ES2336684T3 - Vacunas de subunidades de ornithobacterium rhinotracheale. - Google Patents

Vacunas de subunidades de ornithobacterium rhinotracheale. Download PDF

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Abstract

Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 59,8 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 1.

Description

Vacunas de subunidades de Ornithobacterium rhinotracheale.
La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale, a fragmentos de ADN, a moléculas de ADN recombinante, vehículos recombinantes vivos y células hospedadoras que comprenden tales ácidos nucleicos, a proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale, a anticuerpos contra tales proteínas, a tales proteínas para el uso en vacunas, al uso de tales proteínas en la fabricación de tales vacunas, a vacunas que comprenden tales ácidos nucleicos, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante, vehículos recombinantes vivos, células hospedadoras, proteínas o anticuerpos contra tales proteínas y a métodos para la preparación de tales vacunas.
El Ornithobacterium rhinotracheale es una bacteria descubierta de forma relativamente reciente que se encuentra más y más frecuentemente en granjas de aves de corral y en aves silvestres. Especialmente los animales en granjas comerciales de pollos, granjas de pavos y granjas de patos están infectados frecuentemente. En aves de corral comerciales, la infección está asociada con enfermedades respiratorias: las características más comunes de infección por Ornithobacterium rhinotracheale son aerosaculitis y neumonía. Estos signos se pueden inducir por aerosol en administración intratraqueal o intratorácica del organismo y se agravan por otros factores tales como virus respiratorios, bacterias o condiciones de alojamiento sub-óptimas. La osteítis, meningitis e infecciones articulares que se pueden inducir por aplicación intravenosa se han asociado con Ornithobacterium rhinotracheale. La infección se puede transmitir horizontalmente así como verticalmente a través de los huevos, lo que probablemente explica su propagación rápida y a nivel mundial. Se ha proporcionado una revisión extensa de Ornithobacterium rhinotracheale por van Empel, P.C.M. ad Hafez, H. M. en Avian Pathology 28: 217-227 (1999). La Patente Europea EP0.625.190 se refiere tanto a la bacteria Ornithobacterium rhinotracheale como a vacunas contra Ornithobacterium rhinotracheale.
La investigación serológica ha puesto de manifiesto que las cepas de Ornithobacterium rhinotracheale pueden tener diferentes serotipos, dependiendo hasta cierto grado del origen geográfico de la cepa y del animal hospedador del que se aislaron. En este momento se han encontrado dieciocho serotipos diferentes.
El tratamiento terapéutico de la enfermedad puede ser difícil debido a que dentro del género es muy común la resistencia adquirida contra los antibióticos regulares. Además, existe una reticencia creciente contra el uso de antibióticos en animales de alimentación por motivos tanto públicos como sanitarios y ambientales.
La vacunación ofrece una alternativa para el tratamiento terapéutico con anticuerpos, pero hasta ahora solamente ha sido posible la vacunación con vacunas vivas atenuadas y vacunas inactivadas de células completas.
Avian Diseases, vol. 44, páginas 549-555, 2000, S. J. Sprenger et al. describe la vacunación de pavos de 6 semanas de edad con una vacuna viva o inactivada de Ornithobacterium rhinotracheale. Después de 14 ó 21 semanas, las aves se expusieron a Ornithobacterium rhinotracheale vivo. Se observó que los pavos a los que se había inoculado la vacuna viva o inactivada de Ornithobacterium rhinotracheale estaban protegidos frente a cambios patológicos.
Avian Diseases, vol. 46, páginas 177-185, 2002, V. Lopes et al. describe la investigación de la protección provocada por un mutante sensible a temperatura (Ts) de la vacuna de Ornithobacterium rhinotracheale frente a una exposición a una cepa patógena. Los resultados indicaron que el uso de la cepa mutante Ts de Ornithobacterium rhinotracheale como una vacuna viva sería adecuado para provocar protección contra infección por Ornithobacterium rhinotracheale en pavos.
El éxito de vacunas vivas atenuadas específicamente para Ornithobacterium rhinotracheale depende en gran medida del equilibrio correcto entre atenuación y activación del sistema inmune. Las vacunas inactivadas de células completas básicamente son seguras y, por lo tanto, desde un punto de vista de seguridad, parecerían el tipo preferido de vacuna.
Sin embargo, las vacunas inactivadas de células vivas se tienen que dar a una mayor dosis en comparación con las vacunas vivas atenuadas. Como una regla general, la mayor parte de las proteínas presentes en una bacteria no desempeña ningún papel en la activación del sistema inmune, es decir, no son inmunógenos relevantes. Esto significa que, en el caso de vacunas inactivadas de células completas, para proporcionar a seres humanos o animales un nivel suficiente de inmunogénicas pertinentes, se administra una gran cantidad de material no protector adicionalmente y de forma inevitable. Esto no es una situación deseable.
El uso de vacunas de subunidades podría superar este problema y, por lo tanto, sería altamente preferido, pero actualmente no se conoce vacunas de subunidades inmunogénicas en la técnica para combatir Ornithobacterium rhinotracheale.
Además, se conoce que aunque las vacunas vivas atenuadas y las preparaciones inactivadas de células completas proporcionan un cierto nivel de protección cruzada contra todas las cepas de Ornithobacterium rhinotracheale, las vacunas de subunidades pueden inducir o no reactividad cruzada.
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La presente invención pretende proporcionar por primera vez vacunas que están basadas en subunidades de Ornithobacterium rhinotracheale que inducen reactividad cruzada.
Este objetivo se alcanza proporcionando ocho proteínas novedosas de Ornithobacterium rhinotracheale que desempeñan sorprendentemente un papel importante en la activación de una respuesta inmune protectora y proporcionando vacunas que comprenden una o más de estas proteínas inmunogénicas novedosas. Aún más sorprendentemente, se observó que estas ocho proteínas novedosas no solamente inducen una respuesta inmune homóloga protectora, sino que también inducen una respuesta inmune con reactividad cruzada protectora. Una respuesta inmune homóloga es una respuesta contra cepas del mismo serotipo, mientras que una respuesta inmune de reactividad cruzada es una respuesta contra cepas serológicamente tanto homólogas como heterólogas.
La primera proteína novedosa, Or01, que tiene un peso molecular de 59,8 kD, está codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 1.
Se conoce bien en la técnica que muchas secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar la misma proteína. Este fenómeno se conoce comúnmente como titubeo en la segunda y especialmente en la tercera base de cada triplete que codifica un aminoácido. Este fenómeno puede dar como resultado una heterología de aproximadamente el 20-30% para dos secuencias de nucleótidos que todavía codifican la misma proteína. Por lo tanto, dos ácidos nucleicos que tienen una homología de secuencia de nucleótidos de aproximadamente el 80% todavía pueden codificar la misma proteína.
Por tanto, una realización se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 59,8 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 1.
El peso molecular de la proteína (y las siete otras proteínas) se determina basándose en el peso molecular de los aminoácidos como se dan en la secuencia de aminoácidos.
Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 59,8 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de esta proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 1.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
El nivel de homología de nucleótidos se puede determinar con el programa informático "BLAST 2 SEQUENCES" seleccionado el sub-programa: "BLASTN" que se puede encontrar en www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2sea/bl2.html. Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Los parámetros usados son los parámetros por defecto:
Recompensa por una coincidencia: +1. Penalización por un apareamiento erróneo: -2. Hueco abierto: 5. Extensión de hueco: 2. Disminución x de hueco: 50.
