ES2199932T3 - Poxvirus recombinante y vacuna estreptococica que contiene proteina m. - Google Patents
Poxvirus recombinante y vacuna estreptococica que contiene proteina m.Info
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Abstract
LOS VIRUS DE LA FAMILIA POXVIRIDAE TALES COMO LA VACCINIA O LOS VIRUS DE LAS AVES SON MODIFICADOS PARA CONTENER UN GEN EL CUAL MUESTRA UNA PROTEINA CORRESPONDIENTE A LA REGION EXPUESTA CONSERVADA DE LA PROTEINA M6. LOS PRODUCTOS MODIFICADOS SE UTILIZAN COMO VACUNAS CONTRA LA INFECCION ESTREPTOCOCICA.
Description
Poxvirus recombinante y vacuna estreptocócica que
contiene proteína M.
La presente invención se refiere a virus, tales
como el virus vaccinia y el de la viruela aviar, modificados para
que contengan la secuencia de ADN (gen) que expresará en un mamífero
hospedante, incluso en los seres humanos, una proteína
correspondiente a la región conservada, expuesta de la proteína M6.
También se refiere al uso de productos modificados, tales como las
vacunas, que brindan protección contra la infección estreptocócica.
Asimismo, se refiere a plásmidos u otros vectores portadores de
dicho gen.
La presente solicitud es una continuación parcial
de la Solicitud de los Estados Unidos con Nº de Serie 07/369.118,
inscrita el 21 de junio de 1989. También se menciona la solicitud
concurrentemente inscrita de Fischetti, la solicitud con Nº de Serie
_______________, inscrita el ______________ de 1990 (Expediente del
abogado 18106B), que es una continuación parcial de la solicitud con
Nº de Serie 07/315.588, inscrita el 27 de febrero de 1989, que a su
vez es una continuación parcial de la solicitud con Nº de Serie
173.380, inscrita el 25 de marzo de 1988, cada una de las cuales se
incorpora a la presente por referencia.
En los Estados Unidos se producen aproximadamente
30 millones de casos de infecciones estreptocócicas cada año, siendo
la más común de ellas la faringitis estreptocócica aguda, que se
encuentra predominantemente en los niños en edad escolar. Hasta el
5% de los casos de faringitis no tratados o que han recibido un
tratamiento ineficiente, puede conllevar a la fiebre reumática
aguda, una enfermedad que en último término, puede conducir a un
daño cardíaco. Si bien no constituye un problema de suma importancia
en los Estados Unidos, esta secuela estreptocócica es un problema
significativo en las naciones en vías de desarrollo del mundo. Por
ejemplo, se ha calculado que casi 6 millones de niños en edad
escolar en la India sufren de enfermedad cardíaca reumática.
La proteína M de los estreptococos del grupo A es
un dímero fibroso de hélices dispuestas en forma de espira
arrollada, que se extiende unos 50 nm aproximadamente desde la
superficie de estos organismos. Se trata de una molécula fibrilar de
la cual existen más de 80 tipos M serológicos. La proteína hace que
el estreptococo sea resistente a la fagocitosis no inmune. Es el
principal factor de virulencia de las bacterias estreptocócicas.
Por lo tanto, como existen más de 80 serotipos
diferentes de estreptococos del grupo A, una vacuna basada en
epitopos específicos del tipo puede no resultar práctica. En
general, todavía no se ha encontrado una vacuna satisfactoria capaz
de conferir protección contra la infección estreptocócica, aunque se
han implementado importantes y costosas medidas con el propósito de
cumplir este objetivo.
Existe una puja muy marcada por desarrollar una
vacuna segura y eficaz contra los estreptococos del grupo A.
Sorprendentemente se ha descubierto ahora que un
polipéptido que corresponde a la región conservada expuesta de la
proteína M (en la presente, referida en ocasiones como la
"proteína M6'") puede provocar una respuesta inmune protectora
cuando se administra a un mamífero. El polipéptido M6' puede
producirse mediante la modificación del genoma de un virus de la
familia poxviridae -tales como el ortopoxvirus vaccinia o el
avipoxvirus fowlpox [virus de la viruela aviar]- para que contenga
un gen genéticamente diseñado ("el gen M6'") que, expresa la
proteína M6'. La proteína M6' puede suministrarse a un mamífero
mediante la administración al mamífero de un virus vaccinia o de un
virus de la viruela aviar modificado, que contenga un gen que se
codifique para la proteína.
De este modo, la presente invención provee una
proteína capaz de provocar una respuesta inmunoprotectora contra una
infección estreptocócica en un mamífero; dicha proteína comprende
una secuencia de aminoácidos que es igual o sustancialmente igual a
la secuencia residual de aminoácidos en la región conservada
expuesta de la proteína M6. La presente invención también provee la
proteína M6'.
Asimismo, la presente invención provee un gen que
se codifica para una proteína capaz de provocar una respuesta
inmunoprotectora contra una infección estreptocócica en un mamífero,
en el que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que
es igual o sustancialmente igual a una secuencia residual de
aminoácidos en la región conservada expuesta de la proteína M6. La
presente invención también provee el gen M6'.
Además, la presente invención provee un plásmido
que contiene un gen que se codifica para un proteína capaz de
provocar una respuesta inmunoprotectora para una infección
estreptocócica en un mamífero, en el que dicha proteína comprende
una secuencia de aminoácidos que es igual o sustancialmente igual a
una secuencia residual de aminoácidos en la región conservada
expuesta de la proteína M6. El gen que se codifica puede ser el gen
M6'.
La presente invención provee también un virus,
preferiblemente de la familia poxviridae, que contiene un gen que se
codifica para una proteína capaz de provocar una respuesta
inmunoprotectora contra una infección estreptocócica en un mamífero,
en el que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos que
es igual o sustancialmente igual a una secuencia residual de
aminoácidos en la región conservada expuesta de la proteína M6. Los
virus pox típicos incluyen el vaccinia y el de la viruela aviar; el
virus de la viruela aviar es un virus preferido. El gen que el virus
puede contener es el gen M6'.
Más generalmente, la presente invención provee un
virus que contiene un gen que se codifica para un antígeno
superficial o una parte del mismo de un procarionte, siendo el
citado antígeno superficial o la parte del mismo el responsable de
la virulencia de dicho procarionte. Los virus típicos incluyen
aquéllos que pertenecen a la familia poxviridae, en especial, el
virus vaccinia y el virus de la viruela aviar; el de la viruela
aviar es el virus preferido. El antígeno superficial o la parte del
mismo puede ser una proteína capaz de provocar una respuesta
inmunoprotectora en un mamífero, que comprende una secuencia de
aminoácidos que es igual o sustancialmente igual a una secuencia
residual de aminoácidos en la región conservada expuesta de la
proteína M6. El procarionte puede ser una bacteria, en especial, un
estreptococo. El gen que el virus puede contener es el gen M6'.
