CN116064548B - 一种新型CpG疫苗佐剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型CpG疫苗佐剂及其应用，其中，该免疫刺激性寡核苷酸中全部核苷酸均为硫代修饰；该寡核苷酸的核苷酸序列为以下SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明的寡核苷酸对小鼠脾细胞和人PBMC均显示出较好的免疫刺激作用，与铝佐剂联用在激发机体体液免疫和细胞免疫方面具有显著提高作用，且本发明的佐剂在疫苗的使用中不同剂量间效果差异不大，较低剂量即可取得较好的免疫效果。

Description

一种新型CpG疫苗佐剂及其应用
技术领域
本发明属于疫苗领域，尤其是涉及一种新型CpG疫苗佐剂及其应用。
背景技术
近些年，在疫苗的研制过程中人们逐渐认识到，佐剂的使用对疫苗的成功制备至关重要。因此，疫苗佐剂的研究一直是疫苗研究过程中的重要环节，研究佐剂与疫苗成份的配伍，使二者形成稳定、安全、具有免疫原性的疫苗复合物，使疫苗佐剂作为非特异性免疫增强剂对疫苗接种后诱导有效的免疫应答发挥作用。目前有许多物质被尝试作为疫苗佐剂，但只有铝盐佐剂，MA59(水包油型乳剂)，MPL(糖脂)，病毒样颗粒(viral likeparticle,VLP)，免疫增强的再造流感病毒小体(immunopotentiatingreconsititutedinfluenza virosome,IRIV)和霍乱肠毒素(cholera toxin,CT)被批准应用于人类疫苗中。但在实际应用中，上述佐剂常出现注射部位肿胀、出现肉芽肿、发烧、疼痛、发生过敏等副反应。此外，有些佐剂成本高昂。因此，研制广谱、安全、高效，同时便于生产和使用的疫苗佐剂迫在眉睫。
胞嘧啶－鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（cytosine phosphate guanidineoligodeoxynucleotide，CpG ODN）作为一种新型、安全、高效的免疫佐剂，展现出了良好的应用前景。其可以诱发机体产生多种免疫学效应，提高系统免疫和黏膜免疫水平，具有安全性高、耐受性强等特点。2017年，Dynavax Technologies公司旗下的HEPLISAV-B药物作为世界首个含CpG佐剂获批的疫苗，其包含CpG ODN 1018与市售乙肝疫苗的联用（http://investors.dynavax.com/events-presentations）。此外，Coley公司将CpG ODN 7909作为商品化多价流感灭活疫苗（Fluarix）的佐剂，其随机双盲Ⅰ期临床试验结果表明，CpG ODN是一种安全、可靠的佐剂，可降低多价流感灭活疫苗（Fluarix）的用量。国内外大量研究都证实了CpG ODN作为一种新型高效的免疫激活剂，呈现出了良好的免疫佐剂效应。而CpG ODN对不同的种属、细胞和抗原成分体现出不同的免疫刺激效果，其免疫刺激效果也与其序列结构紧密相关。因此，十分有必要针对不同的应用场景和抗原成分对CpG ODN做出相应的改进和设计。
发明内容
本发明涉及一种免疫刺激性寡核苷酸以及包含这种免疫刺激性寡核苷酸的佐剂及其应用。
在一方面，本发明提供了一种免疫刺激性寡核苷酸，且该寡核苷酸中全部核苷酸均为硫代修饰。
在另一方面，本发明提供了一种免疫刺激性寡核苷酸，其包含序列：
TGACTX1X2X3CGTTTTAX4CGX5X6AGACTGA（SEQ ID NO: 1）；
其中：
X1为G或A；
X2为G或A；
X3为A或T；
X4为G或A；
X5为T或C；并且
X6为T或C。
在另一方面，本发明提供了一种佐剂，其包含上述寡核苷酸。
在另一方面，本发明提供了一种疫苗，其包含上述佐剂。
在另一方面，本发明提供了一种上述寡核苷酸、佐剂在制备疫苗，或者提高抗原或疫苗的免疫原性中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1. 利用设计出的4条不同CpG ODN序列对小鼠脾细胞和人PBMC进行体外刺激，结果表明4条CpG-ODN序列对小鼠脾细胞和人PBMC体外刺激A值均高于阴性对照组，其中CpG-cjx1与阳性对照Dynavax公司的ISS1018刺激免疫效果相当，对小鼠脾细胞和人PBMC均显示出较好的免疫刺激作用。
