JP6553509B2 - ウイルス様粒子の精製 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
[0001] 本出願は、２０１２年６月２２日出願の米国仮特許出願第６１／６６３，２１８号、及び２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９４，０８６号に対する優先権を主張し、それぞれの全内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

[0002] 本発明は、ノロウイルスのワクチンを含む、ワクチンの分野に属する。本発明の態様は、ワクチン組成物を調製し精製する方法に関する。

[0003] ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生は通常、宿主細胞発現系におけるＶＬＰの発現及び集合（assembly）を含む。その結果の産生培養物から感染性因子を除去するには、一般的にウイルス濾過が使用されるが、ＵＶ不活性化又は化学的不活性化などの他の方法も（単独で、又はフィルタ系の方法と組み合わせて）使用することができる。しかしながら、ＶＬＰのような比較的大きい生物成分では、ウイルス濾過は使用可能ではない。何故なら、ＶＬＰはサイズが感染性因子（例えばウイルス）と近すぎて濾過のみでこのような感染性因子から分離できないことが多いからである。

[0004] 特定の例では、Ｓｆ９昆虫細胞中でＶＬＰのバキュロウイルス発現後、その結果の大量産生培養物には、宿主細胞のタンパク質、核酸及び生感染性因子、例えばバキュロウイルスなどの高レベルのプロセス汚染物質が含まれる。低速遠心分離及び濾過によるＶＬＰ産生培養物の回収は、下流精製に適した浄化した試料を生じるが、これらの方法は、宿主細胞のタンパク質及び生きたウイルス、例えばバキュロウイルスの除去には適していない。したがって、ＶＬＰの調製時に下流加工を促進するために、感染性因子を不活性化する、及び／又は回収中のプロセス汚染物質を除去する他の方法が必要である。

[0005] 本明細書では、ＶＬＰ細胞可溶化物及び産生培養物からのプロセス汚染物質の除去に有用な方法、及びそれによって産生されるＶＬＰ組成物が提供される。一実施形態では、本発明の方法は、上記ＶＬＰを含む細胞可溶化物、培養物上清、又は濾液を生成するか又は得ることと、ｐＨ調整溶液を生成するために可溶化物、上清又は濾液のｐＨを約５より小さいｐＨ値に調整することとを含む。方法は、ＶＬＰを含む精製溶液を生成するために、ｐＨ調整溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体を除去することをさらに含む。

[0006] 幾つかの実施形態では、本発明のｐＨ処理法は、ＶＬＰの構造的に多様な集団を分離するために有用であり、ＶＬＰは少なくともＶＬＰの第一亜集団及び第二亜集団を含む。非ＶＬＰ微粒子／凝集物を分離することは、精製溶液を生成するためにｐＨ調整溶液からＶＬＰの第二亜集団を分離することを含むことができ、精製溶液は実質的にＶＬＰの第一亜集団を保持する。当該方法は、精製溶液からＶＬＰの第二亜集団を分離した後、精製溶液からＶＬＰの第一集団を分離することをさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、ＶＬＰはノロウイルスＶＬＰであり、第一亜集団は完全長ＶＰ１サブユニットを有するノロウイルスＶＬＰを含み、第二亜集団は切断型ＶＰ１サブユニットを有するノロウイルスＶＬＰを含む。残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの第一亜集団の比率は、このような処理の後、少なくとも約５０％まで増加する。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの第一亜集団の比率は、このような処理の後、少なくとも約８０％まで増加する。

[0007] 幾つかの実施形態では、分離することは、以下のプロセスのうち１つ又は複数を含む。すなわち、遠心分離、析出、凝集、沈降、及び濾過である。幾つかの実施形態では、ＶＬＰを除去することは、１つ又は複数のクロマトグラフィプロセスを使用して、精製溶液からＶＬＰの第一亜集団を分離することを含む。

[0008] 本発明の幾つかの態様では、ＶＬＰを精製する方法は、ＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養物上清、又は濾液を生成するか又は得ることと、精製溶液を生成するために多工程クロマトグラフィプロセスを使用してＶＬＰを精製することとを含む。多工程クロマトグラフィプロセスの少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、可溶化物、上清又は濾液をクロマトグラフィ材料と接触させることを含み、ＶＬＰが上記クロマトグラフィ材料と結合し、さらに、溶媒及び／又は洗浄剤でクロマトグラフィ材料を処理することと、上記処理後に、クロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出することとを含む。各クロマトグラフィプロセスは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、膜式クロマトグラフィ、及びアフィニティクロマトグラフィから別個に選択される。幾つかの実施形態では、多工程クロマトグラフィプロセスの第一クロマトグラフィプロセスは、イオン交換クロマトグラフィであり、イオン交換クロマトグラフィは、アニオン交換クロマトグラフィ及びカチオン交換クロマトグラフィから選択される。

[0009] 幾つかの実施形態では、多工程クロマトグラフィプロセスの第一クロマトグラフィプロセスはカチオン交換クロマトグラフィであり、上記処理工程は、カチオン交換クロマトグラフィプロセスのカチオン交換カラムで実行される。幾つかの実施形態では、多工程クロマトグラフィプロセスの第一クロマトグラフィプロセスはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィであり、上記処理工程は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィプロセスのヒドロキシアパタイトカラム上で実行される。幾つかの実施形態では、多工程クロマトグラフィプロセスの第一クロマトグラフィプロセスはアフィニティクロマトグラフィであり、上記処理工程は、アフィニティクロマトグラフィプロセスの親和カラム上で実行される。幾つかの実施形態では、多工程クロマトグラフィプロセスの第一クロマトグラフィプロセスは混合モードクロマトグラフィであり、上記処理工程は、混合モードクロマトグラフィプロセスの混合モードカラム上で実行される。幾つかの実施形態では、多工程クロマトグラフィプロセスの第一クロマトグラフィプロセスは疎水性相互作用クロマトグラフィであり、上記処理工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィプロセスの疎水性相互作用カラム上で実行される。幾つかの実施形態では、方法は１つ又は複数の追加のクロマトグラフィプロセスをさらに含む。

[0010] 溶媒及び／又は洗浄剤は以下のうち１つ又は複数を含む。すなわち、リン酸トリブチル（ＴｎＢＰ）、非イオン洗浄剤（Triton X-100及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなど）、双性イオン洗浄剤（CHAPS及びZwittergent 3-12など）及びイオン洗浄剤（コール酸ナトリウム及びホウ酸ジメチルジオクタデシルアンモニウムを含む）である。

[0011] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰはノロウイルス遺伝子群Ｉ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＶ型ＶＬＰ、キメラノロウイルスＶＬＰ、改変ノロウイルスＶＬＰ変異体、及びサポウイルスＶＬＰのうち１つ又は複数である。幾つかの実施形態では、ＶＬＰは、１つ又は複数のサポウイルスＶＬＰである。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、少なくとも約２倍増加している。

[0012] 幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、可溶化物、上清又は濾液と比較して少なくとも約１０倍増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質の少なくとも約５０％が可溶化物、上清又は濾液から除去される。幾つかの実施形態では、上記精製中にＶＬＰの約５０％以上が失われることはない。

[0013] 幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液は、遺伝子組換え法を使用して生成され、ＶＬＰは細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、又は哺乳類細胞中で産生される。ＶＬＰは植物細胞中でも産生することがある。

[0014] 本発明の幾つかの態様では、ＶＬＰを精製する方法は、ＶＬＰを含有する細胞可溶化物又は培養上清／濾液を生成するか又は得ることを含み、上記ＶＬＰは少なくともＶＬＰの第一亜集団及び第二亜集団を含む。方法は、可溶化物、上清又は濾液のｐＨを約５未満のｐＨに調整することと、濾過済み溶液を生成するために濾過プロセスを使用してｐＨ調整済み溶液からＶＬＰの第二亜集団を除去することとをさらに含む。濾過済み溶液は実質的に、ＶＬＰの第一亜集団を保持する。方法は追加的に、少なくとも１つのオンカラム溶媒及び／又は洗浄剤処理工程を組み込んだ多工程クロマトグラフィプロセスを使用して、濾過溶液からＶＬＰの第一亜集団を分離することを含む。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの第一集団の比率は、少なくとも約２倍増加している。幾つかの実施形態では、濾過プロセスはデプス濾過プロセスを含む。

[0015] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰはノロウイルス遺伝子群Ｉ型ＶＬＰ及びノロウイルス遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰのうち１つ又は複数である。他の実施形態では、ＶＬＰはノロウイルス遺伝子群ＩＶ型ＶＬＰ、及びヒトに今後感染すると判定される他のノロウイルス遺伝子群のうち１つ又は複数である。

[0016] 本発明の幾つかの態様では、ＶＬＰを精製する方法は、ＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は濾液を生成するか又は得ることを含む。当該方法は、ｐＨ調整済み溶液を生成するために、可溶化物、上清又は濾液のｐＨを約５未満のｐＨに調整することをさらに含む。当該方法は、追加的に、精製溶液を生成するためにｐＨ調整済み溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体を除去することを含み、上記除去は、精製済みデプス濾過済み溶液を生成するために、デプス濾過プロセスによってｐＨ調整済み溶液を浄化することを含む。幾つかの実施形態では、デプス濾過プロセスは精製溶液を生成するために、ｐＨ調整済み溶液を１つ又は複数のデプスフィルタと接触させることを含む。幾つかの実施形態では、デプスフィルタの少なくとも１つは珪藻土デプスフィルタである。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のデプスフィルタは、それぞれが約５０リットル／ｍ^２〜約１０００リットル／ｍ^２の範囲から個別に選択されたフィルタ容量を有する複数の珪藻土デプスフィルタである。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のデプスフィルタは、それぞれが約１５０リットル／ｍ^２〜約４００リットル／ｍ^２の範囲から選択されたフィルタ容量を有する単独のデプスフィルタである。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液と比較して、残留汚染核酸の少なくとも約９５％がｐＨ調整済み溶液から除去される。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液と比較して、ｐＨ調整済み溶液からのＶＬＰの回収率は少なくとも約７５％である。

[0017] 本発明の幾つかの態様では、本発明の溶液はノロウイルスＶＬＰの精製済み集団を含み、上記溶液は、サイズ排除クロマトグラフィ及びＥＬＩＳＡで測定して、ＶＬＰに対して１０％以下の残留汚染タンパク質を含有する。幾つかの実施形態では、溶液はノロウイルスＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は濾液から精製される。幾つかの実施形態では、溶液は、可溶化物、上清又は濾液に対して３５％以下の残留汚染核酸を含有する。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液中のノロウイルスＶＬＰの回収率は少なくとも約５０％である。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するノロウイルスＶＬＰの比率は、可溶化物、上清又は濾液と比較して少なくとも約１０倍増加している。

[0018] 本発明の幾つかの態様では、本発明の溶液はＶＬＰの精製集団を含み、上記溶液は完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを少なくとも約５０％含有する。幾つかの実施形態では、溶液は完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを最大約１００％含有する。幾つかの実施形態では、溶液には実質的に、切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰがない。幾つかの実施形態では、溶液は、切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを少なくとも約１０％含有する出発原料から生成される。幾つかの実施形態では、出発原料はＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は濾液である。

[0019] 幾つかの実施形態では、生きたウイルスを含有し、さらに生宿主細胞ウイルスから生成されたＶＬＰを含有する溶液中の生きたウイルスを除去及び／又は不活性化する方法は、ｐＨ調整済み溶液を生成するために、溶液のｐＨを約５未満のｐＨ値に調整することを含む。幾つかの実施形態では、ｐＨ調整済み溶液中の生きたウイルスのレベルは、少なくとも約１０^４まで減少している。幾つかの実施形態では、ｐＨ調整済み溶液中の生きたウイルスのレベルは、少なくとも約１０^５倍まで減少している。生きたウイルスは宿主細胞ウイルス、産生ウイルス（例えばバキュロウイルス）、及びヒトの取扱いなどによる他の汚染性ウイルスを含むことができるが、これらに限定されない。

