JP6616329B2 - 非エンベロープウイルス粒子の製造方法 - Google Patents
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Description
[1] 非エンベロープウイルス粒子の製造方法であって、
(a)非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質を添加する工程、
(b)前記物質を添加した試料を酸性にする工程、及び
(c)前記(b)工程で生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程、
を含む方法、
[2](c)工程の後にさらに、(d)非エンベロープウイルス粒子を精製する工程、を含むことを特徴とする[1]に記載の方法、
[3] 酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質が、界面活性剤である[1]に記載の方法、
[4] 酸性にする工程が、酸性の溶液を添加する工程である[1]〜[3]のいずれかに記載の方法、
[5] 非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞の溶解物もしくは破砕物、非エンベロープウイルス粒子を含有する非エンベロープウイルス産生細胞の培養液上清、または非エンベロープウイルス産生細胞から得られる抽出物である[1]〜[4]のいずれかに記載の方法、
[6] 非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液で処理して得られる抽出物の中和物である[5]に記載の方法、
[7] 非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、さらにヌクレアーゼ処理を施された試料である[1]〜[6]のいずれかに記載の方法、
[8] 非エンベロープウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス粒子である[1]〜[7]のいずれかに記載の方法、
[9] [1]〜[8]のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
(1)酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質、及び
(2)酸性の溶液、
を含有することを特徴とするキット、
[10] さらに、中和液を含有することを特徴とする[9]に記載のキット、
に関する。
本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法は、
(a)非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質を添加する工程、
(b)前記物質を添加した試料を酸性にする工程、及び
(c)前記(b)工程で生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明のキットは、上記(1)記載の非ウイルスエンベロープウイルス粒子を製造する方法を実施するためのキットであって、(1)酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質、及び(2)酸性の溶液、を含有することを特徴とする。当該酸性条件で沈殿する物質は、上記(1)本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法で説明した、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質が好適に使用できる。また、当該酸性の溶液は、上記(1)本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法で説明した、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質が添加された試料のpHを酸性にする工程で使用できるものであれば特に限定はされない。本発明のキットについては、さらに中和液を含んでいてもよい。当該中和液は、好適には塩基性の溶液やpH緩衝液である。塩基性の溶液としては、特に限定はされないが、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム溶液などが挙げられる。また、pH緩衝液としては、特に限定はされないが、例えばTris−HCl溶液などが挙げられる。さらに、非エンベロープウイルス産生細胞からの抽出物の調製に使用される試薬や、非エンベロープウイルス粒子の形成に必須な要素を供給する核酸を含むプラスミド、非エンベロープウイルス粒子に封入される核酸を含むプラスミド等を含むキットとしてもよい。
(1)rAAV製造用細胞の播種
組織培養処理T225フラスコ(コーニング社製)に、10%FBS(ギブコ社製)を含むDMEM(シグマ社製)に懸濁した293T/17細胞を播種した。その後、37℃、CO2濃度5%(v/v)のCO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例1−(1)で得られた細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、AAV2のRepタンパク質及びAAV5のCapタンパク質をコードする配列を含むpRC5 Vector(タカラバイオ社製)、アデノウイルスのE2A、VA、V4をコードする配列を含むpHelper Vector(タカラバイオ社製)、AAV2ゲノムの2つのITRの間に蛍光タンパク質ZsGreen1の発現カセットを含むpAAV−ZsGreen1 Vector(タカラバイオ社製)をそれぞれ25μgずつトランスフェクションした。トランスフェクション6時間後、培地を完全に除去し、2%胎仔ウシ血清(FBS)を含むDMEMをフラスコ1枚当たり40mL添加し、37℃、CO2濃度5%(v/v)のCO2インキュベーターで2日間培養した。