2. 通过免疫Balb/c小鼠，分离脾淋巴细胞，测定CD4+/CD8+T细胞表达IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4水平，结果表明本发明的CpG-cjx1组和与铝佐剂联用组的细胞免疫效果明显高于比不加佐剂单抗原组或者单一铝佐剂组。可见，本发明所筛选的CpG-cjx1佐剂在细胞免疫方面发挥了重要作用。同时，本发明的佐剂与铝佐剂联用在激发细胞免疫方面具有显著提高作用。
3. 采用ELISA方法和细胞病变抑制法测定4个组的重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗分别免疫Balb/c小鼠2次后14d血清结合抗体和中和抗体效价结果表明加入CpG-cjx1佐剂的疫苗组均优于不加CpG-cjx1佐剂的疫苗组，并且双佐剂组比其他组中和抗体效价高至少10倍。可见，铝佐剂和CpG-cjx1佐剂联用在激发机体体液免疫和细胞免疫方面具有协同作用。
4.本发明的CpG-cjx1作为佐剂在疫苗的使用中，其不同使用剂量的效果差异不大。其中，在小鼠动物模型中，10µg/剂以上的CpG-cjx1均能取得较好的免疫效果。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本说明书的实施例，并与说明书一起用于解释本说明书的原理。
图1示出了CpG ODN体外刺激小鼠脾细胞，通过MTT法的检测结果；其中CpG-cjx-1、CpG-cjx-2、CpG-cjx-3、CpG-cjx-4为本发明设计的硫代修饰CpG OND序列，1018s为阳性对照（Dynavax公司ISS1018序列），Control为免疫PBS的脾细胞对照。
图2示出了CpG ODN体外刺激人PBMC，通过MTT法的检测结果；其中CpG-cjx-1、CpG-cjx-2、CpG-cjx-3、CpG-cjx-4为本发明设计的硫代修饰CpG OND序列，1018s为阳性对照（Dynavax公司ISS1018序列），Control为空白PBMC细胞对照。
图3示出了细胞流式术检测CD4+和CD8+T细胞中细胞因子的分泌表达；其中，*代表和RBD-Fc组相比具有显著性差异；#代表和RBD-Fc + AL(OH)3组相比具有显著性差异；CpG代表CpG-cjx1。
具体实施方式
I．定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。
如本文使用的和除非另作说明，术语“包含”，“包括”，“具有”，“含有”，包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。
如本文所用，术语“CpG”指由胞嘧啶(cytosine,C)与鸟嘌呤(guanine，G)经磷酸二酯键(phosphodiesterbonds，p)相连组成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5'端和3'端的各两个碱基构成CpG基序(CpG motifs)，其结构为5’-PuPu-CpG-PyPy-3’，5’端为两个嘌呤或一个嘌呤和T，3’端为两个嘧啶。CpG基序也被称为免疫刺激序列(immunostimulatorysequence, ISS)，而CpG ODN是指含有非甲基化的CpG基序的寡聚脱氧核苷酸。CpG ODN模拟了细菌DNA的结构，具有与天然CpG模体相似的免疫效应。脊椎动物的免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)将细菌基因组中的CpG DNA作为一种危险刺激信号进行识别，进而刺激机体产生免疫保护反应。
如本文所用，术语“佐剂”是指提高、增加、向上调节、改变或以其它方式促进对抗原的免疫反应（例如，体液或细胞免疫反应）的任何物质或物质的混合物。
