KR20170100659A

KR20170100659A - 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법

Info

Publication number: KR20170100659A
Application number: KR1020177021403A
Authority: KR
Inventors: 야스히로 카와노; 슈오하오 황; 타츠지 에노키; 마사나리 키타가와
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2017-09-04
Also published as: JP6616329B2; EP3243904A4; US20180273907A1; CN107109374B; WO2016111343A1; JPWO2016111343A1; KR102493350B1; CN107109374A; US10415020B2; EP3243904A1

Abstract

비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료에, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질을 첨가하고, 당해 물질을 첨가 후의 시료를 산성으로 하는 공정에서 발생한 침전물을 제거하는 것에　의해, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획을 얻는 공정을 포함하는, 비엔벨로프 바이러스 입자를 얻기 위한 제조방법이 제공된다.

Description

비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법

본 발명은 비(非)엔벨로프 바이러스 입자를 번잡한 조작 없이, 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

현재, 유전자 재조합 분야나 의료 분야에 있어서는 인간을 포함하는 포유동물 세포에 유전자를 도입하는 방법으로서, 전기천공이나 금속미립자를 사용하는 물리적 방법, 핵산, 폴리 카티온, 혹은 리포솜을 사용하는 화학적 방법 등에 부가해서, 생물학적 공정으로서 바이러스 유래의 유전자 도입용 벡터(이하, 바이러스 벡터)를 사용하는 방법이 있다. 바이러스 벡터란 천연 유래의 바이러스를 개변하고, 소망하는 유전자 등을 표적으로 이입할 수 있도록 한 벡터로, 최근 기술개발이 진행되고 있다. 일반적으로, 유전자 재조합 기술을 사용해서 제작한 바이러스 벡터는 유전자 재조합 바이러스 벡터라고 불리지만, 그러한 유전자 재조합 바이러스 벡터의 유래가 되는 바이러스로서는 레트로바이러스나 렌티바이러스, 센다이바이러스, 및 헤르페스바이러스 등의 엔벨로프를 가지는 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(이하, AAV) 등의 엔벨로프를 가지지 않는 바이러스(이하, 비엔벨로프 바이러스)가 잘 알려져 있다.

특히 AAV는 인간을 포함하는 광범위한 종의 세포에 감염 가능하며, 혈구, 근육, 신경세포 등의 분화를 끝낸 비분열 세포에도 감염하는 점, 인간에 대한 병원성이 없기 때문 부작용의 걱정이 낮은 점, 바이러스 입자가 물리화학적으로 안정한 점 등으로부터, 선천성 유전자 질환의 치료 이외에, 암이나 감염증의 치료를 목적으로 한 유전자 치료법에 사용하는 유전자 도입용 벡터로서의 이용가치가 최근 주목받고 있다.

유전자 재조합 바이러스의 제조방법으로서는 통상, 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소를 핵산 구축물의 형태로 세포에 도입하고, 바이러스를 생산하는 능력을 가지는 세포(이하, 바이러스 생산세포)를 제작하고, 당해 세포를 배양해서 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소를 발현시킴으로써 이루어진다. 일반적으로는, 상기 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소 가운데, 시스 공급을 필요로 하는 것과 트랜스 공급 가능한 것을 분리해서 바이러스 생산용의 세포에 도입함으로써, 야생형 바이러스의 생산, 및 유전자 재조합 바이러스 감염부위에서의 자립 복제를 방지하는 방법이 취해진다(특허문헌 1).

이하, AAV를 유래로 한 유전자 재조합 바이러스(이하, rAAV) 벡터를 예로 들어 구체적으로 설명하면, 1) 야생형 AAV 게놈의 양단 ITR을 남기고, rep, cap 유전자를 제외한 핵산을 플라스미드에 탑재한 rAAV 플라스미드의 도입, 2) Rep, Cap 단백질을 트랜스에 공급하기 위한 rep, cap 유전정보 발현 플라스미드의 도입, 부가해서 AAV는 그 감염성 바이러스 입자 형성에 헬퍼바이러스라고 불리는 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 또는 백시니아바이러스 등의 어느 하나의 바이러스로부터의 보조 요소의 공급을 필요로 하기 때문에, 3) 아데노바이러스 감염을 사용하는 방법이 확립되고 있다. 또 상기 방법을 사용하면, 이론 상, 제조된 벡터액 중에 아데노바이러스가 혼입하지만, 그것을 회피하기 위해서, 상기 3)을 대신해서 3') 아데노바이러스 유래 요소 가운데, AAV의 바이러스 입자 형성에 필수적인 요소만을 발현하는 헬퍼 플라스미드의 도입을 사용하는 제조방법(헬퍼 프리 시스템)이 개발되었다.