Del mismo modo, la presente invención provee una
vacuna que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un
virus que contiene un gen que se codifica para un antígeno
superficial o una parte del mismo de un procarionte, siendo dicho
antígeno superficial o dicha parte del mismo el responsable de la
virulencia de dicho procarionte; y, el mencionado virus está
presente en una cantidad suficiente para que el antígeno suficiente
o la parte del mismo provoque una respuesta protectora contra una
infección causada por dicho procarionte. El antígeno superficial o
la parte del mismo puede ser una proteína capaz de provocar una
respuesta inmunoprotectora contra una infección estreptocócica en un
mamífero, que comprende una secuencia de aminoácidos que es igual o
sustancialmente igual a una secuencia residual de aminoácidos en la
región conservada expuesta de la proteína M6; y el virus está
presente en una cantidad suficiente como para que la proteína
suficiente provoque una respuesta protectora contra una infección
estreptocócica. El procarionte puede ser una bacteria, en especial,
un estreptococo. Una vez más, los virus típicos incluyen aquéllos
pertenecientes a la familia de los poxviridae, en especial, el virus
vaccinia y el de la viruela aviar; se prefiere el de la viruela
aviar; y el gen que el virus puede contener es el gen M6'.
Por otro lado, la presente invención provee un
método para controlar la infección procariótica en un mamífero que
necesita que se practique dicho control, método que comprende la
administración a dicho mamífero de un virus que contiene un gen que
se codifica para un antígeno superficial o una parte del mismo de un
procarionte, siendo dicho antígeno superficial o la parte del mismo
el responsable de la virulencia del citado procarionte; y el
mencionado virus se administra en una cantidad suficiente como para
que el antígeno suficiente o la parte del mismo provoque una
respuesta de los anticuerpos contra una infección causada por dicho
procarionte. El antígeno superficial o la parte del mismo puede ser
una proteína capaz de provocar una respuesta inmunoprotectora contra
infección estreptocócica en un mamífero, que comprende una secuencia
de aminoácidos que es igual o sustancialmente igual a una secuencia
de aminoácidos en la región conservada expuesta de la proteína M6;
el virus se administra en una cantidad suficiente como para que la
proteína provoque una respuesta de los anticuerpos que baste para
efectuar tal control. El procarionte puede ser una bacteria, en
especial, un estreptococo. Una vez más, los virus típicos incluyen
los de la familia de los poxviridae, en especial el virus vaccinia y
el de la viruela aviar; se prefiere el de la viruela aviar; y el gen
que el virus puede contener es el gen M6'.
La presente invención provee, asimismo, un gen
que se codifica para un segmento de un antígeno superficial o una
parte del mismo de un procarionte, siendo dicho antígeno superficial
el responsable de la virulencia del citado procarionte; y, dicho
segmento del antígeno superficial o de la parte del mismo es capaz
de provocar una respuesta inmunoprotectora contra una infección
causada por dicho procarionte en un mamífero. Éste no es un producto
natural dado que la codificación es para un segmento de un antígeno
superficial o de una parte del mismo y no para todo el antígeno
completo.
Del mismo modo, la presente invención provee un
plásmido que contiene un gen que se codifica para un segmento de un
antígeno superficial o una parte del mismo de un procarionte, siendo
dicho antígeno superficial el responsable de la virulencia del
citado procarionte; y, dicho gen que se codifica no se encuentra
presente naturalmente en el citado plásmido.
La frase "dicho gen que se codifica no se
encuentra presente naturalmente en el citado plásmido" se emplea
de manera tal que quede claro que la presente invención no incluye
en su alcance a un producto natural. Por ejemplo, el novedoso gen
M6' de esta invención en el novedoso plásmido pVV3:M6' se depositó
en la American Type Culture Collection [Colección de cultivos
tipo de Estados Unidos]. El depósito fue de una muestra del plásmido
pVV3:M6' en el E. coli con el número de acceso 68003. El gen
M6' no se encuentra presente naturalmente en un plásmido de E.
coli; o, "dicho gen que se codifica (el gen M6') no se
encuentra presente naturalmente en el citado plásmido (del E.
coli)". Del mismo modo, la expresión "segmento del antígeno
superficial o de una parte del mismo" se emplea de manera tal que
los genes y los plásmidos comprendidos en el alcance de la presente
no incluyan los productos de la naturaleza ni aquéllos que ya se
conocen, por ejemplo, el gen M6 o el plásmido pVV3:M6.
De un modo similar, la presente invención provee
una vacuna que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y
un virus, preferiblemente de la familia de poxviridae, que contiene
un gen que se codifica para una proteína capaz de provocar una
respuesta inmunoprotectora contra una infección estreptocócica en un
mamífero, donde la citada proteína comprende una secuencia de
aminoácidos que es igual o sustancialmente igual a una secuencia
residual de aminoácidos en la región conservada expuesta de la
proteína M6; y el mencionado virus está presente en una cantidad
suficiente como para que la proteína suficiente provoque una
respuesta protectora contra una infección estreptocócica. Una vez
más, los virus pox típicos incluyen el virus vaccinia y el de la
viruela aviar; se prefiere el de la viruela aviar; y, el gen que el
virus puede contener es el gen M6'.
La presente invención provee, adicionalmente, un
método para controlar una infección estreptocócica en un mamífero
que necesita la implementación de dicho control, el cual comprende
la administración a dicho mamífero de un virus de la familia
poxviridae que contiene un gen que se codifica para una proteína
capaz de provocar una respuesta inmunoprotectora contra una
infección estreptocócica en un mamífero, donde dicha proteína
comprende una secuencia de aminoácidos que es igual o
sustancialmente igual a la secuencia residual de aminoácidos en la
región conservada expuesta de la proteína M6; el mencionado virus se
administra en una cantidad suficiente como para que la proteína
provoque una respuesta de los anticuerpos suficiente para efectuar
dicho control. Una vez más, los virus pox típicos incluyen el virus
vaccinia y el de la viruela aviar; se prefiere el de la viruela
aviar; y el gen que el virus puede contener es el gen M6'.
La expresión "igual o sustancialmente igual"
se usa en la presente para describir la secuencia de aminoácidos en
las proteínas de la presente invención que tienen la actividad
deseable porque estas proteínas son idénticas a la región conservada
expuesta de la proteína M6 de un estreptococo del grupo A o bien,
tan similares al segmento que tienen la misma actividad. No se
requiere ninguna experimentación indebida para determinar cuáles son
las proteínas que guardan un grado de similitud tal con la región
conservada expuesta de la proteína M6 que tienen la misma actividad
que aquéllas que son iguales a la región. El experto en la técnica,
partiendo de la lectura de la presente memoria descriptiva, podrá
preparar polipéptidos homólogos que tengan la misma actividad y
sustancialmente la misma secuencia que la región conservada expuesta
de la proteína M6. Por ejemplo, los términos pueden ser extendidos,
por ejemplo, para proporcionar un ancla que una la proteína a un
ligante. Una proteína con la misma actividad y un alto grado de
homología con la región conservada expuesta podría sintetizarse con
mayor facilidad o resultar menos costosa de preparar y esta proteína
se considera comprendida en el alcance de esta invención.