Otra estrategia para decidir si una cierta secuencia de ácido nucleico es o no una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención se refiere a la cuestión de si una cierta secuencia de ácido nucleico híbrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 1 (o en la SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15, véase más adelante). Si una secuencia de ácido nucleico híbrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 1 o, por supuesto, como se ilustra en la SEC ID Nº: 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15, se considera que es una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
La definición de condiciones rigurosas se deduce de la fórmula de Meinkoth y Wahl (1984. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138: 267-284.).
Tm = [81,5ºC + 16,6(log M) + 0,41(% GC) - 0,61(% de formamida) - 500/L] -1ºC/1% de apareamiento erróneo
En esta fórmula, M es la molaridad de cationes monovalentes; %GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el ADN; L es la longitud del híbrido en pares de bases.
Las condiciones rigurosas son las condiciones en las que las secuencias de ácido nucleico o fragmentos de las mismas todavía hibridan, si tienen un apareamiento erróneo del 20% como mucho, preferiblemente del 10%, más preferiblemente del 8, 6, 5, 4,3, 2, 1 o el 0% en ese orden o preferencia, con la secuencia de ácido nucleico como se ilustra en cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ó 15.
Otra realización se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 58,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale Or02, o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 3.
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Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 58,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica una fragmento inmunogénico de esa proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 3.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Otra realización más se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 46,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale Or03 o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 5.
Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 46,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de esa proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 5.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
De nuevo, otra realización se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 37,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale Or04 o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 7.
Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 37,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de esa proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 7.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Otra realización se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 45,6 kD de Ornithobacterium rhinotracheale Or11 o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 9.
Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 45,6 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de esa proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 9.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
De nuevo, otra realización se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 42,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale Or77 o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 11.
Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 42,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de esa proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 11.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
También, otra realización se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 34,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale Or98A o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 13.
Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 34,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de esa proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 13.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
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Otra realización se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína de 32,9 kD de Ornithobacterium rhinotracheale Or98B o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, donde dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo tiene una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 15.
Preferiblemente, un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica esta proteína de 32,9 kD Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de ese ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de esa proteína tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 15.
Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
También pertenecen al alcance de la invención secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia ilustrada en la SEC ID Nº 1, 3, 5, 7, 9, 11,13 ó 15 o secuencias de nucleótidos que comprenden series en tándem de las secuencias de acuerdo con la invención.
Ya que la presente invención describe ácidos nucleicos que codifican 8 proteínas novedosas de Ornithobacterium rhinotracheale, ahora por primera vez es posible obtener estas proteínas en cantidades significativas. Esto se puede realizar, por ejemplo, usando sistemas de expresión para expresar la totalidad o partes de un gen que codifica la proteína o un fragmento inmunogénico del mismo.
Por lo tanto, en una forma preferida de esta realización, la invención se refiere a fragmentos de ADN que comprenden un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Un fragmento de ADN es un tramo de nucleótidos que funciona como un vehículo para un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Tales fragmentos de ADN pueden ser, por ejemplo, plásmidos, en los que se clona un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Tales fragmentos de ADN son útiles, por ejemplo, para aumentar la cantidad de ADN para el uso como un cebador y para la expresión de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, como se describe más adelante.
Un requisito esencial para la expresión del ácido nucleico es un promotor adecuado unido funcionalmente al ácido nucleico, de tal forma que el ácido nucleico esté bajo el control del promotor. Es obvio para el especialista en la técnica que la elección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota o vírico capaz de dirigir la transcripción génica en células usadas como células hospedadoras para la expresión de proteína. Por lo tanto, una forma más preferida de esta realización se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN y/o un ácido nucleico de acuerdo con la invención, donde el ácido nucleico de acuerdo con la invención se pone bajo el control de un promotor unido funcionalmente. Esto se puede obtener mediante, por ejemplo, técnicas de biología molecular convencionales.
(Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual, 1989. ISBN 0-87969-309-6). Los promotores unidos funcionalmente son promotores que son capaces de controlar la transcripción de los ácidos nucleicos a los que se unen. Tal promotor puede ser el promotor nativo del gen novedoso, es decir, el promotor que está implicado en la transcripción del ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la invención u otro promotor de Ornithobacterium rhinotracheale, suponiendo que ese promotor sea funcional en la célula usada para la expresión. También puede ser un promotor heterólogo. Cuando las células hospedadoras son bacterias, las secuencias de control de la expresión útiles que se pueden usar incluyen el promotor y el operador de Trp (Goeddel, et al., Nucl Acids Res., 8, 4057, 1980); el promotor y operador lac (Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); el promotor de proteína de membrana externa (Nakamura, K. y Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775,1982); los promotores y operadores de bacteriófago lambda (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); el promotor y operador de \alpha-amilasa (B. subtilis), secuencias de terminación y otras secuencias de mejora y control de la expresión compatibles con la célula hospedadora seleccionada. Cuando la célula hospedadora es una levadura, las secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, factor de apareamiento \alpha. Para células de insecto, se pueden usar los promotores de polihedrina o p10 de baculovirus (Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Cuando la célula hospedadora es de origen vertebrado, las secuencias de control de la expresión útiles ilustrativas incluyen el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (humano) (Seed, B. et al., Nature 329, 840-842,1987; Fynan, E. F. et al., PNAS 90, 11478-11482, 1993; Ulmer, J. B. et al, Science 259, 1745-1748, 1993), LTR de virus de sarcoma de Rous (RSV, Gorman, C. M. et al., PNAS 79, 6777-6781, 1982; Fynan et al., anteriormente; Ulmer et al., anteriormente), el LTR de MPSV (Stacey et al, J. Virology 50, 725-732,1984), el promotor temprano inmediato de SV40 (Sprague J. et al., J. Virology 45, 773, 1983), el promotor de SV40 (Berman, P. W. et al., Science, 222, 524-527, 1983), el promotor de metalotioneína (Brinster, R. L. et al., Nature 296, 39-42, 1982), el promotor de choque térmico (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985), el promotor tardío principal de Ad2 y el promotor de \beta-actina (Tang et al., Nature 356 152-154, 1992). Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias terminadoras y de poli-adenilación. Entre las secuencias que se pueden usar están la secuencia bien conocida de poli-adenilación de hormona de crecimiento bovino, la secuencia de poli-adenilación de SV40, las secuencias terminadoras y de poli-adenilación de citomegalovirus humano (hCMV).
Los sistemas de expresión de células bacterianas, de levadura, fúngicas, de insecto y de vertebrados son sistemas usados muy frecuentemente. Tales sistemas se conocen bien en la técnica y están disponibles de forma general, por ejemplo, en el mercado por Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, EEUU. Además de estos sistemas de expresión, los sistemas de expresión basados en parásitos son sistemas de expresión atractivos. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Francesa con el Nº de Publicación 2 714 074 y en la Publicación NTIS de Estados Unidos Nº US 08/043109 (Hoffman, S. y Rogers, W.: Public. Fecha 1 de diciembre de 1993).
Una forma incluso más preferida de esta realización de la invención se refiere a Vehículos Recombinantes Vivos (LRC) que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo con la invención, un fragmento de ADN de acuerdo con la invención o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención. Estos LRC son microorganismos o virus en los que se ha clonado información genética adicional, en este caso, un ácido nucleico que codifica una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, un fragmento de ADN o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención. Los pollos infectados por tales LRC producirán una respuesta inmunológica no solamente contra los inmunógenos del vehículo, sino también contra las partes inmunogénicas de la proteína o las proteínas para las que se clona el código genético adicionalmente en el LRC, por ejemplo, un gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención.