如本文所用，术语“铝佐剂”是指具有免疫佐剂活性的铝盐，选自氢氧化铝和磷酸铝，优选为氢氧化铝。该试剂会吸附和沉淀在溶液中的蛋白抗原；得到的沉淀物会提高疫苗免疫原性，这通过促进抗原从在接种部位形成的疫苗储存(depot)的缓慢释放来实现。氢氧化铝佐剂在表面仅具有与铝共价键合的羟基。
如本文所用，术语“冠状病毒(Coronavirus)”属于冠状病毒科，冠状病毒属，可以感染哺乳动物和禽类，引起呼吸系统、消化和中枢神经的各种疾病。根据基因组和血清学差异可以将冠状病毒分成四个不同的属：α、β、γ和δ，目前只有α和β属冠状病毒感染人类。截至目前已鉴定出来自两个属(α和β)的6种人冠状病毒(HCoV)，α属冠状病毒包括NL63和229E，β属冠状病毒包括OC43、HKU1、急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”有最广义的含义，特别包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体构成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要其显示出具有所需的生物学活性即可。此术语一般包括由2个或多个具有不同结合特异性的抗体或抗体片段连接在一起构成的杂合抗体。
术语“Fc”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常定义为自位置Cys226，或自Pro230处的氨基酸残基延伸至重链的羧基端。可以除去Fc区的C端赖氨酸（依照EU编号系统的残基447），例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程化改造编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组合物可以包含已除去所有K447残基的抗体群体，未除去任何K447残基的抗体群体，和具有有和无K447残基的抗体混合物的抗体群体。
II．具体实施方案详述
在一方面，本发明提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸中全部核苷酸均为硫代修饰。
在一些实施方案中，前述寡核苷酸，其包含序列TGACTX1X2X3CGTTTTAX4CGX5X6AGACTGA（SEQ ID NO: 1）。
在一些实施方案中，X1为G或A。
在一些实施方案中，X2为G或A。
在一些实施方案中，X3为A或T。
在一些实施方案中，X4为G或A。
在一些实施方案中，X5为T或C。
在一些实施方案中，X6为T或C。
在一些实施方案中，前述寡核苷酸包含核苷酸序列TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA（SEQ ID NO: 2）或其任何变体。
在一些实施方案中，前述寡核苷酸包含核苷酸序列TGACTGAACGTTTTAGCGCTAGACTGA（SEQ ID NO: 3）或其任何变体。
在一些实施方案中，前述寡核苷酸包含核苷酸序列TGACTAGTCGTTTTAACGTCAGACTGA（SEQ ID NO: 4）或其任何变体。
在一些实施方案中，前述寡核苷酸包含核苷酸序列TGACTAGTCGTTTTAGCGCTAGACTGA（SEQ ID NO: 5）或其任何变体。
在一些优选的实施方案中，前述寡核苷酸包含如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列或其任何变体。
在另一方面，本发明提供了一种佐剂，其包含前述寡核苷酸。
在一些优选的实施方案中，其包含前述寡核苷酸作为有效成分。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种佐剂，还包含选自矿物盐类佐剂、油乳剂佐剂、靶向于模式识别受体的微生物和植物提取物以及衍生物类佐剂、微粒抗原递呈系统佐剂或细胞因子类佐剂中的一种或多种。其中，前述矿物盐类佐剂是铝佐剂或镁佐剂中的一种或多种。前述油乳剂佐剂选自皂角苷类佐剂、水包油类和油包水类乳剂中的一种或多种。前述靶向于模式识别受体的微生物和植物提取物以及衍生物类佐剂是磷酰脂A佐剂、CpG佐剂中的一种或多种。前述微粒抗原递呈系统佐剂是聚乙丙交酯(PLG)、脂质体中的一种或多种。前述细胞因子类佐剂是细胞因子IL-1、IL-2、IL-12中的一种或多种。
