CN105727278B - 一种羊口疮重组蛋白抗原疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物由羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047重组蛋白和佐剂组成。本发明还提供一种羊口疮重组蛋白抗原疫苗，其有效成分为上述的免疫原性组合物。本发明的疫苗免疫小鼠后产生针对于这两种重组蛋白特异性的抗体，而且抗体效价在21天可达10万；两种重组蛋白抗原混合与佐剂配伍，既诱导产生IgG1抗体，也产生IgG2a抗体，表明这种疫苗可以促进抗体的免疫应答；两种重组蛋白抗原混合与佐剂配伍，产生的细胞因子既有Th1型又有Th2型的，这说明这种疫苗既能够引发细胞免疫也能够引发体液免疫应答，而且两种蛋白配伍后主要促进细胞免疫应答。

Description

一种羊口疮重组蛋白抗原疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫疫苗技术领域，具体涉及一种羊口疮重组蛋白抗原疫苗及其制备方法。
背景技术
羊传染性脓疱(Contagious ecthyma)又称羊口疮(Orf)，是由羊口疮病毒(Orfvirus,ORFV)引起的羊的一种病毒性传染病，也可以感染人。感染羊口疮病毒的羊生产性能下降，采食困难、消瘦并长期带毒，给养羊业及饲养人员的健康带来严重的危害。该病几乎遍布全世界所有养羊的国家和地区，而且我国是该病流行严重的国家，每年感染ORFV的羊不少于500万只。
目前对该病尚无特效的治疗方法，只能采取临床外伤处置及支持疗法，在防控上国内外主要采取接种羊口疮弱毒活疫苗进行预防，但这种疫苗仍不能够彻底消除和控制该病，在免疫力和安全性方面均存在一定的缺陷，因此创制安全、高效的新型疫苗势在必行。亚单位疫苗免疫动物既可以避免弱毒疫苗株基因重排而致毒力返强的风险，又可以避免灭活疫苗灭活不彻底散毒的可能性，可诱导全面而持久的免疫反应，因此，亚单位疫苗是减毒活苗和灭活苗的首选替代品。
羊口疮病毒（ORFV）的成熟病毒粒子呈砖形或椭圆形毛线团样外观，外层由较厚的囊膜包裹，与VACV相似也具有IMV、EEV等多种病毒粒子形式（Rziha et al., 2003）。单独利用其中的一种蛋白作为疫苗抗原保护效果较差。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种既含有羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白又含有IMV ORF047重组蛋白的羊口疮重组蛋白抗原疫苗，本疫苗克服了活疫苗及弱毒疫苗在免疫方面的缺陷，而且具有安全、高效、廉价的特点；同时提供一种制备这种疫苗的方法。
在痘苗病毒的研究中将IMV L1和EEV A33同时构建到同一个启动子下形成的DNA疫苗免疫小鼠，二者同时表达能够引发高的免疫应答及免疫保护效率，而单独利用其中的一种蛋白作为疫苗抗原保护效果较差。ORF059基因编码的蛋白F1L是ORFV的主要结构蛋白，也是主要的免疫优势抗原，能够刺激机体产生抗体以利于机体清除病原体；ORF047基因编码成熟病毒粒子的膜蛋白L1。在痘苗病毒的研究中已表明L1是一种与IMV膜蛋白必需的豆蔻酰化蛋白，而且在IMV粘附和渗透中起着重要的作用，同时利用L1 DNA疫苗免疫动物能够产生高的中和抗体。本发明中为了克服单一重组蛋白疫苗的缺点，将具有免疫优势抗原的EEV蛋白ORF059和能够产生强的中和病毒抗体IMV蛋白ORF047蛋白联合并配伍佐剂，制备成一种重组亚单位新型疫苗，来弥补单一蛋白疫苗的不足，这种疫苗既可以促进体液免疫也可以促进细胞免疫，为开发预防及根除该疾病的疫苗提供了好的理论基础。
本发明的第一个目的是提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物由羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047重组蛋白和佐剂组成。
羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白的氨基酸序列是指ORF059基因的全长337氨基酸，具体参见序列表SEQ ID No.2；
IMV ORF047重组蛋白的氨基酸序列是指IMV ORF047的胞外区183氨基酸，具体参见序列表SEQ ID No.4。