Para aclarar aún más la terminología que se usará
en este documento, la proteínas de la presente invención no
constituyen la proteína M completa, sino que tienen la misma o
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la región
conservada expuesta de la proteína M6 de los estreptococos del grupo
A (o igual a una parte de la misma). Los polipéptidos de la presente
invención no se consideran naturales. Para obtener las proteínas de
esta invención, los virus se modifican genéticamente para que
expresen estas proteínas. Sin embargo, habiendo descrito en la
presente la región conservada expuesta de la proteína M6 de los
estreptococos del grupo A y la utilidad de la misma, la síntesis de
las proteínas se puede lograr mediante la escisión selectiva
enzimática o química de la proteína M o por síntesis de fase sólida
(véase la solicitud de Fischetti que se menciona bajo el
título Solicitudes relacionadas). Las proteínas que se describen en
la presente, ya sea que provengan de la expresión genética de un
virus modificado o de otra síntesis, no son productos naturales
porque las proteínas de la presente no constituyen la proteína M
completa, sino que son iguales o sustancialmente iguales a una
secuencia de aminoácidos en sólo una parte de la proteína M; dicha
parte comprende la región conservada expuesta de la proteína M (o
una parte de la misma).
Por otro lado, la proteínas descritas en la
presente no tienen las mismas características y utilidad que
cualquier proteína M u otra proteína natural, porque la proteína M
no puede ser utilizada para brindar protección contra las
infecciones estreptocócicas debido a la variabilidad de las especies
de la proteína M de las distintas cepas de estreptococos, mientras
que las proteínas de la presente se pueden utilizar para preparar
vacunas que ofrezcan una protección que no es específica de la cepa.
De este modo, las proteínas que se describen en la presente no son
productos naturales porque no existen como entidades diferenciadas
en la naturaleza, porque nunca antes fueron producidas y porque no
hay producto alguno en la naturaleza que presente las mismas
propiedades que estas proteínas.
La Fig. 1 muestra la secuencia completa de
aminoácidos de la proteína M6 de la cepa D471 de un cultivo
estreptocóccico del grupo A, del cepario de la Universidad de
Rockefeller [The Rockefeller University Collection].
La Fig. 2 ilustra un modelo de la proteína M6
completa de la cepa D471, tal como se presenta en la pared
celular.
La Fig. 3 y la Fig. 4 muestran la estrategia
utilizada para preparar los productos de la presente invención.
La Fig. 5 y la Fig. 6 muestran la estructura de
la proteína M6' y el gen M6' respectivamente.
La Fig. 7 ilustra la ubicación de los péptidos
preferidos de la región conservada.
Se observará en la Fig. 2 que una parte de la
proteína M, el término carboxi, está incrustado en el peptidoglicano
de la pared celular, y en la membrana citoplásmica. Un segmento de
la molécula M queda protegido por el carbohidrato de la pared
celular, que está compuesto por una estructura principal de ramnosa
(círculo abierto) y ramificaciones de
N-acetilglicosamina (círculos cerrados). El término
amino distal de la proteína M no es helicoidal. Gran parte de la
molécula M comprendida entre el resguardo de carbohidratos y la
región no helicoidal está expuesta sobre la superficie del
estreptococo.
La Fig. 1 es la secuencia de aminoácidos completa
de una proteína M de una cepa específica. Las proteínas M de otras
cepas tendrán generalmente las mismas características estructurales
y conformación, aunque las secuencias de aminoácidos variarán. Las
principales variaciones se producen hacia el terminal amino. Las
moléculas se tornan cada vez más conservadas hacia el extremo
carboxi. Entonces, la homología dentro de las moléculas M de los
diferentes serotipos aumenta progresivamente en los sitios que están
más cercanos al término carboxi y más próximos a la pared celular.
La región conservada expuesta se extiende desde aproximadamente la
posición 170 hasta la posición 299 y, más generalmente, se la
considera como la región que comienza a partir de Ile, en la
posición 210. La región conservada expuesta, preferiblemente, se
extiende desde la posición 210 aproximadamente hasta la posición 298
aproximadamente. Se considera que el equilibrio de la molécula es la
región no expuesta conservada. Esta invención se refiere a la región
conservada expuesta de la molécula de la proteína M.
La responsable de la variación antigénica de la
proteína M es la variabilidad en el término amino. Los anticuerpos
específicos del tipo que ofrecen protección contra un serotipo no
son eficaces para resistir la infección causada por otros serotipos
en un ensayo de opsonofagocitosis. De este modo, en teoría es
posible que un individuo se infecte muchas veces con diferentes
cepas estreptocócicas y cada infección seguirá hasta que el sistema
inmune haya generado anticuerpos dirigidos a la región
N-terminal específica del tipo de la molécula M.
Se cree que la región repetitiva C de la proteína
M consiste en bloques repetitivos C altamente conservados,
combinados con secuencias separadoras que pueden estar conservadas
en un grado menor entre los distintos serotipos (véase la Fig. 7).
Los bloques repetitivos C1 y C2 altamente conservados están situados
junto a la pared celular, por ejemplo, en los estreptococos del tipo
6.
En particular, la Fig. 7 muestra que el extremo
amino de la proteína M es específico del tipo (antigénicamente
variable). Las secuencias que están en la posición
298-441 por lo general están asociadas con la
célula. Dentro de la región conservada se presenta la región
repetitiva C, compuesta por el Bloque C1, un Separador y el Bloque
C2. Los epitopos de M6 no específicos del tipo que están compartidos
entre otros serotipos de la proteína M en distintos grados, se
ubican aquí. Los anticuerpos monoclonales y antipeptídicos
purificados por afinidad que trazan el mapa hacia la región
repetitiva B y al sitio de la pepsina de la proteína M6 se comparten
sólo entre un 10% y un 17% de más de 50 serotipos diferentes. En
contraposición, los anticuerpos que trazan el mapa hacia la región
repetitiva adyacente C se comparten entre aproximadamente el 60% y
el 70% de los serotipos. Mientras las proteínas de esta invención
pueden extenderse desde el bloque repetitivo B5 hasta la región
repetitiva C e incluso, desde el bloque repetitivo B4 hasta el
término carboxi, para una protección de base amplia, se prefiere que
la proteína se igual o sustancialmente similar a la región
conservada expuesta que se extiende desde la posición 170
aproximadamente, hasta la posición 299, y se prefiere todavía más
que las proteínas sean iguales o sustancialmente similares a la
región que se extiende desde la posición 235 aproximadamente, hasta
la posición 299, es decir, completamente contenida dentro de la
región repetitiva C altamente conservada. En el siguiente análisis,
los números entre paréntesis precedidos por la palabra péptido o
proteína o polipéptido, o por otras similares, tales como "péptido
(240-260)" se refieren a un péptido, o a una
proteína, o a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que es igual o sustancialmente igual a la secuencia presente en la
proteína M6 que se extiende desde la posición del primer número
hasta la posición de del segundo número.