Como un ejemplo de LRC bacteriano, se pueden usar cepas atenuadas de Salmonella conocidas en la técnica de forma muy atractiva. Además, también se han descrito entre otras cosas parásitos portadores recombinantes vivos por Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 28: 1121 -1130 (1998)). Además, se pueden usar virus LRC como un modo de transportar el ácido nucleico al interior de una célula diana. Los virus portadores recombinantes vivos también se denominan virus vectores. Los virus usados con frecuencia como vectores son virus Vaccinia (Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927(1982)), virus herpes (documento EP 0473210-A2) y retrovirus (Valerio, D. et al. en: Baum, S. J., Dicke, K. A., Lotzova, E. y Pluznik, D. H. (Eds.), "Experimental Haematology today" 1988, Springer Verlag, New York, págs. 92-99 (1989)). Los virus conocidos y usados en la técnica como virus vectores muy adecuados específicamente en aves de corral son virus de peste aviar, virus de Marek serotipo 3, virus Herpes de Pavo, virus Semliki Forest y virus de Enfermedad de Newcastle.
Los Vehículos Recombinantes Vivos también se conocen en la técnica como "vectores vivos", o de forma resumida, "vectores". Por lo tanto, las vacunas basadas en un Vehículo Recombinante Vivo también se conocen en la técnica como vacunas de vector.
La técnica de recombinación homóloga in vivo, bien conocida en la técnica, se puede usar para introducir un ácido nucleico recombinante en el genoma de una bacteria, parásito o virus de elección, capaz de inducir la expresión del ácido nucleico insertado de acuerdo con la invención en el animal hospedador.
Finalmente, otra forma de esta realización de la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de acuerdo con una proteína de acuerdo con la invención, un fragmento de ADN que comprende tal ácido nucleico o una molécula de ADN recombinante que comprende tal ácido nucleico bajo el control de un promotor unido funcionalmente. Esta forma también se refiere a una célula hospedadora que contiene un vehículo recombinante vivo que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo con la invención. Una célula hospedadora puede ser una célula de origen bacteriano, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis y especies de Lactobacillus, en combinación con plásmidos basados en bacterias como pBR322, o vectores de expresión bacterianos tales como pGEX o con bacteriófagos. La célula hospedadora también puede ser de origen eucariota, por ejemplo, células de levadura en combinación con moléculas de vector específico de levadura o células eucariotas superiores como células de insecto (Luckow et al; Bio-technology 6: 47-55 (1988)) en combinación con vectores o baculovirus recombinantes, células vegetales en combinación, por ejemplo, con vectores basados en plásmido Ti o vectores víricos de plantas (Barton, K. A. et al; Cell 32: 1033 (1983), células de mamífero como células Hela, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de Riñón Felino Crandell, también con vectores o virus recombinantes apropiados.
Otra realización de la invención se refiere a una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale y fragmentos inmunogénicos de la misma de acuerdo con la invención.
El concepto de fragmentos inmunogénicos se definirá más adelante.
Una forma de esta realización se refiere a una proteína de 59,8 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 2.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente el 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 2. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
El nivel de homología de proteína se puede determinar con el programa informático "BLAST 2 SEQUENCES" seleccionando el sub-programa: "BLASTP", que se puede encontrar en www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.
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Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). La matriz usada: "blosum62". Los parámetros usados son los parámetros por defecto:
Hueco abierto: 11. Extensión de hueco: 1. Disminución x de hueco: 50.
Otra forma de esta realización se refiere a una proteína de 58,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 4.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 4. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Otra forma más de esta realización se refiere a una proteína de 46,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 6.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 6. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
De nuevo, otra forma de esta realización se refiere a una proteína de 37,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 8.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 8. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Otra forma más de esta realización se refiere a una proteína de 45,6 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 10.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 10. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Otra forma más de esta realización se refiere a una proteína de 42,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 12.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente el 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 12. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Y de nuevo, otra forma de esta realización se refiere a una proteína de 34,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 14.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente el 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 14. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Finalmente, otra forma de esta realización se refiere a una proteína de 32,9 kD de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de la misma, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 16.
En una forma preferida, la realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y a fragmentos inmunogénicos de las mismas, que tienen una homología de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente el 95% de homología con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 16. Se prefiere incluso más un nivel de homología del 98%, del 99% o incluso del 100%.
Otra forma de esta realización se refiere a tales proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale y fragmentos inmunogénicos de dichas proteínas de acuerdo con la invención, donde las proteínas y los fragmentos inmunogénicos de las mismas están codificados por un ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Se comprenderá que, para las proteínas particulares incluidas en este documento, pueden existir variaciones naturales entre cepas individuales de Ornithobacterium rhinotracheale. Estas variaciones se pueden demostrar por una diferencia o diferencias de aminoácidos en la secuencia global o por deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de un aminoácido o aminoácidos en dicha secuencia. Las sustituciones de aminoácidos que no alteran esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas se han descrito, por ejemplo, por Neurath et al en "The Proteins" Academic Press New York (1979). Las sustituciones de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o sustituciones que han tenido lugar frecuentemente en la evolución son, entre otras, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, IIe/Val (véase Dayhof, M. D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Otras sustituciones de aminoácidos incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y Ala/Glu. Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 227, 1435-1441, 1985) y para determinar la similitud funcional entre proteínas homólogas. Tales sustituciones de aminoácidos de las realizaciones ilustrativas de esta invención, así como variaciones que tienen deleciones y/o inserciones, pertenecen al alcance de la invención siempre que las proteínas resultantes conserven su inmunorreactividad. Esto explica por qué las proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención, cuando se aíslan de diferentes aislados de campo, puede tener niveles de homología de tan solo el 80%, mientras que todavía representan la misma proteína con las mismas características inmunológicas. Las variaciones en la secuencia de aminoácidos de una cierta proteína de acuerdo con la invención que todavía proporcionan una proteína capaz de inducir una respuesta inmune contra infección por Ornithobacterium rhinotracheale o al menos contra las manifestaciones clínicas de la infección se consideran "que no influyen esencialmente en la inmunogenicidad".
Cuando una proteína se usa, por ejemplo, con propósitos de vacunación para generar anticuerpos, sin embargo, no es necesario usar toda la proteína. También es posible usar un fragmento de esta proteína que sea capaz, como tal o acoplado a un vehículo tal como, por ejemplo, KLH, de inducir una respuesta inmune contra esa proteína, un denominado fragmento inmunogénico. Se entiende que un "fragmento inmunogénico" es un fragmento de la proteína de longitud completa que todavía ha conservado su capacidad de inducir una respuesta inmune en un hospedador vertebrado, por ejemplo, comprende un epítopo de célula B o T. En resumen, un fragmento inmunogénico es un fragmento que es capaz de inducir una respuesta antigénica contra una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención. En este momento, está disponible una diversidad de técnicas para identificar de forma sencilla fragmentos de ADN que codifican fragmentos antigénicos (determinantes). El método descrito por Geysen et al (Solicitud de Patente WO 84/03564, Solicitud de Patente WO 86/06487, Patente de Estados Unidos Nº 4.833.092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), el denominado método PEPSCAN es un método fácil de realizar, rápido y bien establecido para la detección de epítopos; las regiones inmunológicamente importante de la proteína. El método se usa a nivel mundial y, como tal, se conoce bien por el especialista en la técnica. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la detección de epítopos de células B. También, dada la secuencia del gen que codifica cualquier proteína, los algoritmos informáticos son capaces de indicar fragmentos de proteína específicos como los epítopos inmunológicamente importantes basándose en su concordancia secuencial y/o estructural con epítopos que ahora se conocen. La determinación de estas regiones está basada en una combinación de los criterios de hidrofilicidad de acuerdo con Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981)) y los aspectos de estructura secundaria de acuerdo con Chou y Fasman (Advances in Enzymology 47: 45-148 (1987) y Patente de Estados Unidos Nº 4.554.101). Los epítopos de células T se pueden predecir asimismo a partir de la secuencia por ordenador con la ayuda del criterio de anfifilicidad de Berzofsky (Science 235, 1059-1062 (1987) y Solicitud de Patente de Estados Unidos 07/005.885). Una revisión condensada se encuentra en Shan Lu en common principles: Tibtech 9: 238-242 (1991), Good et al en Malaria epitopes; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu para una revisión; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzofsky para HIV-epitopes; The FASEB Journal 5: 2412-2418 (1991). Un fragmento inmunogénico tiene habitualmente una longitud mínima de 8 aminoácidos, preferiblemente más de 8, tal como 9, 10, 12, 15 o incluso 20 aminoácidos. Los ácidos nucleicos que codifican tal fragmento, por lo tanto, tienen una longitud de al menos 24, pero preferiblemente 27, 30, 36, 45 o incluso 60 ácidos
nucleicos.