在一些优选的实施方案中，该佐剂包含前述寡核苷酸和铝佐剂作为有效成分。
包含前述寡核苷酸和所述矿物盐类的佐剂是复合佐剂。其中，所述矿物盐类佐剂是铝佐剂或镁佐剂中的一种或多种。
本发明的铝佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝。
在另一方面，本发明提供了一种疫苗，其包含前述寡核苷酸或佐剂。
在一些实施方案中，前述疫苗中还含有抗原。
在一些优选的实施方案中，其中前述抗原为冠状病毒RBD-Fc。
在一些优选的实施方案中，前述冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
在一些实施方案中，前述疫苗中前述佐剂的剂量为5-3000µg/剂。
在一些优选的实施方案中，前述寡核苷酸的剂量选自5µg/剂、10µg/剂、30µg/剂或50µg/剂。
在一些优选的实施方案中，前述寡核苷酸的剂量为10µg/剂。
在一些实施方案中，每剂疫苗中前述寡核苷酸和铝佐剂的质量比为1:8-1:100。
在一些优选的实施方案中，前述佐剂包含所述寡核苷酸10µg/剂，以及所述铝佐剂0.5mg/剂。
在另一方面，本发明提供了一种前述寡核苷酸、佐剂或复合佐剂的应用。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了一种前述寡核苷酸、佐剂或复合佐剂在制备疫苗，或者提高抗原或疫苗的免疫原性中的用途。
在一些实施方案中，前述疫苗为严重急性呼吸综合征冠状病毒2疫苗。
在一些实施方案中，前述抗原为冠状病毒RBD-Fc。
在一些实施方案中，前述冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
在另一方面，本发明提供了一种前述寡核苷酸、佐剂或复合佐剂以及疫苗的制备方法。
为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本发明的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
实施例
实施例1：CpG ODN佐剂序列的筛选
1. CpG ODN序列的设计与合成
根据CpG ODN序列设计原则，共设计合成4条候选CpG ODN序列（如表1所示）。将4条候选CpG ODN序列合成后进行全链硫代修饰，合成后利用常规ULTRA-PAGE方法进行纯化，溶于生理盐水，-20℃冰箱中保存备用。其中序列编号1018为阳性对照，为Dynavax公司ISS1018序列。
表1：CpG ODN 序列
2. 不同CpG ODN序列对小鼠脾细胞免疫刺激活性比较
主要实验试剂：RPMI 1640培养液（Sigma产品，货号：R8758）含L－谷氨酰胺、10%小牛血清、青霉素、链霉素、β－巯基乙醇，4℃储存备用；MTT（Sigma产品，货号：11465007001）：用PBS配成质量浓度为5mg/mL的液体，过滤除菌，4℃储存备用；淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司。
实验动物：4～6周龄雌性Balb/c小鼠，购自北京斯贝福(北京)生物技术有限公司。
实验方法：
（1）拉颈处死小鼠，使用75%酒精对其表面进行消毒，无菌条件下用剪刀剪开小鼠左侧中上部皮毛，裸露出皮下缔结组织，剪开组织使脾脏暴露，尽量去除脂肪等不必要成分，取得的完好的脾依次放入装有2mL培养基的六孔板孔内，盖子上做好标记；
（2）5mL注射器手柄在纱网包裹的单只脾脏上研磨，无肉眼可见的组织残留时，将悬液转移到15mL离心管中，并用2mL培养基冲洗六孔板底，一并转移到离心管中，对每个脾都进行如上操作；
（3）在35mm培养皿中放入4mL-5mL小鼠淋巴分离液（取用前恢复至室温并摇匀），研磨；