바이러스 생산이 달성된 바이러스 생산세포는 그 후에 회수, 파쇄되고, 수득된 rAAV 입자를 포함하는 세포 파쇄액을 적당하게 필터 여과, 초원심, 크로마토그래피, 또는 한외여과 등의 공정에 적용하는 것에 의해서 rAAV 입자가 정제되고, 최종 제조물이 된다.

현재, 유전자 재조합 바이러스 벡터의 이용이 유전자치료의 기초연구, 또는 임상 응용의 분야에 넓어짐에 따라서, 더욱 고역가, 고순도의 rAAV 입자를 취득하는 방법이 필요로 되어, 각종 개량 방법이 개시되고 있다. 예를 들면, 배양액의 pH를 상승시킨 스트레스 조건하에서 바이러스 생산세포를 배양함으로써, rAAV 입자의 생산과 당해 입자의 배양 상청으로의 방출비율을 재촉하는 방법(특허문헌 1)이 알려져 있지만, 그 이외는 생산된 rAAV 입자의 정제 이후의 공정에 관한 연구(고안)이다. 또, rAAV 입자의 정제에 있어서는 초원심이나 크로마토그래피를 사용하지 않고 여러가지의 세로타입(serotype)(이하, 혈청형 라고도 한다)의 rAAV 입자를 정제하는 방법이 제안되고 있다 (비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 그러나, 당해 방법은 폴리에틸렌글리콜(PEG)상과 수상의 2상 분할방법, PEG 침전, 클로로포름 처리, 및 투석에 4종류의 처리공정을 포함하는 복잡한 정제 방법인 것에 첨가하고, 순도 위에서도 SDS-PAGE에 있어서 불순물이라고 생각되는 밴드가 다수 인정되고 있어, 순도 및 간편함이라고 하는 관점으로부터 보면 충분하지 않다. 이상과 같이, rAAV 입자를 정제에 적용하는 전에 실시되는 바이러스 생산세포의 처리방법, 및 rAA 입자의 정제 방법에 대해서는 여전히 개선의 여지가 남아 있다.

국제공개 제2000/14205호 팸플릿

J. Virol. Methods, 제183권, 제2호, 139∼146쪽 (2012년) Bioengineered, 제4권, 제2호, 103∼106쪽 (2013년)

본 발명의 목적은 번잡한 조작 없이, 고순도의 비엔벨로프 바이러스 입자를 얻기 위한 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 번잡한 조작 없이, 고순도의 비엔벨로프 바이러스 입자를 얻기 위한 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 예의 연구한 결과, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료에, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질을 첨가하고, 당해 물질을 첨가 후의 시료를 산성으로 하는 공정에서 발생한 침전물을 제거하는 것에 의해, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획을 얻는 것이 할 수 있는 일을 찾아내고, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다:

[1] 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법으로써,

(a) 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료에, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질을 첨가하는 공정;

(b) 상기 물질을 첨가한 시료를 산성으로 하는 공정; 및

(c) 상기 (b)공정에서 발생한 침전물을 제거하고, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획을 취득하는 공정;을 포함하는 방법.

[2] 상기 [1]에서, (c)공정의 후에, 추가로, (d) 비엔벨로프 바이러스 입자를 정제하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

[3] 상기 [1]에서, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질이 계면활성제인 방법.

[4] 상기 [1]∼ [3] 중 어느 하나에서, 산성으로 하는 공정이 산성의 용액을 첨가하는 공정인 방법.

[5] 상기 [1]∼ [4] 중 어느 하나에서, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료가,

비엔벨로프 바이러스 생산세포의 용해물 혹은 파쇄물, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 배양 상청액, 또는 비엔벨로프 바이러스 생산세포로부터 수득되는 추출물인 방법.

[6] 상기 [5]에서, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료가,

비엔벨로프 바이러스 생산세포를 산성의 용액으로 처리해서 수득되는 추출물의 중화물인 방법.

[7] 상기 [1]∼ [6] 중 어느 하나에서, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료가,

추가로, 뉴클레아제 처리가 실시된 시료인 방법,

[8] 상기 [1]∼ [7] 중 어느 하나에서, 비엔벨로프 바이러스 입자가 아데노 관련 바이러스 입자인 방법.

[9] 상기 [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 방법을 실시하기 위한 키트로써,

(1) 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질; 및

(2) 산성의 용액;을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.

[10] 상기 [9]에서, 중화액을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.

본 발명에 의해, 번잡한 조작 없이, 고순도의 비엔벨로프 바이러스 입자를 얻기 위한 제조방법이 제공된다.

도 1은 실시예 1에서 조제한 샘플의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 조제한 샘플의 회수율을 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 조제한 샘플의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 3에서 조제한 샘플의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 6에서 조제한 샘플의 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 도면이다.