実施例1−(2)で得られた各フラスコに、0.5M EDTA(和光純薬社製)0.5mLを添加し、室温で数分間静置することで細胞を剥離させた。その後、溶液ごと細胞を回収し、1,750×g、4℃、10分間遠心後、上清を除去した。細胞ペレットを2mLのクエン酸バッファー(38.1mM クエン酸、74.8mM クエン酸ナトリウム、75mM 塩化ナトリウム、100mM 塩化マグネシウム、pH5)で再懸濁し、15秒間ボルテックスミキサーで混和を行い、室温で5分間静置、再び15秒間ボルテックスミキサーで混和を行った。その後、4,000×g、4℃、10分間遠心を行い、上清を回収した。得られた上清に1/10量の2M Tris−HCl(pH9.5)を添加した溶液を抽出液とした。
実施例1−(3)で得られた抽出液に、1/100量の20U/μL Cryonase(登録商標) Cold−active Nuclease(タカラバイオ社製)を添加後(終濃度0.2U/μL)、37℃で1時間反応させた。サンプルを5等分し、サンプル1には1/10量の1M クエン酸のみを添加した。サンプル2には、1/10量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウムのみを添加した。サンプル3には1/10量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間静置後、さらに1/40量の1M クエン酸を添加した。サンプル4には1/10量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間静置後、さらに1/20量の1M クエン酸を添加した。サンプル5には1/10量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間静置後、さらに1/10量の1M クエン酸を添加した。それぞれのサンプルについて、pHを測定した結果を表1に示す。
実施例1−(3)で得られた抽出液及び実施例1−(4)で得られた5種の濃縮前rAAV5に、それぞれ等量の5×サンプルバッファー(タカラバイオ社製)を加えて混合し、95℃、10分間処理を行った。各処理液4μLを4−12%ポリアクリルアミドゲルにアプライし電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルを適当量のOriole蛍光ゲルステイン溶液(バイオラッド社製)に浸し、遮光して90分間振とうした。振とう後のゲルをLuminoshot400(タカラバイオ社製)にて撮影した。その結果を図1に示す。図1中、レーンCは抽出液、レーン1〜5は濃縮前rAAV5(サンプル1〜5)である。
実施例1−(3)で得られた抽出液及び実施例1−(4)で得られた5種の濃縮前rAAV5のゲノム力価を測定した。ゲノム力価測定には、AAVpro(登録商標) Titration Kit(for Real Time PCR) Ver.2(タカラバイオ社製)を使用し、反応液の調製等の操作はキット添付の説明書に従った。得られたゲノム力価のデータを用いて、下記式に従って総ゲノム力価を算出した。
(1)デオキシコール酸ナトリウム及びクエン酸の添加量の検討
実施例1−(1)〜(3)と同様の方法で抽出液を取得した。得られた抽出液に、1/100量の20U/μL Cryonase(登録商標) Cold−active Nucleaseを添加後(終濃度0.2U/μL)、37℃で1時間反応させた。サンプルを4等分し、1/10量又は1/20量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間静置後、さらに1/20量又は1/30量の1M クエン酸を添加した。それぞれのサンプルについて、pHを測定した結果を表2に示す。
実施例2−(2)で得られた濃縮前rAAV5を100kDaKの限外ろ過膜(メルクミリポア社製)に入れ、2,000×g、4℃、10分間遠心し、そのろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜に10mLのD−PBSを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作(洗浄操作)」を5回繰り返し、最終濃縮液を精製rAAV5(サンプルa〜d)とした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにrAAV5を10倍に濃縮した。
実施例1−(5)と同様の方法で実施例2−(2)で得られた精製rAAV5の純度を確認した。その結果を図3に示す。図3中、レーンMはProtein Molecular Weight Marker (Broad)(タカラバイオ社製、上から200、116、97、66、44、29、20kDa)、レーンa〜dは精製rAAV5(サンプルa〜d)である。
(1)rAAV製造用細胞の播種
実施例1−(1)と同様の方法でrAAV製造用細胞を播種した。
実施例1−(2)と同様の方法でrAAV製造用プラスミドを実施例3−(1)で得られた細胞にトランスフェクションした。ただし、調製するrAAVのセロタイプに合わせて、pRC5 Vectorの代わりに、pRep−Cap1 AAV Helper Plasmid(Applied Viromics社製)、pRC2−mi342 Vector(タカラバイオ社製)、pRep−Cap3 AAV Helper Plasmid(Applied Viromics社製)、pRC6 Vector(タカラバイオ社製)を使用した。
実施例1−(3)と同様の方法で各セロタイプのrAAVの抽出液を取得した。
実施例3−(3)で得られた各抽出液に、1/100量の20U/μL Cryonase(登録商標) Cold−active Nucleaseを添加後(終濃度0.2U/μL)、37℃で1時間反応させた。その後、各サンプルに1/10量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間以上静置後、さらに1/20量の1M クエン酸を各サンプルに添加した。それぞれのサンプルについて、pHを測定したところ、pH4〜6であった。