上述羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047重组蛋白为原核表达系统表达的重组蛋白。
作为优选，所述佐剂为ISA201佐剂。
作为优选，所述疫苗中羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白的浓度为1mg/mL、IMVORF047重组蛋白的浓度为1mg/mL。
作为优选，所述羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047重组蛋白和佐剂的体积比为：1:1:2。
本发明的第二个目的是提供一种羊口疮重组蛋白抗原疫苗，所述疫苗的有效成分为上述任一所述的免疫原性组合物。
本发明的第三个目的是提供上述疫苗的制备方法，步骤如下：
（1）制备羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白；
（2）制备IMV ORF047重组蛋白；
（3）将羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047重组蛋白、佐剂混合制剂，得到疫苗。
本发明的第四个目的是提供上述免疫原性组合物或疫苗在制备预防羊口疮的药物中的应用。用于防止羊口疮病毒在羊中的传播，减少羔羊的发病率。
本发明的第五个目的是提供编码上述的羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMVORF047重组蛋白的基因分子。
比如，编码上述的羊口疮EEV囊膜ORF059重组蛋白的基因序列为序列表SEQ IDNo.1，编码IMV ORF047重组蛋白的基因序列为序列表SEQ ID No.3。
本发明的第六个目的是提供包含上述基因的表达载体。
本发明的第七个目的是提供包含上述表达载体的宿主细胞。
本发明中的疫苗与现有的疫苗相比，具有明显的特点和优势：首先，本发明中的抗原既包括免疫优势EEV蛋白又包含有产生较强中和病毒能力抗体的IMV蛋白，这对一个基因组较大的痘病毒的防控是较合理的；其次本发明中应用了ISA201佐剂，该佐剂是水包油形式的佐剂，配制疫苗简单方便、不存在乳化的麻烦，成本低廉，而且效果理想；最后本发明中的疫苗包含了不同病毒粒子形式上的重组蛋白抗原，克服了单一蛋白保护效果不全面，也不存在弱毒苗毒力返强的缺点。
对于本发明制备的新型羊口疮重组蛋白抗原疫苗效果好主要表现在：（1）该疫苗免疫小鼠后产生针对于这两种重组蛋白特异性的抗体，而且抗体效价在21天可达10万；（2）两种重组蛋白抗原混合与佐剂配伍，既诱导产生IgG1抗体，也产生IgG2a抗体，表明这种疫苗可以促进抗体的免疫应答；（3）两种重组蛋白抗原混合与佐剂配伍，产生的细胞因子既有Th1型又有Th2型的，这说明这种疫苗既能够引发细胞免疫也能够引发体液免疫应答，而且两种蛋白配伍后主要促进细胞免疫应答。细胞免疫对抵抗羊口疮病毒的感染十分重要，这为羊口疮的根除及预防提供坚实的基础。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为pET-30-ORF059和pET-30-ORF047-183AA(ORF047共有245个AA,前面 183AA是胞外区，而剩余的是跨膜区和胞内区，本申请表达的是胞外区)的原核表达及westernbloting鉴定图；
图2为免疫小鼠21d血清中IgG1、IgG2a测定结果图；
图3为免疫小鼠14d脾淋巴细胞分泌IFNγ、IL-6测定结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明的实施例分成2个部分完成，实施例一：ORF059、ORF047重组蛋白抗原的制备；实施例二 ：重组蛋白抗原新型疫苗的制备及免疫效果试验。
实施例1 羊口疮ORF059、ORF047重组蛋白的制备
1 ORF059、ORF047表达载体的构建及表达蛋白的纯化
本发明利用实验室已分离鉴定的羊口疮病毒株ORFV/GSYM/2012/China，克隆扩增基因组中的ORF059基因(王盈盈等，2013)和ORF047基因，设计原核表达引物，克隆获得目的片段，通过限制性内切酶消化目的片段和原核表达载体，进一步通过连接酶连接目的基因和载体，然后转化BL21感受态细胞，通过诱导剂诱导表达目的蛋白，通过镍层析柱纯化目的蛋白。具体如下：
1.1引物设计
分析本实验室已经克隆的ORF059、ORF047 基因序列，利用Olig06.0软件设计表达引物，并利用seman软件分析原核表达载体Pet-30a（+）及目的基因的酶切位点:
ORF059上游引物： 5'-CCGGAATTCATG GAT CCA CCC GAA ATC ACG-3'，划线部分为EcoRⅠ限制酶切位点；下游引物：5'-CCGCTCGAGTCA CAC GAT GGC CGT GAC C-3'，划线部分为XhoⅠ限制酶切位点。
ORF047上游引物： 5'-CCG GAA TTC ATG GGG GCC GCC AGC A，划线部分为EcoRⅠ限制酶切位点；下游引物：CGG AAG CTT TTA CTT GCC GGC CTC CTG GTC，划线部分为Hind III限制酶切位点。
ORF059 PCR总反应体积为50μL：灭菌去离子水40μL，10×PCR buffer 5μL，2.5 mMdNTP Mixture 4μL， 含有ORF059基因质粒0.3μL，上、下游引物（50μmol/L）各0.1μL，rTaq酶0.5μL；表达片段ORF059 PCR扩增条件：95℃ 5min；94℃ 50 s，52℃50s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5 min。
ORF047 PCR总反应体积为50μL：灭菌去离子水40μL，10×PCR buffer 5μL，2.5 mMdNTP Mixture 4μL， 含有ORF047 基因质粒0.3μL，上、下游引物（50μmol/L）各0.1μL，rTaq酶0.5μL；表达片段ORF047PCR扩增条件：95℃ 5min；94℃ 50 s，65℃ 50s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5 min。
1.2表达载体的构建
利用EcoRⅠ和XhoⅠ将ORF059（1011bp）和pET-30a载体双酶切，利用EcoRⅠ和Hind III将ORF047（552bp）和pET-30a载体双酶切，并回收，在16℃连接12-16h，连接产物转化BL21（DE3）感受态，挑取单克隆进行PCR、酶切和测序鉴定，ORF059的基因序列参见序列表SEQ ID No.1，ORF047的基因序列参见序列表SEQ ID No.3。
测序正确的菌株，按 1%的比例接种到含有50ug/mL Amp的LB培养基中，220rpm/min在37℃摇床震荡摇振2-3h，当OD值达到0.6左右，加诱导剂IPTG终浓度为0.1mM，诱导5h，离心收集菌体。菌体SDS-PAGE电泳，并利用抗-his标签抗体western bloting验证表达的蛋白是否正确。
Western bloting 检测结果表明，两种目的蛋白表达正确，而且均具有反应原性，其中ORF059大小约42KD（如图1A），而ORF047大小约为26KD（如图1B）。ORF059的氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.2，ORF047-183AA的氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.4。
图1A、1B为pET-30-ORF059、pET-30-ORF047-183AA原核表达及westernbloting鉴定图。图1A中M是蛋白marker；1，2为表达的pET-30-ORF059重组蛋白，大小约为45Kd；3为westernbloting鉴定目的蛋白，其能够与抗his标签的抗体反应，说明表达的目的蛋白正确，具有免疫反应原性；图1B中M是蛋白marker；1，2，3为表达的pET-30-ORF047-183AA重组蛋白，约为26Kd；4为western bloting鉴定目的蛋白，其能够与抗his标签的的抗体的反应，说明表达的目的蛋白正确。
1.3蛋白的纯化
（1）将确定已表达的pET-30a-ORF047-183AA、pET-30a-ORF059重组菌，按照1.2中的诱导培养条件扩大培养，离心收集菌体；
（2）菌体在磷酸缓冲液中洗涤两次，并用30mL缓冲液悬浮，在-70℃冰箱中反复冻融两次，利用超声破碎仪超声(功率为3800w，超声8s，停8s，超声共1h)，12000rpm，10min离心收集沉淀；
（3）分别利用2M和4M的尿素洗涤沉淀，共洗涤2次，利用8M的尿素溶解沉淀，室温放置1h后，12000rpm，20min离心，收集上清；
（4）将上清与装有镍填料纯化柱结合1h后，利用磷酸缓冲液洗涤5次，并控制流速（约为1mL/min），洗掉杂蛋白；
