JP4523164B2 - ワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、新規ワクチン製剤、それらの製法、及び医療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、有効な免疫刺激剤、好ましくは、例えば、モノホスホリル・リピドA又はその誘導体で補強された改良A型肝炎ワクチンに関する。本発明は、上記A型肝炎ワクチンが1成分であるところの併合ワクチンにも関する。
【0002】
A型肝炎ワクチンは知られている。例えば、Smithkline Beecham BiologicalsからのワクチンHavrix(商標)が、A型肝炎の感染を防ぐために使用されることができ、そしてまた、アジュバントとして水酸化アルミニウムと配合される。このワクチンは、Andre et al.の手順に従って製造される。それは、ホルモール(ホルムアルデヒド)で失活されたHM−175A型肝炎ウイルスの減弱株を含む;Andre et al.〔Prog Med.Virol.1990,vol37;−p72−95〕を参照のこと。
【0003】
上記A型肝炎とB型肝炎抗原の併合物であるワクチンTwinrix(商標)は、A型肝炎とB型肝炎に対して同時に保護するために使用されることができる。上記A型肝炎抗原とサルモネラ・チフィムリアム(Salmonella typhimurium)の精製Vi多糖の併合物であるワクチンHepatyrix(商標)は、肝炎と腸チフスに対して同時に保護するために使用されることができる。
【0004】
国際特許出願WO93/19780(Smithkline Beecham
Biologicals s.a.)は、とりわけ、3D−MPLで補強されたA型肝炎ワクチンを開示している。
ヨーロッパ特許第0339667号(Chemo Sero)は、A型肝炎抗原とB型肝炎抗原を併合して、併合ワクチンを製造するという一般概念について記載している。その明細書には、使用されるアジュバントは決定的でなく:それは、望ましい程度までこの免疫活性を高めることができるだけでなければならず、そしていかなる副効果をも生じさせないと述べられている。アルミニウム・ゲル、特に、水酸化アルミニウム・ゲルとリン酸アルミニウム・ゲルが使用されうると述べられている。
【0005】
今般、A型肝炎ワクチンのための失活ウイルスを製造及び精製する伝統的な方法が、A型肝炎ウイルスがその中で成長するところの宿主細胞からの汚染物の少量の残渣を残すことができるということが発見された。このような宿主細胞汚染物は、特にそれらがヒト起源であり、天然において2倍体であり、そして低レベルであるときは、そのワクチンがアルミニウム塩で補強されるときには心配ない。しかしながら、そのワクチンが強い免疫刺激剤で補強されるとき、ワクチン接種を受けた人が、その宿主汚染物に対して、有害な免疫応答を引き起こすことができる理論的な可能性が存在する。
【0006】
従って、上記宿主細胞タンパク質の微量成分の実質的に全てを除去する、製法の必要性が在る。
従って、本発明の1の局面においては、宿主細胞汚染物を実質的に含まない、失活A型肝炎ウイルスの製法であって:
a)A型肝炎ウイルスを培養し、そしてA型肝炎調製物を収獲し;
b)上記A型肝炎調製物をプロテアーゼで処理し;そしてその後、
c)プロテアーゼ消化材料から無傷のウイルスを分離し;
d)上記ウイルスを失活させる、
を含む前記製法が提供される。
【0007】
驚くべきことに、上記プロテアーゼ消化処理は、上記A型肝炎ウイルスに悪影響を及ぼさないが、上記A型肝炎調製物から宿主細胞汚染物の分解及び分離を容易にする。
好ましくは、上記A型肝炎ウイルスは、HM−175株由来である。
宿主細胞汚染物を実質的に含まないとは、銀染色されたSDS PAGEをスキャンすることにより、10%未満の、好ましくは、8%未満の、より好ましくは、5%未満の宿主細胞タンパク質が検出されることができるということを意味する。より重要には、そしてスロット・ドット・ハイブリダイゼーションにより測定されるとき、上記ワクチン中のHAVの1投与量は、好ましくは、10ng未満の宿主細胞タンパク質を含有する。