Los ensayos de absorción con el antipéptido Fabs,
indican que un mAb específico de la Clase I (10B6) traza el mapa
hacia el péptido (240-260), mientras que el otro mAb
específico de la Clase I (10F5) traza el mapa tanto hacia el péptido
(240-260) como hacia el péptido
(272-292). Asimismo, los anticuerpos del antipéptido
dirigidos al péptido (240-260) y al péptido
(272-292) tienen una inmunorreactividad sustancial
con las formas extraídas de varias proteínas M de Clase II en el
análisis de transferencia Western [Western blot], aunque los
anticuerpos antipeptídicos para el péptido (248-269)
y el péptido (256-277) pueden ser específicos de la
Clase I. De esta manera, dentro de una región estrecha de la región
repetitiva C de la proteína M6, puede haber determinantes
antigénicas tanto específicas de la Clase I como compartidas. Por lo
tanto, una vacuna que consista en antígenos correspondientes a la
región repetitiva C brindará protección tanto contra los
estreptococos de la Clase I como de la Clase II.
Así, además de las proteínas que son iguales o
sustancialmente iguales a la secuencia de la región conservada
expuesta de la proteína M6, existe una preferencia por las proteínas
que son iguales o sustancialmente similares a la secuencia de la
región repetitiva C o un parte de la misma. De un modo similar, las
proteínas preferidas incluyen el polipéptido
(216-235), el polipéptido (248-269),
el polipéptido (275-284), el polipéptido
(240-260), el polipéptido (256-277)
y el polipéptido (272-292) (véase la
solicitud de Fischetti que se menciona bajo el título Solicitudes
relacionadas).
Las vacunas para utilizar en la protección contra
la infección estreptocócica ya se han propuesto anteriormente. Estas
vacunas se prepararon a partir de polipéptidos del extremo amino
hipervariable de la molécula. Han tenido cierto éxito para brindar
inmunidad de específica del tipo contra los serotipos homólogos. Su
rendimiento ha mejorado gracias a la incorporación de varias
determinantes específicas del tipo en la misma vacuna multivalente.
Sin embargo, dada la enorme gama de serotipos M existentes, este
procedimiento no resulta atractivo.
Los estreptococos del grupo A son patógenos
humanos ampliamente diseminados y los responsables de las
infecciones nasofaríngeas y del impétigo. Solamente en los Estados
Unidos se producen aproximadamente 30 millones de casos de
infecciones estreptocócicas del grupo A por año. A pesar del hecho
de que la infección estreptocócica puede tratarse exitosamente con
antibióticos, en el ínterin produce a menudo una molestia
significativa y pérdida en la productividad. Un pequeño porcentaje
de los individuos infectados afectados que padecen de esta infección
estreptocócica desarrollan una enfermedad más grave, tal como la
fiebre reumática y glomerulonefritis. En los países en vías de
desarrollo, la fiebre reumática es la causa principal de la
enfermedad cardíaca entre los niños. Por lo tanto, existe una puja
imperiosa por crear una vacuna contra los estreptococos del grupo A
que sea segura y eficaz.
La experiencia indica que las infecciones
estreptocócicas, particularmente, la faringitis, generalmente se
limitan a los niños. La incidencia de la infección alcanza su punto
culminante a la edad comprendida entre los 6 y los 8 años.
Aparentemente, los adultos son más resistentes a dichas infecciones,
presumiblemente porque han consolidado una inmunidad que es eficaz
contra la mayoría de los serotipos. Por lo tanto puede haber una
respuesta inmunológica a las infecciones estreptocócicas que produce
anticuerpos que reconocen epitopos en la mayoría de, sino en todos,
los serotipos estreptocócicos. Se descubrió que dichos epitopos se
encuentran en la región conservada de la proteína M, que no está
protegida por su proximidad a la pared celular, es decir, la región
conservada expuesta de la proteína M.
Si bien la identidad de los aminoácidos en esta
región varía en cierta medida entre los serotipos, generalmente se
extiende desde el aminoácido 170 aproximadamente hasta la posición
299 en la molécula de la proteína M, preferiblemente desde la
posición 210 hasta la 298 ó 299 y más preferiblemente todavía, desde
la posición 235 aproximadamente hasta la posición 299
aproximadamente.
Los polipéptidos o las proteínas de esa región
son capaces de provocar -y lo hacen- una respuesta inmune protectora
cuando se administran a un mamífero que necesita esa protección
contra la infección estreptocócica.
Como es sabido, el organismo de un mamífero tiene
varios métodos de protegerse contra las infecciones por
microorganismos. Uno de ellos es un sistema de adaptación en el que
la respuesta inmune a un organismo invasor resulta en la producción
de los anticuerpos IgG que actúan permitiendo la opsonización y la
fagocitosis mediada por el complemento. Otro es la producción o
activación de la IgA que es la inmunoglobulina predominante de las
secreciones seromucosas, tales como la saliva, las secreciones
traqueobronquiales, el calostro, las secreciones de la leche y
genitourinarias. La IgG también se encuentra en estas secreciones,
pero en una concentración menor. La IgA secretora (sIgA) es una
forma dimérica de la IgA protegida de la proteólisis por el
componente secretor. Una de las funciones de la IgA es la de
prevenir que los microorganismos infecciosos se adhieran, colonicen
e invadan el tejido de la mucosa.
Un procedimiento que se prefiere en la actualidad
para poner en práctica la presente invención comprende,
principalmente, la estimulación del sistema inmune secretor -en
particular, la sIgA- por administración intranasal u oral. Puede
haber una producción concomitante de IgG, y ambas pueden contribuir
a la inmunización. La invención se describirá principalmente tal
como se aplica a dicho procedimiento. Los polipéptidos de la
invención también se pueden usar para estimular la IgA como la
respuesta principal por administración parenteral con producción
concomitante de IgA de bajo nivel.
El virus vaccinia y el virus de la viruela aviar
son miembros de la familia de los poxviridae. Dentro de la familia
de los poxviridae se encuentra en género ortopoxvirus y el género
avipoxvirus, entre otros. Hay más de 20 virus en la familia
de los poxviridae, incluso aquellos virus responsables de la
viruela, la viruela vacuna, la viruela aviar y las enfermedades de
mamíferos.
La viruela aviar se encuentra en el género
Avipoxvirus, mientras que la vaccinia y viruela se encuentran en el
género Ortopoxvirus. El género Avipoxvirus también incluye la
viruela del canario [Canary pox], la viruela del pinzón
[junco pox], la viruela de la paloma [pigeon pox], la
viruela del gorrión [sparrow pox], la viruela del estornino
[starling pox] y la viruela del pavo [turkey pox]. Las
características de los virus pox incluyen el hecho de que los
viriones son grandes, en forma de ladrillo (u ovoides en el caso del
género Parapoxvirus), con un tamaño de aproximadamente
300-450 por 170-260 nm, una
envuelta externa, un recubrimiento de estructuras tubulares y una
estructura interna constituida por un núcleo que contiene ADN y uno
o dos organismos laterales. El genoma consiste en una sola molécula
de dsADN con extremos covalentemente cerrados ("horquillas"),
con un tamaño de 130-280 kbp. Los virus tienen más
de 100 proteínas y varias enzimas (incluso una polimerasa de ARN
dependiente del ADN, guanilmetiltransferasa y poli (A) polimerasa).