본 명세서에 있어서 비엔벨로프 바이러스란, 엔벨로프 바이러스 이외의 바이러스를 가리킨다. 여기에서 엔벨로프 바이러스란 바이러스 표면에 지질층 혹은 지질 이중층을 가지는 바이러스를 가리킨다. 비엔벨로프 바이러스의 대표적인 것으로서는 DNA를 게놈으로 하는 바이러스에 대해서는 아데노바이러스, 파보바이러스, 파포바바이러스, 인간 유두종 바이러스 등, RNA를 게놈으로 하는 바이러스에 대해서는 로타바이러스, 콕사키바이러스, 엔테로바이러스, 사포바이러스, 노로바이러스(norovirus), 폴리오바이러스, 에코바이러스, A형 간염바이러스, E형 간염바이러스, 라이노바이러스, 아스트로바이러스 등이 예시된다.

본 발명의 제조방법이 적용되는 비엔벨로프 바이러스는 특별하게 한정은 없고, 이미 생산 방법이 알려진 비엔벨로프 바이러스일 수도, 천연으로부터 새롭게 취득된 비엔벨로프 바이러스, 또는 그것들을 유래로 하는 유전자 재조합 바이러스 벡터일 수도 있다. 본 발명의 제조방법으로 제조되는 비엔벨로프 바이러스에는 호적하게는 아데노바이러스, 또는 파보바이러스과의 AAV가 예시된다. 본 발명의 제조방법은 공지의 모든 혈청형의 AAV에도 적용 가능하며, 예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 및 AAV13으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 1종의 AAV의 제조에 이용할 수 있다. 또, 본 명세서에 있어서 rAAV의 혈청형에 대해서 기술하는 경우, 캡시드(capsid)의 유래가 되는 혈청형을 기준으로 한다. 즉, rAAV 조제 시에 사용되는 cap 유전자의 유래에 따라서 그 rAAV의 혈청형을 결정하는 것으로 하고, rAAV 입자 중에 봉입되어 있는 AAV게놈의 혈청형 유래에는 의존하지 않는 것으로 한다. 예를 들면, 캡시드가 AAV6 유래이고, rAAV 입자 중에 봉입되어 있는 AAV게놈 중의 ITR이 AAV2 유래의 경우에는, 본 명세서 중에서는 당해 rAAV는 혈청형 6으로 한다. 또, 상기의 각 혈청형의 AAV의 캡시드의 돌연변이체를 포함하는 AAV의 제조에도 본 발명의 제조방법을 적용할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「바이러스 입자」란 캡시드라 불리는 단백질 각(proein shell)로 구성된 입자를 의미한다. 또 「바이러스 벡터」란 상기의 바이러스 입자에 포함되어 있는 바이러스 게놈(핵산형상)을 의미한다. 예를 들면, AAV의 경우, rAAV 입자는 캡시드라 불리는 단백질 각으로 구성된 입자로서 rAAV 벡터를 포함한다. 또, rAAV 벡터는 rAAV 입자 내에 존재하는 바이러스 게놈 DNA를 포함하는 것이다. 또 본 명세서에서는 「바이러스 입자」에는 바이러스 게놈을 포함하지 않고 있는 바이러스 유사입자(예를 들면, AAV 중공입자: 국제공개 제2012/144446호 팸플릿)의 경우도 포함한다. 특별하게 한정은 되지 않지만, rAAV 벡터 유래의 바이러스 유사입자, 또는 AAV 중공입자는 rAAV 입자의 범주이다.

본 명세서에 있어서, 산성이란 pH6.5 미만인 것을 말하고, 중성이란 pH6.5∼7.5이 것을 말하고, 염기성과는 pH7.5 초과인 것을 말한다.

이하에 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

(1) 본 발명의 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법

본 발명의 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법은,

(a) 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료에, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질을 첨가하는 공정,

(b) 상기 물질을 첨가한 시료를 산성으로 하는 공정, 및

(c) 상기 (b)공정에서 발생한 침전물을 제거하고, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획을 취득하는 공정, 을 포함하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로는, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료에, 우선 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질이 첨가된다. 당해 물질의 첨가는 고형물을 첨가해서 실시할 수도 있지만, 바람직하게는 미리 조제해 둔 용액을 소망하는 최종 농도가 되도록 첨가함으로써 실시된다. 당해 물질의 첨가 후는, 곧 다음 공정(b)으로 진행될 수 있지만, 바람직하게는 당해 물질의 첨가 후 잠시 방치한다. 방치온도 및 방치시간은 적당하게 결정할 수 있고, 특별하게 한정되지 않지만, 방치온도로서는 예를 들면 0∼40℃, 바람직하게는 4∼37℃, 방치시간으로서는 예를 들면 1분∼24시간, 바람직하게는 5분∼1시간을 들 수 있고, 예를 들면 37℃에서 30분간 방치한다.