【0008】
好ましくは、使用されるプロテアーゼは、トリプシンである。使用されることができる他のプロテアーゼは、プロナーゼ(pronase)、パパイン(papain)、及びペプシン(pepsin)を含む。
上記プロテアーゼ処理は、好ましくは、約2時間、室温より高い温度で、例えば、約37℃で、行われる。
【0009】
上記プロテアーゼ及び消化成分からの無傷のウイルスの分離は、さまざまな好適な方法により、例えば、パーミエーション(permeation)クロマトグラフィーにより達成されることができる。
あるいは、上記プロテアーゼ及び消化された成分は、サイズに基づき分離するいずれかの分離方法、例えば、限外濾過により、分離されることができる。
【0010】
次に、上記生成物は、他の汚染物を除去するための他のステップによりさらに精製されることができる。例えば、上記生成物は、上記生成物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて、核酸残渣を除去することにより、さらに精製されることができる。
本発明に係る方法のプロテアーゼ消化ステップは、2つの効果に因りA型肝炎調製物の精製を改良することができる。第1に、上記プロテアーゼは、それらが、上記プロテアーゼ処理に続くクロマトグラフィー分離ステップにおいてより容易に分離するように、汚染性宿主タンパク質を消化する。第2に、汚染性宿主タンパク質の消化は、上記イオン交換ステップにおいて、未消化の宿主タンパク質と他の方法で会合されるであろう他の汚染性材料、特に核酸のよりよい分離を許容する。これらの観察された効果は、いかなる方法においても本発明を必ずしも限定しないと理解されよう。
【0011】
本発明の他の局面においては、先に定義したような、汚染性宿主タンパク質を実質的に含まない、失活A型肝炎ウイルスが提供される。
次に失活A型肝炎ウイルスはワクチンに配合されることができる。
従って、本発明は、さらなる局面において、宿主細胞汚染物を実質的に含まない失活A型肝炎ウイルスを含むA型肝炎ウイルスを提供する。
【0012】
このようなワクチンは、有利には、好適なアジュバントを含む。好適なアジュバントは、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムのゲル又はリン酸アルミニウムを含むが、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩であることも、又はアシル化チロシン、又はアシル化糖、カチオン又はアニオン誘導体化多糖、又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液であることもできる。有利には、高く精製されたA型肝炎ウイルスは、強いアジュバント系と配合されることができる。従って、本発明の配合物においては、上記アジュバント組成物が、Th1性状を含む免疫応答を誘発することが望ましい。
【0013】
一般的な意味においては、Th1−型応答は、サイトカイン、例えば、IL−4,IL−5、及びIL−10の産生を特徴とするTh2−型応答とは異なり、IFN−γの産生を特徴とする。体液性応答のアイソタイプ特性は、Th1又はTh2−型応答のためのマーカーとして、使用されることもできる。マウスにおいては、Th1−型応答は、しばしば、IgG2aサブタイプの抗体の産生に関係し、一方、IgG1は、Th2−型応答のマーカーである。この状況は、ヒトにおいては明らかではないが、データは、IgG1とIgG4がそれぞれTh1−とTh2−型応答のマーカーであることができるであろうということを示唆している。
【0014】
好適なアジュバント系は、例えば、モノホスホリル・リピドA、好ましくは、3−0−脱アシル化モノホスホリル・リピドA(3D−MPL)の併合物を含み、そして好ましくは、アルミニウム塩とともに配合される。
強化系は、モノホスホリル・リピドAとサポニン誘導体の併合物、好ましくは、WO94/00153中に開示されたような、QS21と3D−MPLの併合物、又はQS21がWO96/33739中に開示されたようなコレステロールでクエンチされているところのより反応原性の低い組成物を含む。