La transcripción inicial se produce dentro del núcleo del virus, lo
cual conduce a la síntesis de proteínas precoces, algunas de las
cuales conducen a un despojo del recubrimiento del ADN viral lo cual
permite una mayor transcripción y replicación del ADN. La
replicación y montaje se produce en el citoplasma del viroplasma
("fábricas virales"), y se liberan viriones por desarrollo
(budding) (viriones con envuelta extracelular) o por
destrucción celular (viriones con envuelta intracelular). Existe un
antígeno común del grupo de virus pox (antígeno de la
nucleoproteína) y los virus miembro del género Ortopoxvirus producen
una hemaglutinina sin viriones.
La presente invención se describirá básicamente
en la medida que se relaciona con el virus vaccinia y el de la
viruela aviar como el vector para el gen que expresa la región
conservada expuesta de la proteína M, pero también se pueden emplear
otros vectores (virus, especialmente, miembros de los poxviridae).
De un modo similar, otros genes para los antígenos de los
procariontes que son los responsables de la virulencia de los
citados procariontes también se pueden emplear. El de la viruela
aviar es un vector preferido porque aproximadamente 1 de entre
100.000 personas expuestas al vaccinia tienen una reacción adversa
(por ejemplo, encefalitis), mientras que ninguna reacción de este
tipo se ha observado por la exposición al virus de la viruela aviar.
Asimismo, la gama de hospedantes naturales para el virus de la
viruela aviar se limita a las especies avícolas (véase Taylor y
colaboradores, "Protective immunity against avian influenza
induced by fowlpox virus recombinant" [Inmunidad protectora
contra la influenza avícola inducida por el virus recombinante de la
viruela aviar], Vaccine, vol. 6, diciembre de 1988, página
504, que se incorpora en la presente por referencia). La cepa de la
viruela aviar, designada en la presente como FP-1,
es una cepa Duvette modificada para usar como una vacuna en los
pollos de días de edad; la cepa es una cepa comercial designada como
O DCEP 25/CE67/2309, octubre de 1980 y la comercializa Institute
Merieux, Inc.
El virus vaccinia y el de la viruela aviar son
virus eucarióticos que completan la mayoría de las fases de sus
respectivos ciclos reproductivos dentro del citoplasma de una célula
hospedante. Son virus que no se transforman, es decir, el ADN viral
no se integra en el genoma hospedante y tampoco ningún producto
genético viral causa transformación. Los virus se consideran no
oncogénicos. El vaccinia se usó durante aproximadamente 200 años en
las vacunas para la inoculación contra la viruela, y la profesión
médica conoce plenamente las propiedades del virus cuando se lo
utiliza en una vacuna. Aunque la inoculación con el vaccinia no está
libre de riesgos, los peligros en líneas generales son bien
conocidos, están bien definidos y el virus se considera
relativamente benigno.
Paoletti y colaboradores, en las Patentes de los
Estados Unidos Nos. 4.603.112, 4.722.848 y 4.769.330 describieron
los procedimientos para la producción de las cepas del vaccinia,
donde el genoma del vaccinia se modificó, por ejemplo, mediante la
introducción de un gen que no está presente naturalmente. Los
procedimientos de estas patentes generalmente se aplican a la
preparación de los productos de esta invención. Y cada una de las
Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.603.112, 4.722.848 y 4.769.330
se incorporan en la presente por referencia. En el documento de
patente WO 89/03429, que se publicó el 20 de abril de 1989
(PCT/US88/02816, solicitudes de prioridad, solicitudes de los
Estados Unidos 090.711, 110.335, 186.054 y 234.390, respectivamente,
inscriptas el 27 de agosto de 1987, 20 de octubre de 1987, 25 de
abril de 1988 y 23 de agosto de 1989), incorporadas en el presente
por referencia, Paoletii establece los procedimientos para la
producción de cepas del virus de la viruela aviar donde el genoma de
la viruela aviar fue modificado, por ejemplo, mediante la
introducción de un gen que no está naturalmente presente. Sin
embargo, ni esta publicación ni las patentes de Paoletti
anteriormente mencionadas enseñan o sugieren la introducción en un
virus, especialmente del vaccinia o del de la viruela aviar, de un
gen para un antígeno superficial (o para una parte del mismo) de un
procarionte que es el responsable de la virulencia del citado
procarionte; y, en particular, la publicación de Paoletti antes
citada y las patentes tampoco enseñan ni sugieren la introducción de
un gen para la región conservada expuesta de la proteína M (o para
una parte de la misma) en un virus, en especial, un virus vaccinia o
un virus de la viruela aviar. Por otro lado, Paoletti en el
documento de patente WO89/03429 no brinda ninguna utilidad práctica
para la inserción de ADN procariótico en un virus: el único uso que
Paoletti hace del ADN procariótico es el gen LacZ que expresa
Beta-galactosidasa en virtualmente cualquier sistema
y se emplea comúnmente como un mero marcador del color. La expresión
de la beta-galactosidasa por la inserción del gen
LacZ en un virus no es una enseñanza o sugerencia de inducir al
virus para que exprese un antígeno (o una parte del mismo) que sea
responsable de la virulencia de un procarionte por la inserción en
el mencionado virus de ADN procariótico para dicho antígeno (o una
parte del mismo).
Ahora se ha descubierto que un virus modificado,
preferiblemente el virus de la viruela aviar o el virus vaccinia,
que contiene en su genoma un gen genéticamente diseñado que expresa
un antígeno responsable de la virulencia de un procarionte,
preferiblemente, el gen M6' o un gen que expresa la región
conservada expuesta de la proteína M6 (proteína M6') puede ser
empleado con éxito para generar una respuesta inmune en un
hospedante mamífero, que basta para proteger al hospedante contra
infecciones causadas por dicho procarionte, por ejemplo, las
infecciones estreptocócicas, tales como la faringitis
estreptocócica.
La estrategia usada para armar y aislar un virus
recombinante apropiado que contenga el gen M6' y que exprese la
proteína M6' se muestra en las Figuras 3 y 4. La producción del
nuevo virus utiliza el conocido plásmido pVV3:M6 preparado conforme
lo describen Hruby y colaboradores en Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos Vol. 85, páginas 5714-5717, agosto de 1988
Microbiology (incorporado en la presente por referencia) para
producir el nuevo plásmido pVV3:M6' que se usa para introducir el
gen M6' quimérico en el virus vaccinia o, preferiblemente, en el
genoma del virus de la viruela aviar a fin de producir el virus
recombinante VV:M6' o FPV:M6'.