（4）把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，覆盖500μL-1000μL的RPMI 1640培养基（保持液面分界明显）；
（5）室温，水平转子800g离心力离心30min，离心结束后细胞分层；
（6）洗出淋巴细胞层，再加入10mL RPMI 1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心10min收集细胞；
（7）倾倒上清液，用培养液重悬细胞，计数。接种于24孔板，5×105个细胞/孔。将合成的CpG ODN序列用去离子水稀释后以20μg/mL的终浓度加入脾细胞作为刺激物，于37℃、5% CO2培养72h后以MTT法检测CpG ODN诱导小鼠脾细胞增殖水平，对CpG ODN佐剂的免疫调节活性进行筛选分析。
不同CpG ODN序列对小鼠脾细胞免疫刺激活性比较：分离4～6周龄雌性Balb/c小鼠脾细胞，利用设计出的不同CpG ODN序列对脾细胞进行体外刺激，用MTT法检测各组A值。结果显示4条硫代序列中，各CpG ODN的A值均高于免疫PBS的脾细胞阴性对照组，其中1号序列A值达到0.511，与阳性对照ISS1018序列A值（0.521）接近，显示出较好的针对小鼠脾细胞的免疫刺激作用（见图1）。
3. 不同CpG ODN序列对人PBMC免疫刺激活性比较
人PBMC中含有丰富的T、B淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞，这些免疫细胞是人体应对外来病原体感染的主要功能细胞。以Ficoll分离液将人PBMC从新鲜全血中分离，悬于含10% FBS的1640培养基中，接种于24孔板，5×105个细胞/孔。将合成的CpG ODN序列用去离子水稀释后以20μg/mL的终浓度加入PBMC细胞作为刺激物，每个序列设3个复孔。于37℃、5% CO2培养72h后以MTT法检测CpG ODN诱导PBMC细胞增殖水平，对自行设计的CpG ODN佐剂的免疫调节活性进行筛选分析。
不同CpG ODN序列对人PBMC体外刺激活性比较：利用设计出的不同CpG ODN序列对人PBMC进行体外刺激，用MTT法检测各组A值。结果显示，4条硫代序列中，各CpG ODN的A值均高于空白PBMC细胞阴性对照组，其中1号序列A值高达0.401，与阳性对照ISS1018序列A值（0.393）接近，显示出较好的针对人PBMC的免疫刺激作用（见图2）。
结论：利用设计出的4条不同CpG ODN序列对小鼠脾细胞和人PBMC进行体外刺激，结果表明4条CpG ODN序列对小鼠脾细胞和人PBMC体外刺激A值均高于阴性对照组，其中CpG-cjx1与阳性对照Dynavax公司的ISS1018刺激免疫效果相当，对小鼠脾细胞和人PBMC均显示出较好的免疫刺激作用。
实施例2：CpG ODN 作为严重急性呼吸综合征冠状病毒2疫苗佐剂免疫小鼠体内效果验证
1. 实验材料：
（1）试验动物：健康Balb/c小鼠，6~8周龄，18-20g，雌性，SPF级，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司；动物合格证编号：NO.110324210104634878，接收日期：2021.9.5，饲养于北京麦迪理邦生物科技有限公司动物实验室。
（2）细胞和毒株：Vero-E6细胞系，SARS-CoV-2(hCoV-19/China/CAS-B001/2020,GISAID No. EPI_ISL_514256-7)，由中国科学院微生物研究所制备与提供。