【0015】
油/水エマルジョン中に、QS21,3D−MPL、及びd,l−アルファ−トコフェロールを含む特に強力なアジュバントが、WO95/17210中に記載されている。
包含されることができる他の知られたアジュバントは、例えば、WO96/02555中に開示されたような、CpG含有オリゴヌクレオチドである。
【0016】
従って、本発明の好ましい態様においては、モノホスホリル・リピドA又はその誘導体により補強された、本発明に係るウイルスを含むワクチンが提供される。
好ましくは、上記ワクチンは、さらに、サポニン、より好ましくは、QS21を含む。
【0017】
好ましくは、上記配合物は、さらに、油/水エマルジョン及びd,l−アルファ−トコフェロールを含む。
本発明は、医薬として許容される賦形剤又は担体、例えば、3D−MPLと、本発明に係る精製ウイルスを混合することを含む、ワクチン配合物の製法をも提供する。
【0018】
本発明の精製ウイルスは、有利には、それが、A型肝炎感染に加えて他の疾患の予防又は治療において有効であるように、他の抗原と併合されることができる。好ましい併合は、B型肝炎抗原を含む併合を含む。
B型肝炎表面抗原(HBS Ag)の調製は、よく文書化されている。例えば、Harfold et al.in Develop.Biol.Standard 54,page 125(1983),Gregg et al.in Biotechnology,5,page479(1987),EP−A−0226846,EP−A−0299108、及びその文献中の引用文献を参照のこと。
【0019】
本明細書中に使用するとき、表現“B型肝炎表面抗原”又は“HBS Ag”は、HBV表面抗原の抗原性を提示するいずれかのHBS Ag抗原又はその断片を含む。HBS Ag S抗原の226アミノ酸配列(Tiollais et al,Nature,317,489(1985)及びこの文献中の引用文献を参照のこと)に加えて、本明細書中に記載するHBS Agは、所望により、上記文献及びEP−A−0278940中に記載されたようなプレ−S配列の全部又は一部を含む。特に、HBS Agは、ad血清型のB型肝炎ウイルス上のオープン・リーディング・フレームに対して、HBS AgのL−タンパク質の残基12〜52、その後の残基133−145、その後の残基175−400を含むアミノ酸を含むポリペプチド(このポリペプチドをL* という;EP0414374を参照のこと。)を含むことができる。本発明の範囲内のHBS Agは、EP0198474(Endotronics)中に記載されたプレS1−プレS2ポリペプチド又はそのアナログ、例えば、EP0304578(McCormick and Jones)中に記載されたものをも含む。
【0020】
本明細書中に記載するとき、HBS Agは、突然変異体、例えば、WO91/14703又はEP0511855A1中に記載された“逸脱(escape)空然変異体”、特に、145位においてグリシンからアルギニンへのアミノ酸置換が存在するところのHBS Agをもいう。
通常、上記HBS Agは粒子形態になるであろう。この粒子は、例えば、Sタンパク質だけを含むことができるし、又は複合粒子、例えば、(L* ,S){ここで、L* は先に定義したものと同じであり、そしてSはHBS AgのS−プロテインを表す。}であることができる。上記粒子は、有利には、それが酵母内で発現されるところの形態である。
【0021】
本発明は、さらなる局面において、医学療法における使用のために、特に、肝炎ウイルス感染の治療又は予防における使用のために、本明細書中に記載するようなワクチン配合物を提供する。好ましい局面においては、本発明に係るワクチンは、進行性の肝炎感染、より特にそれを患うヒトにおけるA型肝炎及び/又はB型肝炎感染のために有用である治療用ワクチンである。
【0022】
得られた驚くべき有効な結果に照らして、さらに好ましい局面においては、本発明は、A型肝炎及び/又はB型肝炎感染の治療又は予防のためのワクチン製剤を提供する。