Por lo tanto, una forma de otra realización más de la invención se refiere a vacunas para combatir infección por Ornithobacterium rhinotracheale, que comprenden una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale o fragmentos inmunogénicos de la misma, de acuerdo con la invención como se ha descrito anteriormente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otra realización más de la presente invención se refiere a una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma para el uso en una vacuna.
Otra realización más de la presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico, o fragmento de ADN, una molécula de ADN recombinante, un vehículo recombinante vivo, una célula hospedadora o un proteína o un fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo con la invención para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por Ornithobacterium rhinotracheale.
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Un modo de preparar una vacuna de acuerdo con la invención es cultivar la bacteria, seguido de purificación bioquímica de una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, de la bacteria. Sin embargo, esto es un modo para preparar la vacuna que requiere mucho tiempo.
Por lo tanto, es mucho más conveniente usar los productos de expresión del gen que codifica una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale o fragmentos inmunogénicos de la misma en vacunas. Esto es posible por primera vez ahora debido a que en la presente invención se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale.
Las vacunas basadas en los productos de expresión de estos genes se pueden preparar de forma sencilla mezclando la proteína de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma de acuerdo con la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable como se describe más adelante.
Alternativamente, una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender vehículos recombinantes vivos como se ha descrito anteriormente, capaces de expresar la proteína de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos la misma. Tales vacunas, por ejemplo, basadas en un vehículo de Salmonella o un vehículo vírico, por ejemplo, un vector de virus Herpes tiene la ventaja con respecto a vacunas de subunidades que imitan mejor el modo natural de infección de Ornithobacterium rhinotracheale. Además, su auto-propagación es una ventaja, ya que solamente son necesarias pequeñas cantidades del vehículo recombinante para la inmunización.
Las vacunas también se pueden basar en células hospedadoras como se ha descrito anteriormente, que comprenden la proteína o fragmentos inmunogénicos de la misma de acuerdo con la invención.
Todas las vacunas que se han descrito anteriormente contribuyen a la vacunación activa, es decir, activan el sistema de defensa del hospedador.
Alternativamente, se pueden generar anticuerpos, por ejemplo, en conejos o se pueden obtener a partir de líneas celulares productoras de anticuerpos como se describe más adelante. Tales anticuerpos se pueden administrar entonces a los pollos. Este método de vacunación, vacunación pasiva, es la vacunación de elección cuando un animal ya está infectado y no hay tiempo para permitir que se active la respuesta inmune natural. También es el método preferido para vacunar animales que tienden a alta presión de infección repentina. Los anticuerpos administrados contra la proteína de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma, en estos casos, se unen directamente a Ornithobacterium rhinotracheale. Esto tiene la ventaja de que disminuye o detiene la multiplicación de Ornithobacterium rhinotracheale. Por lo tanto, otra forma más de esta realización de la invención se refiere a una vacuna para combatir infección por Ornithobacterium rhinotracheale que comprende anticuerpos contra una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de esa proteína y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otra realización más de esta invención se refiere a anticuerpos contra una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de esa proteína.
Los métodos para la producción a gran escala de anticuerpos de acuerdo con la invención también se conocen en la técnica. Tales métodos dependen de la clonación de (fragmentos de) la información genética que codifica la proteína de acuerdo con la invención en un fago filamentoso para la presentación en fagos. Tales técnicas se describen, entre otros, en la "Antibody Engineering Page" bajo "filamentous phage display" en http://aximt1.imt.uni-marburg.de/-rek/aepphage.html. y en artículos de revisión de Cortese, R. et al., (1994) en Trends Biotechn. 12: 262-267; de Clarckson, T. & Wells, J. A. (1994), en Trends Biotechn. 12: 173-183; por Marks, J. D. et al., (1992) en J. Biol. Chem. 267: 16007-16010; por Winter, G. et al., (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 y por Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv. 12: 539-555. Los fagos se usan posteriormente para explorar bibliotecas de expresión de camélido que expresan anticuerpos de cadena pesada de camélido. (Muyldermans, S. y Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140 (1999) y Ghahroudi, M. A., et al., FEBS Letters 414: 512-526 (1997)). Las células de la biblioteca que expresan los anticuerpos deseados se pueden replicar y se pueden usar posteriormente para expresión a gran escala de anticuerpos.
Otra realización más se refiere a un método para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención que comprende la mezcla de anticuerpos de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un modo alternativo y eficaz de vacunación es la vacunación directa con ADN que codifica el antígeno pertinente. La vacunación directa con ADN que codifica proteínas ha sido exitosa para muchas proteínas diferentes. (Como se revisa, por ejemplo, en Donnelly et al., The Immunologist 2: 20-26 (1993)). Este modo de vacunación también es muy atractivo para la vacunación de pollo contra la infección por Ornithobacterium rhinotracheale. Por lo tanto, otras formas más de esta realización de la invención se refieren a vacunas que comprenden ácidos nucleicos que codifican una proteína de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma, que comprenden fragmentos de ADN que comprenden tales ácido nucleicos o que comprenden moléculas de ADN recombinante de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los ejemplos de plásmido de ADN que son adecuados para el uso en una vacuna de ADN de acuerdo con la invención son plásmido de clonación o expresión convencionales para células hospedadoras bacterianas, eucariotas y de levadura, estando muchos de dichos plásmidos disponibles en el mercado. Los ejemplos bien conocidos de tales plásmidos son pBR322 y pcDNA3 (Invitrogen). Los fragmentos de ADN o las moléculas de ADN recombinante de acuerdo con la invención deben ser capaces de inducir la expresión de proteína de las secuencias de nucleótidos. Los fragmentos de ADN o las moléculas de ADN recombinante pueden comprender una o más secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención. Además, los fragmentos de ADN o las moléculas de ADN recombinante pueden comprender otras secuencias de nucleótidos tales como los oligonucleótidos inmunoestimulantes que tienen dinucleótidos CpG no metilados o secuencias de nucleótidos que codifican otras proteínas antigénicas o citocinas de potenciación con adyuvante.
La secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención o el plásmido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención, preferiblemente unido operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción, a usar en la vacuna de acuerdo con la invención, puede estar desnudo o empaquetado en un sistema de suministro. Los sistemas de suministro adecuados son vesículas lipídicas, iscoms, dendrómeros, niosomas, matrices de polisacáridos y similares (véase más adelante), todos conocidos bien en la técnica. También muy adecuadas como sistema de suministro son bacterias vivas atenuadas tales como especies de Salmonella y virus vivos atenuados tales como vectores de virus Herpes, como se ha mencionado anteriormente.
