DK170923B1 - Vaccine mod infektiøst fuglebronkitisvirus, anvendelse af et inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus til fremstilling heraf samt vaccinesæt - Google Patents

Description

DK 170923 B1

Den foreliggende opfindelsen angår en hidtil ukendt vaccine, der indeholder inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus.

Infektiøs bronkitis er en i høj grad smitsom sygdom i respirationsvejene hos høns, som for læggehøners vedkommende 5 også ugunstigt kan påvirke produktionen og kvaliteten af æggene. Anvendelse af infektiøse bronkitisvacciner til immunisering af fjerkræ har nu været etableret i mange år.

I almindelighed indeholder vaccinerne et infektiøst bronkitisvirus af en særlig serotype, såsom Connecticut- eller 10 Massachusetts-serotype, hvoraf sidstnævnte er mere almindelig i Storbritannien og Europa. Der har også være forsøgt kombination af forskellige infektiøse bronkitis-serotyper, men beskyttelse mod de respektive serotyper er ikke altid optimal.

For nylig er der blevet introduceret inaktiverede infektiøse 15 bronkitisvacciner, som indeholder variantstammer, dvs. nye, serologisk distinkte stammer af infektiøst bronkitisvirus, men de nødvendiggør, at fjerkræ først immuniseres eller "grundes" med en levende vaccine; hidtil har det været antaget, at en sådan "grunding" måtte udføres ved hjælp af en 20 levende vaccine, som indeholder et virus af samme stamme som det inaktiverede virus.

DK 470/83 beskriver vacciner mod infektiøs bronkitis hos fjerkræ, hvor vaccinerne er afledt af infektiøse bronkitis-vira, der spontant hæmagglutinerer hønseerythrocyter. DK 25 5082/80 og DK 3847/82 beskriver vacciner mod infektiøs bron kitis hos fjerkræ, hvor vaccinerne er fremstillet af virusstammer, der afviger fra de kendte H-stammer. I modsætning til disse og andre kendte vacciner mod infektiøs fuglebronkitis er det muligt ifølge den foreliggende opfindelse at 30 immunisere uden en indledende vaccination med en levende vaccine af samme stamme.

Det har nu vist sig, at inaktiverede vacciner afledt af en ny variantstamme af infektiøst fuglebronkitisvirus og stammer, DK 170923 B1 2 som er serologisk beslægtet dermed (dvs. vira som krydsreagerer med denne særlige variantstamme) giver beskyttelse mod sådanne serologisk beslægtede variant-stammer, og desuden fordrer immunisering med sådanne stammer overraskende ikke 5 nogen indledende vaccination eller "grunding" af fjerkræ med en levende vaccine af samme stamme. Dette gør det muligt at udføre "grunding" ved hjælp af heterologe levende vacciner, som kan være velprøvede, konventionelle, levende vacciner med fastslået sikkerhed og effektivitet.

10 Den nye infektiøse fuglebronkitis-variantvirusstamme blev isoleret fra slagtekyllinger og er deponeret hos Central Veterinary Laboratory, New Haw, Weybridge, England, og er registreret under nummeret VLO 10110/AVI/9, og desuden hos Institut Pasteur, Paris, Frankrig, registreret under nummeret 15 1-400 og deponeret den 11. december 1984.

Denne stamme, der i det følgende benævnes VLO 10110/AVI/9, viste sig ved virusneutralisationsprøver at være beslægtet, men ikke identisk med stammen Dutch D207, men afviger fra de konventionelle vira af Massachusetts-serotypen, som alminde-20 ligvis bruges i infektiøse bronkitisvacciner. Ved hjælp af krydsneutralisationsprøver udført i luftrør-organkulturer viste det sig, at isolatet ikke neutraliseres af antiserum mod infektiøst bronkitisvirus M41 eller mod H120-vaccinestam-merne af infektiøst bronkitisvirus, der begge er af Massachu-25 setts-serotypen. Tabel 1 viser resultater af de forskellige virusneutralisationsprøver (VN-prøver) under anvendelse af den konstantvirus variable-serummetode. Resultaterne viser, at det nye variantvirus VLO 10110/AVI/9 er serologisk distinkt og ikke hører til Massachusetts-serotype. De olieemul-30 sionsvacciner, som er nævnt i Tabel 1, indeholder Massachusetts M41-stammen og/eller VLO 10110/AVI/9 variantstammen af infektiøst fuglebronkitisvirus.