（5）再利用含有50mM、100mM、200mM、300 mM咪唑的磷酸缓冲液分别洗脱目的蛋白，收集蛋白；
（6）再分别利用含有逐渐递减的尿素浓度（6M、4M、2M）的磷酸缓冲液透析蛋白，去除大浓度的尿素，并利用超滤管浓缩蛋白，并利用BCA法测定蛋白的浓度。调整蛋白的浓度为2mg/mL。
实施例2 重组蛋白抗原新型疫苗的制备及免疫效果试验
2.1材料与方法
2.1.1疫苗的制备
本发明中的疫苗由前述实施例制备的重组蛋白ORF047，ORF059，ORF047+ORF059分别作为抗原与市售佐剂ISA201佐剂（法国SEPPIC公司研制）配伍，低速搅拌混合后制备含有不同抗原蛋白的疫苗，加入的佐剂与抗原的体积比为1:1。重组蛋白组ORF047+ORF059中，ORF047与ORF059的体积比为1:1。
2.1.2试验动物与免疫
50只6-8周龄的雌性BALB/C小鼠购自兰州兽医研究所实验动物中心。每组10只共分为ORF047重组蛋白抗原疫苗组、ORF059重组蛋白抗原疫苗组、ORF047+ORF059重组蛋白抗原疫苗组，佐剂对照组，PBS对照组，将2.1.1中制备好的不同重组蛋白抗原疫苗在0d和14d皮下分点注射免疫，二免后21d从尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA法检测特异性抗体的类型及抗体的水平。
通过间接ELISA法检测特异性ORF047及ORF059 IgG1和IgG2a 抗体水平，结果显示，三个疫苗组在加强免疫后的第21d抗体滴度高达1：10万；但是不论单一抗原还是复合抗原都能够产生抗原特异性的IgG1和IgG2a抗体，以产生的IgG1为主，IgG2a的量较少，但不论是哪种抗体，其滴度在各组之间的差异不显著（参见图2A,2B）。
图2为免疫小鼠21d血清中IgG1、IgG2a测定结果图。
图2A为二次免疫21d小鼠血清中特异性ORF047的IgG1、IgG2a结果。利用纯化的ORF059重组蛋白包被96孔ELISA板，将收集的每只小鼠血清稀释8个滴度（1:800开始，倍比稀释，直到1:102400），利用抗小鼠的IgG1、IgG2a HRP二抗检测， 结果表明，ORF047、ORF059重组蛋白二者联合的疫苗免疫小鼠与单一的ORF047重组蛋白疫苗组相比，IgG1水平有所下降，但差异不显著；
图2B为二次免疫21d小鼠血清中特异性ORF059的IgG1、IgG2a结果。检测方法同上，结果表明，ORF059、ORF047二者联合的疫苗组与单一的ORF059疫苗组相比，抗体水平与单一的抗原免疫相比没有降低；但与IgG1相比，IgG2a产生的较少，同时表明二者联合应用产生的抗体以IgG1为主。
2.1.3免疫小鼠血清或脾淋巴细胞因子含量的检测
试验组小鼠颈椎脱臼处死，在70%乙醇中浸泡3分钟，无菌取出红色长条状的脾脏；用眼科剪将脾脏剪碎置300目的网上，用注射器内芯轻轻研磨脾脏，边研磨边用PBS冲洗细胞；将获得的脾细胞悬液用淋巴细胞分离液悬浮（淋巴细胞分离液与脾细胞悬液体积比为3:4），2500rpm室温离心15分钟；中间出现一层白色的膜状夹层，用吸管轻轻吸取中间白膜置于另一新的离心管中；加入PBS轻轻混匀，然后2000rpm离心5min；弃去上清，重复上述步骤2次；离心管中加入RPMI1640完全培养基后，取一定量台盼蓝染色并在显微镜下计数，并调整细胞的浓度为1×107/ml。
取上述制备好的小鼠脾淋巴细胞加入96孔细胞培养板中，每孔加入100μl细胞悬液；每只小鼠设3个重复，每孔都加入ORF047+ ORF059重组蛋白（5μg/ML），完全1640培养基作为空白对照组；终浓度5μg/ML的未免疫小鼠制备的脾细胞经ConA刺激后作为阳性对照，在5% C02、37℃培养箱中培养，24h收集上清。利用小鼠的IL-6、IFN-γ试剂盒检测刺激的脾细胞上清中分泌的细胞因子含量。
加强免疫后的14d，每组剖杀3只小鼠制备免疫脾细胞，分别用特异性的ORF059、ORF047抗原刺激后，培养24h后收集上清，ELISA试剂盒检测脾细胞分泌IFN-γ和IL-6的含量（其中以未免疫小鼠制备的脾细胞经ConA刺激后作为阳性对照），结果表明（参见图3A和图3B)：
ORF047+ORF059重组复合蛋白与佐剂配制的疫苗更有效的诱导免疫细胞分泌IFN-γ，含量高达964.66pg/106cell，是单一ORF047疫苗组的1.85倍，是ORF059疫苗组的2.68倍，与 F1组相比差异显著（p<0.05）；是PBS对照组的37倍，差异极显著（p<0.01），而与单一的ISA201相比，差异显著（p<0.05）。