有利には、本発明の肝炎ワクチン製剤は、それが1以上の他のバクテリア、ウイルス又は真菌(fungal)感染の治療又は予防において有効であるように、他の抗原を含む。
【0023】
従って、本発明に係る肝炎ワクチン配合物は、好ましくは、以下の疾患:
ジフテリア、破傷風、百日咳、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae b)(Hib)、及びポリオ、の中の1以上に対して保護を与えるために、本分野において知られた非肝炎抗原から選ばれることができる少なくとも1の他の成分を含む。
【0024】
好ましくは、本発明に係るワクチンは、先に定義したようなHBS Agを含む。
上記併合ワクチンにおける使用のために好適な成分は、既に商業的に入手でき、そして詳細は、世界保健機構から得られることができる。例えば、ポリオ成分は、Salk失活ポリオ・ワクチン(IPV)であることができる。百日咳ワクチン成分は、全細胞又は無細胞製品を含むことができる。
【0025】
有利には、本発明に係る肝炎又は併合ワクチンは、小児ワクチン又は青年期ワクチンである。
青年用途のための好ましい本発明に係る併合ワクチンは、以下の疾患:
ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、単純ヘルペス・ウイルス(HSV)、エプスタイン・バール・ウイルス(EBV)、水疱瘡ウイルス(VZV)、ヒト・Hイトメガロウイルス(HCMV)、トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplasma gandii)、の中の1以上に対し保護を提供することが、本分野において知られている抗原から選ばれる1以上の成分を含む。
【0026】
上記ワクチン投与量中の各抗原の量は、典型的なワクチン接種を受けた者において有意な有害副作用を伴わずに免疫保護応答を誘導する量として選ばれる。このような量は、どの特異的免疫原が使用されるかということに依存して変化するであろう。一般に、各投与は、A型肝炎のために投与当り0.1〜1.0μgのタンパク質、最も好ましくは、0.06〜0.220μgタンパク質/投与を含むであろうと予想される。A型肝炎以外の抗原、例えば、HBS Ag、HSV、等のためには、投与当りのタンパク質の量は、より高く、例えば、約20μg/投与までであることができる。特別なワクチンのための1以上の免疫原のそれぞれの最適量は、被験体(患者 subjects)における抗体力価及び/又は他の応答の観察を含む標準的な試験により確められることができる。最初のワクチン接種後、被験体は、約4週間以内にブーストを受容することができる。
【0027】
本発明のさらなる局面においては、肝炎感染の予防又は治療において有効なワクチンの製法であって、本明細書中に定義するような肝炎抗原をMPL又はその誘導体と混合することを含む、前記製法が提供される。
上記方法を用いて、1以上の追加の成分が、好ましくは、失活A型肝炎ワクチンと混合されて、併合ワクチンが提供される。
【0028】
以下の実施例は、本発明とその利点を説明する。
実施例
実施例1
a)精製ステップ
本実施例中に与える一連のステップを、本発明に係る方法に従うが、常に、トリプシン又は他のプロテアーゼ消化ステップを含んで、異なる組合せにおいて、行うことができる。
【0029】
培養及び収獲
A型肝炎ウイルスHM175を、MRC5細胞(Andre et al.前掲)上で培養し、そしてそのウイルスを、上記細胞層の洗浄後に収獲して、成長培地中で使用した血清を除去する。凍結/解凍後、界面活性剤(Tween20(商標))を添加して、上記細胞死骸から上記ウイルスを抽出する。細胞死骸を、0.22μm膜を通した濾過により、除去する。濾液をさらに限外濾過にかける。得られた濃縮物は、最終的に、1〜2時間、5〜10,000xgにおける遠心分離により清澄化されることができる。
【0030】
トリプシン処理