TABEL 1 3 DK 170923 B1 VN-prøver på infektiøse bronkitisvirus sera

Reciprokke titere *

Gruppe Levende Oliesnulsionsvaccine VLO 10110/AVI/9 M41 "grunder" variantstanme A VLO 10110/AVI/9 - 180 < 10 variantstanme B M41 < 10 160 C - VLO 10110/AVI/9 25 < 10 variantstanme D H120 M41 < 10 >640 E H120 M41 + VLO 10110/AVI/9 394 >640 variantstanme (lige dele) * gennemsnit af to prøver

Ifølge et træk ved opfindelsen er derfor tilvejebragt en 5 hidtil ukendt vaccine indeholdende inaktiveret infektiøs fuglebronkitisvirus VLO 10110/AVI/9 og/eller en inaktiveret virusstamme, som er serologisk beslægtet dermed, idet immunresponset dertil hos fugle forøges ved "grunding" med en levende heterolog stamme af infektiøst fuglebronkitisvirus.

10 Som nævnt ovenfor har det vist sig, at en inaktiveret vaccine baseret på den nye variantstamme VLO 10110/AVI/9 af infektiøst bronkitisvirus og/eller en stamme, som er serologisk beslægtet dermed, ikke gør det nødvendigt, at fjerkræet indledningsvis er blevet vaccineret eller "grundet" med en 15 levende vaccine af samme stamme. I stedet har det uventet vist sig, at "grunding" med en heterolog levende vaccine baseret på en konventionel stamme (fx H120 vaccine) er tilstrækkelig til at sikre, at efterfølgende vaccination med vaccinen baseret på den inaktiverende variantstamme giver et DK 170923 B1 4 forstærket immunrespons. Det har således vist sig, at "grun-ding" med en levende svækket virusvaccine af Massachusetts-serotypen såsom en levende vaccine til en konventionel stamme af Massachusetts-serotype H120, H52 eller M41, eller mild 5 Massachusetts (MM) er tilstrækkelig til at sikre, at påfølgende vaccination med den inaktiverede variantstamme-vaccine til VLO 10110/AVI/9 og/eller serologisk beslægtede stammer giver et forstærket immunrespons.

De inaktiverede vacciner til variantstammen 10110/AVI/9 10 og/eller stammer, der serologisk er beslægtet dermed, kan fremstilles på konventionel måde, fx ved at dyrke viruset i embryonerede æg. Når den inficerede allantoinvæske har nået en passende titer, (fx ca. 108,0 mediane ciliostatiske do-ser/ml (8,0 log10 CD50/ml, hvor CD50/ml er defineret i J.K.A.

15 Cook et al., Archives of Virology 1976, 50., 109-118)), kan den derefter indhøstes og inaktiveres ved hjælp af inaktiveringsmidler såsom formaldehyd eller /3-propiolacton. Efter inaktivering kan viruset koncentreres, og pH kan om nødvendig reguleres. Det inaktiverede antigen i et vandigt medium kan 20 blandes med et adjuvans såsom aluminiumhydroxid eller inkorporeres i olieemulsion indeholdende en olie, fx paraffinolie, et olieopløseligt overfladeaktivt middel og et vandopløseligt overfladeaktivt middel, idet mængdeforholdet mellem olie og vandig fase almindeligvis er i området 2-5:1.

25 Rensede paraffinolier, som kan bruges i en adjuvant emulsion, er fx et i handelen gående produkter såsom "Drakeol", "Mar-col" eller "Puremore", skønt de fleste kvaliteter flydende paraffin egner sig. Der kan også bruges en olie som squalan.

Det mest foretrukne mængdeforhold mellem olie og vandig fase 30 er ca. 4:1, hvor den resulterende emulsion er stabil og har passende viskositet til injektion.