Las vacunas de ADN se pueden administrar, por ejemplo, de forma sencilla mediante aplicación intradérmica tal como por el uso de un inyector sin aguja. Este modo de administración suministra el ADN directamente a las células del animal a vacunar. Las cantidades de ADN en el intervalo entre 10 pg y 1000 \mug proporcionan buenos resultados. Preferiblemente, se usan cantidades en el intervalo de microgramos entre 1 y 100 \mug.
En una realización adicional, la vacuna de acuerdo con la presente invención comprende uno o más antígenos adicionales obtenidos de un virus o microorganismo patógeno para aves de corral, un anticuerpo contra tal antígeno o información genética que codifica dicho antígeno.
Por supuesto, tales antígenos pueden ser, por ejemplo, otros antígenos de Ornithobacterium rhinotracheale. Es beneficioso combinar, en una vacuna, dos o más de las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención, anticuerpos contra tales proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas o información genética que codifica tales proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas. Además de esto, es beneficioso incluir en una vacuna de acuerdo con la invención antígenos procedentes de otro microorganismo o virus patógeno para aves de corral, un anticuerpo contra tal antígeno o información genética que codifica dicho antígeno.
Preferiblemente, el virus o microorganismo se selecciona entre el grupo que consiste en virus de peste aviar, virus de Bronquitis Infecciosa, Enfermedad de Bursa Infecciosa (Gumboro), Virus de la Enfermedad de Marek, agente de Anemia del pollo, Reovirus Aviar, Mycoplasma gallisepticum, Virus de la Rinotraqueitis del Pavo, Haemophilus paragallinarum (Coriza), Poxvirus de Pollo, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la Peste de Pato, virus de la Enfermedad de Newcastle, virus del síndrome de Caída de Huevo, virus de Laringotraqueitis Infecciosa, Virus Herpes de Pavos, especies de Eimeria, Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella multocida, Mycoplasma synoviae, especies de Salmonella y E. coli.
Las vacunas basadas en las proteínas de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención también son muy adecuadas como vacunas marcadoras. Una vacuna marcadora es una vacuna que permite diferenciar entre pollos vacunados e infectados en campo, por ejemplo, basándose en el panel de anticuerpos característico, diferente del panel de anticuerpos inducido por infección de tipo silvestre. Se induce un panel de anticuerpos diferente, por ejemplo, cuando una proteína inmunogénica presente en una bacteria de tipo silvestre no está presente en una vacuna: entonces el hospedador no preparará anticuerpos contra esa proteína después de la vacunación. Por tanto, una vacuna basada en una proteína de Ornithobacterium rhinotracheale de acuerdo con la invención induciría solamente anticuerpos contra esa proteína, mientras que una vacuna basada en Ornithobacterium rhinotracheale de tipo silvestre vivo, vivo atenuado o completo inactivado induciría anticuerpos contra todas o la mayoría de las proteínas bacterianas. Un simple ensayo ELISA, que tiene pocillos que comprenden una proteína de acuerdo con la invención y pocillos que comprenden otra proteína de acuerdo con la invención es suficiente para ensayar el suero de pollos y para indicar si los pollos están vacunados con una vacuna de subunidades de acuerdo con la invención o han padecido infección de campo por Ornithobacterium rhinotracheale; los pollos vacunados con una vacuna que comprende una proteína de acuerdo con la invención no tendrían anticuerpos contra otra proteína de acuerdo con la invención. Los pollos que se han encontrado con una infección de campo por Ornithobacterium rhinotracheale, sin embargo, tendrían anticuerpos contra todas las proteínas inmunogénicas de Ornithobacterium rhinotracheale y, por tanto, también contra otra proteína de acuerdo con la invención.
Todas las vacunas de acuerdo con la presente invención comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua estéril o una solución salina fisiológica estéril. En una forma más compleja, el vehículo puede ser, por ejemplo, un tampón.
Los métodos para la preparación de una vacuna comprenden la mezcla de una proteína o un fragmento inmunogénico de la misma, de acuerdo con la invención y/o anticuerpos contra esa proteína o un fragmento inmunogénico de la misma y/o un ácido nucleico y/o un fragmento de ADN, una molécula de ADN recombinante, un vehículo recombinante vivo o una célula hospedadora de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las vacunas de acuerdo con la presente invención también pueden contener en una presentación preferida una sustancia inmunoestimuladora, un denominado adyuvante. Los adyuvantes comprenden en general sustancias que refuerzan la respuesta inmune del hospedador de un modo no específico. En la técnica se conocen varios adyuvantes diferentes. Los ejemplos de adyuvantes usados frecuentemente en vacunas de pollo son dipéptidos de muramilo, lipopolisacáridos, varios glucanos y glicanos y Carbopol^{(R)} (un homopolímero). La vacuna también puede comprender un denominado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al que se adhiere la proteína, sin unirse covalentemente al mismo. Tales vehículos son, entre otros, bio-microcápsulas, microalginatos, liposomas y macrosoles, todos conocidos en la técnica. Una forma especial de tal vehículo, en el que el antígeno se incluye parcialmente en el vehículo, es el denominado ISCOM (documentos EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380). Además, la vacuna puede comprender uno o más compuestos con actividad superficial o emulsionantes adecuados, por ejemplo, Span o Tween.
Con frecuencia, la vacuna se mezcla con estabilizantes, por ejemplo, para proteger proteínas con tendencia a degradación contra que sean degradadas, para mejorar la vida útil de la vacuna o para mejorar la eficacia de secado por congelación. Los estabilizantes útiles son, entre otros, SPGA (Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), hidratos de carbono, por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de las mismas y tampones, tales como fosfatos de metal alcalino.
Además, la vacuna se puede suspender en un diluyente fisiológicamente aceptable. No es necesario decir que en la presente invención también se incluyen otros modos de potenciar con adyuvante, añadir compuestos o diluyentes de vehículo, emulsionar o estabilizar una proteína.
Las vacunas de acuerdo con la invención que se basan en la proteína de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma se pueden administrar de forma muy adecuada en cantidades que varían entre 1 y 100 microgramos de proteína por animal, aunque en principio se pueden usar dosis menores. Una dosis que supera 100 microgramos, aunque inmunológicamente será muy adecuada, será menos atractiva por motivos comerciales.
Las vacunas basadas en un vehículo recombinante vivo atenuado, tales como los virus y bacterias LRC que se han descrito anteriormente, se pueden administrar en dosis mucho menores, debido a que se multiplican por sí mismos durante la infección. Por lo tanto, las cantidades muy adecuadas variarían entre 10^{3} y 10^{9} UFC/UFP para, respectivamente, bacterias/virus.
Las vacunas de acuerdo con la invención se pueden administrar, por ejemplo, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa o en superficies de la mucosa tal como por vía oral o por vía intranasal. Las vacunas de vehículo recombinante vivo o vacunas de vector se pueden administrar de forma más eficaz por pulverización, por aerosol o por administración en el agua de bebida.
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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de biblioteca, sueros y exploración
Para la construcción de una biblioteca de expresión de la cepa O-95029 Nº 16279 de serotipo G de Ornithobacterium rhinotracheale se aisló ADN genómico de células cultivadas en caldo Todd Hewitt (THB) durante 24 horas a 37ºC en un agitador de 100 rpm de acuerdo con el método descrito en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Se obtuvieron fragmentos de ADN de 1-4 kb por digestión con enzimas de restricción y se ligaron en brazos de vector \lambdaTriplEx (Clontech, Palo Alto, CA, EEUU). Se realizó el empaquetamiento posterior usando el extracto de empaquetamiento in vitro de Stratagene (La Jolla, CA, EEUU). Se usaron células de Escherichia coli XL1 Blue, cultivadas en caldo Luria Bertani (LB) complementado con MgSO_{4} 10 mM y maltosa al 0,2% para la transfección. La complejidad de la biblioteca de expresión construida se ensayó 6,9 y contenía el 97% de recombinantes.