上記HAVウイルスを含有する濃縮物を、ブタの膵臓から抽出した精製トリプシンで処理する。使用したトリプシンを2回結晶化し、そして使用前に凍結を保った。トリプシンの添加前、上記濃縮物を、一定の撹拌の下、37℃で前もって温める。次に、トリプシンを、濃縮物1ml当り440IUの比で添加し、そしてその混合物を、37℃で、最短で2時間(最長で2.5時間)緩やかに撹拌する。
【0031】
濃縮
トリプシン処理の後、上記産物を、その容量を減少させるために限外濾過装置上で周囲温度で直ちに処理することができる。使用した膜は30,000ダルトンの名目カット−オフをもつ再生セルロースであり、そして膜1cm2 当り最大8mlまでのトリプシン処理産物を、0.2〜0.6バールの間の経膜圧で処理して、8〜12の目の濃縮率を達成する。
【0032】
パーミエーション・クロマトグラフィー
このステップの目的は、無傷のHAVウイルスからタンパク質を分離することである。トリプシン処理後にパーミエーション・クロマトグラフィー・ステップが行れるとき、条件は、残存トリプシンをも除去するように適合されなければならない。使用された分離ゲルは、Permeation Sepharose 4BFFである。
【0033】
上記ウイルスは、(カラムの全容量に近い)より大きな保持容量を用いて溶出されるより小さなタンパク質断片よりも、より小さな保持容量で、溶出される。
クロマトグラフィー・パラメーターは以下のようである:
クロマトグラフィー材:(Pharmaciaからの)Sepharose 4BFF
インジェクト容量:ゲル容量の1〜5%
溶出速度:5〜10cm/時間
温度:10〜16℃
画分のプール:標的100ngプロット/720Elisa単位(+/−10%)
イオン交換
この精製ステップの目的は、(MRC5細胞に起源をもつ)DNA含量を低下させることである。このステップを、バッチ原理に従って走らせる。
【0034】
先のクロマトグラフィ・ステップからのプールを、0.3M NaClに調整し、そして次に室温で1時間(最長1.5時間)緩かに撹拌しながらイオン交換樹脂と混合する。
DNA固定の後、上記ゲルを濾過により除去する。次に、固定されていないHAVウイルス懸濁液を、そのNaCl濃度を150mMに調整するように希釈する。あるいは、このイオン交換精製ステップは、カラム・クロマトグラフィーにより行われることもできる。
【0035】
最終的に精製された産物を、0.22μmフィルター上で滅菌濾過する。クロマトグラフィー・パラメーターは以下のようなものである:
供給:上記プールの容量に対して3%のゲル(容量/容量)
温度:周囲
失活を、Andre et al.中に記載されたように行う。但し、250μg/mlのホルモールを使用する。
【0036】
ホルムアルデヒド低下
上記失活の終わり後48時間以内に、そのホルムアルデヒド含量を低下させ、そしてアルミニウム塩(好ましくは、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム)上に事前吸着させるために、上記産物をダイアフィルトレートし、そして濃縮する。
【0037】
使用前に、完全限外濾過装置を、少なくとも30分間、0.1N NaOHを用いて除菌する。次に、この装置を、ダイアフィルトレーション・バッファーで十分に濯ぎ、そしてその膜を、アミノ酸含有バッファー(Travasol)で被覆する。最終的に、この装置を、ダイアフィルトレーション・バッファーで濯ぐ。
【0038】
ダイアフィルトレーション及び濃縮の後、最終生成物を0.22μmフィルター上で滅菌濾過する。
b)精製スキーム
上記の精製ステップを、純粋な生成物が経済的なやり方で得られるような方法で、併合した。2つのこのような精製スキームを、スキーム1に示す。この両者が類似の生成物を作り出す。スキーム1に示すようなステップの1の形態(configuration)においては、上記ステップを実施例1a中に記載する順番で行い、そして他の形態においては、上記トリプシン・ステップを、上記限外濾過ステップと第1のパーミエーション・クロマトグラフィー・ステップの間で行った。これは、第2のパーミエーション・クロマトグラフィー・ステップが省略されることができるということを意味する。
実施例2−特徴付け