実施例3−(4)で得られた濃縮前rAAVを100kDaKの限外ろ過膜に入れ、2,000×g、4℃、5分間以上遠心し、そのろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜に14mLのD−PBSを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作(洗浄操作)」を5回繰り返し、最終濃縮液を精製rAAVとした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにrAAVを3〜5倍に濃縮した。
実施例1−(5)と同様の方法で各セロタイプのrAAVの抽出液(レーンC)、濃縮前rAAV(レーンPre)及び精製rAAV(レーンF)の純度を確認した。その結果を図4に示す。
実施例1−(6)と同様の方法で各セロタイプのrAAVのゲノム力価を測定し、各工程のrAAVの総ゲノム力価を算出した。抽出液の総ゲノム力価を100とした時の相対値(回収率)を表3に示す。
(1)濃縮前rAAV6の取得
実施例3−(1)〜(4)と同様の方法で濃縮前rAAV6を取得した。
濃縮前rAAV6を3等分し、サンプル1はポリエチレングリコール添加無しサンプルとした。サンプル2には終濃度0.4%(w/v)になるように、ポリエチレングリコール(PEG)−6000(SIGMA社製)溶液を添加した。サンプル3に終濃度0.8%(w/v)になるように、PEG−6000溶液を添加した。それぞれのサンプルを100kDaKの限外ろ過膜に入れ、2,380×g、室温、10分間以上遠心し、ろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜にそれぞれの終濃度のポリエチレングリコールを含有した10〜14mLのPBSを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作(洗浄操作)」を3回繰り返した。サンプル2とサンプル3だけPBSによる洗浄操作を追加で行い、最終濃縮液を精製rAAV6とした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにrAAV6を6〜12倍に濃縮した。
実施例1−(6)と同様の方法で各rAAV6のゲノム力価を測定し、各工程のrAAV6の総ゲノム力価を算出した。抽出液の総ゲノム力価を100とした時の相対値(回収率)を表4に示す。
(1)rAAV6抽出液の取得
実施例3−(1)〜(3)と同様の方法でrAAV6抽出液を取得した。
実施例5−(1)で得られたrAAV6抽出液に、1/100量の20U/μL Cryonase(登録商標) Cold−active Nucleaseを添加後(終濃度0.2U/μL)、37℃で1時間反応させた。サンプルの一部を3等分した後、各サンプルに1/10量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間以上静置後、さらに1/20量の1M クエン酸、1/20量の1M 塩酸、又は1/20量の1M 酢酸をそれぞれ添加した。それぞれのサンプルのpHを測定し、酸性であることを確認した。それぞれのサンプルの条件を表5に示す。
実施例1−(5)と同様の方法で、濃縮前rAAV6の純度を確認したところ、酸性の溶液の種類に関わらず同等の純度を示した。また、実施例1−(6)と同様の方法で濃縮前rAAV6のゲノム力価を測定し、回収率を算出したところ、酸性の溶液の種類に関わらず同等の回収率を示した。これらのことは、rAAVと夾雑タンパク質の混合物にデオキシコール酸ナトリウム及び酸性の溶液を添加する際に、どのような種類の酸性の溶液を使用しても、夾雑タンパク質を沈殿させ、除去できることを示す。
(1)rAAV2抽出液の取得
実施例3−(1)〜(3)と同様の方法でrAAV2抽出液を取得した。
実施例6−(1)で得られたrAAV2抽出液に、1/100量の20U/μL Cryonase(登録商標) Cold−active Nucleaseを添加後(終濃度0.2U/μL)、37℃で1時間反応させた。サンプルの一部を3等分した後、各サンプルに1/10量の5%(v/v) デオキシコール酸ナトリウム、5% (v/v)ケノデオキシコール酸ナトリウム、又は5%(v/v) コール酸ナトリウムを添加し、37℃で30分間以上静置後、さらに1/20量の1M クエン酸をそれぞれ添加した。それぞれのサンプルのpHを測定し、酸性であることを確認した。それぞれのサンプルの条件を表6に示す。
実施例6−(2)で得られた濃縮前rAAV2を100kDaの限外ろ過膜に入れ、2,000×g、4℃、5分間以上遠心し、そのろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜に14mLのD−PBSを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作(洗浄操作)」を5回繰り返し、最終濃縮液を精製rAAV2とした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにrAAV2を濃縮した。
実施例1−(5)と同様の方法でrAAV2抽出液(レーンC)、濃縮前rAAV2(レーンPre)及び精製rAAV2(レーンF)の純度を確認した。その結果を図5に示す。
Claims (8)
- 非エンベロープウイルス粒子の製造方法であって、
(a)非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質を添加する工程、
(b)前記物質を添加した試料を酸性にする工程、及び
(c)前記(b)工程で生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程、
を含み、非エンベロープウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス粒子であり、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び/又は酸性条件で沈殿する物質がカルボン酸型アニオン界面活性剤である、方法。 - (c)工程の後にさらに、(d)非エンベロープウイルス粒子を精製する工程、を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 酸性にする工程が、酸性の溶液を添加する工程である請求項1または2に記載の方法。