La biblioteca de expresión de serotipo G de Ornithobacterium rhinotracheale se exploró con antisueros policlonales dirigidos contra organismos vivos completos de varios serotipos de Ornithobacterium rhinotracheale. Los sueros se recogieron de pollos de engorde que estaban vacunados por pulverización con aerosol con bacterias vivas de Ornithobacterium rhinotracheale de serotipo B (cepa GGD 1261), serotipo G (cepa O-95029 Nº 16279) o serotipo M (cepa TOP 98036 4500) a las dos semanas de edad. Tres semanas más tarde, los pollos se expusieron por vía intravenosa a serotipo A de Ornithobacterium rhinotracheale (cepa B3263/91). Se recogieron sueros una semana después de la exposición. Todas las aves vacunadas mostraron patología reducida (que variaba del 10% al 60%) en comparación con aves de control no vacunadas. Antes del uso en la exploración de la biblioteca de expresión, los antisueros se adsorbieron con lisado de células de Escherichia coli XL1 Blue como se describe en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6) para reducir una señal de fondo específica.
La biblioteca de expresión se exploró por transferencia de placas usando una exploración inicial de aproximadamente 20.000 placas. El procedimiento se realizó como se describe en el manual de los fabricantes (Clontech, Palo Alto, CA, EEUU). Todas las exploraciones de bibliotecas se realizaron en condiciones nativas. En resumen, las células de Escherichia coli XL1 Blue infectadas por fagos se sembraron en agar superior LB en placas de agar LB ambas complementadas con MgSO_{4}10 mM. Después, las placas se incubaron a 42ºC durante 4 horas. Un disco de filtro de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania), embebido previamente en IPTG 10 mM, se puso en cada placa para inducir la expresión de las proteínas codificadas por los insertos clonados de Ornithobacterium rhinotracheale. Después de 4 horas de incubación a 37ºC todos los filtros se eliminaron de las placas. Después del lavado y el bloqueo, los filtros se incubaron con antisuero de pollo (combinado de 10 animales, dilución 1:250). El antisuero usado en la primera exploración se obtuvo de pollos vacunados con vacuna viva con el serotipo G de Ornithobacterium rhinotracheale seguido de una exposición al serotipo A de Ornithobacterium rhinotracheale. Como anticuerpo secundario se usó IgG de conejo anti-pollo con peroxidasa (Nordic, Tilburg, Países Bajos) a dilución 1:1000. Como sustrato se usó la solución Vector SG (Vector, Burlingame, CA, EEUU). De la exploración inicial de 20.000 placas, 200 placas reactivas se localizaron en las placas de agar y se aislaron. Se repitió una transferencia de placa y exploración como se ha descrito anteriormente dos veces dando como resultado 175 placas reactivas individuales, puras. Después, los clones puros se aplicaron de forma puntual in duplo sobre una césped de agar superior de E. coli XL1 Blue para dar placas confluentes de aproximadamente 5 mm de diámetro. De nuevo se realizó una transferencia de placas y los filtros se incubaron con los antisueros obtenidos de aves vacunadas con vacuna viva con el serotipo B o serotipo M de Ornithobacterium rhinotracheale antes de la exposición a serotipo A de Ornithobacterium rhinotracheale. De las 175 placas reactivas, se seleccionaron 30 placas porque presentaban reactividad cruzada con sueros de aves vacunadas con vacuna viva con el serotipo B, serotipo G o serotipo M de Ornithobacterium rhinotracheale y expuestas al serotipo A de Ornithobacterium rhinotracheale.
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Ejemplo 2 Identificación de fases de lectura abierta (ORF) que codifican proteínas antigénicas y expresión en Escherichia coli
Los insertos de ADN de las 30 placas seleccionadas se analizaron para identificar las fases de lectura abierta que codifican las proteínas antigénicas. Se usaron cebadores oligonucleotídicos diseñados para los brazos del vector \lambda TriplEx tanto para la amplificación por PCR como la secuenciación. Se realizó PCR en un volumen de reacción final de 50 \mul que contenía dNTP 50 \muM (Promega, Wl, EEUU), 10 pmol de ambos cebadores, 20 U/ml de polimerasa Supertaq plus y 10X de tampón Supertaq (ambos de HT Biotechnology Ltd, Cambridge, RU) en agua. Se añadió ADN de fago seleccionando una placa recién sembrada usando un palillo y transfiriendo este ADN desde el palillo a la mezcla de reacción. Se usaron las siguientes condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 3 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 min, hibridación a 50ºC durante 2 min y elongación a 68ºC durante 2 min 30 s, seguido de una extensión final a 68ºC durante 10 min. Para determinar la secuencia de nucleótidos de los insertos de ADN amplificado, se realizó una reacción de secuencia (94ºC 10 s; 50ºC 5 s; 60ºC 2 min durante 25 ciclos) usando la mezcla de reacción Big dye Terminator Ready (Qiagen Inc., CA, EEUU), 50 ng de ADN de molde (producto de PCR) y 2,4 pmol de cebador en un volumen de reacción de 20 \mul.
Después del análisis de secuencia, los 30 clones parecieron representar 8 genes diferentes. Ya que la mayoría de las fases de lectura abierta eran una fusión con el gen de lacZ del vector \lambdaTriplEx, el extremo 5' del gen estaba ausente. Por este motivo se realizó una reacción de secuencia usando cebadores internos y ADN cromosómico del serotipo G de Ornithobacterium rhinotracheale como un molde para secuenciar el hueco 5' ausente.
Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para amplificar las fases de lectura abierta de longitud completa que codifican los 8 antígenos con reactividad cruzada (Or01, Or02, Or03, Or04, Or11, Or77, Or98A y Or98B) de ADN genómico de serotipo G de Ornithobacterium rhinotracheale cepa 0-95029 Nº 16279 (véase la Tabla 1). Los cebadores oligonucleotídicos 5' contienen un sitio de restricción (subrayado) que precede al codón de inicio ATG (negrita) seguido de secuencias obtenidas del gen de interés (cursiva). Los oligonucleótidos 3' contienen secuencias codificantes (cursiva) seguido de un sitio de restricción (subrayado). Los productos de PCR se clonaron en el vector de expresión de interés. Los productos de ligación se transformaron hasta células hospedadoras E. coli BL21 (DE3) codón RIL pLysS (Novagen, Madison, Wl, EEUU) para la expresión de proteína. Mediante el uso del vector plasmídico pET (pET22b) y un sistema de expresión de ARN polimerasa de T7 (Novagen, Madison, Wl, EEUU), las proteínas recombinantes se expresaron en E. coli, con un péptido líder de E. coli pelB fusionado en la porción amino terminal (los péptidos líder de Ornithobacterium rhinotracheale de proteínas Or02, Or03, Or11 y Or77 se sustituyeron) y 6 restos de histidina en la porción en carboxi terminal de la proteína. Se usó la cepa de E. coli BL21 (DE3) codón RIL pLysS (Novagen, Madison, Wl, EEUU) para un alto nivel de expresión durante la inducción con IPTG como se describe en el manual del sistema pET (Novagen, Madison, Wl, EEUU).