본 발명의 방법에서 사용하는 「산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질」이란 중성 또는 염기성 조건과 비교해서, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 성질을 가지는 물질을 말한다. 당해 물질로서는 특별하게 본 발명을 한정하나 것은 아니지만, 시료 중의 단백질과의 상호작용에 의해 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키고, 침전시키는 성질을 가지는 것이 본 발명에 호적하다.

또, 본 발명의 방법에서 사용하는 「산성 조건하에서 침전하는 물질」이란 중성 또는 염기성 조건에서 산성 조건으로 변화되는 것에　의해, 자신이 침전하는 성질을 가지는 물질을 말한다. 당해 물질로서는 특별하게 본 발명을 한정하나 것은 아니지만, 산성 조건하에서 침전할 때에 시료 중의 단백질을 함께 침전시키는 성질을 가지는 것이 본 발명에 호적하다.

본 발명의 방법에서 사용하는 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질과 산성 조건하에서 침전하는 물질은 다른 것 일 수도 있고, 동일 물질일 수도 있다. 당해 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질은 특별하게 한정되지 않지만 계면활성제일 수도 있다. 당해 계면활성제는 아니온 표면활성제, 비이온성 계면활성제, 카티온 계면활성제 및 양성 계면활성제로 대별된다.

아니온 표면활성제란 음이온 계면활성제라고도 불리는 것으로, 수중에서 전리(ionize)해서 유기 아니온이 되는 것이다. 당해 아니온 표면활성제는 카복시산형, 설폰산형, 황산 에스테르형 및 인산 에스테르형으로 분류된다. 당해 카복시산형으 분류되는 것으로서는 데옥시콜산염, 콜산염 또는 라우로일 사르코신염이 예시된다. 또, 설폰산형으로서는 도데실황산염이 예시된다. 상기 염은 나트륨염, 리튬염이 호적하다.

비이온성 계면활성제란 수중에서 이온이 되지 않는 것을 말한다. 당해 비이온성 계면활성제는 에스테르형, 에테르형, 에스테르에텔형, 알칸올 아미드형, 당형 및 메틸글루카민형으로 분류된다. 상기 에스테르형으로서는 폴리에틸렌소르비탄모노라우레이트(Tween(등록상표) 20), 폴리에틸렌소르비탄모노팔미테이트(Tween(등록상표)40), 폴리에틸렌소르비탄모노스테아레이트(Tween(등록상표) 60) 또는 폴리에틸렌소르비탄모노올레이트(Tween(등록상표) 80) 등이 예시된다. 또, 에테르형으로서는 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르(Nonidet(등록상표) P-40), 폴리옥시에틸렌알킬에테르(BriJ(등록상표) L23, BriJ(등록상표) L58)가 예시된다. 에스테르에텔형으로서는 폴리에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌헥시탄 지방산 에스테르 또는 소르비탄 지방산 에스테르폴리에틸렌글리콜이 예시된다. 또 알칸올아미드로서는 N,N-비스[3-(D-글루콘아미드)프로필]데옥시콜아미드가 예시된다. 당형으로서는 알킬말토사이드, 알킬글루코피라노사이드가 예시된다. 메틸글루카민형으로서는 알킬-N-메틸글루카민이 예시된다.

카티온 계면활성제는 양이온 계면활성제라고도 불리는 것으로, 이것은, 수중에서, 전리해서 유기 카티온이 되는 것이다. 카티온 계면활성제는 알킬아민염형 및 제4급 암모늄염형으로 분류되며, 당해 알킬아민염형으로서는 모노메틸아민염산염, 디메틸아민염산염 또는 트리메틸아민염산염이 예시된다. 또, 제4급 암모늄염형으로서는 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드 또는 미리스틸트리메틸암모늄브로마이드 등이 예시된다.

양성 계면활성제란 분자 내에 아니온기와 카티온기의 양자를 겸비하고 있는 계면활성제이다. 수용액 중에서의 전리상태는 아미노산에 유사하고 있으며, 양성 계면활성제에는 아미노산 유도체가 많이 존재한다. 따라서 아미노산과 마찬가지로 등전점을 가지고, 등전점보다 알칼리성측에 있는 경우에는 아니온 표면활성제로서, 산성측에 있을 경우에는 카티온 계면활성제로서 작용한다. 상기 양성 계면활성제로서는 설포베타인이 예시된다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 라우릴설포베타인, 카프릴릴설포베타인, 옥틸설포베타인, 팔미틸설포베타인 또는 미리스틸설포베타인을 들 수 있다.