（3）试剂：DMEM（Gibco，批号：8120287），FBS(Gibco)，青链霉素（新赛美生物科技有限公司，批号2009021031）；96孔细胞培养板（Corning）由中国科学院微生物研究所提供；RBD-FC原液（北京昭衍生物技术有限公司，批号BDS201302）；氢氧化铝佐剂（长春生物制品研究所责任有限公司，批号2P18-003-202005）；本发明所设计的CpG-cjx1佐剂；稀释液（北京昭衍生物技术有限公司，批号DM210403）；重组SARS-CoV-2 RBD-his蛋白（北京麦迪理邦生物科技有限公司研发中心，批号20200501），规格2mg/1.0mL；Anti-Mouse,IgG,HRP-Linked Antbody鼠二抗（cst公司，货号7076s），规格1mL；PBS注射液（北京中生奥邦生物科技有限公司，批号F210908B），规格500mL/瓶；小鼠淋巴细胞分离液（北京达科为生物技术有限公司）；FITC anti-mouse CD4、PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a、PE anti-mouseIFN-γ、rilliant Violet 421™ anti-mouse IL-2、APC anti-mouse TNF-a、PE/Cyanine7anti-mouse IL-4（biolegend公司）；固定液、破膜液（biolegend公司）；重组SARS-CoV-2RBD-his蛋白（原始株）（北京麦迪理邦生物科技有限公司，批号：20200501），规格2mg/mL。
（4）仪器：生物安全柜（AIRTECH BHC-1604 IIA/B3S）；CO2细胞培养箱（ThermoFisher 370 Series）；显微镜（OLYMPUS CKX31SF），由中国科学院微生物研究所提供；微孔板检测仪（伯腾BioTek）；低速水平离心机，安徽中科中佳提供；流式细胞仪CytoFlex S，美国贝克曼公司。
2. 实验方法：
（1）免疫4组6~8周、雌性Balb/c小鼠，方案见表2，共免疫4组（0.5mL/剂/只）：
1）25μg RBD-Fc；
2）25μg RBD-Fc + 0.5mg AL(OH)3；
3）25μg RBD-Fc + 10μg CpG-cjx1；
4）25μg RBD-Fc + 0.5mg AL(OH)3+ 10μg CpG-cjx1。
于0d和21d腹腔注射免疫两次，28d取血，取脾，分离脾淋巴细胞，测定CD4+/CD8+T细胞表达IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4水平。
（2）免疫4组6~8周、雌性Balb/c小鼠，方案见表3，共免疫5组（0.5mL/剂/只）：
1）25μg RBD-Fc；
2）25μg RBD-Fc + 0.5mg AL(OH)3；
3）25μg RBD-Fc + 10μg CpG-cjx1；
4）25μg RBD-Fc + 0.5mg AL(OH)3+ 10μg CpG-cjx1；
5）PBS对照组。
于0d和21d腹腔注射免疫两次，35d尾静脉采血并分离血清。采用流式细胞术测定重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗（CHO细胞）或重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗制剂免疫小鼠的细胞免疫效果，具体方案见表2。采用ELISA方法和细胞病变抑制法分别检测免疫小鼠产生的结合抗体效价和中和抗体效价，其样本编号见表3，每份样本血清0.2mL左右冻存。具体采集Balb/c小鼠血清样本25份，其中，疫苗试验组血清样本20份，PBS对照组血清样本5份。
表2：测细胞免疫实验分组方案
表3：测体液免疫实验分组方案
（3）疫苗配制：
取RBD-Fc抗原、Al(OH)3、CpG-cjx1用稀释液稀释，按照表2和表3疫苗组分配置。配置好的疫苗分别在磁力搅拌器上搅拌1.5h，4℃环境下放置1~1.5h。
（4）流式细胞术细胞免疫测定方法：
a. 脾组织加入5mL小鼠淋巴细胞分离液，轻轻研磨，200目尼龙网过滤至洁净离心管中，在液面以上轻轻加入1mL PBS，以800g、30min，升速快降速慢离心，收集中间淋巴细胞层；
b. 加入5mL PBS洗涤细胞，500g，离心5min，弃上清；
c. RPMI 1640完全培养基重悬细胞，细胞计数后取2×106细胞至流式管中；
d. 每管加入100nM RBD-his蛋白，PMA（50ng/mL）、Ionomycin(1μg/mL)、Monensin(2μM)，37℃，5% CO2孵育5h；