[0020] 幾つかの実施形態では、方法は、精製溶液を生成するために、ｐＨ調整済み溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体を除去することと、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスを使用して精製溶液を精製することとをさらに含む。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、精製した溶液をクロマトグラフィ材料と接触させることを含み、ＶＬＰが上記クロマトグラフィ材料と結合し、さらに、クロマトグラフィ材料を溶媒及び／又は洗浄剤で処理することを含む。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、溶出液を生成するために、上記処理後にクロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出させることをさらに含む。幾つかの実施形態では、溶出液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液と比較して、少なくとも約１０^２減少している。

[0021] 本発明の幾つかの態様では、生きたウイルスを含有し、さらに生きたウイルスによって生成されたＶＬＰを含有する溶液から生きたウイルスを除去及び／又は不活性化する方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスを使用して、生きたウイルスを含有する溶液を精製することを含む。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、生きたウイルスを含有する溶液をクロマトグラフィ材料と接触させることを含み、ＶＬＰが上記クロマトグラフィ材料と結合し、さらに、クロマトグラフィ材料を溶媒及び／又は洗浄剤で処理することを含む。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、溶出液を生成するために、上記処理後にクロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出することをさらに含む。幾つかの実施形態では、溶出液中の生残留汚染性ウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液と比較して少なくとも約１０^５減少している。幾つかの実施形態では、溶出液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液と比較して少なくとも約１０^７減少している。

[0022] 本発明はまた、１つ又は複数のアジュバント及び／又は賦形剤に加えて、本明細書で開示した方法によって生成したＶＬＰ組成物、及びＶＬＰを含むワクチン組成物も含む。本明細書で生成するＶＬＰ組成物は、プロセス汚染物質が少なく、産生中に形成される異常ＶＬＰ構造が実質的にないという点で有利である。

[0023]図１Ａは、低ｐＨ処理を示し、顕著なバンドとしてノーウォークＶＰ１サブユニットを示す染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、レーン１はバルクのノーウォークＶＬＰ産生培養物（トータル）であり、レーン２はＶＬＰ産生培養物の微量遠心管上清／濾液であり、レーン３は産生培養物の微量遠心管ペレットであり、レーン４は低ｐＨ処理後のバルクＶＬＰ産生培養（合計）であり、レーン５は低ｐＨ処理、低速遠心分離及び０．２μｍ濾過後のＶＬＰ産生培養物（最終回収材料）である。 [0024]図１Ｂは、低ｐＨ処理を示し、顕著なバンドとしてコンセンサスＶＰ１サブユニットを示す染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、レーン１はバルクのコンセンサスＶＬＰ産生培養物（トータル）であり、レーン２は低ｐＨ処理、低速遠心分離及び０．２μｍ濾過後のＶＬＰ産生培養物（最終回収材料）である。 [0025]図２Ａは、溶媒／洗浄剤処理を示し、カチオン交換捕捉クロマトグラフィ中の結合及び溶出単位操作の代表的クロマトグラムであり、ノーウォークＶＬＰ馴化培地が、１００ｍＬ／分で総容量１８０ｍＬのSartobind Sカプセルに装填されている。クロマトグラムは、１）馴化培地の装填、２）溶媒／洗浄剤の洗浄、及び３）ノーウォークＶＬＰの溶出を示す。 [0026]図２Ｂは、溶媒／洗浄剤処理を示し、ヒドロキシアパタイト捕捉クロマトグラフィ中の結合及び溶出単位操作の代表的クロマトグラムであり、ノーウォークＶＬＰ馴化培地が、８０ｍＬ／分で総容量２５０ｍＬのヒドロキシアパタイトカラムに装填されている。クロマトグラムは、１）馴化培地の装填、２）溶媒／洗浄剤の洗浄、及び３）１００ｍＭリン酸塩の洗浄、及び４）ノーウォークＶＬＰの溶出を示す。 [0027]図３Ａは、ＶＬＰの完全性（integrity）の分析を示し、分析サイズ−排除のクロマトグラムであり、クロマトグラムは集合した粒子と一致する７．４分のピークを実際に示している。 [0028]図３Ｂは、ＶＬＰの完全性の分析を示し、Ｔ３正二十面体ＶＬＰで予測される約３０〜４０ｎｍの粒子を示す透過電子顕微鏡写真である。 [0029]図４Ａは、遠心分離を介したＶＬＰの産生及び回収の流れ図を示す。 [0030]図４Ｂは、デプス濾過を介したＶＬＰの産生及び回収の流れ図を示す。

[0031] 本発明は溶液及び／又はワクチン組成物の調製に関し、特にＶＬＰの精製方法に関する。具体的には、本発明の発明者は、ＶＬＰ産生培養物の低ｐＨ処理工程が、ＶＬＰ構造の免疫原性及び完全性を維持しながら、生きた宿主細胞ウイルス及び残留汚染タンパク質などのプロセス汚染物質、さらにＶＬＰ集団の幾つかの変異体を有利に除去することを発見した。例えば、ノロウイルスＶＬＰの精製に関して、本発明の発明者は、低ｐＨ処理工程の結果、切断型ＶＰ１サブユニットを有する生きたウイルス及びノロウイルスＶＬＰが実質的に除去及び／又は不活性化されたことを発見した。

[0032] 本発明の態様は、任意のＶＬＰ及びその変異体の精製に適用可能であることが理解される。幾つかの実施形態では、ＶＬＰはカリシウイルス科に属するウイルスのものである。幾つかの実施形態では、ＶＬＰは、キメラ又は組み換え変異体などのノロウイルスＶＬＰである。幾つかの実施形態では、ＶＬＰはサポウイルスＶＬＰである。

[0033] 本発明の態様は、生きたウイルスの感染性因子を除去することになるＶＬＰの精製に適用可能であることも理解される。幾つかの実施形態では、生きたウイルスは、例えばパルボウイルス、ロタウイルスなどのような無エンベロープウイルスである。幾つかの実施形態では、生きたウイルスは、例えば、バキュロウイルス、レトロウイルス、エランチウイルス、アルボウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなどのようなエンベロープウイルスである。

[0034] また、本発明の発明者は、バキュロウイルス発現系を使用してＶＬＰが産生される場合、溶媒及び／又は洗浄剤での処理は、残留バキュロウイルスなどのウイルス汚染物質を不活性化し除去するために有用な工程であることを発見した。したがって、本発明の方法は、追加的又は代替的に、ＶＬＰを含む組成物と接触している（例えばクロマトグラフィカラムの）クロマトグラフィ材料を溶媒及び／又は洗浄剤で処理すること、及び／又はクロマトグラフィ材料と接触する前にＶＬＰを含む組成物に溶媒／洗浄剤を添加することを伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスを含むことができる。その後に、クロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出し、残留溶媒／洗浄剤を除去するためにSDR Hyper-Dを添加する。

[0035] さらに、本発明の発明者は、バキュロウイルス発現系を使用してＶＬＰが産生される場合、例えば珪藻土及び／又は合成デプスフィルタなどの１つ又は複数のデプスフィルタでのデプス濾過は、バキュロウイルス核酸などの残留汚染核酸を除去するのに有用な工程であることを発見した。したがって、本発明の方法は、追加的又は代替的に、精製したデプス濾過溶液を生成するために、ＶＬＰ及び残留汚染核酸を含有するすべての溶液をデプス濾過プロセスによって浄化することを含むことができる。

[0036] 本発明の発明者は、上述したプロセスのうち１つ又は複数によって生成された精製溶液の結果、任意の事前精製溶液と比較して、精製溶液中のＶＬＰに対して残留汚染タンパク質が減少していることも発見した。したがって、本発明の溶液は、精製の結果、ＶＬＰに対して残留汚染タンパク質の減少を示すことができる。

[0037] 本発明の発明者は、上述したプロセスのうち１つ又は複数によって生成された精製溶液の結果、任意の事前精製溶液と比較して、完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰのＶＬＰレベルが相対的に上昇するので有利であることも発見した。したがって、本発明の溶液は、精製の結果、完全長ＶＰ１サブユニットのあるＶＬＰのレベル上昇を示すことができる。

[0038] ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法は、上記ＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は濾液を生成するか又は得ることを含む。方法は、ｐＨ調整済み溶液を生成するために、可溶化物、上清又は濾液のｐＨを約５未満のｐＨ値に調整することも含む。方法は、精製済み溶液を生成するために、ＶＬＰを含有するｐＨ調整済み溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体を除去することも含む。

[0039] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰの産生は、少なくともＶＬＰの第一亜集団及び第二亜集団、さらに他のプロセス汚染物質材料を含む細胞可溶化物、培養上清、又は濾液を生成する。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液は大量産生培養であるか、又は大量産生培養から生成される。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液は、濾過及び／又は遠心分離によって事前除去されている培養上清から得られる。

[0040] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰの亜集団は、ｐＨ処理に対する様々な応答に基づき、誘発される抗原応答に基づき、及び／又は構造的差異に基づいて特徴付けられる。したがって、ウイルスに応じて、ＶＬＰの２つを超える亜集団が存在できることが想像される。幾つかの実施形態では、生成されたＶＬＰはノロウイルスＶＬＰであり、第一亜集団は完全長ＶＰ１サブユニットのあるノロウイルスＶＬＰを含み、第二亜集団は切断型ＶＰ１サブユニットを有するノロウイルスＶＬＰを含む。幾つかの実施形態では、ノロウイルスＶＬＰはノロウイルス遺伝子群Ｉ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＩＩ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＶ型ＶＬＰ、及びノロウイルス遺伝子群Ｖ型ＶＬＰのうち１つ又は複数である。幾つかの実施形態では、ＶＬＰは酸安定性ＶＬＰである。

[0041] 本発明の方法は、プロセス汚染物質及び異常形成されたＶＬＰ様構造からＶＬＰを分離するために、可溶化物、上清又は濾液のｐＨを調整することを含む。プロセス汚染物質は、多糖類、宿主細胞タンパク質などの残留汚染タンパク質、宿主細胞核酸などの残留汚染核酸、脂質、媒質成分、生宿主細胞ウイルス（例えばバキュロウイルス）などの生感染性因子など、さらに以上の汚染物質のいずれかの集合体又は凝集体を含むことができるが、これらに限定されない。異常形成されるＶＬＰ様構造は、環境条件（例えばｐＨ処理又は温度）、誘発される抗原応答、構造的差異、分離プロフィール（例えばクロマトグラフィ、沈殿、又は濾過）などに基づいて所望のＶＬＰ構造から識別可能である任意のＶＬＰ構造とすることができる。

[0042] 幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液のｐＨは、ｐＨ調整済み溶液を生成するために、約５未満に調整される。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液のｐＨは、約４．５未満に、約４未満に、約３．５未満に、約３．４未満に、約３．３未満に、約３．２未満に、約３．１未満に、約３未満に、約２．９未満に、約２．８未満に、約２．７未満に、約２．６未満に、約２．５未満に、約２未満に、約１．５未満に、約１未満に、及びその間のすべての範囲／部分範囲に調整される。

[0043] 可溶化物、上清又は濾液のｐＨは、当業者に知られている任意の方法で調整することができる。幾つかの実施形態では、ｐＨは、酸性化をもたらす１つ又は複数の試薬を可溶化物、上清又は濾液に添加することによって調整される。例示的な酸性化試薬には塩酸、酢酸、硫酸、及びリン酸を含めることができる。添加試薬のｐＨ、体積、及び組成物は、当技術分野で知られているように適切に選択することができる。