ORF047+ORF059重组复合蛋白与佐剂配制的疫苗ORF047+ORF059组也能够有效的诱导免疫细胞的分泌的IL-6，含量达1165.54pg/106cell，是单一ORF047疫苗组的6.96倍，是单一ORF059疫苗组6.60倍，约是PBS组的33倍；复合组与单一蛋白疫苗组及PBS对照组相比差异显著；单一蛋白疫苗组间差异不显著（P>0.05），但与对照组相比较差异显著。
本发明的相关试验结果分析表明：利用病毒的两种感染粒子形式上的基因编码的EEV ORF059蛋白及编码IMVORF047蛋白制备的亚单位疫苗免疫小鼠，比采用一种ORF059蛋白或者IMVORF047蛋白制备的疫苗免疫小鼠引发的细胞免疫应答更强，且不影响体液免疫应答，这是一种较有潜力的预防羊口疮的理想疫苗。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种羊口疮重组蛋白抗原疫苗及其制备方法
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggacccac cagacatcac tgcctacata atcggggtta ccgaaggccg cgggaccaag 60
gaggtgttcc ccacgctgcc gtatctggtg ggcctcgccg acgacccgcc caagcctcaa 120
cccgcaccta agcctgctcc ctctccttcg ccagcccctg caccggcccc cgcgccgacc 180
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tggaaagacg tggactccaa agactacccg cacttcttca cggacatgtg caagtccacg 300
tgtccaaagg agatgcagcg ccgcgcggca caccacctca acctctggga gagcatatct 360
gccggcactg tccccactaa gtactccgac gatgacttca tcctggtggt cgacaacgac 420
atgaccttcc gcaagcccga gatggtaaag ccgctcatag aggcgatgag gacgaacggc 480
tggtacatga cgcagctcaa ggaaacctac atgaccggcg cgctggccac caacgtcccc 540
ggcacaggcg accccgagct catggtctac cccggcgggt acgacgtctc gctagacgcc 600
tacatcatca gcgtcggcgg catgaagaag ctctacgacg cgatcatcaa ggagggaggg 660
ctgcgcagcg gcctgctcac cgaggtgttc acgctggaga agcggctctc tctggcgcgc 720
gtggtgctct ccggcgccga gcaggtggtc taccccgagt actacataca ggttaagacg 780
cggctcagcg gcgcgccctc tctgtggtcg ctgctcgcca cgtggctggc gcgcttctgg 840
cccggcgcca tctacttctt caccacgccg ctcttttcct tcatggggct cttcgacgtg 900
gacgtggtcg acatcttcat cctggcatac ctgctggtgc tcgtgctgct gctgccgaac 960
tcgcggctgc tgtggttcat cgccgggctg ctggtcaccg ctatcgtctg a 1011
<210> 2
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工蛋白
<400> 2
Met Asp Pro Pro Asp Ile Thr Ala Tyr Ile Ile Gly Val Thr Glu Gly
1 5 10 15
Arg Gly Thr Lys Glu Val Phe Pro Thr Leu Pro Tyr Leu Val Gly Leu
20 25 30