Det olieopløselige overfladeaktive middel er fortrinsvis en monoester af et sukkeralkoholanhydrid, fx sorbitan eller mannitan, med en langkædet fedtsyre såsom oliesyre, stea DK 170923 B1 5 rinsyre eller laurinsyre. "Arlacel"® 80 eller "Span"® 80 (sorbitan mono-oleat) og "Arlacel"® A (mannitan mono-oleat) er særlig velegnet.

Det vandopløselige overfladeaktive middel er fortrinsvis et 5 polyoxyethylenderivat af en monoester af et sukkeralkoholan-hydrid såsom sorbitan med en langkædet fedtsyre såsom laurinsyre, oliesyre eller stearinsyre. Polyoxyethylenkæden indeholder fortrinsvis ca. 20 oxyethylenenheder. "Tween"® 80 (polyoxyethylen (20) sorbitan mono-oleat) er særlig velegnet.

10 Koncentrationen af det olieopløselige overfladeaktive middel i oliefasen er fortrinsvis i området 8-12% v/r (forholdet mellem vægtenheden og rumfangsenheder som mellem gram og milliliter), fordelagtigt ca. 10% v/r. Koncentrationen af det vandopløselige overfladeaktive middel i vandfasen er for-15 trinsvis i området 4-4,5% v/r, fordelagtigt ca. 4,25% v/r.

Vaccinen kan med fordel indeholde inaktiveret virus vundet fra 106 til 108 mediane ciliostatiske doser (6-8 log10 CD50) af variantstammen VLO 10110/AVI/9 (og/eller en serologisk beslægtet stamme) pr. dosis vaccine.

20 Den inaktiverede vaccine vil som regel blive givet til fuglene ved læggetiden i en alder af omkring 16-20 uger ved subkutan eller intramuskulær injektion, fortrinsvis ad intra-muskulær vej. Én dosis af den inaktiverede vaccine er som regel tilstrækkelig og kan fx bestå af 0,25-1,00 ml, fx 0,5 ml 25 af ovennævnte vaccine; en sådan dosis indeholder med fordel den antigene ækvivalent til 106-108 mediane cilostatiske doser (6-8,0 log10 qDijø) af variantvirusstammen.

Den inaktiverede vaccine kan foruden den inaktiverede variantstamme VLO 10110/AVI/9 og/eller en stamme serologisk 30 beslægtet dermed tillige indeholde en eller flere yderligere inaktiverede virusstammer som fx af Massachusetts-serotypen fx M41, andre stammer af infektiøst bronkitisvirus eller andre vira såsom Newcastlesyge-virus, infektiøst bursalsyg- DK 170923 B1 6 domsvirus, adenovira såsom EDS 76 virus, reovira og andre vira. Således kan sådanne vacciner fx indeholde monovalent olieemulsionsvaccine indeholdende inaktiveret VLO 10110/AVI/9 alene, en bivalent olieemulsionsvaccine indeholdende både 5 inaktiveret VLO 10110/AVI/9 og inaktiveret Massachusetts M41, en trivalent olieemulsionvaccine indeholdende VLO 10110/AVI/9, inaktiveret Massachusetts M41 og Newcastlesyge-virus eller en tetravalent olieemulsionsvaccine indeholdende VLO 10110/AVI/9, inaktiveret Massachusetts M41, Newcastle-10 syge-virus og infektiøst bursalsygdomsvirus.

Som nævnt ovenfor kan modtagerne af de inaktiverede vacciner ifølge opfindelsen "grundes" eller forbehandles ved hjælp af konventionel levende infektiøs bronkitisvirus-vaccine, fx en levende, svækket virusvaccine indeholdende et infektiøst fug-15 lebronkitisvirus af Massachusetts serotypen såsom en levende vaccine med et konventionelt H120, H52, M41 eller MM-virus. Dette er tilstrækkeligt til at sikre, at efterfølgende vaccination med en emulsions-variantstammevaccine giver en forstærket immunreaktion.