Se ha descubierto que el nuevo virus vaccinia o
de la viruela aviar que contiene el fragmento del gen de la región
conservada completa de la proteína M6, es decir, que contiene el gen
M6' para expresar una proteína M6 truncada, en la presente
identificada como la proteína M6', conferirá una protección
significativa contra la colonización bacteriana de la mucosa cuando
se usa con una vacuna profiláctica. Por cuestiones de conveniencia,
el nuevo virus vaccinia se denominará en la presente VV:M6'; y el
nuevo virus de la viruela aviar se denominará en la presente virus
FPV:M6'.
Los siguientes Ejemplos no limitativos se brindan
a modo ilustrativo exclusivamente y no deben considerarse como una
limitación de la presente invención, siendo posibles muchas
variaciones evidentes de los mismos sin apartarse del espíritu ni
del alcance de la invención.
La Fig. 3 muestra la estructura del virus
recombinante VV:M6'. La parte superior de la figura es una
representación esquemática de las principales características
estructurales de la proteína codificada por el cuadro de lectura
abierto M6 con regiones conservadas y variables entre los diferentes
serotipos M indicados. Véase Hollingshead y colaboradores, J. Biol.
Chem. 261, 1677 (1986). Se indican los bloques repetitivos de
aminoácidos A, B, C, y D, al igual que la región rica en
prolina-glicina (Pro/Gly) y el ancla de la membrana
(ancla M). Usando el sitio FokI indicado, la mitad 3'
conservada del gen M6 se subclonó en un vector plasmídico, conforme
se describe a continuación. La estructura genómica del VV:M6'
recombinante se muestra al pie de la figura. El inserto M6' está
apoyado sobre el gen constitutivo de timidina cinasa viral de 7.6
kDa (flechas en negrita). Se indica la ubicación aproximada de los
sitios de inicio transcripcional precoces (P\gamma) y tardíos
(P(), como así también, el sitio usado para la terminación de las
transcripciones precoces (T(). La estructura del VV:M6'
recombinante, la secuencia de las regiones de empalme y la expresión
de la unidad transcripcional quimérica se verificaron por
secuenciamiento de ADN, hibridación por transferencia Northern
[Northern blot]; y procedimientos de trazado de mapas de
nucleasa S1.
En la primera etapa para la construcción de del
VV:M6' tal como se muestra en la Fig. 4, el plásmido pVV:M6 se cortó
con FokI (se escinde en la posición 751 de la secuencia M6) y
ClaI (se escinde en el extremo 3' del inserto). El fragmento
que corresponde a la mitad 3' del gen M6 se aisló, los extremos
ahuecados se rellenaron usando el fragmento Klenow de la polimerasa
I del ADN, y el fragmento con extremo romo se clonó en el sitio
SmaI del ADN de M13mp 19 RF. Un fago recombinante que
contenía el inserto en la orientación correcta se identificó por
hibridación con una sonda de oligonucleótido específica de la hebra.
El ADN de una sola hebra se preparó y se usó como sustrato para la
mutagénesis específica del sitio dirigida al oligonucleótido,
diseñada para introducir una G entre las posiciones 769 y 770 del
inserto. Esta modificación, que fue verificada por los
procedimientos de secuenciamiento de dideoxinucleótidos de Sanger,
resultó en la conversión del codón Lys-209 del
cuadro de lectura abierto M6 en un codón AGT con cuadro anin. El
inserto mutagenizado (M6') se escindió del ADN del fago usando
EcoRI y BamHI que se cortan en los extremos 5' y 3',
respectivamente, del inserto M6'. Los extremos ahuecados se hicieron
romos con Klenow y el fragmento se ligó por el extremo romo en el
sitio BamHI del plásmido de inserción pVV3, que también se
rellenó con Klenow. Se emplearon los procedimientos de mapeo de
restricción y secuencia de nucleótidos para seleccionar un plásmido
recombinante que contuviera el inserto M6' en la orientación
correcta con respecto al elemento promotor de VV de 7,5 kDa. Este
plásmido de recombinación pVV3:M6 se usó para introducir el gen
quimérico en el genoma VV usando tecnología estándar de
transferencia de marcadores. El virus recombinante (VV:M6') se
cultivó, purificó y luego se analizó cuidadosamente para corroborar
que estuviera presente el inserto M6', intacto, y que se
transcribiera activamente en las células infectadas con el
virus.
Las estructuras del gen M6' y la proteína M6' se
muestran en las Figuras 5 y 6 usando los símbolos estándar para los
constituyentes.
Se inmunizaron unos grupos de ratones (Swiss CD1,
Jackson Labs) en forma intranasal con el virus VV:M6' virus o bien,
con la cepa del tipo salvaje, a una dosis de 10^{7} a 10^{8}
unidades formadoras de placa (PFU, plaque forming
units)/ratón. Luego de cuatro semanas, los ratones se inocularon
intranasalmente y por vía oral con estreptococos M6 del grupo A
(cepa S43/192 del cepario de la Universidad Rockefeller) que se
hicieron resistentes a 200 ug/ml de estreptomicina. Todos los
animales se colocaron en jaulas, a razón de 4-5 por
cada una de ellas durante el desarrollo del experimento. La
preparación de la cepa para la inoculación fue tal como la describen
Bessen y Fischetti en Infect. Immun. 56,2666 (1988). Se realizaron
dos inoculaciones por separado, usando diferentes dosis de
estreptococos (6 x 10^{6} ó 1 x 10^{7} unidades formadoras de
colonias (CFU/ratón). En cada caso, se administraron 20 ul de la
suspensión estreptocócica en cada fosa nasal y 10 ul adicionales por
la vía oral. Comenzando 24 horas después de la inoculación y con
intervalos de 24 a 72 horas durante diez días subsiguientes, se hizo
un hisopado de fauces (Calgiswab tipo 4, Spectrum) y se cultivó en
placas de agar sangre que contenían 200 ug/ml de estreptomicina
tanto para discriminar como para prevenir la competencia entre el
desarrollo de los estreptococos incorporados y los organismos de la
flora normal. Los cultivos se desarrollaron durante toda la noche a
37ºC y se les asignó un puntaje según la presencia de estreptococos
Beta-hemolíticos. Los ratones que murieron luego de
la inoculación se sometieron a una autopsia y sus bazos se
extirparon asépticamente y se cultivaron en estreptomicina tanto
para discriminar como para prevenir la competencia entre el
crecimiento de los estreptococos incorporados y los organismos de la
flora normal. Los cultivos se desarrollaron durante toda la noche a
37ºC y se les asignó un puntaje según la presencia de estreptococos
Beta-hemolíticos. Los ratones que murieron luego de
la inoculación se sometieron a una autopsia y sus bazos se
extirparon asépticamente y se cultivaron en agar sangre que contenía
estreptomicina.