e. 孵育结束后，收集细胞，离心弃上清，加入抗体CD4、CD8各2μL，室温避光孵育15min；
f. 加入0.5mL细胞固定液，室温避光固定40min，加入2mL 1×细胞破膜液，离心弃上清；
g. 再次加入2mL 1×细胞破膜液，离心弃上清；
h. 加入IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α抗体各2μL，室温避光孵育30min；
i. 加入2mL细胞破膜液，500g，离心5min，弃上清；
j. 用0.5mL cell staining buffer重悬细胞，上机检测。
（5）ELISA检测血清结合抗体滴度：
取RBD-his蛋白用碳酸盐缓冲液（CBS，pH 9.6）稀释到1000ng/mL，包被酶标版，100µL/孔，4℃放置12~18h，用含10%牛血清（FCS）的PBS封闭1~2h，处理好的酶标版即可用于检测。将小鼠血清用含10% FCS的PBS进行对倍稀释；37℃温箱中孵育45min；在脱色摇床上以200rmp速度用PBST进行3×3min洗涤；加入100µL/孔HRP标记的鼠二抗工作液，37℃温箱中继续孵育45min；再次洗涤（方法同上）；加入100µL/孔TMB单组分显色液，37℃温箱中孵育15min；最后加入终止液（2M H2SO4）50µL/孔；在酶标仪上读取OD值。测量波长450nm，参比波长620nm。
（6）细胞病变抑制法检测血清中和抗体滴度：
检测步骤如下：取Vero-E6细胞接种96孔细胞板，每孔2×105~4×105个细胞，培养基为含10% FBS的DMEM液体，培养条件为37℃、5% CO2、饱和湿度。采用对倍稀释方法用含2%FBS的DMEM稀释小鼠血清，各血清稀释度液体按100 CCID50/200µL加入严重急性呼吸综合征冠状病毒2原始毒株，37℃放置1.0h。待细胞铺满80%左右时，弃培养基，用PBS洗涤3次；最后加入混合处理好的血清-病毒液，每个稀释度重复4孔，每孔加液200µL。细胞继续放37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，每24h观察记录细胞病变，连续观察72h。
（7）结果判定和统计学：
观察并记录细胞病变情况，出现细胞病变的判定为没有保护，利用Reed-Muench氏法计算血清的中和效价（保护50%细胞不产生病变的血清的最高稀释度即为该血清的NT50）；采用Reed-Muench方法进行计算，结果采用均值加减标准差表示。
3. 试验结果
（1）流式细胞术测定细胞免疫效果：
采用流式细胞术测定重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗（CHO细胞）或重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗制剂免疫小鼠的细胞免疫效果（结果见表4）。结果表明：第4组双佐剂疫苗组CD4 IFN-γ、CD4 TNF-α、CD8 IFN-γ、CD8 TNF-α明显高于单抗原组和单铝佐剂组，偏向Th1型细胞免疫。由此表明CpG-cjx1佐剂在细胞免疫方面发挥了重要作用，铝佐剂和CpG-cjx1佐剂联用在激发机体细胞免疫方面具有协同作用。
表4：重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗（CHO细胞）免疫小鼠细胞因子检测实验结果
（2）ELISA方法和细胞病变抑制法检测血清结合抗体滴度结果：
采用ELISA方法和细胞病变抑制法测定1）25µg RBD-Fc；2）25µg RBD-Fc + 0.5mgAL(OH)3；3）25µg RBD-Fc + 10µg CpG-cjx1；4）25µg RBD-Fc + 0.5mg AL(OH)3+ 10µg CpG-cjx1，4个组的重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗分别免疫Balb/c小鼠2次后14d血清结合抗体和中和抗体效价结果见表5。由结果可见，第4组，双佐剂的重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗免疫小鼠2次后14d血清均产生了较高的结合抗体和中和抗体效价，第4组（双佐剂组）比不加CpG的单铝佐剂组中和抗体效价高10倍左右。