[0044] 幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液のｐＨ調整及び／又は処理の継続時間は、約３０分である。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液のｐＨ調整及び／又は処理の継続時間は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、及びその間のすべての範囲／部分範囲である。

[0045] 幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液は、上記説明したようにＶＬＰの第一亜集団及び第二亜集団を含み、可溶化物、上清又は濾液の調整は、第一及び第二亜集団の不均質分布をもたらす。幾つかの実施形態では、ｐＨ処理は、ｐＨ調整済み溶液中の微粒子及び／又は凝集体形成をもたらし、ＶＬＰの第二亜集団は実質的に、その結果である微粒子／凝集体中に見られ、ＶＬＰの第一亜集団はｐＨ調整済み溶液のボリューム中に残る。幾つかの実施形態では、本明細書で精製したノロウイルス遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰで例示されるように、完全長ＶＰ１タンパク質があるＶＬＰを含む第一亜集団とは対照的に、第二亜集団は、切断型ＶＰ１タンパク質を含有するＶＬＰを含む。

[0046] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰを精製する方法は、精製溶液を生成するために、ｐＨ調整済み溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体を除去することをさらに含む。幾つかの実施形態では、除去は以下のプロセス、すなわち、遠心分離、析出、凝集、沈降、及び濾過のうち１つ又は複数を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、分離は、少なくとも微粒子／凝集体を除去する遠心分離を伴う。

[0047] 幾つかの実施形態では、非ＶＬＰ微粒子／凝集体の除去は、精製溶液を生成するためにｐＨ調整済み溶液からＶＬＰの第二亜集団を分離することを含み、精製溶液は実質的にＶＬＰの第一亜集団を保持する。すなわち、微粒子／凝集体はＶＬＰの第二亜集団を含む。この方法で、回収プロセスの早期段階で、すなわち、培養浄化中に、ＶＬＰの望ましくない亜集団の選択的除去を達成することができる。

[0048] 幾つかの実施形態では、除去／浄化は１つ又は複数の濾過プロセスによって実行される。適切な濾過にはデプス濾過、膜濾過、化学的濾過などが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの濾過プロセスは１つ又は複数のデプスフィルタを使用するデプス濾過である。デプス濾過は、多孔性フィルタ／濾過媒質を採用した任意の濾過プロセスを指すことができる。適切なデプスフィルタは珪藻土デプスフィルタ、合成デプスフィルタなどを含むが、これらに限定されない。デプス濾過を使用することの利点には、操作の容易さ、及び使い捨て材料の使用可能性があり、これによって再使用した機器に必要なクリーニングを確認する必要がなくなる。幾つかの実施形態では、ミクロン未満のフィルタを使用することなどの１つ又は複数の追加の濾過プロセスも任意選択で採用することができる。

[0049] 幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの第一亜集団の比率は、この工程後に少なくとも約２倍増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの第一亜集団の比率は、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、及びその間のすべての値に増加している。

[0050] 幾つかの実施形態では、濾過後、残留汚染核酸の少なくとも約５０％が可溶化物、上清又は濾液から除去される。「残留汚染核酸」という用語は、宿主細胞核酸、宿主細胞ウイルスの核酸、産生ウイルス（すなわち、ＶＬＰの産生に使用される）の核酸などを含むことができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾過から残留汚染核酸は少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、及びその間のすべての値だけ除去される。

[0051] 概して、規定された加工工程後のＶＬＰの精製程度は、（可溶化物、上清又は濾液に対して）任意の他の成分の濃度に対するＶＬＰの濃度の比率の変化によって測定することができる。例えば、比率はＶＬＰ濃度と感染性因子の濃度の間、ＶＬＰ濃度と残留汚染タンパク質の間、及び／又はＶＬＰ濃度と宿主細胞プロセス汚染物質の間で計算することができる。

[0052] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰの精製は、ｐＨ調製済み溶液からＶＬＰの第二亜集団を除去した後、精製済み溶液からＶＬＰの第一集団を分離することも含む。幾つかの実施形態では、精製済み溶液からＶＬＰの第一集団を分離することには、例えば遠心分離（例えば連続流）、析出、相分離、タンジェント流路か、バッファ交換法などの任意の適切な分離プロセスが含まれる。幾つかの実施形態では、精製済み溶液からＶＬＰの第一集団を分離することには、１つ又は複数のクロマトグラフィプロセスを使用することが含まれる。各クロマトグラフィプロセスは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ及びアフィニティクロマトグラフィから個別に選択することができるが、これらに限定されない。イオン交換クロマトグラフィは、アニオン交換クロマトグラフィ又はカチオン交換クロマトグラフィとすることができる。

[0053] 幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの第一亜集団の比率は、この工程後、少なくとも約２倍増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの第一亜集団の比率は、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、及びその間のすべての値だけ増加している。幾つかの実施形態では、この工程後、残留汚染核酸の少なくとも約５０％が可溶化物、上清又は濾液から除去される。「残留汚染核酸」という用語は、宿主細胞核酸、産生ウイルスの核酸、ウイルス核酸、細菌核酸、真菌核酸、本明細書で述べたシステム及び方法に関連しても関連していなくてもよい他の生物からの核酸などを含むことができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、可溶化物、上清又は濾液から残留汚染核酸が少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％。少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、及びその間のすべての値だけ除去される。

[0054] 本発明の発明者は、ＶＬＰ調製品から生きたウイルス感染性因子（例えばバキュロウイルス）を精製するために、溶媒及び／又は洗浄剤処理工程が有用であることも発見した。上述したように、溶媒及び／又は洗浄剤は、クロマトグラフィカラムと接触する前にＶＬＰ調製品に添加することができ、及び／又はクロマトグラフィカラムと接触する前に大量溶液に添加することができ、及び／又はＶＬＰ調製品と接触した後にクロマトグラフィカラムに添加することができる。このように、本明細書では単純さを期してオンカラム溶媒／洗浄剤に関して述べているが、これらの可能性はそれぞれ本明細書の範囲に入ることが理解される。このような実施形態では、本発明の方法は、ＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は濾液を生成するか又は得ることと、多工程クロマトグラフィプロセスを使用してＶＬＰを精製することとを含む。多工程クロマトグラフィプロセスの少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、可溶化物、上清又は濾液をクロマトグラフィ材料と接触させることを含み、 ＶＬＰが上記クロマトグラフィ材料に結合する。少なくとも１つのこのクロマトグラフィプロセスは、溶媒及び／又は洗浄剤でクロマトグラフィ材料を処理することも含む。少なくとも１つのこのクロマトグラフィプロセスは、処理後にクロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出することをさらに含む。

[0055] 幾つかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、溶媒及び／又は洗浄剤でクロマトグラフィ材料を処理することも含む。幾つかの実施形態では、クロマトグラフィ材料はクロマトグラフィカラムであり、処理は溶媒及び／又は洗浄剤でのオンカラム処理又は洗浄を含む。任意の適切な溶媒及び／又は洗浄剤を使用することができる。幾つかの実施形態では、溶媒は有機溶媒であり、以下のうち１つ又は複数を含むが、これらに限定されない。すなわち、リン酸トリブチル（ＴｎＢＰ）である。幾つかの実施形態では、洗浄剤は以下のうち１つ又は複数を含むが、これらに限定されない。すなわち、Triton X-100、オクチルフェノールエチレンオキシド凝縮液、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びコール酸ナトリウム、及びその様々な組み合わせである。例示的組成物には非イオン洗浄剤（Triton X-100及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンなど）、双性イオン洗浄剤（CHAPS及びZwittergent 3-12など）、及びイオン洗浄剤（コール酸ナトリウム及びホウ酸ジメチルジオクタデシルアンモニウムなど）がある。

[0056] 幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤は少なくとも約０．０１％の洗浄剤（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％の洗浄剤（ｗ／ｖ）、及びその間のすべての値を含む。幾つかの実施形態では、溶媒及び／洗浄剤は少なくとも約０．０１％の溶媒（ｗ／ｖ）、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％の溶媒（ｗ／ｖ）、及びその間のすべての値を含む。幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤は追加的に、一般的に使用されている生物学的緩衝剤（例えば酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、トリスなど）及び／又は塩（例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなど）を含む。

[0057] 幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤での処理の継続時間は約１０分である。幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤での処理の継続時間は約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、及びその間のすべての範囲／部分範囲である。

[0058] 幾つかの実施形態では、細胞可溶化物又は培養上清／濾液は、上記説明したように遺伝子組換え法を使用して生成される。幾つかの実施形態では、ＶＬＰは以下のうち１つ又は複数の中で産生される。すなわち、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物、又は哺乳類細胞である。幾つかの実施形態では、ＶＬＰはノロウイルス遺伝子群Ｉ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰ及び／又はノロウイルス遺伝子群ＩＶ型ＶＬＰである。

[0059] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰを精製することは、多工程クロマトグラフィプロセスを使用してＶＬＰを精製することを含む。各クロマトグラフィプロセスは上記列挙されたように個別に選択される。幾つかの実施形態では、多工程クロマトグラフィプロセスの第一クロマトグラフィプロセスは、カチオン交換クロマトグラフィであり、１つ又は複数のその後のクロマトグラフィプロセスも使用することができる。

[0060] 幾つかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、可溶化物、上清又は濾液をクロマトグラフィ材料と接触させることを含み、ＶＬＰが上記クロマトグラフィ材料に結合する。使用されるクロマトグラフィ材料は、採用される特定のクロマトグラフィプロセスによって決定され、カチオン交換カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、疎水性相互作用カラム、サイズ排除カラム、アニオン交換カラム、混合モードカラム、又は親和カラムなどを含んでよいが、これらに限定されない。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスがカチオン交換クロマトグラフィである場合、クロマトグラフィ材料はカチオン交換カラム又は膜である。

[0061] 幾つかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、オンカラム処理後に、クロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出することも含む。溶出メカニズムは、クロマトグラフィプロセスの選択肢、使用される溶媒及び／又は洗浄剤、ＶＬＰ／クロマトグラフィ基質と溶出液との相互作用などを含むが、これらに限定されない実験要素によって決定されることがある。溶出は、当技術分野で知られているように、任意の適切且つ一般的に使用されている生物学的緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、トリス）及び塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム）でクロマトグラフィシステムのｐＨ及び／又はイオン強度を調整することによって実行することができる。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスはカチオン交換クロマトグラフィであり、溶出はカチオン交換カラムを酢酸塩で洗浄することによって実行される。別の実施形態では、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィであり、溶出は、ヒドロキシアパタイトカラムをリン酸ナトリウムで洗浄することによって実行される。

[0062] 幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、溶媒及び／又は洗浄剤処理を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスの後、可溶化物、上清又は濾液と比較して約２倍増加している。「残留汚染タンパク質」という用語は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ウイルスからのタンパク質成分、産生ウイルスの核酸、ウイルスの核酸、細菌の核酸、真菌の核酸、産生系に関係しても関係しなくてもよい他の生物の核酸などを含むことができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍、及びその間のすべての値に増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、多工程クロマトグラフィプロセスの後、約２倍増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、約３倍、約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、及びその間のすべての値に増加している。

[0063] 幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤処理を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスの後、残留汚染タンパク質の少なくとも約３０％が可溶化物、上清又は濾液から除去される。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質の少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、及びその間のすべての値が、可溶化物、上清又は濾液から除去される。

