉封闭液，在96孔ELISPOT板中加入刺激液（每孔加入刺激液100μL，所有刺激均用小鼠完全培养基配制）。实验孔中加入100μL结核抗原蛋白（Ag85A和CFP10），抗原刺激浓度为10μg/mL（每孔200 μL培养体系）。阳性对照孔中加入5μg/mL ConA，阴性孔中加入100μL完全培养基作为空白对照。加完刺激液后，将本实施例中步骤2分离的脾胀淋巴细胞悬液100 μL，即每孔细胞数为2×105个细胞。
（4）96孔ELISPOT板置CO2培养箱中培养20h（注意：不要挪动板子）。
（5）按照小鼠IFN-γ ELISPOT 试剂盒说明书，进一步进行酶学和显色反应，用蒸馏水冲洗以终止显色反应。最后用蒸馏水充分洗涤5次ELISPOT板，于室温避光、风干过夜。用酶联斑点计数仪计算斑点数。
由于疫苗涉及的抗原多，选择2个单一抗原（Ag85A和CFP10）进行脾淋巴细胞刺激。结果如图5所示，与阳性对照BCG免疫的小鼠对比，mRNA 两针免疫的小鼠的抗原特异性IFN-γ均低于BCG免疫的小鼠。针对BCG初免+mRNA加强免疫后抗原特异性IFN-γ的分泌，与BCG免疫的阳性对照相比，BCG初免+mRNA加强免疫的策略诱导更显著的IFN-γ分泌，且比mRNA两针免疫的策略也更显著。
4. ICS检验
（1）将本实施例中步骤2分离的脾淋巴细胞按照106个细胞/孔铺96孔细胞板，每孔加100μl细胞悬液；
（2）每孔加100μl刺激液，所有刺激均用小鼠完全培养基配制，即每孔实验体系为200μl。实验孔中加入10μg/ml结核抗原蛋白（Ag85A和CFP10）；阴性孔中加入100μl完全培养基作为空白对照。实验孔和阴性孔均在37℃条件下孵育20 h。阳性对照孔中加入含有50ng/ml 豆蔻酰佛波醇乙酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）和500 ng/mlIonomycin的混合刺激液，阳性对照孔的刺激在实验孔刺激结束前5 h加入；
（3）细胞刺激结束前5 h，每孔加入GolgiStop Solution，阻止细胞分泌的细胞因子释放到上清中；
（4）细胞刺激结束，96孔板离心，2000rpm，5min。弃上清，细胞用PBS洗一遍，然后进行流式细胞染色；
（5）细胞表面分子染色：分别用FITC标记抗小鼠CD3流式抗体、Elab Fluor® Red780标记抗小鼠CD4流式抗体、PerCP/Cyanine5.5标记抗小鼠CD8流式抗体，用FACS Buffer（含2% FBS的PBS）稀释抗体到工作浓度，每孔加100μl染色体系重悬细胞，4℃避光染色30min。
（6）胞外染色结束后，每孔加100μl的FACS Buffer后离心，弃上清，每孔再加200μl的FACS Buffer洗一遍（离心条件：2000rpm，5min），弃上清。
（7）细胞固定和破膜：用Fixation/Permeabilization kit中的破膜液，每孔加入100μl破膜液重悬细胞，4℃避光破膜20-30 min。
（8）每孔加100μl破膜洗液（将试剂盒中的洗液稀释到1×后使用）后离心，弃上清，每孔再加200μl破膜洗液洗一遍（离心条件：2000rpm，5min），弃上清。
（9）胞内细胞因子染色：分别用藻红蛋白PE（phycoerythrin）标记抗小鼠IFN-γ流式抗体、别藻蓝蛋白APC（allophycocyanin）标记抗小鼠IL-2流式抗体，用1×破膜稀释抗体到工作浓度，每孔加入100μl抗体混合液重悬细胞，4℃避光染色40min。
（10）胞内染色结束后，每孔加100μl破膜洗液后离心，弃上清，每孔再加200μl破膜洗液洗两遍（离心条件：2000rpm，5min），弃上清。
（11）用200μl PBS重悬细胞，将细胞转移到流式管中。用流式细胞仪进行检测。
T细胞在应答结核分枝杆菌的感染中发挥了关键性的作用。采用流式细胞术评估疫苗免疫后抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的应答情况。针对mRNA两针免疫的小鼠，流式细胞术的结果如图6所示，经单一抗原（Ag85A和CFP10）刺激的小鼠脾淋巴细胞均会分泌CD4+和CD8+细胞的功能性细胞因子。与BCG阳性对照相比，无论是AC58 mRNA-LNP两针免疫，还是BCG初免+mRNA-LNP加强免疫后，均检测到较高比例CD4+和CD8+ T细胞分泌的IFN-γ、IL-2；对比AC58 mRNA-LNP两针免疫与BCG初免+mRNA-LNP加强免疫之间小鼠CD4+和CD8+ T细胞分泌的IFN-γ、IL-2发现，BCG初免+mRNA-LNP加强免疫的方式诱导较高的细胞因子分泌。现有技术“Immune cell interactions in tuberculosis（Flynn JL，Chan J.. Cell. 2022Dec 8；185(25)：4682-4702）”公开了IFN-γ和IL-2等Th1型细胞因子是宿主抵抗M. tb感染的关键分子，宿主分泌较高的IFN-γ和IL-2可降低组织器官中的荷菌数。由此可见，采用BCG初免+mRNA加强免疫的方式可提高机体预防M. tb感染的效果。
综上，本发明的多抗原嵌合mRNA疫苗可以激发针对结核分枝杆菌的特异性免疫反应，因而，有望被开发成肺结核的预防和/或治疗性疫苗产品，具有极大的临床应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1. 一种多核苷酸mRNA，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的多核苷酸mRNA的应用，其特征在于，在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为用于增强卡介苗免疫效果的药物。
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