본 발명의 방법에서는 바람직하게는 산성 pH에서 불용화하는 아니온 표면활성제가 예시된다. 더욱 바람직하게는 카복시산형 아니온 표면활성제인 데옥시콜산 나트륨, 케노데옥시콜린산 나트륨, 콜산 나트륨, 글리코콜산 나트륨, 타우로콜산 나트륨, 타우로데옥시콜산 나트륨이 호적하게 사용된다. 특히 호적하게는 데옥시콜산 나트륨, 케노데옥시콜린산 나트륨, 콜산 나트륨이 사용된다.

본 발명의 방법의 공정(a)에 있어서는, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질을 고형물로서 첨가할 수도 있고, 또는, 미리 조제해 둔 당해 물질의 용액을 첨가할 수도 있다. 당해 물질의 용액 농도는 특별하게 한정되지 않고, 당업자가 적당하게 결정할 수 있다. 또, 당해 물질의 용액 조제에 사용하는 용매에는 특별하게 한정은 없고, 물, 완충액, 세포 배양용 배지 등, 적당하게 선택 가능하다. 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질은 소망하는 최종 농도가 되도록, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료에 첨가된다. 당해 물질의 소망 최종 농도는 산성 조건하에서 시료 중의 협잡 단백질을 침전시키는 농도일 수 있고, 특별하게 한정되지 않는다. 시료에 함유되는 비엔벨로프 바이러스의 종류나 당해 물질의 종류에 따라 다르지만, 예를 들면, 데옥시콜산 나트륨, 케노데옥시콜린산 나트륨, 또는 콜산 나트륨을 사용하는 경우의 최종 농도로서는 0.1∼2%(v/v), 바람직하게는 0.2∼1%(v/v)를 들 수 있다. 또, 개개의 비엔벨로프 바이러스에 의해 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질의 최적 농도가 다를 경우에는 적절한 농도를 결정하는 것은 당연한 것이다.

다음에, 본 발명의 방법에서는, 상기 물질이 첨가된 시료의 pH를 산성으로 한다. 이 공정에 있어서, 중성 또는 염기성의 시료를 산성으로 할 수 있으면, 그 방법에는 특별하게 한정은 없다. 산성으로 하는 수단으로서는 기체의 산을 버블링할 수도 있고 고체의 산을 첨가할 수 있다. 특히 바람직하게는 미리 조제해 둔 산성의 용액을 소망하는 최종 농도가 되도록 첨가하는 것이다. 본 발명에 사용되는 산으로서는 예를 들면, 시트르산, 아세트산, 말산, 인산, 염산, 황산, 질산, 락트산, 프로피온산, 부티르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 타르타르산, 벤조산, 설포살리실산, 포름산, 또는 그것들의 염, 또한 MES, Bis-Tris 등의 완충 영역이 pH6.5 미만의 굿 버퍼에서 선택되는 화합물이 예시된다. 산성의 용액으로서는 예를 들면, 상기 화합물을 함유하는 용액이 사용된다. 산성의 용액 조제에 사용하는 용매에는 특별하게 한정은 없고, 물, 완충액, 세포 배양용 배지 등, 적당하게 선택가능하다. 특히 호적하게는 시트르산, 및 그것들의 염을 함유하는 수용액이 사용된다. 상기의 산 또는 산성의 용액은 소망하는 최종 농도가 되도록 상기 시료에 첨가된다. 당해 소망하는 최종 농도는 상기 시료의 pH가 산성이 되도록 하는 농도일 수 있고, 특별하게 한정되지 않는다. 또, 당해 산성으로 한 후의 최종pH는 바람직하게는 pH6.5 미만이고, 더욱 바람직하게는 pH4∼6의 범위이다. 또, 개개의 비엔벨로프 바이러스에 의해 최적 pH가 다를 경우에는 적절한 pH를 결정하는 것은 당연한 것이다.

본 발명의 방법에서 사용하는 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 시료는 비엔벨로프 바이러스 생산세포 유래의 시료일 수도 있다. 당해 바이러스 생산세포는 특별하게 한정은 없고, 환경 중이나, 감염증의 환자 임상 검체 등으로부터 수득된 바이러스 생산세포일 수도 있고, 인위적으로 제작한 바이러스 생산세포일 수도 있다.