[0064] 幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤処理を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスの後、可溶化物、上清、又は濾液中のＶＬＰはいずれも失われていない。幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤処理を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスの後、可溶化物、上清又は濾液の約１％以下、約２％以下、約３％以下、約４％以下、約５％以下、約６％以下、約７％以下、約８％以下、約９％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、及びその間のすべての値が失われる。

[0065] 幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤処理を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスの後、可溶化物、上清又は濾液からのＶＬＰの回収率は約１００％である。幾つかの実施形態では、溶媒及び／又は洗浄剤処理を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスの後、可溶化物、上清又は濾液からＶＬＰの少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、及びその間のすべての値が回収される。

[0066] 幾つかの実施形態では、本明細書で述べる本発明の方法は、生きたウイルスを含有し、生きたウイルスによって生成されたＶＬＰをさらに含有する溶液中の生きたウイルスを除去及び／又は不活性化することも提供し、方法は、ｐＨ調整済み溶液を生成するために、生きたウイルスを含有する溶液のｐＨを約５未満のｐＨ値に調整することを含む。生きたウイルスは、生宿主細胞ウイルス、産生ウイルス（例えばバキュロウイルス）、産生系に関連しても関連していなくてもよい汚染ウイルスなどでよいが、これらに限定されない。ＶＬＰは、遺伝子群Ｉ型ＶＬＰ及び／又は遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰでよいが、これらに限定されない。

[0067] 幾つかの実施形態では、ｐＨ調整済み溶液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液より少なくとも約１０倍低い。幾つかの実施形態では、ｐＨ調整済み溶液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液より少なくとも約１００倍、少なくとも約１０^３倍、少なくとも約１０^４倍、少なくとも約１０^５倍、少なくとも約１０^６倍、少なくとも約１０^７倍、少なくとも約１０^８倍、少なくとも約１０^９倍、少なくとも約１０^１０倍、及びその間のすべての値だけ低い。

[0068] 幾つかの実施形態では、非ＶＬＰ微粒子／凝集体をｐＨ調整済み溶液から除去して、精製済み溶液を生成することができ、次にそれを少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスで処理することができる。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、精製済み溶液をクロマトグラフィ材料と接触させることを含むことができ、ＶＬＰがクロマトグラフィ材料に結合し、さらに溶媒及び／又は洗浄剤でクロマトグラフィ材料を処理することができる。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、処理後にクロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出して溶出液を生成することも含むことができる。幾つかの実施形態では、溶出液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液と比較して、少なくとも約１０^２倍低下する。幾つかの実施形態では、溶出液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液と比較して、少なくとも約１０^３倍、少なくとも約１０^４倍、少なくとも約１０^５倍、少なくとも約１０^６倍、少なくとも約１０^７倍、少なくとも約１０^８倍、少なくとも約１０^９倍、少なくとも約１０^１０倍、少なくとも約１０^１１倍、少なくとも約１０^１２倍、少なくとも約１０^１３倍、少なくとも約１０^１４倍、少なくとも約１０^１５倍、少なくとも約１０^１６倍、及びその間のすべての値だけ低下する。

[0069] 幾つかの実施形態では、本明細書で述べる本発明の方法は、生きたウイルスを含有し、生きたウイルスによって生成されたＶＬＰをさらに含有する溶液中の生きたウイルスを除去及び／又は不活性化することも提供し、方法は、少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスを使用して、生きたウイルスを含有する溶液を精製することを含む。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、溶液をクロマトグラフィ材料と接触させることを含むことができ、ＶＬＰがクロマトグラフィ材料に結合し、さらに溶媒及び／又は洗浄剤でクロマトグラフィ材料を処理することを含むことができる。少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスは、処理後に、溶出液を生成するために、クロマトグラフィ材料からＶＬＰを溶出することも含むことができる。幾つかの実施形態では、溶出液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液と比較して、少なくとも約１０倍低下している。幾つかの実施形態では、溶出液中の生きたウイルスのレベルは、生きたウイルスを含有する溶液と比較して、少なくとも約１０^２倍、少なくとも約１０^３倍、少なくとも約１０^４倍、少なくとも約１０^５倍、少なくとも約１０^６倍、少なくとも約１０^７倍、少なくとも約１０^８倍、少なくとも約１０^９倍、少なくとも約１０^１０倍、及びその間のすべての値だけ低下する。

[0070] 幾つかの実施形態では、さらに、プロセス汚染物質及び／又はＶＬＰの２次亜集団を除去する低ｐＨ処理工程及び濾過プロセス／工程、さらに生きたウイルスの感染性因子を不活性化するオンカラム溶媒及び／又は洗浄剤処理を伴う少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスを使用して、ＶＬＰを含有する可溶化物、上清又は濾液からウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製するためにも操作可能である。幾つかの実施形態では、第一亜集団は完全長ＶＰ１サブユニットを有するノロウイルスＶＬＰを含み、第二亜集団は切断型ＶＰ１サブユニットを有するノロウイルスＶＬＰを含む。可溶化物、上清又は濾液は、上述したように任意の適切な手段によって生成される。

[0071] 可溶化物、上清又は濾液のｐＨの調整は、ｐＨ値の状態（例えば約５未満）、処理の継続時間（例えば約３０分）などを含め、既に述べたものと同様の方法で実行される。ｐＨ処理の結果、ｐＨ調整済み溶液のボリューム中にＶＬＰの第一亜集団が残る一方、ＶＬＰの第二亜集団を含有する微粒子及び／又は凝集体が形成される。

[0072] 濾過プロセスは、既に述べたものと同様の方法で実行され、デプス濾過プロセスでよい。濾過工程の結果、ＶＬＰの第二亜集団、さらに残留汚染核酸などのプロセス汚染物質を含有する微粒子／凝集体が除去されて、濾過された精製済み溶液が生成され、ＶＬＰの第一亜集団は濾過された精製済み溶液のボリューム中に残る。

[0073] この実施形態では、ｐＨ処理工程及び濾過工程は多工程クロマトグラフィプロセスの前に実行され、ＶＬＰの精製は、多工程クロマトグラフィプロセスを使用して、濾過済み精製済み溶液からＶＬＰの第一亜集団を分離することを含み、多工程クロマトグラフィプロセスの各クロマトグラフィプロセスは、上述したように個別に選択される。ＶＬＰの第一亜集団はクロマトグラフィ材料／カラムに結合し、これが溶媒及び／又は洗浄剤で処理される。上記列挙したように、任意の適切な溶媒及び／又は洗浄剤を使用することができる。次に、ＶＬＰの第一亜集団をクロマトグラフィ材料から溶出する。

[0074] 幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、低ｐＨ処理、及び少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスの後、約２倍に増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、約３倍、約４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、及びその間のすべての値に増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、低ｐＨ処理及び多工程クロマトグラフィプロセスの後、約２倍増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの比率は、約３倍、約４倍、約５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、及びその間のすべての値に増加している。

[0075] 幾つかの実施形態では、本発明はさらに、プロセス汚染物質及び／又は望ましくないＶＬＰの亜集団、例えばＶＬＰの第二亜集団を除去するために、低ｐＨ処理工程及びデプス濾過プロセス／工程を使用してＶＬＰを精製するように操作可能である。ｐＨ処理工程は上述したように実行することができる。

[0076] デプス濾過プロセスは、濾過済み精製済み溶液を生成するために、ｐＨ調整済み溶液を１つ又は複数のデプスフィルタと接触させることを含むことができる。１つ又は複数のデプスフィルタは、加工ボリューム、微粒子の負荷又は荷重、産生物の回収率、最終混濁度、フィルタ容量などの任意の産生要素に基づいて、精製システム用に適切に選択することができる。幾つかの実施形態では、デプスフィルタの少なくとも１つは珪藻土デプスフィルタである。幾つかの実施形態では、デプスフィルタの幾つかは、珪藻土デプスフィルタであり、それぞれが約５０リットル／ｍ^２、約１００リットル／ｍ^２、約２００リットル／ｍ^２、約３００リットル／ｍ^２、約４００リットル／ｍ^２、約５００リットル／ｍ^２、約６００リットル／ｍ^２、約７００リットル／ｍ^２、約８００リットル／ｍ^２、約９００リットル／ｍ^２、約１０００リットル／ｍ^２、及びその間のすべての値から個別に選択されたフィルタ容量を有する。幾つかの実施形態では、約１５０リットル／ｍ^２、約２００リットル／ｍ^２、約２５０リットル／ｍ^２、約３００リットル／ｍ^２、約３５０リットル／ｍ^２、約４００リットル／ｍ^２、及びその間のすべての値から選択されたフィルタ容量を有する単一のデプスフィルタを使用する。使用可能な例示的デプスフィルタは、Millistak+HCポッドフィルタである。

[0077] 幾つかの実施形態では、細胞可溶化物又は培養上清／濾液と比較して、残留汚染核酸の少なくとも約５０％が、デプス濾過プロセスによってｐＨ調整済み溶液から除去される。幾つかの実施形態では、細胞可溶化物又は培養上清／濾液と比較して、残留汚染核酸の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、及びその間のすべての値が、デプス濾過プロセスによってｐＨ調整済み溶液から除去される。

[0078] 幾つかの実施形態では、細胞可溶化物又は培養上清／濾液と比較して、デプス濾過プロセスによるｐＨ調整済み溶液からのＶＬＰの回収率は約１００％である。幾つかの実施形態では、細胞可溶化物又は培養上清／濾液と比較して、デプス濾過プロセスによるｐＨ調整済み溶液からのＶＬＰの回収率は少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、及びその間のすべての値である。

[0079] 幾つかの実施形態では、回収されるＶＬＰはＶＬＰの第一集団である。幾つかの実施形態では、１つ又は複数のクロマトグラフィプロセスを使用して、上述したようにデプス濾過済み精製済み溶液からＶＬＰの第一亜集団を分離することができる。

[0080] 幾つかの実施形態では、本発明の態様はさらに、サイズ排除クロマトグラフィ及びＥＬＩＳＡで測定した状態で、ＶＬＰに対して８０％以下の残留汚染タンパク質を含有するノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液を提供するように操作可能である。ノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液は、上述したように細胞可溶化物、培養上清、又は濾液から、又は上述したように、ｐＨ調整済み溶液、デプス濾過済み溶液などのような任意の他の溶液から生成することができる。幾つかの実施形態では、ノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液は、ノロウイルスＶＬＰを含有する可溶化物、上清、又は濾液の溶液を精製することによって得られる。幾つかの実施形態では、ノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液は、以下のプロセスのうち１つ又は複数によって生成される。すなわち、ｐＨ処理、遠心分離、析出、凝集、沈降、濾過、及びクロマトグラフィである。幾つかの実施形態では、ノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液は、上述したように、ｐＨ処理工程及び濾過工程、その後の多工程クロマトグラフィプロセスなどによって、任意の処理済み／未処理溶液から生成される。

[0081] 幾つかの実施形態では、ノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液は、細胞可溶化物又は培養上清／濾液と比較の溶液と比較して、残留汚染核酸を含有していない。幾つかの実施形態では、ノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液は、細胞可溶化物又は培養上清／濾液に対して、約１％以下、約２％以下、約３％以下、約４％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、及びその間のすべての値の残留汚染核酸を含有する。

[0082] 幾つかの実施形態では、溶液は元の可溶化物、上清、又は濾液からのノロウイルスＶＬＰの約１００％を含有する。幾つかの実施形態では、溶液は、元の可溶化物、上清、又は濾液からのノロウイルスＶＬＰの約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、及びその間のすべての値を含有する。

[0083] 幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するノロウイルスＶＬＰの比率は、元の可溶化物、上清、又は濾液と比較して少なくとも約５０倍増加している。幾つかの実施形態では、残留汚染タンパク質に対するノロウイルスＶＬＰの比率は、元の可溶化物、上清、又は濾液と比較して、少なくとも約４５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約３倍、少なくとも約２倍、及びその間のすべての値に増加している。