Ala Asp Asp Pro Pro Lys Pro Gln Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ser
35 40 45
Pro Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Lys Pro Ser
50 55 60
Pro Pro Ala Pro His Pro Lys Gly Asp His Val Leu Lys Ala Val Glu
65 70 75 80
Trp Lys Asp Val Asp Ser Lys Asp Tyr Pro His Phe Phe Thr Asp Met
85 90 95
Cys Lys Ser Thr Cys Pro Lys Glu Met Gln Arg Arg Ala Ala His His
100 105 110
Leu Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Gly Thr Val Pro Thr Lys Tyr
115 120 125
Ser Asp Asp Asp Phe Ile Leu Val Val Asp Asn Asp Met Thr Phe Arg
130 135 140
Lys Pro Glu Met Val Lys Pro Leu Ile Glu Ala Met Arg Thr Asn Gly
145 150 155 160
Trp Tyr Met Thr Gln Leu Lys Glu Thr Tyr Met Thr Gly Ala Leu Ala
165 170 175
Thr Asn Val Pro Gly Thr Gly Asp Pro Glu Leu Met Val Tyr Pro Gly
180 185 190
Gly Tyr Asp Val Ser Leu Asp Ala Tyr Ile Ile Ser Val Gly Gly Met
195 200 205
Lys Lys Leu Tyr Asp Ala Ile Ile Lys Glu Gly Gly Leu Arg Ser Gly
210 215 220
Leu Leu Thr Glu Val Phe Thr Leu Glu Lys Arg Leu Ser Leu Ala Arg
225 230 235 240
Val Val Leu Ser Gly Ala Glu Gln Val Val Tyr Pro Glu Tyr Tyr Ile
245 250 255
Gln Val Lys Thr Arg Leu Ser Gly Ala Pro Ser Leu Trp Ser Leu Leu
260 265 270
Ala Thr Trp Leu Ala Arg Phe Trp Pro Gly Ala Ile Tyr Phe Phe Thr
275 280 285
Thr Pro Leu Phe Ser Phe Met Gly Leu Phe Asp Val Asp Val Val Asp
290 295 300
Ile Phe Ile Leu Ala Tyr Leu Leu Val Leu Val Leu Leu Leu Pro Asn
305 310 315 320
Ser Arg Leu Leu Trp Phe Ile Ala Gly Leu Leu Val Thr Ala Ile Val
325 330 335
<210> 3
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggggccg ccgccagcat ccagaccacc gtgaccaccg tcagcgagcg catccgcaac 60
gagctcgagc agagcgcgag cgctagcgcg accgccgact gcgacgtcac catcgggagt 120
ctgattatcc gcaagaacct gggatgcagc gtttccgtcc ggaacatgtg ctcggccaac 180
gccggcgcgc agctggacgc cgtcatgaag gccgtgagca gcaccttcaa cgacctctcg 240
tcggaccaga aggcctacgt gcccgggctg ctcacggccg cgctcaacat ccagaccacg 300
gtgaacaccg ccgtcaagga cttcgagacg tacatgaagc agacctgcac ggcggacgca 360