20 Infektiøst bronkitisvirus H120 vaccine foretrækkes som forbehandlingsvaccinen, og særligt foretrækkes der en sådan som leveres af Glaxo Animal Health Limited som en frysetørret 1000 dosis ampul, som kan rekonstitueres i 1 ml vand og derefter fortyndes yderligere efter behov.

25 Forbehandlingsvaccinen gives til kyllinger, som er indtil 12 uger gamle, fortrinsvis 3 uger. Desuden kan der eventuelt gives en anden forbehandlingsdosis eller yderligere doser. Vaccinen kan indeholde mindst 3 log10 mediane æginfektions-doser (EIDS0) af levende, svækket infektiøst fuglebronkitis-30 virus pr. fugledosis. Vaccinen kan indgives ved drikkevand, ved drypning af øjne, intranasalt eller ved hjælp af et aerosolpræparat. I almindelighed bør den inaktiverede vaccine gives mindst fire uger og fortrinsvis 13 uger efter forbehandl ingsvaccinen.

DK 170923 B1 7 I overensstemmelse med den foreliggende opfindelsen kan man således immunisere en fugl mod infektiøs fuglebronkitis, hvorved fuglen vaccineres med en inaktiveret vaccine indeholdende inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus VLO 5 10110/AVI/9 og/eller en stamme, som er serologisk beslægtet dermed, hvorved fuglen i forvejen er vaccineret med en levende vaccine indeholdende et levende heterolog infektiøst fuglebronkitisvirus (dvs. en stamme, der er serologisk forskellig fra det inaktiverede virus).

10 Opfindelsen angår endvidere et vaccinesæt, der omfatter nævnte inaktiveret virusvaccine og nævnte levende virusvaccine hver for sig. Vaccinesættet har multiple dosisenheder af hver af de respektive vacciner. Fortrinsvis kan der være 500 eller 1000 dosisenheder af hver vaccine til stede i sættet.

15 Opfindelsen angår ydermere anvendelse af inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus VLO 10110/AVI/9 og/eller en stamme serologisk beslægtet dermed til fremstilling af en vaccine til anvendelse til vaccination af fugle mod infektiøs fuglebronkitis i kombination med en indledende vaccination med en 20 levende vaccine indeholdende et levende heterolog infektiøst fuglebronkitisvirus.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

EKSEMPEL 1 25 (a) Fremstilling af en monovalent olieemulsionsvaccine inde holdende inaktiveret stamme VLO 10110/AVI/9

10 dage gamle SPF-embryonerede hønseæg podedes gennem allan-toishulrummet med 3-4 log10 CD50 infektiøs bronkitisvirusstamme VLO 10110/AVI/9. Efter 70 timers inkubering ved 37°C

30 indhøstedes allantoisvæsken. Der tilsattes et konserveringsmiddel (0,013% tiomersal) og efter klaring ved centrifugering DK 170923 B1 8 med lav hastighed blev virusinfektionen inaktiveret ved inku-bering med 0,05% /3-propiolacton i 2 timer ved 37°C. Den inaktiverede allantoisvæske koncentreredes ved ultrafiltrering, således at den indeholdt mindst ækvivalenten til 108 5 CD50/ml. "Polysorbate" 80 opløstes i det inaktiverede virale antigenpræparat til en koncentration på 4,25%. Den blandedes derefter med en let mineralolie (USA's farmakopé) indeholdende 10% sorbitan monooleat BP (den britiske farmakopé) i forholdet 1:4 og emulgeredes. Vaccinen opbevaredes ved 4°C.

10 (b) Immunisering Én dosis indeholdende mindst 3 log10 EID50 af H120 levende vaccine blev intranasalt givet til 3 uger gamle kyllinger.

Ved alderen 16 uger fik hver fugl intramuskulært indgivet 0,5 ml af VLO 10110/AVI/9 olieemulsionsvaccine (antigenisk ækvi-15 valent 7,0 log10 CD50) . Der opnåedes middel hæmagglutina- tionsinhibering (HI) antistof titere mod M41 på 7,0 log2 og mod D274 på 8,3 log2 8 uger efter vaccinationen med olieemulsionsvaccinen .