[0084] 幾つかの実施形態では、ワクチンの臨床及び大規模製造などの商業プロセスに、ノロウイルスＶＬＰの精製済み集団の溶液を採用することができる。幾つかの実施形態では、臨床及び大規模製造プロセスに関連するプロセス体積は、わずか２０リットルでもよい。例えば幾つかの実施形態では、ノロウイルスＶＬＰを含む溶液からワクチンを調製することができる。

[0085] 幾つかの実施形態では、本発明の態様はさらに、ＶＬＰの精製済み集団を有する溶液を提供するように操作可能であり、上記溶液は完全長ＶＰ１サブユニットを有する少なくとも約５０％のＶＬＰを含有する。幾つかの実施形態では、ＶＬＰの精製済み集団を有する溶液は、完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、及びその間のすべての値だけ含有する。言い換えると、ＶＬＰの精製済み集団を有する溶液は、切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰが実質的になくてもよい。幾つかの実施形態では、ＶＬＰの精製済み集団を有する溶液は、切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを最大約５％、最大約１０％、最大約１５％、最大約２０％、最大約２５％、最大約３０％、最大約３５％、最大約４０％、最大約４５％、最大約５０％、及びその間のすべての値だけ含有する。

[0086] 幾つかの実施形態では、ＶＬＰの精製済み集団を有する溶液は、切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを少なくとも約５％含有する未精製溶液から生成することができる。幾つかの実施形態では、未精製溶液は、切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、及びその間のすべての値だけ含有することができる。

[0087] 未精製溶液は、細胞可溶化物、培養上清、濾液、ｐＨ調整済み溶液などの任意の処理済み／未処理溶液でよい。幾つかの実施形態では、ＶＬＰの精製済み集団を有する溶液は、上述したように、ｐＨ処理工程、及びｐＨ処理から切断型ＶＰ１サブユニットを除去することによって、未精製溶液から生成される。除去は、遠心分離、析出、凝集、沈殿、濾過などのうち１つ又は複数によって実行することができる。幾つかの実施形態では、完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰの精製済み集団は、ＶＬＰの精製済み集団を有する溶液に１つ又は複数のクロマトグラフィプロセスを適用することによって生成することができる。

[0088] これらの実施形態のいずれかによって産生された精製済みＶＬＰには、生きたウイルスの感染性因子が実質的にないので有利である。感染性因子がないと言うのは、生宿主細胞ウイルス自体のように感染することができる活性因子が存在しないことを指すことがある。すなわち、精製済みＶＬＰは、不活性で感染することができない因子を含有することがある。例示により、バキュロウイルスがもはや感染できないように処理されているバキュロウイルスを含有する試料は、試料がなお不活性化したバキュロウイルスを含有していても、感染性因子がないことになる。さらに、試料は、感染することができる活性因子が絶対的にない状態である必要はなく、むしろ試料は、適宜ヒト又は動物ワクチンとして意図された目的に使用できる（すなわち、適宜ヒト又は動物のワクチンにおける感染性因子の許容可能なレベルに適用される任意の米国連邦法規に適合する）ように、活性因子が十分に少ない状態であればよい。

[0089] 本発明の方法は、臨床及び商業的製造のためにＶＬＰの産生を拡大する方法として特に有用である。低ｐＨ処理及び／又はオンカラム溶媒及び／又は洗浄剤処理工程を組み込んだ精製法の結果、開始培養１Ｌ当たり精製済みＶＬＰが少なくとも約５０〜２５０ｍｇ、精製済みＶＬＰが少なくとも約２００〜４００ｍｇ／Ｌ、精製済みＶＬＰが少なくとも約３５０〜５００ｍｇ／Ｌ、精製済みＶＬＰが少なくとも約４００〜７５０ｍｇ／Ｌ、精製済みＶＬＰが少なくとも約７００〜８５０ｍｇ／Ｌ、精製済みＶＬＰが少なくとも約８００〜１０００ｍｇ／Ｌ、及びその間のすべての範囲及び部分範囲になる。産生されるＶＬＰには、プロセス汚染物質及び異常ＶＬＰ構造が実質的にない。この場合、実質的にない、とは、当業者に認識できるように、すべてのプロセス汚染物質及び異常ＶＬＰ構造を除去するように意図することができるが、本明細書で述べる手順に関連する実際的態様の結果、最終的組成物から汚染物質及び異常ＶＬＰ構造を完全には消去しないことがあるが、それでも意図された目的に使用できるという意味である。

[0090] 本発明の実施形態はさらに、上記方法によって精製されたＶＬＰの第一亜集団を含むワクチンを含むように操作可能である。通常、このようなワクチンは溶液又は懸濁液として注射可能物質として調製し、注射前に液体中の溶液又は懸濁液に適切な固体形態として調製することもできる。このような製剤は、乳化するか固体粉末として生産することもできる。活性の免疫原性成分を、薬学的に許容可能で活性成分と適合性のある賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせである。

[0091] また、所望に応じて、ワクチンは湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチンの有効性を強化するアジュバントなどの補助物質を含有することができる。幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は精製済みＶＬＰと組み合わせた１つ又は複数のアジュバントを含む。大部分のアジュバントは、水酸化アルミニウム又は鉱物油などの急速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質、及び百日咳菌又は結核菌由来のタンパク質などの免疫応答の刺激物質を含有する。適切なアジュバントは、例えばFreund's Incomplete Adjuvant及びComplete Adjuvant（Pifco Laboratories、ミシガン州デトロイト）；Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc.、ニュージャージー州ローウェイ）；水酸化アルミニウムゲル（明礬）又はリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄又は亜鉛の塩；アシル化チロシン、アシル化糖の不溶性懸濁物；カチオン又はアニオン誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；及びクイルＡとして販売されている。

[0092] 適切なアジュバントにはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、特にＴｏｌｌ様受容体タイプ４（ＴＬＲ−４）アゴニスト（例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣体又は類似体）、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖類（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ビロソーム、渦巻形、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、水中油型エマルジョン、ＭＦ５９、及びスクアレンも含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、アジュバントは細菌由来の外毒素ではない。好ましいアジュバントには、３ＤＭＰＬ又はＱＳ２１などのＴｈ１型応答を刺激するアジュバントが含まれる。

[0093] モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、すなわち、サルモネラからのリピドＡの非毒性誘導体は、ワクチンアジュバントとして開発されてきた強力ＴＬＲ−４アゴニストである（Evans他、２００３）。マウスの臨床前試験では、鼻腔内ＭＰＬが分泌、さらに体液の全身応答を向上させることが示されている（Baldridge他、２０００；Yang他、２００２）。１２０，０００人を超える患者の臨床試験で、ワクチンアジュバントとして安全で有効であることも証明されている（Baldrick他、２００２；Baldridge他、２００４）。ＭＰＬはＴＬＲ−４受容体を通して先天性免疫の誘導を刺激し、したがってグラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方、ウイルス、及び寄生生物などの広範囲の感染性病原体に対する非特異的免疫応答を誘発することができる（Baldridge他、２００４；Persing他、２００２）。ワクチン製剤にＭＰＬを含めると、ワクチンの抗原成分によって生じた特異的応答を向上させながら、先天性応答を迅速に誘導し、ウイルス攻撃から非特異的免疫応答を誘発するであろう。

[0094] 幾つかの実施形態では、本発明は適応免疫及び先天性免疫のエンハンサとしてモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）又は３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）を含むワクチンを提供する。化学的に、３Ｄ−ＭＰＬは３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５又は６個のアシル鎖との混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態が、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第０６８９４５４Ｂ１号（SmithKline Beecham Biologicals SA）に開示されている。別の実施形態では、本発明は合成リピドＡ、リピドＡ模倣体又は類似体、例えばBioMiraのＰＥＴリピドＡ、又はＴＬＲ−４アゴニストのように機能すべく設計された合成誘導体を含むワクチン組成物を提供する。

[0095] 特定の実施形態では、ワクチン組成物は２つのアジュバントを含む。アジュバントの組み合わせは上記から選択することができる。１つの特定の実施形態では、２つのアジュバントはＭＰＬ及び水酸化アルミニウム（例えば明礬）である。別の特定の実施形態では、２つのアジュバントはＭＰＬ及び油である。

[0096] 「有効アジュバント量」又は「アジュバントの有効量」という用語は、当業者に十分理解されており、鼻洗浄でのＩｇＡ、血清ＩｇＧ又はＩｇＭレベル、又はＢ及びＴ細胞増殖に関して測定した場合の、投与された抗原に対する免疫応答を刺激することができる１つ又は複数のアジュバントの量、すなわち、投与された抗原組成物の免疫応答を増大させる量を含む。免疫グロブリンレベルの適切に効果的な増加は、アジュバントが全くない同じ抗原組成物と比較して、５％超、好ましくは２５％超、特に５０％超を含む。

[0097] 一実施形態では、本発明は非経口投与用に調合されたワクチン組成物を提供し、組成物は水酸化アルミニウム及び緩衝剤と組み合わせた精製済みＶＬＰを含む。緩衝剤は、Ｌ−ヒスチジン、イミダゾール、コハク酸、トリス、クエン酸、ビストリス、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、グリシンアミド、及びトリシンからなる群から選択することができる。一実施形態では、緩衝剤はＬ−ヒスチジン又はイミダゾールである。好ましくは、緩衝剤は約１５ｍＭ〜約５０ｍＭ、さらに好ましくは約１８ｍＭ〜約４０ｍＭ、又は最も好ましくは約２０ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で存在する。幾つかの実施形態では、抗原又はワクチン組成物のｐＨは約６．０〜約７．０、又は約６．２〜約６．８、又は約６．５である。ワクチン組成物は水性製剤とすることができる。

[0098] 幾つかの実施形態では、ワクチン組成物はＶＬＰ、水酸化アルミニウム、及び緩衝剤に加えて、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。例えば、アジュバントはＭＰＬ、フラジェリン、ＣｐＧオリゴ、合成リピドＡ、又はリピドＡ模倣体又は類似体などのＴｏｌｌ様受容体アゴニストでよい。幾つかの実施形態では、アジュバントはＭＰＬである。

[0099] 一実施形態では、本発明のワクチンは、免疫原としての１つ又は複数の精製済みＶＬＰ抗原、ＭＰＬなどのアジュバント、粘膜表面への付着を促進するキトサンなどのバイオポリマー、及びマンニトール及びスクロースなどの充填剤を含有する乾燥粉末として調合することができる。無エンベロープウイルスの非限定的例としてノロウイルスを使用すると、ノロウイルスワクチンは、１つ又は複数のノロウイルス遺伝子群抗原（例えばノーウォークウイルス、ヒューストンウイルス、スノーマウンテンウイルス）、ＭＰＬアジュバント、キトサン粘膜接着剤、及び充填剤として適切な流れ特性を提供するマンニトール及びスクロース（又はデキストロース、ラクトース、トレハロース及びグリセロールなどの他の糖類）を含有する１０ｍｇの乾燥粉末として調合することができる。製剤は、約７．０ｍｇ（２５〜９０％ｗ／ｗ範囲）のキトサン、約１．５ｍｇのマンニトール（０〜５０％ｗ／ｗ範囲）、約１．５ｍｇのスクロース（０〜５０％ｗ／ｗ範囲）、約２５μｇのＭＰＬ（０．１〜５％ｗ／ｗ範囲）、及び約１００μｇのノロウイルス抗原（０．０５〜５％ｗ／ｗ範囲）を含むことができる。