gtcattcaca acaaaatcaa gatccaaaac atcgtcatgg aagagtgcgc ctctctgcca 420
gggagtccgg cctcgcacct ggagtttgtg aacaccggca cggccgcggg caactgcggc 480
gtgaaggccg tgatggacgt gctcgcgaag gccagcacca ccgtgcgcaa cgaccaggag 540
gccggcaagt aa 552
<210> 4
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工蛋白
<400> 4
Met Gly Ala Ala Ala Ser Ile Gln Thr Thr Val Thr Thr Val Ser Glu
1 5 10 15
Arg Ile Arg Asn Glu Leu Glu Gln Ser Ala Ser Ala Ser Ala Thr Ala
20 25 30
Asp Cys Asp Val Thr Ile Gly Ser Leu Ile Ile Arg Lys Asn Leu Gly
35 40 45
Cys Ser Val Ser Val Arg Asn Met Cys Ser Ala Asn Ala Gly Ala Gln
50 55 60
Leu Asp Ala Val Met Lys Ala Val Ser Ser Thr Phe Asn Asp Leu Ser
65 70 75 80
Ser Asp Gln Lys Ala Tyr Val Pro Gly Leu Leu Thr Ala Ala Leu Asn
85 90 95
Ile Gln Thr Thr Val Asn Thr Ala Val Lys Asp Phe Glu Thr Tyr Met
100 105 110
Lys Gln Thr Cys Thr Ala Asp Ala Val Ile His Asn Lys Ile Lys Ile
115 120 125
Gln Asn Ile Val Met Glu Glu Cys Ala Ser Leu Pro Gly Ser Pro Ala
130 135 140
Ser His Leu Glu Phe Val Asn Thr Gly Thr Ala Ala Gly Asn Cys Gly
145 150 155 160
Val Lys Ala Val Met Asp Val Leu Ala Lys Ala Ser Thr Thr Val Arg
165 170 175
Asn Asp Gln Glu Ala Gly Lys
180

Claims (5)

1.一种免疫原性组合物，其特征在于：所述免疫原性组合物由羊口疮病毒EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047胞外区重组蛋白和佐剂组成；
所述羊口疮病毒EEV囊膜ORF059重组蛋白的浓度为1mg/mL、IMV ORF047重组蛋白的浓度为1mg/mL，所述羊口疮病毒EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047重组蛋白和佐剂的体积比为：1:1:2；
所述ORF059重组蛋白的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1，所述IMV ORF047重组蛋白的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述佐剂为ISA201佐剂。
3.一种羊口疮重组蛋白抗原疫苗，其特征在于：所述疫苗的有效成分为权利要求1或2所述的免疫原性组合物。
4.权利要求3所述的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤如下：
（1）制备羊口疮病毒EEV囊膜ORF059重组蛋白；
（2）制备IMV ORF047重组蛋白；
（3）将羊口疮病毒EEV囊膜ORF059重组蛋白、IMV ORF047重组蛋白、佐剂混合制剂，得到疫苗。
5.权利要求1或2所述的免疫原性组合物或权利要求3所述的疫苗在制备预防羊口疮病毒的药物中的应用。
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