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Ejemplo 3 Purificación de antígenos, formulaciones de vacuna y análisis serológico
Se aislaron antígenos recombinantes expresados en E. coli del sobrenadante (Or77), se purificaron por cromatografía de afinidad de metales usando resina talon (Clontech Inc., Palo Alto, CA, EEUU) como se describe por el fabricante (Or03, Or04, Or98A y Or98B), o mediante ciclos repetidos de congelación - descongelación, sonificación y centrifugación (Or01, Or02 y Or11). Se usó electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) seguido de tinción con azul brillante de Coomassie para evaluar la pureza de las proteínas recombinantes. Se estimaron las concentraciones de proteína usando albúmina sérica bovina como el patrón.
Todas las proteínas recombinantes purificadas (Or01, Or02, Or03, Or04, Or11, Or77, Or98A y Or98B) se formularon individualmente en una emulsión de agua en aceite. Además, se formularon cinco vacunas de subunidades diferentes (A, B, C, D y E) que contenían diferentes composiciones de los 8 antígenos recombinantes (tabla 2). La tinción con Coomassie de las 5 vacunas de combinación mostró bandas de proteína claramente identificables que se corresponden a proteínas recombinantes Or01, Or02 y Or77. Ya que los pesos moleculares de Or03, Or04 y Or11 y los pesos moleculares de Or98A y Or98B son aproximadamente iguales, no se pudieron distinguir bandas de proteínas individuales (figura 1). Todas las proteínas están presentes en concentraciones aproximadamente iguales de 50 mg/antígeno/l (25 \mug/dosis). Por lo tanto, la carga antigénica total de la vacuna A a D es 200 mg/l. La concentración de antígeno de la vacuna E es 400 mg/l. El fondo de proteína es material restante de la cepa de E. coli usada para expresar los antígenos recombinantes de Ornithobacterium rhinotracheale.
Se estudió la capacidad de las diferentes vacunas de subunidades de estimular la respuesta inmune humoral para producir anticuerpos específicos de proteína mediante inyección subcutánea de 0,5 ml de vacuna a pollos de engorde SPF de 2 semanas de edad. Cuatro semanas después de la vacunación se recogieron muestras séricas y se ensayaron para la presencia de anticuerpos reactivos contra las proteínas recombinantes. Se realizó transferencia de Western semiseca de acuerdo con Towbin, H., Staehlin, T. y Gordon, J. (1979) Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 43-50. La fase de proteína de las vacunas se transfirió e incubó con suero combinado (dilución 1:100) de aves vacunadas y no vacunadas. Los sueros obtenidos de aves vacunadas con cada una de las 8 vacunas individuales Or01 a Or98B mostraron reactividad específica de proteína (figura 2). La Figura 3 muestra la reactividad de antisueros obtenidos de aves vacunadas con la vacuna de subunidades A a E (véase la tabla 2 y la figura 1), dirigidos contra las mismas vacunas en transferencia de Western. Por ejemplo: se carga la transferencia A con las vacunas A, B, C, D y E (correspondiendo a los carriles A a E). El suero usado para la unión de anticuerpo primario se obtiene de aves vacunadas con la vacuna A (se corresponde al número de transferencia). Por este motivo, en este suero están presentes anticuerpos \alpha-Or01, \alpha-Or02, \alpha-Or03 y \alpha-Or04. En la transferencia A, estas cuatro proteínas se tiñen en el carril A, D y E, que son los carriles que se cargaron con las tres vacunas que contienen estos antígenos (A, D y E). La transferencia B se carga como la transferencia A y el suero usado se obtiene de aves vacunas con la vacuna B. Los anticuerpos \alpha-Or77, \alpha-Or11, \alpha-Or03 y \alpha-Or04 tiñen los antígenos correspondientes en la transferencia B en los carriles B, C y E. Los demás antígenos que no estaban presentes en la vacuna B no se pudieron detectar en esta transferencia. En la transferencia E, todas las proteínas se tiñen debido a que la vacuna E contiene los ocho antígenos de Ornithobacterium rhinotracheale. El suero usado en la transferencia de Western F se obtiene de aves no vacunadas que sirvieron como un control negativo. No se pudieron detectar antígenos recombinantes de Ornithobacterium rhinotracheale usando este suero.
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Ejemplo 4 Estudios de protección
Para evaluar la capacidad protectora cruzada de la respuesta de anticuerpos inducida por diferentes vacunas de subunidades (vacunas combinadas A, B, C, D, E y la vacuna individual Or77), se realiza un experimento animal. Se vacunaron pollos de engorde SPF a las 2 semanas de edad como se ha descrito anteriormente. A las 5 semanas de edad, las aves se sensibilizaron con ND LaSota (dosis: 1*10^{6} E.I.D. por ave) por pulverización con aerosol. A las 6 semanas de edad las aves se expusieron a la cepa B3263/91 de serotipo A de Ornithobacterium rhinotracheale (exposición heteróloga). La exposición se realizó por pulverización con aerosol de un cultivo bacteriano fresco que contenía 8,5*10^{8} unidades formadoras de colonias (UFC) por ml de THB. Durante la exposición por aerosol, el cultivo bacteriano se administró como una pulverización fina a las aves en un aislador de aproximadamente 1,5 m^{3}, usando un pulverizador de pintura comercial. La neblina desarrollada en los aisladores se mantuvo durante al menos 10 min con la circulación de aire cerrada. Los grupos de control de exposición y grupos de sensibilización con el ND se incluyeron en el ensayo. Una semana después de la exposición, a las 7 semanas de edad, las aves se sacrificaron y las lesiones orgánicas se puntuaron macroscópicamente usando un sistema de puntuación de Ornithobacterium rhinotracheale para enfermedad respiratoria del siguiente modo: para sacos aéreos torácicos, 0 = ninguna anormalidad, 1 = un saco aéreo afectado gravemente por aerosaculitis fibrinosa o focos limitados de tamaño de cabeza de alfiler o exudados fibrinosos en ambos sacos aéreos, 2 = ambos sacos aéreos afectados gravemente por aerosaculitis fibrinosa; para sacos aéreos abdominales, 0 = ninguna anormalidad, 1 = focos de tamaño de cabeza de alfiler o exudados fibrinosos o aerosaculitis fibrinosa ligeramente difusa, 2 = aerosaculitis fibrinosa grave. La puntuación de aerosaculitis se proporciona como la suma de ambas puntuaciones. Para pulmones, 0 = ninguna anormalidad, 1 = neumonía unilateral, 2 = neumonía bilateral. Las puntuaciones de grupo promedio se dan como un porcentaje de la máxima puntuación posible. Se realizó análisis estadístico usando ANOVA de una vía no paramétrico de Kruskal-Wallis.
La Figura 4 muestra la capacidad de protección cruzada de las 5 vacunas de subunidades diferentes A a E. El grupo de control de exposición no se vacunó pero se sensibilizó y expuso y mostró la mayor puntuación. Las aves vacunadas con la vacuna E (que contenía los 8 antígenos) mostró una protección prácticamente completa comparable a los resultados del grupo que no recibió vacunación y exposición pero que se sensibilizó con el virus de la Enfermedad de Newcastle. Se pudo observar una protección cruzada ligeramente menor, pero todavía significativa (P < 0,05) en aves vacunadas con la vacuna A, B y C. La vacuna de combinación D mostró protección cruzada de menor significación (p = 0,19). Las aves no tratadas no mostraron lesiones orgánicas. Como se puede observar en la figura 5, los animales vacunados con Or77 (= cepa de serotipo G) y expuestos a serotipo A también mostraron una reducción significativa (p < 0,05)) en puntuaciones de lesión respiratoria en comparación con el grupo de control no vacunado.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Tinción de Coomassie en las 5 vacunas de combinación (A a E). Cada vacuna contenía una composición diferente de las 8 proteínas recombinantes purificadas. La vacuna de subunidades A se corresponde al carril A, la vacuna de subunidades B se corresponde a carril B, la vacuna de subunidades C se corresponde al carril C, la vacuna de subunidades D se corresponde al carril D, la vacuna de subunidades E se corresponde al carril E. Las proteínas recombinantes con pesos moleculares aproximadamente iguales se indican por una flecha sencilla.