[00100] 上述したノロウイルスワクチン製剤を続けると、ノロウイルス抗原は、約０．０１％（ｗ／ｗ）〜約８０％（ｗ／ｗ）の濃度でワクチン中に存在することができる。幾つかの実施形態では、ノロウイルス抗原は、両方の鼻孔に投与するには１０ｍｇの乾燥粉末製剤毎に約５μｇ、約１５μｇ、及び約５０μｇ（０．０２５、０．０７５及び０．２５％）、又は一方の鼻孔に投与するには約１０μｇ、約３０μｇ、及び約１００μｇ（０．１、０．３及び１．０％ｗ／ｗ）の用量で調合することができる。製剤は、各投与中に一方又は両方の鼻孔に投与することができる。免疫応答を改善するために、最初の投与から１〜１２週間後に、ブースタ投与することができる。ワクチン及び抗原製剤中のノロウイルス抗原の含有量は、１μｇ〜１００ｍｇの範囲、好ましくは１〜５００μｇの範囲、さらに好ましくは５〜２００μｇ、最も一般的には１０〜１００μｇの範囲とすることができる。各投与量で投与されるノロウイルス抗原の合計は、両方の鼻孔に投与する場合は合計２０ｍｇの乾燥粉末中に、又は一方の鼻孔に投与する場合は１０ｍｇの乾燥粉末中に、約１０μｇ、約３０μｇ、又は約１００μｇとすることができる。乾燥粉末は、粒子の１０％未満が直径１０μｍ未満となるような特徴である。平均粒子サイズは、直径１０〜５００μｍの範囲である。

[0100] 幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は凍結乾燥した粉末であり、水性製剤に再構成する。それ故に、本発明は、精製済みノロウイルス組成物を作製する方法であって、（ａ）ノロウイルス抗原、スクロース、及びキトサンを含む事前凍結乾燥溶液を調製することを含み、キトサンに対するスクロースの比率が約０：１〜約１０：１であり、さらに（ｂ）溶液を冷凍することと、（ｃ）冷凍した溶液を３０〜７２時間凍結乾燥することとを含み、最終的凍結乾燥産物が凝集した形態であるパーセンテージの上記ノロウイルス抗原を含有する方法を含む。凍結乾燥は周囲温度又は低温で実行するか、様々な温度で循環して進行することができる。例示のみを目的として、凍結乾燥は一連の工程で、例えば−６９℃で開始し、３時間かけて徐々に−２４℃に調整して、次にこの温度を１８時間維持し、次に１時間かけて徐々に−１６℃に調整して、次にこの温度を６時間保持し、次に３時間かけて徐々に＋３４℃に調整して、最後にこの温度を９時間維持するというサイクルで実行することができる。一実施形態では、事前凍結乾燥溶液は充填剤をさらに含む。別の実施形態では、上記充填剤はマンニトールである。

[0101] 所望のパーセンテージの凝集体を生じるために適切なスクロースとキトサンの比率は、以下のガイドラインによって決定することができる。約２：１〜約１０：１の範囲のスクロースとキトサンの質量比を含む事前凍結乾燥混合物から、事前凍結乾燥溶液の濃度に応じて、凍結乾燥後に約５０％〜１００％の範囲で無傷のウイルス抗原（すなわち、０％〜５０％凝集した抗原）が生じる。スクロースとキトサンの質量比が０：１の場合は、無傷のノロウイルス抗原が３０％未満になる（すなわち、凝集した抗原が７０％を超える）。スクロース及びキトサンの両方を除外し、マンニトールなどの充填剤のみを使用すると、無傷な抗原が１０％未満になる（すなわち、事前凍結乾燥溶液の濃度に応じて、凝集した抗原が９０％を超える）。これらのガイドラインを使用することにより、当業者であれば、事前凍結乾燥混合物のスクロースとキトサンの質量比及び濃度を調整して、最適な免疫応答を生じるために必要な所望の量の凝集を得ることができる。

[0102] ワクチンは、投与処方に適合する方法で、及び治療上有効且つ免疫原性になるような量で投与することができる。さらに、ワクチンにとって有効なアジュバントを達成する様々な方法が知られ、本明細書で開示するＶＬＰと組み合わせて使用することができる。

[0103] 様々な宿主発現ベクタシステムを使用して、ＶＬＰポリペプチドを発現させることができる。このような宿主発現システムは、ＶＬＰポリペプチドを産生してＶＬＰを生成する手段となる媒体を意味する。

[0104] 哺乳類の宿主細胞中で、多くのウイルス系発現システムを使用することができる。また、挿入された配列の発現を調整する、又は所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾して処理する宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾は、ＶＬＰの生成、又はＶＬＰポリペプチド又はアジュバント又は追加的抗原などの追加的ポリペプチドの機能にとって重要になることがある。様々な宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後加工及び修飾にとって特徴的且つ特異的メカニズムを有する。適切な細胞系統又は宿主システムを選択して、発現した異種タンパク質の適正な修飾及び加工を確保することができる。そのために、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、及びリン酸化を適切に加工する細胞機構を有する真核性宿主細胞を使用することができる。

[0105] 本発明の特定の態様は、ＶＬＰ調製物質に関連する追加の抗原を含み、免疫応答を誘発することができる任意の物質でよい。幾つかの実施形態では、抗原は任意のアレルゲンとすることができる。アレルゲンは細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖類結合体、多糖類及び他の分子のペプチド及び非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、及び炭水化物を含むが、これらに限定されない。

[0106] 本発明は、以下の非限定的実施例を参照することにより、さらに良く理解される。本明細書で使用する単数形の「ある」及び「前記」は、文脈から明白に他の意味が規定されない限り、複数の指示対象も含む。上記方法及び／又は図解は特定の順序で生じる特定の事象及び／又はフローパターンを示すが、特定の事象及び／又はフローパターンの順序は変更することができる。例えば、低ｐＨ処理によるＶＬＰの加工は、ワクチン製造プロセス中に生成される任意のプロセス中間体について実行することができ、それには大量産生培養、浄化した産生培養、クロマトグラフィ溶出分画、クロマトグラフィ流通／洗浄分画、限外濾過／ダイアフィルトレーション濃縮水分画、及び／又はプロセス分画濾液が含まれるが、これらに限定されない。

[0107] また、可能な場合、特定の事象を並列プロセスで同時に実行する、さらに順番に実行することができる。

実施例
[0108]Ｓｆ９培養
[0109] Ｓｆ９昆虫細胞のルーチン的培養を、２７℃及び周囲空気飽和のフラスコ中で実施した。Ｓｆ９細胞を、バキュロウイルスの増大及びＶＬＰの産生のために複数継代にわたって培養した。自動細胞カウンタ（T4 Celloメータ、Nexcelom Bioscience）を使用して、Ｓｆ９培養のルーチン的集計を実施した。

[0110]組み換え型バキュロウイルス
[0111] 組み換え型バキュロウイルスは、製造業者の指示に従いCellfectinを使用して、転写ベクタ及び線状バキュロウイルスＤＮＡを付着Ｓｆ９昆虫細胞に同時導入し、その後にプラークを精製して、バキュロウイルス増大の追加のラウンドを実行することによって生成した。次に、低速遠心分離によって得られた上清の分画として、組み換え型バキュロウイルスを回収した。その結果の組み換え型バキュロウイルスを調整して、最終的に１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯにし、アリコーティングして−８０℃で保存した。ＶＬＰを産生するための冷凍バキュロウイルスの増大は、以上で概略するように実施した。

[0112]ＶＬＰの産生
[0113] ノロウイルスＶＬＰの産生は、使い捨てのWaveバイオリアクタと使用して実施した。バイオリアクタで産生するには、Sf-900 II無血清媒質を無菌的にWaveバイオリアクタへと移動し、培養を接種した。適切な細胞密度に到達したら、組み換え型バキュロウイルスを無菌的にバイオリアクタ培養に添加し、以上で概略した条件で発現培養をインキュベートする。バイオリアクタの培養は通常、生細胞密度に基づいて感染後４〜６日で回収した。

[0114] ノロウイルスＶＬＰに加えて、サポウイルスＶＰ１サブユニットを含有する組み換え型バキュロウイルスを感染させることによって、産生培養を生成することができる。あるいは、産生培養は、表面に露出したループ領域に異種アミノ酸及び／又は抗原を含有するように組み換えられているノロウイルスＶＰ１サブユニット（キメラノロウイルスＶＬＰ）を含有する組み換え型バキュロウイルスに感染させることによって生成することができる。

[0115]バイオリアクタの回収
[0116] 回収のために、ＨＣｌを添加し、次に攪拌しながら周囲温度で２時間インキュベートすることによって、バイオリアクタ培養をｐＨ３．０に調整した。次に、イミダゾールを添加し、次に低速遠心分離によって浄化することによって、培養をｐＨ５．０（ノーウォーク）又はｐＨ６．０（コンセンサス）に調整した。バイオリアクタの最終浄化は、遠心分離後の上清を濾過することによって実施した。その結果の回収材料（馴化培地）は、次にユニット操作の前に周囲室温で２４時間以内保存、又は４℃で１週間以内保存した。

[0117] サポウイルス又はキメラノロウイルスＶＬＰを含有する大量産生培養の回収については、３０分〜４８時間の範囲の期間にわたってｐＨ２．５で処理した後、汚染物質の除去及びＶＬＰの回収率を評価する試験を実施することになる。構造的に無傷なＶＬＰの最も好ましい回収率及びプロセス汚染物質の除去を示す条件を量産化加工に使用する。この目的に適切なキメラ変異体などの組み換えＶＬＰのリストは、２０１１年１月２１日出願で「Targeted Heterologous Antigen Presentation on Calicivirus Virus-Like Particles」と題したＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２０９４号、及び２００９年８月１０日出願で「Virus-Like Particles Comprising Composite Capsid Amino Acid Sequences for Enhanced Cross Reactivity」と題した米国実用新案出願第１３／０２３，３６３号に見ることができ、その開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

[0118]カチオン交換捕捉クロマトグラフィ
[0119] Sartobind Sカプセルを使用して、ノロウイルスＶＬＰのカチオン交換（ＣＥ）捕捉クロマトグラフィを実施した。精製するために、カプセルを酢酸塩（ｐＨ５．０）で平衡化し、馴化培地（≦１．５ｇＶＬＰ合計）を装填した。次に、２８０ｎｍ（Ａ_２８０）での流通吸収が２００ｍＡＵ未満になるまで、カプセルを酢酸塩（ｐＨ５．０）で洗浄した。次に、カプセルを酢酸塩（ｐＨ５．０）、１％のTriton X-100、０．２％のリン酸トリブチルで飽和させ、洗浄した。このオンカラム溶媒／洗浄剤処理の後、Ａ_２８０＜５０ｍＡＵになるまで、１００ｍＬ／分の酢酸塩（ｐＨ５．０）でカプセルを洗浄した。酢酸塩（ｐＨ５．０）及びＮａＣｌでノロウイルスＶＬＰの溶出を実施した。ＶＬＰ溶出分画を使い捨ての瓶又はバイオプロセス用袋に採取した。

[0120] カチオン交換クロマトグラフィによるコンセンサスＶＬＰの精製は上述のように実施したが、すべてのプロセス緩衝剤に酢酸塩（ｐＨ５．０）ではなくクエン酸塩（ｐＨ６．０）を使用した。