상기 비엔벨로프 바이러스 생산세포 제조용 세포로서는 특별하게 한정은 없고, 인간, 원숭이, 설치류 등의 포유 동물 세포, 호적하게는 트랜스펙션 효율이 높은 293 세포(ATCCCRL-1573)이나 293T/17 세포(ATCCCRL-11268), 293F 세포, 293FT 세포(모두, Life Technologies Corporatio.), G3T-hi 세포(국제공개 제2006/035829호 팸플릿), Sf9 세포(ATCCCRL-1711), 시판하고 있는 바이러스 생산용 세포주, AAV293 세포(Stratagene사)가 예시된다. 또, 예를 들면, 상기 293 세포 등은 아데노바이러스 E1 단백질을 항상적으로 발현하지만, 이러한, rAAV 생산에 필요한 단백질의 하나, 또는 몇개를 일과적 혹은 항상적으로 발현하도록 개변한 세포일 수도 있다. 이것들의 여러 가지의 세포에 대해서, 공지의 방법이나 시판하고 있는 키트를 사용해서 비엔벨로프 바이러스 벡터를 도입하고, 비엔벨로프 바이러스 생산세포로 할 수 있다. 또, 당해 세포의 배양은 공지의 배양조건으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 온도 30∼37℃, 습도 95% RH, CO₂ 농도 5∼10%(v/v)에서의 배양이 예시되지만, 본 발명은 이러한 조건에 한정되는 것은 아니다. 소망하는 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 증식이나 비엔벨로프 바이러스의 생산을 달성할 수 있는 것이라면 상기의 범위 이외의 온도, 습도, CO₂농도로 실시할 수도 있다. 또, 배양기간은 특별하게 한정은 없고, 예를 들면 12∼150시간, 호적하게는 48∼120시간이다.

비엔벨로프 바이러스 생산세포로서 예를 들면, rAAV 생산세포를 예로 들어 설명하면 rAAV 입자형성에 필수적인 요소로서, (A) AAV 유래 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 및 Cap 단백질을 코딩하는 핵산, (B) 아데노바이러스 유래 요소, 예를 들면 E1a 단백질, E1b 단백질, E2 단백질, E4 단백질 및 VARNA를 공급하는 핵산, 및 (C) rAAV 입자에 봉입되는 핵산을 임의의 세포에 도입하는 것에　의해, rAAV 생산세포를 제작할 수 있다. 또, 상기의 (B)에 기재된 핵산으로 바꾸어서 아데노바이러스 등을 헬퍼바이러스로서 사용하는 방법도 알려져 있다.

상기의 AAV 유래 Rep 단백질을 코딩하는 핵산 및 Cap 단백질을 코딩하는 핵산, 및 상기의 아데노바이러스 유래 요소를 공급하는 핵산의 형태에는 한정은 없고, 각각의 요소를 공급가능한 하나 또는 복수의 핵산 구축물로서, 플라스미드나 바이러스 벡터에 탑재하고, 세포에 도입할 수 있다. 이것들의 핵산의 세포로의 도입은 예를 들면, 시판 또는 공지의 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 사용해서 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다.

상기의 rAAV 입자에 봉입되는 핵산은 AAV 유래의 ITR 서열과 rAAV 벡터에 탑재하는 것이 소망되는 핵산으로 구성된다. rAAV 벡터에 탑재하는 것이 소망되는 핵산으로서는 임의의 외래 유전자, 예를 들면 폴리펩티드(효소, 성장인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 데코이, RNA 간섭을 일으키는 RNA 등을 공급하는 핵산이 예시된다. 부가해서 외래 유전자의 발현 제어를 위해서 적당한 프로모터, 인핸서, 터미네이터나 기타의 전사조절요소가 상기의 핵산에 삽입될 수도 있다. 예를 들면, rAAV 입자에 봉입되는 핵산은 2개의 ITR 서열의 사이에 rAAV 벡터에 탑재하는 것이 소망되는 임의의 외래 유전자를 포함할 수도 있고, 또는, 2개의 ITR 서열의 사이에, rAAV 벡터에 탑재하는 것이 소망되는 임의의 외래 유전자 및 해당 외래 유전자의 발현 제어를 위한 1 이상의 요소를 포함할 수도 있다. rAAV 입자에 봉입되는 핵산은 핵산구축물로서 플라스미드의 형태로 세포에 도입할 수 있다. 상기의 플라스미드는 예를 들면 시판하고 있는 rAAV 벡터 플라스미드인 pAAV-CMV Vector 등(TAKARA BIO INC.)을 사용해서 구축할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료는 예를 들면, 상기한 바와 같이 배양된 비엔벨로프 바이러스 생산세포를 파쇄 혹은 용해해서 조제할 수 있다. 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 배양 중에 배양액에 비엔벨로프 바이러스 입자가 누출하는 경우에는 당해 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 배양액의 상청액을 시료로 할 수 있다. 또, 상기 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 파쇄 또는 용해는 초음파 처리, 동결융해 처리, 효소 처리, 삼투압 처리 등의 공지의 방법으로 실시 할 수 있다. 이렇게 해서 수득된 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 파쇄물 혹은 용해물 또는 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 배양 상청액의 pH가 중성 또는 염기성이라면, 상기 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료로서 그대로 사용할 수 있고, 그렇지 않은 경우에는, 중화하는 것에　의해서, 본 발명의 방법에서 사용하는 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료로 할 수 있다. 또, 본 명세서에서 중화란 특별하게 한정은 되지 않지만, 산성의 용액에 염기성의 용액이나 pH 완충액을 첨가하는 것을 의미하고, 중화 후의 용액(중화물)은 중성일 수도 있고, 염기성일 수도 있다. 염기성의 용액으로서는 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 수산화 나트륨 수용액, 수산화 칼륨 용액 등을 들 수 있다. 또, pH 완충액으로서는 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 Tris-HCl 용액 등을 들 수 있다.