Figura 2: Reactividad de antisueros monovalentes, obtenidos de pollos vacunados con la vacuna de subunidades recombinante sencilla, contra la misma proteína en transferencia de Western. Las proteínas de vacuna reactivas se indican por flechas negras.
Figura 3: Reactividad de antisueros, obtenidos de pollos vacunados con las vacunas de subunidades A a E en transferencia de Western. Cada transferencia contiene las proteínas de las vacuna A, B, C, D y E (correspondientes a los carriles A a E). El suero usado para la exploración se obtiene de aves vacunas con la vacuna A (transferencia A), vacuna B (transferencia B), vacuna C (transferencia C), vacuna D (transferencia D) o vacuna E (transferencia E). El suero usado en la transferencia de Western F se obtiene de aves no vacunadas. Las proteínas de vacuna reactivas se indican por una línea negra.
Figura 4: Capacidad protectora cruzada de vacunas de subunidades A a E, en comparación con grupos de exposición y de control con NDV, representada como la máxima puntuación posible de lesión orgánica respiratoria.
Figura 5: Capacidad protectora cruzada de la vacuna de subunidades Or77, en comparación con los grupos de exposición y de control con NDV, representada como la máxima puntuación posible de lesión orgánica respiratoria.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
TABLA 2 Vacunas de subunidades (A a E) que consisten en diferentes combinaciones de subconjuntos de proteínas
2 
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<110> AKZO Nobel N.V.
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<120> Vacunas de subunidades de Ornithobacterium rhinotracheale 
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<130> 2004.011
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<160> 16
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<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
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<211> 1614
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1614)
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<400> 1
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3
4
5
6 
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<210> 2
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<211> 537
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 2
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7
8
9
10 
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<210> 3
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<211> 1572
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1572)
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<400> 3
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11
13
14 
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<210> 4
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<211> 523
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 4
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15
16
17 
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<210> 5
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<211> 1242
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1242)
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<400> 5
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18
19
20 
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<210> 6
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<211> 413
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 6
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21
22
23 
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<210> 7
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<211> 1023
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1023)
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<400> 7
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25
26
27 
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<210> 8
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<211> 340
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 8
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28
29
30 
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<210> 9
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<211> 1230
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1230)
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<400> 9
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31
32
33 
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<210> 10
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<211> 409
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 10
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34
35
36 
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<210> 11
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<211> 1140
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1140)
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<400> 11
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37
38
39 
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<210> 12
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<211> 379
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 12
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40
41 
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<210> 13
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<211> 918
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(918)
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<400> 13
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43
44
45 
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<210> 14
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<211> 305
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 14
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46
47 
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<210> 15
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<211> 888
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<212> ADN
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<220>
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<221> CDS
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<222>(1)..(888)
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<400> 15
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49
50 
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<210> 16
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<211> 295
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<212> PRT
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<213> Ornithobacterium rhinotracheale 
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<400> 16
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52
53

Claims (52)

1. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 59,8 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 1.
2. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 1.
3. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 58,2 kD Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 3.
4. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 3.
5. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 46,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 5.
6. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 5.
7. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 37,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 7.
8. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 7.
9. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 45,6 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 9.
10. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 9.
11. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 42,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 11.
12. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 11.
13. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 34,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 13.
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14. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 13.
15. Ácido nucleico que codifica una proteína inmunogénica de 32,9 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha parte del mismo una homología de al menos el 80% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 15.
16. Ácido nucleico o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por que la secuencia tiene una homología de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con el ácido nucleico del gen de proteína de Ornithobacterium rhinotracheale como se ilustra en la SEC ID Nº: 15.
17. Fragmento de ADN que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1-16.
18. Molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-16 o un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, bajo el control de un promotor unido funcionalmente.
19. Vehículo recombinante vivo que comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 17 o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 18.
20. Célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 18 o un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 19.
21. Una proteína inmunogénica de 59,8 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 2.
22. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 21, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 2.
23. Una proteína inmunogénica de 59,8 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.
24. Una proteína inmunogénica de 58,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 4.
25. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 24, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 4.
26. Una proteína inmunogénica de 58,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4.
27. Una proteína inmunogénica de 46,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 6.
28. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 27, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 6.
29. Una proteína inmunogénica de 46,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.
30. Una proteína inmunogénica de 37,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 8.
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31. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 30, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 8.
32. Una proteína inmunogénica de 37,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.
33. Una proteína inmunogénica de 45,6 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 10.
34. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 33, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 10.
35. Una proteína inmunogénica de 45,6 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10.
36. Una proteína inmunogénica de 42,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 12.
37. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 36, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 12.
38. Una proteína inmunogénica de 42,2 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12.
39. Una proteína inmunogénica de 34,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 14.
40. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 39, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 14.
41. Una proteína inmunogénica de 34,0 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.
42. Una proteína inmunogénica de 32,9 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº:16.
43. Una proteína inmunogénica de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de dicha proteína, de acuerdo con la reivindicación 42, teniendo dicha proteína o fragmento inmunogénico de la misma una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 85%, preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95% con la secuencia de aminoácidos como se ilustra en la SEC ID Nº: 16.
44. Una proteína inmunogénica de 32,9 kD de Ornithobacterium rhinotracheale o un fragmento inmunogénico de la misma, caracterizada por que está codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16.
45. Un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 18, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 19, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20 o una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 21-44 o un fragmento inmunogénico de la misma, para el uso en una vacuna.
46. Uso de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicaciones 1-16, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 18, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 19, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20 o una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 21-44 o un fragmento inmunogénico de la misma para la fabricación de una vacuna para combatir infección por Ornithobacterium rhinotracheale.
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47. Vacuna para combatir infección por Ornithobacterium rhinotracheale, caracterizada por que comprende un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 18, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 19, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20 o una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 21-44 o un fragmento inmunogénico de la misma y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
48. Vacuna para combatir infección por Ornithobacterium rhinotracheale, caracterizada por que comprende anticuerpos contra una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 21-44 o un fragmento inmunogénico de dicha proteína y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
49. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 47, caracterizada por que comprende un adyuvante.
50. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 47-49, caracterizada por que comprende un antígeno adicional obtenido de un virus o microorganismo patógeno para aves de corral, un anticuerpo contra tal antígeno o información genética que codifica dicho antígeno.
51. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 50, caracterizada por que dicho virus o microorganismo patógeno para pollos se selecciona entre el grupo que consiste en virus de peste aviar, virus de Bronquitis Infecciosa, Enfermedad de Bursa Infecciosa (Gumboro), Virus de la Enfermedad de Marek, agente de Anemia del pollo, Reovirus Aviar, Mycoplasma gallisepticum, Virus de la Rinotraqueitis del Pavo, Haemophilus paragallinarum (Coriza), Poxvirus de Pollo, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la Peste del Pato, virus de la Enfermedad de Newcastle, virus del síndrome de Caída de Huevo, virus de Laringotraqueitis Infecciosa, Virus Herpes de Pavos, especies de Eimeria, Ornithobacterium rhinotracheale, Pasteurella multocida, Mycoplasma synoviae, especies de Salmonella y E. coli.
52. Método para la preparación de una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 47-51, comprendiendo dicho método la mezcla de un ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 18, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 19, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20, una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 21-44 o un fragmento inmunogénico de la misma o anticuerpos contra una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 21-44 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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