[0121]ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）捕捉クロマトグラフィ
[0122] ノーウォークＶＬＰのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）捕捉クロマトグラフィは、総容積２５０ｍＬのＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトカラム（BioRad）を使用して実施した。精製するために、カプセルをＭＥＳ（ｐＨ６．０）で平衡化し、馴化培地（≦２５０ｍｇＶＬＰ合計）を装填した。次に、２８０ｎｍ（Ａ_２８０）での流通吸収が２００ｍＡＵ未満になるまで、カプセルをＭＥＳ（ｐＨ６．０）で洗浄した。次に、カプセルをＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１％のTriton X-100、０．２％のリン酸トリブチルで飽和させ、洗浄した。このオンカラム溶媒／洗浄剤処理の後、Ａ_２８０＜５０ｍＡＵになるまで、７０ｍＬ／分のＭＥＳ（ｐＨ６．０）でカプセルを洗浄した。ノロウイルスＶＬＰの溶出は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で洗浄し、ＶＬＰの溶出は４００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で洗浄して実施した。ＶＬＰ溶出分画を使い捨ての瓶又はバイオプロセス用袋に採取した。

[0123] オンカラム溶媒／洗浄剤処理したサポウイルス又はキメラノロウイルスＶＬＰのクロマトグラフィについては、カチオン交換カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、疎水性相互作用カラム、サイズ排除カラム、アニオン交換カラム、混合モードカラム、又は親和カラムを含むが、これらに限定されないクロマトグラフィ基質からのＶＬＰの効率的な結合及び溶出を可能にする緩衝条件（ｐＨ及びイオン強度）を評価する試験が実行されることになる。構造的に無傷なＶＬＰの最も好ましい回収率及びプロセス汚染物質の除去を示す条件については、以上で概略したものと同様の方法でＶＬＰ加工（溶媒／洗浄剤処理など）が実行されることになる。

[0124]ＶＬＰの特徴付け
[0125] 精製後、ノロウイルスＶＬＰは分析法のパネルで純度を分析し、ＮｕＰＡＧＥ勾配ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。その結果のＰＡＧＥゲルを、Imperial Protein Stain又は着色銀で着色した。捕捉クロマトグラフィ工程中に、産生培養の低ｐＨ処理及びオンカラム溶媒／洗浄剤処理の標準的プラークアッセイで、バキュロウイルスの不活性化を評価した。

[0126] ノーウォークＶＬＰの構造的完全性の分析は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）及び透過電子顕微鏡（ＥＭ）を使用した精製済み産物の分析によって実施した。ＳＥＣについては、精製済みノーウォークＶＬＰを希釈し、Superose 6カラムで分析した。ＥＭ分析については、ＶＬＰをＬ−ヒスチジン（ｐＨ６．５）、塩化ナトリウム中で希釈し、銅のメッシュグリッド上に点在させ、２％の酢酸ウラニルで着色した。

[0127]結果
[0128] バイオリアクタ産生−ＶＬＰを産生する拡大可能な方法を開発するために、当技術分野で周知の技術を使用し、組み換え型バキュロウイルスに感染させるようにＳｆ９培養をWaveバイオリアクタ中で増殖させた。

[0129] バイオリアクタ回収−ノロウイルスＶＬＰの産生後、バイオリアクタ培養は、高レベルの生バキュロウイルス（約１０^７〜１０^８ｐｆｕ／ｍＬ）を含有し、これはＶＬＰの製造中に不活性化して除去しなければならない。産生培養の低ｐＨ処理は回収中に実行可能な工程を示したかを判定する試験を実施した。表１に示すように、産生培養をｐＨ＜３．５で１時間、室温でインキュベートした試験で、高レベルのバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）の不活性化（ノーウォークＶＬＰプロセスでは、５ｌｏｇ_１０超、コンセンサスＶＬＰプロセスでは４ｌｏｇ_１０超）が達成された。表１は、高レベルのレトロウイルス（Ａ−ＭＬｕＶ）の不活性化（ノーウォークＶＬＰプロセスでは、７ｌｏｇ_１０超、コンセンサスＶＬＰプロセスでは、６ｌｏｇ_１０超）を達成したことも示す。対照的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィによる産生培養の分析は、産生培養の低ｐＨ処理後、ノーウォークＶＬＰとコンセンサスＶＬＰは両方とも可溶性のままで、構造的に無傷であることを示した。産生中に、ノロウイルスＶＰ１サブユニット中に通例、Ｎ末端タンパク質分解性分割が観察された。また、有意なレベルのＳｆ９宿主細胞タンパク質を除去すると、大量培養の低ｐＨ処理によって切断型ＶＰ１を含有するＶＬＰが選択的に除去されることも示す（図１Ａ及び図１Ｂ）。

[0130] 以上の発見事項に基づき、低ｐＨ処理による回収戦略、及び低速遠心分離による一次浄化が開発されている。下流の捕捉工程をさらに保護するために、その結果の低速上清／濾液分画をＰＥＳカプセルフィルタに通し、次にカプセルフィルタを封じ込めた無菌バイオプロセス袋に入れる。この回収戦略は、その結果となる馴化培地中で上述した保存条件にて安定しているノロウイルスＶＬＰの効率的な回収率を提供し、下流加工のために比較的純粋なＶＬＰ分画を生成する。

[0131] 下流加工−下流加工のために、量産化ｃＧＭＰ製造に非常に適した直交精製法に重点が置かれている。以下の手順は、開始馴化培地からＶＬＰを加工するように設計されている。

[0132] カチオン交換クロマトグラフィ−膜式クロマトグラフィは、大径（約１μｍ）膜ポアの効率的な物質移動により、大きい高分子複合体の精製に有用であることが判明した。Sartobind Sカチオン交換膜は、馴化培地からＶＬＰを捕捉し、精製するために使用されてきた従来のビード系クロマトグラフィ基質と比較した場合、ノロウイルスＶＬＰと効率的に結合する（図２Ａ）。ノロウイルスＶＬＰの下流加工中にバキュロウイルスの不活性化を増大させるために、１％のTriton X-100、リン酸トリブチルを含有する平衡緩衝剤を使用したオンカラム溶媒／洗浄剤処理工程を、捕捉工程に組み込んである。溶媒／洗浄剤緩衝液を除去するカプセル洗浄の後、塩化ナトリウムを含有する平衡化緩衝液の段階的勾配でノロウイルスＶＬＰを溶出する。現在の加工方式は、Sartobind Sの１０”カプセルに装填した馴化培地中に最大１．５ｇのノロウイルスＶＬＰを規定している。表２に示すように、高レベルのバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）の不活性化（ノーウォークＶＬＰプロセスでは、４ｌｏｇ_１０超、コンセンサスＶＬＰプロセスでは、４ｌｏｇ_１０超）が達成された。表２は、高レベルのレトロウイルス（Ａ−ＭＬｕＶ）の不活性化（ノーウォークＶＬＰプロセスでは、７ｌｏｇ_１０超、コンセンサスＶＬＰプロセスでは、６ｌｏｇ_１０超）が達成されたことも示す。低ｐＨ処理とオンカラム溶媒／洗浄剤処理の両方を採用した場合に、表１及び表２に列挙した精製値の数字を加えると、エンベロープウイルスの不活性化の正確な尺度になったことも、さらに観察された。

[0133] カチオン交換クロマトグラフィと同様に、オンカラム溶媒／洗浄剤処理を伴うヒドロキシアパタイト捕捉クロマトグラフィも、ノロウイルスＶＬＰの加工に効果的であることが示された（図２Ｂ）。

[0134] 精製済みノロウイルスＶＬＰの特徴付け−多工程クロマトグラフィプロセスを使用した産生及び下流加工の後にＶＬＰの集合状態を評価するために、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）及び透過電子顕微鏡（ＥＭ）で精製済みＶＬＰを分析した。上述した条件にてＳＥＣで分析した場合、ノーウォークＶＬＰ及びコンセンサスＶＬＰは、約７．２〜７．６分の保持時間を示し、これは数百万ダルトンの分子量を有する精製済み産物と一致する（図３Ａ）。分解したＶＰ１カプシッドタンパク質は、約１５分の保持時間で溶出するので、これらの結果は、カプシッドタンパク質の大部分が集合したＶＬＰに取り込まれていることを確認する。透過による精製済み材料の分析は、ノーウォークＶＬＰとコンセンサスＶＬＰの両方で約３４〜４０ｎｍの主に均一な粒子を示し、これはＶＰ１カプシッドモノマーのＴ３正二十面体集合体と一致する（図３Ｂ）。

[0135]溶媒／洗浄剤処理によるウイルスの不活性化／除去
[0136] コンセンサスＶＬＰの馴化培地にモデルウイルスを固定し、オンカラム溶媒／洗浄剤処理を伴う、及び伴わないカチオン交換クロマトグラフィで加工した。表３に示すように、ＣＥ工程のみではモデルウイルスの減少が最小であり、オンカラム溶媒／洗浄剤処理を含むと、高レベルの除去／不活性化が観察された。

[0137]低ｐＨ及び溶媒／洗浄剤処理によるウイルスの不活性化／除去
[0138] Ｓｆ９昆虫細胞中のノロウイルスＶＬＰ産生後、バイオリアクタ産生培養は、従来の方法（低速遠心分離及び濾過）で回収した後に高レベルの生バキュロウイルス（約１０^８ｐｆｕ／ｍＬ）を含有している。表４は、低ｐＨ処理のみでは、産生培養中に見られるレベルのバキュロウイルスを完全には不活性化しないことを示す。対照的に、低ｐＨ処理及び溶媒／洗浄剤処理の組み合わせによるバキュロウイルス不活性化のレベルは、産生培養中で約１０ｐｆｕ／ｍＬを超える。

[0139]低ｐＨ処理によるＶＰ１タンパク質分解性フラグメントの除去
[0140] バキュロウイルス発現系の産生中、コンセンサスＶＰ１サブユニットはタンパク質分解性分割を経験することができ、その結果、発現した材料の特定の分画でＮ末端の切断が生じる。このタンパク質分解性フラグメントは集合してＶＬＰになり、下流加工中に完全長ＶＰ１サブユニットで構成されたＶＬＰと同時精製される。開発試験中に、大量バイオリアクタ産生培養の低ｐＨ処理は、Ｎ末端切断産生物を含有するＶＬＰの集団を選択的に除去し、より均質な材料を下流加工に提供することが発見された。

[0141] 下流加工後、銀系統ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び濃度測定によるコンセンサスＶＬＰ薬剤物質の分析は、回収時にｐＨ処理されなかったバイオリアクタ培養から精製したＶＬＰに有意のレベルのＶＰ１のＮ末端切断産物を示した（表５）。対照的に、ｐＨ処理したバイオリアクタ培養から精製したＶＬＰは、専ら完全長ＶＰ１サブユニットで構成されていた。

[0142]オンカラム溶媒／洗浄剤処理による宿主細胞タンパク質の除去
[0143] バイオリアクタ産生培養の回収後、ノーウォークＶＬＰ及びコンセンサスＶＬＰを、オンカラム溶媒／洗浄剤処理を伴うカチオン交換（ＣＥ）クロマトグラフィで加工した。ＶＬＰ及びＳｆの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の含有量を、バイオリアクタ回収材料（ＣＥロード）及びカチオン交換溶出分画（ＣＥ溶出）の両方について評価した。これらの試験で、ＶＬＰ含有量をサイズ排除クロマトグラフィで判定し、ＨＣＰ含有量は、市販されているＥＬＩＳＡキット（Cygnus Technologies、Cat: F020）を使用して判定した。表６は、プロセス分画のＨＣＰ含有量について、複数のＶＬＰのロットで平均したデータを示し、上述したアッセイで判定して、ＣＥ工程によってＨＣＰが有意に減少したことを示す。