또, 본 발명의 방법에서 사용하는 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료는 비엔벨로프 바이러스 생산세포를 산성의 용액으로 처리해서 수득되는 추출물의 중화물일 수도 있다. 즉, 비엔벨로프 바이러스 생산세포를 산성의 용액과 접촉시키는 것에 의해 수득된 시료를 중화한 것도 호적하게 사용할 수 있다. 이 공정은 배양 후에 원심분리나 여과에 의해 배양액을 제거해서 회수된 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 펠릿을 산성의 용액에 현탁하는 조작, 혹은 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 배양액에 배양액을 산성으로 할 수 있는 성분을 첨가하는 조작의해 실시된다. 상기 산성의 용액으로서는 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 배양 시의 pH보다 낮은 pH를 나타내며, 또 바이러스 생산이 달성된 비엔벨로프 바이러스 생산세포로부터 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 추출물을 취득할 수 있는 용액이라면 한정은 없다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 공정 (b)에서 사용되는 산성의 용액으로서 예시된 것과 동일한 용액을 사용할 수 있다. 상기 배양액을 산성으로 할 수 있는 성분으로서는 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 배양액 pH를 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 배양 시의 pH보다 낮은 pH로 하는 성분이며, 또, 바이러스 생산이 달성된 비엔벨로프 바이러스 생산세포로부터 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 추출물을 취득할 수 있는 성분이라면 한정은 없다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 공정(b)에서 사용되는 산으로서 예시된 것과 동일한 화합물을 사용할 수 있다. 상기 산성의 용액 또는 산성으로 할 수 있는 성분과 접촉하고 있을 때의 온도와 시간은 특별하게 한정은 없고, 온도로서는 예를 들면 0∼40℃, 호적하게는 4∼37℃, 시간으로서는 예를 들면 1분∼48시간, 호적하게는 5분∼24시간이 예시된다. 추가로 산성의 용액 또는 산성으로 할 수 있는 성분과 접촉시킨 상태 혹은 중화한 후의 상태에서, -80℃ 등의 초저온 냉장고에서 장기로 보존하는 것도 가능하다. 이 접촉 조작에 의해 비엔벨로프 바이러스는 바이러스 생산세포 외로 방출된다.

또 본 발명의 방법에서 사용하는 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료는 미리 뉴클레아제 처리가 실시된 시료일 수도 있다. 예를 들면, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질을 첨가하기 전에 뉴클레아제 처리를 실시할 수도 있다. 당해 공정에서 사용하는 뉴클레아제는 추출물 중의 DNA에 작용하는 것이 바람직하고, 예를 들면, Benzonase(등록상표; Merck Millipore Corporation.), Cryonase Cold-active nuclease(TAKARA BIO INC.) 등이 예시된다. 해당 뉴클레아제 처리의 온도 및 시간, 뉴클레아제의 양 등의 조건은 사용하는 효소의 종류에 따라서 적당하게 결정할 수 있으며, 특별하게 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에서 발생한 침전물을 제거하고, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획을 취득하는 공정이란, 산성으로 하는 공정에서 발생한 침전물을 제거하고, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획을 취득하는 공정을 가리킨다. 침전의 제거는 여과와 같은 공지의 고액분리방법으로 실시할 수 있다. 호적하게는 원심분리에 의해 실시된다.

상기의 침전물의 제거 공정을 거쳐서 수득된, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획은, 추가로 정제하는 공정을 실시할 수도 있다. 또, 당해 정제공정에 의해, 비엔벨로프 바이러스 입자가 농축될 수도 있다. 당해 정제방법으로서는 초원심, 크로마토그래피, 한외여과, 기타 공지의 방법이 예시된다.