Los resultados del estudio se muestran en la
Tabla I.
| Días post-inoculación | Días post-inoculación | ||||||||||||
| Rato- | Rato- | ||||||||||||
| nes | 1 | 2 | 3 | 6 | 8 | 10 | nes | 1 | 2 | 3 | 6 | 8 | 10 |
| A. Experimento I^{1} | |||||||||||||
| Vacuna VV del tipo salvaje | Vacuna VV:M6' recombinante | ||||||||||||
| CFU en el cultivo de fauces^{2} | CFU en el cultivo de fauces | ||||||||||||
| 1 | >100 | >100 | >100 | * | 1 | 0 | 0 | >100 | * | ||||
| 2 | >100 | >100 | >100 | * | 2 | 0 | 0 | * | |||||
| 3 | >100 | >100 | >100 | * | 3 | 0 | 0 | 1 | >100 | * | |||
| 4 | >100 | 92 | >100 | * | 4 | 0 | 5 | 4 | 0 | 3 | 0 | ||
| 3 | 63 | >100 | >100 | * | 5 | 0 | 3 | 3 | 1 | 1 | 0 | ||
| 6 | 0 | 15 | * | 6 | 0 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 7 | 43 | >100 | 82 | 3 | 4 | 0 | 7 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8 | 35 | 1 | 17 | 2 | >100 | 20 | 8 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 9 | 1 | 1 | 1 | 2 | >100 | 5 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | >100 | >100 | >100 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 11 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | * | 11 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 12 | 3 | 8 | 1 | 0 | 1 | 0 | 12 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 13 | 0 | 0 | 88 | 0 | 0 | 1 | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 14 | 1 | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 15 | 4 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 15 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 16 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||
| 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||
| 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||
| A. Experimento II | |||||||||||||
| Vacuna VV del tipo salvaje | Vacuna VV:M6' recombinante | ||||||||||||
| 1 | >100 | >100 | * | * | 1 | >100 | >100 | * | |||||
| 2 | >100 | >100 | >100 | * | 2 | >100 | >100 | >100 | * | ||||
| 3 | >100 | >100 | 13 | * | 3 | 14 | >100 | 0 | 50 | >100 | >100 | ||
| 4 | >100 | >100 | >100 | >100 | * | 4 | 0 | 61 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 3 | 36 | 86 | 67 | * | 5 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 6 | >100 | >100 | 5 | >100 | >100 | >100 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 7 | >100 | 37 | 2 | >100 | >100 | >100 | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8 | 16 | 49 | 32 | >100 | 6 | 85 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| * = MUERTOS, después de la autopsia, los bazos cultivados en agar sangre que contenía estreptomicina revelaron estreptococos | |||||||||||||
| \exists-hemolíticos. | |||||||||||||
| 1 La dosis de inoculación estreptocócica en el Experimento I fue de 6 x 10^{6} CFR y de 1 x 10^{7} CFR en el Experimento II. | |||||||||||||
| 2 Unidades formadoras de colonias de estreptococos \exists-hemolíticos en agar sangre con contenido de estreptomicina de los | |||||||||||||
| hisopados de fauces de ratones inoculados con estreptococos del grupo A. |
Tal como se observará, la colonización faríngea
de los animales inmunizados con el virus del tipo salvaje difirió
significativamente de la de aquéllos inmunizados con el VV:M6'
recombinante. De los animales vacunados con el VV:M6' en ambos
grupos de dosificación, sólo el 16% de los 152 hisopados totales
tomados, dio un resultado positivo, donde 10 de ellos (6%) rindieron
>100 CFU, mientras que el 69% de los 115 hisopados dieron
positivo en el grupo tipo salvaje, donde 40 de ellos (35%)
exhibieron >100 CFU. En promedio >70% de los animales
inmunizados con el virus tipo salvaje dieron un cultivo positivo
respecto de estreptococos del grupo A en cada día del hisopado,
hasta 10 días después de la inoculación. Esto se compara con una
colonización de <30% de ratones inmunizados con el virus VV:M6' y
cultivados durante el mismo período después de la inoculación. Estas
cifras se resumen en la Tabla II.
| Días post-inoculación^{2} | ||||||
| Vacuna VV | (Cultivo positivo^{3}/total inoculados) | |||||
| [% colonizados] | ||||||
| Tipo salvaje | 19/25 | 18/25 | 19/25 | 18/25 | 21/25 | 19/25 |
| [76] | [72] | [76] | [72] | [84] | [76] | |
| Recombinante (VV:M6') | 3/28 | 9/28 | 7/28 | 8/28 | 8/28 | 8/28 |
| [11] | [32] | [25] | [29] | [29] | [29] | |
| ^{1} Compilado de la Tabla I | ||||||
| ^{2} Diferencia significativa (p>0,005) en todos los puntos temporales, entre los ratones vacunados con el tipo salvaje y | ||||||
| los vacunados con el tipo recombinante, de acuerdo con el análisis del chi cuadrado. | ||||||
| ^{3} Los cultivos de los animales dieron positivo para los estreptococos del grupo A o murieron después de la inocula- | ||||||
| ción estreptocócica. |
La Tabla I muestra los resultados de dos
experimentos separados en los que diferentes grupos de ratones
fueron tratados con la vacuna VV del tipo salvaje o bien, con la
vacuna VV:M6' y posteriormente inoculados. Tal como se observará, en
el primer grupo de 17, el 65% de los animales inmunizados con el
virus del tipo salvaje fueron colonizados el día 1 luego de la
inoculación estreptocócica y permanecieron esencialmente de ese modo
o murieron en el transcurso del experimento. En el segundo grupo de
8, el 100% de los ratones fueron colonizados el día 1, y más de la
mitad de ellos habían muerto al llegar el día 8. En los ratones
inmunizados con VV:M6', 0/20 (0%) en el Experimento I y sólo 3/8
(38%) en el Experimento II exhibieron un cultivo de fauces positivo
el día 1 posterior a la inoculación. Sólo el 18% de todos los
ratones vacunados con VV:M6' murieron durante los experimentos,
mientras que el 48% de todos los ratones vacunados con el tipo
salvaje murieron. Los cultivos de los bazos tomados de los animales
muertos revelaron estreptococos
beta-hemolíticos.
El ELISA cinético, aplicado tal como lo describen
Bessen y Fischetti, Infect. Immun., 56,2666 (1988) y
Fischetti y colaboradores J. Immunol. 141, 3592 (1988) (cada
uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia) se
utilizó para confirmar la presencia de anticuerpos. En el momento de
la inoculación estreptocócica (4 semanas luego de la inmunización)
la IgG específica de la proteína M se elevó significativamente en el
suero de los animales vacunados con la VV:M6' y estuvo ausente en
aquellos animales que recibieron el virus del tipo salvaje. Se
observaron niveles elevados comparables de anticuerpos contra el
virus vaccinia, tanto en los animales inmunizados con el tipo
salvaje como en los inmunizados con el tipo VV:M6'.