[0144]低ｐＨ処理及びデプス濾過によるノーウォーク及びコンセンサスＶＬＰバイオリアクタ産生培養の回収
[0145] ノーウォークＶＬＰ及びコンセンサスＶＬＰの現在の製造では、バイオリアクタ産生培養を低ｐＨ処理で回収し、遠心分離／濾過で浄化する。現在の回収手順の低ｐＨ処理工程は、ウイルスの不活性化及びプロセス汚染物質の除去に使用され、遠心分離は、産生培養の一次浄化に使用される。遠心分離は、バイオリアクタ浄化の確固たる拡大可能な方法であるが（図４Ａ参照）、一次浄化にデプス濾過を代替的に使用すると（図４Ｂ参照）、操作の容易さ及び使い捨て材料の使用可能性など幾つかの利点があり、これによってクリーニングを確認する必要がなくなる。

[0146] バイオリアクタ産生培養の回収をさらに特徴付け、洗練するために、１）バキュロウイルス及び宿主細胞核酸のプロセス汚染物質の除去を評価し、２）一次浄化用の珪藻土デプスフィルタの使用を評価する開発試験を実施した。以上で概略した試験が、図４Ａ〜図４Ｂに要約され、以下のように実施された。

[0147] ノーウォーク及びコンセンサスＶＬＰ産生培養を、振盪フラスコ又は攪拌タンクバイオリアクタ中で生成した。

[0148] 産生培養は、低速遠心分離及び０．２μｍの濾過で、低ｐＨ処理及びその後の低速遠心分離及び０．２μｍの濾過で、低ｐＨ処理及びその後のデプス濾過及び０．２μｍの濾過で回収した。

[0149] プロセス分画の核酸含有量をｑＰＣＲで評価し、ＶＬＰの回収率をサイズ排除クロマトグラフィで評価した。

[0150] 表７に示した試験では、回収時の低ｐＨ処理工程の結果、ノーウォークＶＬＰ産生培養（１２．７〜４７．４倍の減少）及びコンセンサスＶＬＰ産生培養（２．９〜３．０倍の減少）の両方で核酸汚染物質が有意に除去される。また、遠心分離の代わりにデプスフィルタを使用した一次浄化は、ノーウォークＶＬＰ産生培養（６５．０〜１１０．９倍の減少）及びコンセンサスＶＬＰ産生培養（３０．７〜５１．９倍の減少）の両方で核酸汚染物質の全体的除去を増加させた。

[0151] 表８に示すように、様々なデプスフィルタを使用した回収試験で、１５５〜３９０Ｌ／ｍ^２の範囲の容量及び７３〜１０１％のＶＬＰ回収率が観察された。観察された好ましいフィルタ容量及びＶＬＰ回収率によって、このようなアプローチが量産化製造に使用するのに適切なものになる。

Claims (29)

1. ヒトノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法であって、
   前記ＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は濾液を生成するか又は得るステップであって、前記ＶＬＰが少なくともＶＬＰの第一亜集団、及びＶＬＰの第二亜集団を含み、前記第一亜集団が完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含み、前記第二亜集団が切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含む、ステップと、
   前記可溶化物、上清、又は濾液のｐＨを５未満のｐＨ値に調整して、ｐＨ調整済み溶液を生成するステップと、
   濾過プロセスを使用して前記ｐＨ調整済み溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体、及びＶＬＰの前記第二亜集団を除去して、精製済み溶液を生成するステップであって、前記精製済み溶液が、前記濾過プロセスにより得られるろ液であり、該精製済み溶液が、完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含むＶＬＰの前記第一亜集団を実質的に保持し、前記切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを実質的に含まない、ステップと、
   を含む、方法。
2. 残留汚染タンパク質に対するＶＬＰの前記第一亜集団の比率が、少なくとも２倍増加する、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｐＨの前記調整が、３０分間と４８時間の間の継続時間実行される、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＶＬＰが、酸安定性ＶＬＰを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記除去が、デプス濾過及びその後の追加的濾過によってｐＨ調整済み溶液を浄化して、前記精製済み溶液を生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
6. 残留汚染核酸の少なくとも９８％が、前記精製の結果として、前記可溶化物、上清、又は濾液から除去される、請求項１に記載の方法。
7. １つ又は複数のクロマトグラフィプロセスを使用して、前記精製済み溶液からＶＬＰの第一亜集団を分離するステップをさらに含み、各クロマトグラフィプロセスが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、及びアフィニティクロマトグラフィから個別に選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記精製済み溶液をクロマトグラフィ材料と接触させるステップであって、前記ＶＬＰが前記クロマトグラフィ材料に結合する、ステップと、
   溶媒及び／又は洗浄剤で前記クロマトグラフィ材料を処理するステップと、
   前記処理の後、前記クロマトグラフィ材料から前記ＶＬＰの前記第一亜集団を溶出させるステップと、
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記溶媒及び／又は洗浄剤が、ＴｎＢＰ、オクチルフェノール、エチレンオキシド凝縮液、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びコール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及びリン酸トリブチルのうち１つ又は複数を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＶＬＰが、ノロウイルス遺伝子群Ｉ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＶ型ＶＬＰ、キメラノロウイルスＶＬＰ、及びサポウイルスＶＬＰのうち１つ又は複数である、請求項８に記載の方法。
11. 残留汚染タンパク質に対する前記ＶＬＰの比率が、前記可溶化物、上清又は濾液と比較して少なくとも１０倍増加する、請求項８に記載の方法。
12. 前記精製の結果、残留汚染タンパク質の少なくとも５０％が、前記可溶化物、上清又は濾液から除去される、請求項８に記載の方法。
13. 前記精製中に失われる前記ＶＬＰが５０％以下である、請求項８に記載の方法。
14. 各クロマトグラフィプロセスが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、膜式クロマトグラフィ、及びアフィニティクロマトグラフィから個別に選択される、請求項８に記載の方法。
15. 前記ＶＬＰが、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物、又は哺乳類細胞中で産生される、請求項８に記載の方法。
16. ヒトノロウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法であって、
    前記ＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は濾液を生成するか又は得るステップであって、前記ＶＬＰが少なくともＶＬＰの第一亜集団、及びＶＬＰの第二亜集団を含み、前記第一亜集団が完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含み、前記第二亜集団が切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含む、ステップと、
    前記可溶化物、上清又は濾液のｐＨを５未満のｐＨ値に調整して、ｐＨ調整済み溶液を生成するステップと、
    前記ｐＨ調整済み溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体、及びＶＬＰの前記第二亜集団を除去するステップと、を含み、前記除去するステップが、デプス濾過プロセスによって前記ｐＨ調整済み溶液を浄化して、デプス濾過済み精製済み溶液を生成するステップであって、前記デプス濾過済み精製済み溶液が前記デプス濾過プロセスにより得られるろ液であり、該デプス濾過済み精製済み溶液が、完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含むＶＬＰの前記第一亜集団を実質的に保持し、前記切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを実質的に含まない、ステップとを含む、方法。
17. 前記デプス濾過プロセスが、前記ｐＨ調整済み溶液を１つ又は複数のデプスフィルタと接触させるステップを含み、前記デプスフィルタの少なくとも１つが、珪藻土デプスフィルタである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記可溶化物、上清又は濾液と比較して、残留汚染核酸の少なくとも９５％が、前記ｐＨ調整済み溶液から除去される、請求項１６に記載の方法。
19. 前記可溶化物、上清又は濾液と比較して、前記ｐＨ調整済み溶液からの前記ＶＬＰの回収率が少なくとも７５％である、請求項１６に記載の方法。
20. 前記分離が、１つ又は複数のクロマトグラフィプロセスを使用して、前記デプス濾過済み精製済み溶液からＶＬＰの前記第一亜集団を分離するステップをさらに含み、各クロマトグラフィプロセスが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ、カチオン交換クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、及びアフィニティクロマトグラフィから個別に選択される、請求項１６に記載の方法。
21. 前記ＶＬＰが、ノロウイルス遺伝子群Ｉ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＩ型ＶＬＰ、ノロウイルス遺伝子群ＩＶ型ＶＬＰ、キメラノロウイルスＶＬＰ、及びサポウイルスＶＬＰのうち１つ又は複数である、請求項１６に記載の方法。
22. 前記ＶＬＰが、ノロウイルス遺伝子群Ｉ型ＶＬＰであり、前記第一亜集団が、完全長ＶＰ１サブユニットを有するノロウイルスＶＬＰを含み、前記第二亜集団が、切断型ＶＰ１サブユニットを有するノロウイルスＶＬＰを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ＶＬＰが、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物、又は哺乳類細胞中で産生される、請求項１６に記載の方法。
24. ヒトノロウイルスのＶＬＰの精製済み集団を含む溶液を製造する方法であって、
    前記ＶＬＰを含有する細胞可溶化物、培養上清、又は細胞培養物の濾液を生成するか又は得るステップであって、前記ＶＬＰが少なくとも完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰと切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含む、ステップと、
    前記可溶化物、上清、又は濾液のｐＨを５未満のｐＨ値に調整して、ｐＨ調整済み溶液を生成するステップと、
    濾過プロセスを使用して前記ｐＨ調整済み溶液から切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを除去して、精製済み溶液を生成するステップであって、前記精製済み溶液が、前記濾過プロセスにより得られるろ液であり、前記精製済み溶液が、少なくとも５０％の完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含有し、１０％未満の切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含有する、ステップと、
    を含む、方法。
25. ヒトノロウイルスのＶＬＰの精製済み集団を製造する方法であって、
    １つ又は複数のクロマトグラフィプロセスを使用して、請求項２４に記載の方法により製造された溶液からＶＬＰの精製済み集団を分離して、完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰの精製済み集団を生成するステップを含む、方法。
26. 生きたウイルスを含有し、前記生きたウイルスによって生成されたヒトノロウイルスＶＬＰをさらに含有する溶液であって、前記ＶＬＰが少なくとも完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含むＶＬＰの第一亜集団、及び切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含むＶＬＰの第二亜集団を含む、溶液中において、前記生きたウイルスを除去及び／又は不活性化する方法であって、
    前記生きたウイルスを含有する前記溶液のｐＨを５未満のｐＨ値に調整して、ｐＨ調整済み溶液を生成するステップと、
    濾過プロセスを使用して前記ｐＨ調整済み溶液から非ＶＬＰ微粒子／凝集体、及びＶＬＰの前記第二亜集団を除去して、精製済み溶液を生成するステップであって、前記精製済み溶液が、前記濾過プロセスにより得られるろ液であり、該精製済み溶液が、完全長ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを含むＶＬＰの前記第一亜集団を実質的に保持し、前記切断型ＶＰ１サブユニットを有するＶＬＰを実質的に含まない、ステップと、を含む、方法。
27. 前記ｐＨ調整済み溶液中の前記生きたウイルスのレベルが少なくとも１０^４倍減少する、請求項２６に記載の方法。
28. 少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスを使用して、前記精製済み溶液を精製するステップとをさらに含み、前記少なくとも１つのクロマトグラフィプロセスが、
    前記ｐＨ調整済み溶液をクロマトグラフィ材料と接触させるステップであって、前記ＶＬＰは前記クロマトグラフィ材料に結合する、ステップと
    前記クロマトグラフィ材料を溶媒及び／又は洗浄剤で処理するステップと、
    前記処理の後、前記クロマトグラフィ材料から前記ＶＬＰを溶出して、溶出液を生成するステップとを含み、
    前記溶出液中の前記生きたウイルスのレベルが、前記生きたウイルスを含有する前記溶液と比較して少なくとも１０^２倍減少する、請求項２６に記載の方法。
29. 前記溶出液中の前記生きたウイルスのレベルが、前記生きたウイルスを含有する前記溶液と比較して少なくとも１０^３倍減少する、請求項２８に記載の方法。

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