EKSEMPEL 2 20 Fremstilling af en bivalent olieemulsionsvaccine indeholdende den inaktiverede stamme VLO 10110/AVI/9 og stammen M41 (a) To grupper af 10 dage gamle SPF-embryonerede hønseæg blev inokuleret via allantoishulrummet med 3-4 log10 CD50 infekti-øs virusstamme VLO 10110/AVI/9 eller stammen M41. Efter 70-72 25 timers inkubering ved 37°C stødtes allantoisvæsken fra de to grupper æg hver for sig. Til hvert æg sattes der konserveringsmiddel (0,013% thiomersal) og efter klaringen ved centrifugeringen med lav hastighed inaktiveredes virusinfektionen ved inkubering med 0,05% jS-propiolacton i 2 timer ved 30 37°C. De to grupper af inaktiveret allantoisvæske blev kon centreret ved ultrafiltrering. "Polysorbate" 80 opløstes i de inaktiverede virale antigenpræparater til en koncentration på DK 170923 B1 9 4,25%. De blev derefter blandet med en let mineralolie (USA's farmakopé) indeholdende 10% sorbitan monooleat BP i forholdet 1:4 og emulgeredes. De to emulsioner blev derefter blandet sammen i lige store portioner, og den bivalente vaccine opbe-5 varedes ved 4°C.

(b) På lignende måde kan der fremstilles polyvalente vacciner ved anvendelse af den foran beskrevne teknik, men således at der tillige inkorporeres inaktiveret Newcastlesyge-virus eller inaktiveret Newcastlesyge-virus og infektiøst bursal- 10 sygdomsvirus.

(c) Immunisering Én dosis indeholdende mindst 3 log10 EID50 af H120 levende vaccine blev indgivet intranasalt til 3 uger gamle kyllinger. Ved 16 ugers alderen blev der til hver fugl intramuskulært 15 indgivet 1 ml bivalent olieemulsionsvaccine i overensstemmelse med (a) ovenfor (antigenisk ækvivalent 7,0 log10 CD50 af hver virusstamme). Den gennemsnitlige hæmagglutinations-in-hibering (HI) antistof titer mod M41 på >10,7 log2 og mod D274 på 9,0 log2 opnåedes 8 uger efter vaccinationen med 20 olieemulsionsvaccinen.

EKSEMPEL 3

Sammenlignende forsøg med forbehandlede ("grundede") og ikke-forbehandlede "ugrundede" fugle 25 Den monovalente olieemulsionsvaccine fremstillet som beskrevet i eksempel 1 eller en ækvivalent M41 monovalent vaccine eller en bivalent olieemulsionsvaccine fremstillet som i eksempel 2(a) indeholdende begge virale antigenpræparater blev indgivet til både 16 uger gamle kyllinger, som var ble-30 vet forbehandlet med levende H120 (en vaccine af Massachusetts serotype som i stor udstrækning bruges kommercielt), og til 16 uger gamle kyllinger, som ikke var blevet forbe- DK 170923 B1 10 handlet. Hæmagglutinationsinhibering (HI) antistof titere måltes 4 og 8 uger efter vaccinationen. Forstærkede immunreaktioner og forholdsvis høje antistof titere til variantviruset fandtes hos fugle vaccineret med den monovalente VLO 5 10110/AVI/9 eller den bivalente olieemulsionsvaccine, som i forvejen var blevet forbehandlet med den konventionelle H120 levende vaccine. Antistoftiterne var betydelige højere end de titere, der fremkom hos ikke-forbehandlede fugle (se Tabel 2). Det vil forstås, at den tilsvarende forstærkning af 10 antistoftiterne med hensyn til M41-virus efter forbehandling ("grunding") med H120-vaccine er konventionel i og med, at M41 og H120 er af den samme serotype.