- 非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞の溶解物もしくは破砕物、非エンベロープウイルス粒子を含有する非エンベロープウイルス産生細胞の培養液上清、または非エンベロープウイルス産生細胞から得られる抽出物である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液で処理して得られる抽出物の中和物である請求項4に記載の方法。
- 非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、ヌクレアーゼ処理を施された試料である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の非エンベロープウイルスの製造方法に用いるためのキットであって、
(1)カルボン酸型アニオン界面活性剤、及び
(2)酸性の溶液、
を含有することを特徴とするキット。 - さらに、中和液を含有することを特徴とする請求項7に記載のキット。
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---|---|---|---|---|
CA1340384C (fr) | 1986-04-09 | 1999-02-09 | Eli Lilly And Company | Method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer |
EP0245949B1 (en) | 1986-04-09 | 1997-10-29 | Eli Lilly And Company | A method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer |
DE3622089A1 (de) | 1986-07-02 | 1988-01-07 | Krueger Gmbh & Co Kg | Viruzides mittel mit breitbandwirkung |
CA2228269C (en) | 1995-08-03 | 2008-01-08 | Avigen, Inc. | High efficiency helper system for aav vector production |
AU722196B2 (en) * | 1995-08-30 | 2000-07-27 | Genzyme Corporation | Chromatographic purification of adenovirus and AAV |
US6004797A (en) | 1995-11-09 | 1999-12-21 | Avigen, Inc. | Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production |
CN1207569C (zh) * | 1997-08-04 | 2005-06-22 | 株式会社先端生命科学研究所 | 用于测定含病毒样品的方法、病毒测定方法和诊断试剂盒 |
US7244828B2 (en) * | 1997-11-07 | 2007-07-17 | Aftab Alam | Agent for protein precipitation, a method of protein precipitation, a method of protein assay using protein precipitation agent, and a kit for protein assay |
PT1109892E (pt) | 1998-09-04 | 2009-02-17 | Targeted Genetics Corp | Métodos para produzir preparações de vectores de aav recombinantes libertados, de título elevado, isentas de vírus auxiliares |
US6593123B1 (en) | 2000-08-07 | 2003-07-15 | Avigen, Inc. | Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification |
EP1506287B1 (en) | 2002-05-14 | 2007-04-25 | Merck & Co., Inc. | Methods of adenovirus purification |
US7419817B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-09-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. | Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography |
US9198984B2 (en) | 2006-04-28 | 2015-12-01 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable production method for AAV |
US20080132688A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-06-05 | Amgen Inc. | Methods for Removing Viral Contaminants During Protein Purification |
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SI3067417T1 (sl) | 2009-06-16 | 2018-11-30 | Genzyme Corporation | Izboljšani postopki čiščenja vektorjev rekombinantnega AAV |
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