表5：ELISA方法和细胞病变抑制法检测血清结合抗体滴度结果
4. 结论
（1）通过免疫Balb/c小鼠，分离脾淋巴细胞，测定CD4+/CD8+T细胞表达IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4水平。结果表明本发明的CpG-cjx1组（RBD-FC+CpG-cjx1）和CpGcjx1与铝佐剂联用组（RBD-FC+AL(OH)3+CpG-cjx1）的细胞免疫效果明显高于比不加佐剂单抗原组或者单一铝佐剂组，可见，本发明所筛选的CpG-cjx1佐剂在细胞免疫方面发挥了重要作用。同时，本发明的佐剂与铝佐剂联用在激发细胞免疫方面具有显著提高作用。
（2）采用ELISA方法和细胞病变抑制法测定4个组的重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2融合蛋白疫苗分别免疫Balb/c小鼠2次后14d血清结合抗体和中和抗体效价，结果表明加入CpG-cjx1佐剂的疫苗组均优于不加CpG-cjx1佐剂的疫苗组，并且第4组（双佐剂组）比其他组中和抗体效价至少高10倍。可见，矿物盐佐剂和CpG-cjx1佐剂联用在激发机体体液免疫和细胞免疫方面具有协同作用。
实施例3：CpG ODN佐剂最佳剂量的确定实验
为了进一步确定该CpG佐剂的最佳剂量，对不同剂量的CpG-cjx1佐剂（5、10、30、50µg/0.5mL/剂）配置疫苗免疫小鼠进行最佳剂量的筛选，动物免疫方案见表6。
表6：在小鼠上确定CpG佐剂剂量的动物免疫方案
对各组小鼠免疫后的结果如下表7所示：
表7：不同剂量的CpG-cjx1佐剂配制重组RBD-Fc蛋白疫苗免疫小鼠的免疫效果
由上表的结论可知，本发明的CpG-cjx1作为佐剂在疫苗的使用中，其不同使用剂量之间效果差异不大。其中，在小鼠动物模型中，10µg/0.5mL/剂以上的CpG-cjx1均能取得较好的免疫效果。

Claims (9)

1.寡核苷酸，所述寡核苷酸中全部核苷酸均为硫代修饰；
所述寡核苷酸为选自以下序列的核苷酸序列：
TGACTGAACGTTTTAACGTCAGACTGA（SEQ ID NO: 2）；
TGACTGAACGTTTTAGCGCTAGACTGA（SEQ ID NO: 3）；
TGACTAGTCGTTTTAACGTCAGACTGA（SEQ ID NO: 4）；
TGACTAGTCGTTTTAGCGCTAGACTGA（SEQ ID NO: 5）。
2.佐剂，其包含权利要求1所述寡核苷酸。
3.权利要求2所述的佐剂，其还包含选自矿物盐类佐剂、油乳剂佐剂、靶向于模式识别受体的微生物和植物提取物以及衍生物类佐剂、微粒抗原递呈系统佐剂或细胞因子类佐剂中的一种或多种。
4.权利要求3所述的佐剂，其中所述矿物盐类佐剂是铝佐剂或镁佐剂中的一种或多种；所述油乳剂佐剂是皂角苷类佐剂、水包油类和油包水类乳剂中的一种或多种；所述靶向于模式识别受体的微生物和植物提取物以及衍生物类佐剂是磷酰脂A佐剂、CpG佐剂中的一种或多种；微粒抗原递呈系统佐剂是聚乙丙交酯(PLG)、脂质体中的一种或多种；细胞因子类佐剂是细胞因子IL-1、IL-2、IL-12中的一种或多种。
5.权利要求3所述的佐剂，其中权利要求1所述寡核苷酸作为有效成分。
6.疫苗，其包含权利要求2-5中任一项所述佐剂。
7.权利要求6所述的疫苗，其中所述疫苗还包含抗原。
8.权利要求7所述的疫苗，其中所述佐剂包含铝佐剂和所述寡核苷酸，每剂疫苗中所述寡核苷酸和所述铝佐剂的质量比为1:8-1:100。
9.权利要求1所述寡核苷酸、权利要求2-5中任一项所述佐剂在制备疫苗，或者在制备提高抗原或疫苗的免疫原性的药物中的用途。
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