精製された産物のサンプルを、SDS PAGE(12.5%アクリルアミド、スタッキング・ゲル中1%SDS、40〜50ボルトで15時間の移動)により分析した。このゲルを、AgNO3 で染色し、そしてその色を、10〜20分間、発色させ、そして伝統的なHAVプロセス(Andre et al.)と比較した。
【0039】
図2と図3から分かるように、上記産物をプロテアーゼ処理に供することにより、高分子量汚染物のほとんどが除去される。
実施例3−HAVワクチン配合物
3.1 HAV−アルミニウム(alum)3D−MPL
実施例1のHAV粒子を、まず、水酸化アルミニウム(Superfos)に吸着させ、その後、遊離の3D−MPLを添加する。0.5ml投与量720ELUのA型肝炎ウイルス粒子/0.025mgAl3+イオン、及び50μgの3D−MPL。
3.2 HAV+HbS Ag配合物
以下の配合物を作った:
【0040】
【化1】
【0041】
群1において、個々の抗原を、HA,0.475mg A13+イオン(AlPO4 Super fos型)について、アルミニウム塩0.025mg Al3+イオン(Al(OH)3Superfos)に吸着させた。群2と5においては、50μg/投与の遊離3D−MPLを、肝炎S抗原に添加し、それに上記の吸着されたA型肝炎成分を添加した。群3と4においては、3D−MPLを、別々に上記アルミニウム塩に吸着させ、そして次に上記3つの吸着された成分を互いに混合せた。
実施例4−免疫原性実験
Balb/Cマウス
10匹のマウスからなる群を、HAV/HBS 配合物(1/10HD)で2週間間隔で3回筋中、免疫感作させた。HbS に対する抗体応答を、IIに後(postII)14日目に、そしてIII の後14日目に、ELISAによりモニターした。抗−HBS 応答のアイソタイプ特性を、IIの後14日目に分析した。HAVに対する抗体応答をIII の後14日目にモニターした。
【0042】
NMRIマウス
10匹のマウスからなる群を、HAV/HBS 配合物(1/2HD)で1回腹腔内に免疫感作させた。HbS とHAVに対する抗体応答を、注射後28日目にELISAによりモニターした。
【0043】
【表1】
【0044】
HAVマウス血清学
抗−A型肝炎ウイルス抗原(HAV)抗体の定量を、BehringからのEnzygnostキット(ref:OQEC11)を用いて行った。このアッセイは、競合テスト原理に基づくELISAであり、1ステップで走らせられ、そして最初に、ヒト血清学のために開発された。
【0045】
マウス血清(1/10から出発する4希釈)、(80 mIU/mlから出発する8希釈)、及び対照の2倍希釈を、抗−HAV陰性ヒト血清中で行った。テスト/対照サンプル(25μl)、HAV抗原溶液(50μl)、及びペルオキシダーゼと結合した抗−HAVマウス・モノクローナル(コンジュゲート・バッファー中で行われた1/41希釈の50μl)の混合物を、37℃で2時間、HAVプレ−コートされたマイクロプレート上でインキュベートした。次に、このプレートを洗浄し、そしてTMBの溶液(100μl)で30分間インキュベートした。この反応を、H2 SO4 0.5Nで停止させ、そして450/620nmで読んだ。
【0046】
抗−HAV抗体力価を、(4つのパラメーターの等式を用いて)SoftmaxProにより上記文献から計算し、そして mIU/mlで表す。
結果
上記結果を図1に示す。
図1の中、結果は、MPLを含有する配合物が、アルミニウム塩群単独よりも、有意に高い、A型肝炎成分に対する抗体応答を誘発するということを表す。同様に、図1b中に示す結果は、MPL含有配合物が、HbS Agに対する高い抗体力価を誘発することを表す。
実施例5−臨床試験
HAV/HBS(HAB)配合物を、健康な被験体に投与した。
【0047】
抗−HAV抗体の血清力価を、ELISA(Boehringer MannheimからのEnzymunテスト)により計測し、そして抗−HBS 抗体の血清力価を、テスト・キットAUSAB−Abbottを用いたラジオイムノアッセイ(RIA)により計測した。抗−HAV抗体についての上記アッセイのカット−オフは33 mIU/mlであり、そして抗−HBS 抗体についての上記アッセイのカット−オフは1 mIU/mlであった。