TABEL 2

Reciprok log2 middel HI antistof titere hos kyllinger

Levende virus Olieernulsionsvaccine HI titer mod M41 Hl titer arod D274* 20 24 20 24 uger uger uger uger intet M41 7,3 9,2 4,6 4,8 H120 M41 >10,6 >10,2 5,1 7,1 intet VLO 10110/AVI/9 3,9 5,3 5,9 6,6 H120 VLO 10110/AVI/9 6,6 7,0 7,2 8,3 intet VLO 10110/AVI/9 + M41 7,3 7,8 6,3 6,7 H120 VLO 10110/AVI/9 + M41 >10,6 >10,7 > 8,1 9,0 15 * D274 virus er en lignende stamme som D207 og anvendtes til HI-prøven, fordi den frembringer en hæmagglutinin med høj titer.

Claims (8)

1. Vaccine mod infektiøst fuglebronkitisvirus, 25 kendetegnet ved at den indeholder et inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus som er deponeret hos Institut Pasteur under nummeret 1-400 og/eller en inaktiveret virusstamme serologisk beslægtet dermed, for hvis vedkommende immunreaktionen hos fugle forøges ved forbehandling med en DK 170923 B1 levende heterologisk stamme af infektiøst fuglebronkitis-virus.

2. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved at det inaktiverede infektiøse 5 fuglebronkitisvirus er 1-400.

3. Vaccine ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at det inaktiverede antigen i et vandigt medium er blandet med aluminiumhydroxid eller en olieemulsion indeholdende en paraffinolie eller squalan, et 10 olieopløseligt overfladeaktivt middel og et vandopløseligt overfladeaktivt middel, idet mængdeforholdet mellem olie- og vandig fase er ca. 4:1.

4. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved at den indeholder inaktiveret virus 15 vundet fra 6-8 log10CD50 af variantstammen 1-400 og/eller nævnte serologiske beslægtede stamme pr. dosis vaccine.

5. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved at den foruden inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus 1-400 og/eller en inaktiveret 20 virusstamme serologisk beslægtet dermed tillige indeholder en eller flere yderligere inaktiverede virusstammer.

5 Ved 15 ugers alderen blev serumprøver undersøgt, og de viste sig at være fri for antistoffer mod "variant"stammer af infektiøst bronkitisvirus. Fuglene overførtes til individuelle læggebure i en isolationssuite. Halvdelen af fuglene blev vaccineret med den bi-10 valente olieemulsionsvaccine ifølge eksempel 2 indeholdende inaktiveret stamme VLO 10110/AVI/9 + inaktiveret stamme M41, mens den anden halvdel ikke blev vaccineret yderligere. De enkelte fugles ægproduktion samt æggenes farve blev opnoteret dagligt.

15 Ved 30 ugers alderen blev fuglene udsat for et fint aerosol af stammen VLO 10110/AVI/9. Vaccination af kommercielle høns med en kombination af levende H120 og inaktiveret bivalent olieemulsionsvaccine var i stand til at forhindre det alvorlige tab i ægproduktion og 20 ugunstige ændringer i skalkvalitet, der optrådte hos fugle, der ikke var vaccineret på denne måde, når de blev udsat for denne belastning i en alder på 30 uger.

6. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved at den foruden nævnte inaktiverede infektiøse fuglebronkitisvirus 1-400 indeholder inaktiveret 25 infektiøst fuglebronkitisvirus M41 og inaktiveret Newcastle-syge-virus og/eller inaktiveret infektiøst bursalsygdoms-virus.

7. Vaccinesæt, kendetegnet ved at det særskilt indeholder multiple 30 dosisenheder dels af en inaktiveret vaccine indeholdende et inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus 1-400 og/eller en virusstamme serologiske beslægtet dermed, og dels en levende DK 170923 B1 vaccine indeholdende et levende heterologisk infektiøst fuglebronkitisvirus.

8. Anvendelse af et inaktiveret infektiøst fuglebronkitisvirus 1-400 og/eller en inaktiveret virusstamme serologisk 5 beslægtet dermed til fremstilling af vaccine til anvendelse til vaccination af fugle mod infektiøs fuglebronkitis i kombination med en indledende vaccination med en levende vaccine indeholdende et levende heterolog infektiøst fuglebronkitisvirus .