El plásmido pVV3:M6' de inserción que contiene el
gen M6' se produce tal como se explica en el Ejemplo 1 y se inserta
en un sitio no esencial en el genoma de un virus de viruela aviar
atenuado (FPV, Fowlpox Virus) (cepa FP-1). El
gen se inserta entre dos sitios HincII de un fragmento
PvuII de 900 bp del genoma FP-1 con la
posterior eliminación de aproximadamente 30 bp. El virus de la
viruela aviar recombinante, FPV:M6' se produce por los métodos antes
descritos en el Ejemplo 1 para el virus vaccinia. Otros métodos
previamente descritos para el virus de la viruela aviar y para el
virus vaccinia respectivamente, tales como en Taylor y
colaboradores, mencionado anteriormente o como en Panicali y
colaboradores, "Construction of poxvirus as cloning vectors:
Protective insertion of the thymidine kinase gene from herpes
simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus",
[Construcción del virus pox como vectores de clonación: inserción
protectora del gen de la cinasa de la timidita del virus del herpes
simple en el ADN del virus vaccinia infeccioso] Proc. Natl Acad.
Sci. USA 1982, 79, 4927, incorporado en la presente por referencia,
también se puede emplear para producir el plásmido de inserción y el
virus de la viruela aviar recombinante. La estructura del FPV:M6'
recombinante, la secuencia de las regiones de empalme y la expresión
de la unidad transcripcional quimérica se verifican por
secuenciamiento de ADN, hibridación por transferencia Northern
[Northern blot] y procedimientos de mapeo de la nucleasa S1.
El virus recombinante (FPV:M6') se cultiva, purifica y luego se
analiza cuidadosamente para verificar que el inserto M6' esté
presente, intacto y activamente transcripto en las células
infectadas con el virus.
Las estructuras del gen M6' y la proteína M6' se
muestran en las Figuras 5 y 6 usando símbolos estándar para los
constituyentes.
Unos grupos de ratones se inmunizan con el virus
FPV:M6' o bien, con la cepa del tipo salvaje y luego se inoculan con
estreptococos M6 del grupo A de acuerdo con los procedimientos
explicados en el Ejemplo 2. Del mismo modo, la confirmación de la
presencia de anticuerpos es tal como se detalla en el Ejemplo 2. Los
resultados obtenidos son sustancialmente los mismos que los
descritos en el Ejemplo 2.
Los resultados de los Ejemplos precedentes
muestran claramente la aptitud del virus vaccinia recombinante y del
virus de la viruela aviar recombinante de la presente invención para
expresar cantidades suficientes de la proteína M6' a fin de inducir
una respuesta inmune que brinde protección contra la colonización
estreptocócica en mamíferos.
Los productos novedosos que se han descrito hasta
el momento incluyen en gen M6', el plásmido pVV3:M6' que contiene el
gen M6', la proteína M6' y los virus VV:M6' y FPV:M6' recombinantes.
Sin ninguna admisión de la necesidad de hacer esto, se establece que
una muestra del plásmido pVV3:M6' en el E. coli se ha
depositado en el American Type "Culture Collection" con
el número de acceso 68003; y una muestra del virus vaccinia
recombinante VV:M6' también se ha depositado con el número de acceso
ATCC VR 2242.
Los expertos en la técnica reconocerán que, si
bien la invención se ha descrito por referencia a productos
específicos, no se limita a estos productos específicos. El concepto
de la invención se puede llevar a la práctica utilizando productos
que tengan actividades similares, y se pueden producir por síntesis
química, ingeniería genética u otras técnicas. Por ejemplo, el gen
M6' se puede modificar agregando o eliminando uno o varios codones y
el gen M6' modificado resultante, cuando se incorpore en un virus
tal como un virus vaccinia o un virus de la viruela aviar, dará
lugar a la expresión de proteínas M6' modificadas que tengan una
capacidad protectora igual o sustancialmente igual para los
mamíferos, contra la infección bacteriana. Aunque esta descripción
se refiere a una "región conservada expuesta", se entenderá que
no todas las regiones de estas características halladas en cada cepa
estreptocócica serán idénticas de hecho, ni tampoco lo serán los
genes que las produzcan. No obstante, todos tendrán sustancialmente
la misma actividad, es decir, el gen producirá una proteína de la
misma región general de la proteína M y la proteína brindará
protección contra la infección estreptocócica. Todas estas
modificaciones de los productos novedosos de esta invención están
incluidas dentro de este alcance.
Las vacunas de esta invención se prepararán, por
lo general, para la administración nasal, oral o parenteral, de
acuerdo con las técnicas convencionales que son bien conocidas para
los expertos en la técnica farmacéutica. Los ejemplos de dichas
composiciones incluyen las composiciones sólidas para la
administración oral, tales como cápsulas, comprimidos, píldoras y
similares; las preparaciones líquidas para suspensiones destinadas a
la administración oral, jarabes o elixires; y las preparaciones para
la administración parenteral, tales como emulsiones o suspensiones
estériles. Muchas de estas composiciones pueden ser adoptadas para
la administración nasal, utilizando un tipo de envase desde el cual
la composición pueda ser dispensada mediante la aplicación de
presión por aire o por otro gas. También se puede fabricar en forma
de composiciones sólidas estériles que se pueden suspender en agua
estéril, solución salina fisiológica o glucosa.
Todas estas composiciones contendrán una cantidad
suficiente del virus vaccinia y/o del virus de la viruela aviar
modificado como para generar una respuesta de protección en el
hospedante o algún otro medio inyectable, oral o nasal precisamente
antes del uso.
El producto se puede suministrar en forma
liofilizada para la reconstitución en una preparación amortiguadora
(buffer) con solución salina isotónica acuosa.
Los expertos en la técnica podrán establecer
fácilmente las dosificaciones y los regímenes óptimos para un
hospedante mamífero dado. Se tomarán en cuenta muchos factores bien
conocidos para médicos y veterinarios, entre los que se incluyen,
principalmente, la edad y el peso, como así también, la vía de
administración. Se pueden utilizar técnicas de refuerzo de
vacunación, tales como las que se emplean con otras vacunas.
Habiendo descrito de este modo en forma detallada
las realizaciones preferidas de la presente invención, debe
entenderse que la invención definida por las reivindicaciones
adjuntas no debe quedar limitada por los detalles particulares
establecidos en la descripción anterior, dado que muchas variaciones
de la misma son posibles, sin apartarse del espíritu y del alcance
de la presente invención.
Claims (6)
1. Virus vaccinia o de la viruela aviar
recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una
proteína derivada de M6, capaz de provocar una respuesta
inmunoprotectora contra una infección estreptocócica en un mamífero,
teniendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos de:
- a)
- la proteína M6' de la Fig. 5; o
- b)
- la región conservada expuesta de la proteína M6, desde la posición 210 hasta la posición 298 de la Fig. 1.
2. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1,
como un medicamento.
3. Una vacuna contra una infección estreptocócica
que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un virus de
acuerdo con la reivindicación 1.
4. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 3
para la administración intranasal y/u oral.
5. El uso de un virus de acuerdo con la
reivindicación 1, para preparar una vacuna contra una infección
estreptocócica.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en
el que la vacuna es para la administración intranasal y/u oral.
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