【0048】
33 mIU/mlの抗−HAV抗体力価をもつ被験体を、抗−HAV抗体について血清陽性であると考えた。1 mIU/mlの抗−HBS 抗体力価をもつ被験体を、抗−HBS 抗体について血清陽性であると考えた。抗−HBS についての血清保護率を、10 mIU/mlの抗−HBS 力価をもつ被験体の割合として定義した。
【0049】
【表2】
結果:
HAB/MPLが健康な被験体に投与されるところの上記フェーズI臨床試験においては、免疫応答の際に免疫刺激剤として働くMPLの顕著な効果が存在する。
【0050】
MPLは、抗−HAV動態に対して明らかな効果をもつ。それは、6.5ヶ月目及び7ヶ月目(すなわち、最後のワクチン投与後、それぞれ、14と30日後)に観察される顕著な既往反応をもつ、より速く、かつ、強い免疫応答を誘発する。
この試験の制限内で、上記候補HAB/MPLワクチンは、ひじょうに良好な安全性及び反応原性特性を示したと結論することができる。18〜40歳の健康な成人の試験群における2投与からなるワクチン接種の全経過の後、それはひじょうに免疫原性であった。両A型肝炎抗原とB型肝炎抗原に対する強いプライミング及びより速い免疫応答が存在した。
【0051】
【表3】
【0052】
【表4】
【0053】
【表5】
【0054】
【表6】
Claims (13)
- 宿主細胞汚染物を実質的に含まない失活A型肝炎ウイルスの製法であって、以下のステップ:
a)A型肝炎ウイルスを培養し、そしてA型肝炎調製物を収獲し、
b)上記A型肝炎調製物をプロテアーゼで処理し、その後、
c)無傷のウイルスを、プロテアーゼ消化タンパク質から分離し、
d)上記無傷のウイルス調製物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、そして
e)上記ウイルスを失活させる、
を含む前記製法。但し、前記製法は、DNase 又はRNase による酵素処理を含まない。 - 前記A型肝炎ウイルスがHM−175株由来である、請求項1に記載の製法。
- 前記プロテアーゼがトリプシン、プロナーゼ、パパイン又はペプシンである、請求項1又は2に記載の製法。
- 前記ステップc)が、パーミエーション(permeation)クロマトグラフィー・ステップを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製法。
- 前記失活A型肝炎ウイルス調製物調製物が、宿主細胞汚染物を実質的に含まない、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製法。
- 前記調製物が、SDS PAGEをスキャンすることにより検出することができる10%未満の汚染性宿主細胞タンパク質を含む、請求項5に記載の製法。
- 前記調製物が、SDS PAGEをスキャンすることにより検出することができる8%未満の汚染性宿主細胞タンパク質を含む、請求項5に記載の製法。
- 前記調製物が、SDS PAGEをスキャンすることにより検出することができる5%未満の汚染性宿主細胞タンパク質を含む、請求項5に記載の製法。
- 以下のステップ:
f)前記失活A型肝炎ウイルスの調製物を、医薬として許容される担体及びアジュバントと混合して、A型肝炎ワクチンを製造する、
をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の製法。 - 前記アジュバントが、モノホスホリル・リピドA又はその誘導体を含む、請求項9に記載の製法。
- 前記アジュバントが、QS21をさらに含む、請求項10に記載の製法。
- 前記アジュバントが、油/水エマルジョン及びトコフェロールをさらに含む、請求項11に記載の製法。
- 前記失活A型肝炎ウイルスの調製物を、B型肝炎抗原と混合する、請求項9〜12のいずれか1項に記載の製法。
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