상기 한외여과란 한외 여과막을 사용하는 여과이다. 한외 여과막은 물리적으로 명료한 다수의 미세한 구멍을 가지는 분리막이다. 한외 여과막의 분화 분자량은 비엔벨로프 바이러스 정제의 점 및 불순물제거의 점으로부터 50∼300kDa인 것이 바람직하고, 70∼150kDa인 것이 더 바람직하고, 100kDa인 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면, 분화 분자량이 100kDa의 한외 여과막 Amicon(등록상표) Ultra-15(Merck Millipore Corporation., 이하, 100kDa의 한외 여과막이라고 기재한다)에 의해 실시할 수 있다. 이 때, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨가하는 것에　의해, 비엔벨로프 바이러스 입자의 회수율을 개선할 수 있다. 첨가하는 PEG에는 특별하게 한정은 없고, 여러 가지의 평균분자량의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면 평균분자량 200∼10,000의 PEG, 바람직하게는 평균분자량 4,000∼8,000의 PEG가 본 발명에서는 사용된다. 더욱 바람직하게는 평균분자량 6,000의 PEG를 사용할 수 있다.

또, 상기 크로마토그래피에 의한 비엔벨로프 바이러스 입자의 정제는 이온교환컬럼(예를 들면, mustang Q(pall사))나 어피니티 칼럼(예를 들면, AVB Sepharose(등록상표) (GE사)나 헤파린 칼럼 등), 수산화 인회석 칼럼 등에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 비엔벨로프 바이러스 입자는 바람직하게는 아데노 관련 바이러스 입자이다.

본 발명의 방법에서는 비엔벨로프 바이러스 입자의 취득 정도는 평가 방법으로서 비엔벨로프 바이러스의 역가 등을 사용해서 나타난다. 상기 비엔벨로프 바이러스의 역가는 특별하게 한정은 없지만, 일정량의 시료 중의 (a) 비엔벨로프 바이러스의 게놈 개수(게놈 역가), (b) 실험적으로 측정되는 비엔벨로프 바이러스의 세포에의 감염능력 (감염 역가), 또는 (c) 비엔벨로프 바이러스를 구성하는 단백질의 순도를 측정하는 방법을 들 수 있다.

상기 (a)의 방법으로서는 시료 중의 바이러스 게놈의 카피 수를 PCR법으로 측정하는 방법이 예시된다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면, 게놈 역가 측정에는, AAVpro(등록상표) Titration Kit(for Real Time PCR) Ver.2(TAKARA BIO INC.)를 사용하고, 사용설명서에 기재된 방법으로 게놈 역가를 산출할 수 있다.

또, (b)의 방법으로서는 예를 들면 시료의 연속 희석액을 적당한 표적세포에 감염시키고, 세포의 형상변화(세포 변성)를 검출하는 방법, 도입 유전자의 발현을 검출하는 방법, 세포에 도입된 바이러스 게놈의 카피 수를 측정하는 방법 등이 예시된다.

또 (c)의 방법으로서는 예를 들면 당해 단백질을 SDS-PAGE로 해석하는 방법 혹은 면역적 수법으로 정량하는 방법 등이 예시된다.

(2) 본 발명의 제조방법 위한 키트

본 발명의 키트는 상기 (1)에 기재된 비 바이러스 엔벨로프 바이러스 입자를 제조하는 방법을 실시하기 위한 키트이로써, (1) 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질, 및 (2) 산성의 용액을 함유하는 것을 특징으로 한다. 당해 산성 조건하에서 침전하는 물질은, 상기 (1) 본 발명의 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법에서 설명한, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질이 호적하게 사용될 수 있다. 또, 당해 산성의 용액은 상기 (1) 본 발명의 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법에서 설명한, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질이 첨가된 시료의 pH를 산성으로 하는 공정에서 사용할 수 있는 것이라면 특별하게 한정되지 않는다. 본 발명의 키트에 대해서는 추가로, 중화액을 포함할 수도 있다. 당해 중화액은 호적하게는 염기성의 용액이나 pH 완충액이다. 염기성의 용액으로서는 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 수산화 나트륨 수용액, 수산화 칼륨 용액 등을 들 수 있다. 또, pH 완충액으로서는 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 Tris-HCl 용액 등을 들 수 있다. 또, 비엔벨로프 바이러스 생산세포로부터의 추출물의 조제에 사용되는 시약이나, 비엔벨로프 바이러스 입자의 형성에 필수적인 요소를 공급하는 핵산을 포함하는 플라스미드, 비엔벨로프 바이러스 입자에 봉입되는 핵산을 포함하는 플라스미드 등을 포함하는 키트로서도 좋다.

본 발명에 의해, 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법 이외에, 당해 제조방법에 사용되는 키트, 및 당해 제조방법에서 제조한 비엔벨로프 바이러스 입자도 제공된다. 본 발명의 제조방법을 사용해서 취득한 비엔벨로프 바이러스 입자는 의약 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다. 당해 의약 조성물은 환자 유래의 세포에 체외에서 사용하거나, 혹은 환자에게 직접 투여할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 rAAV5의 정제

(1) rAAV 제조용 세포의 파종

조직배양처리 T225 플라스크(Corining Incorporatio.)에, 10% FBS(Gibco사)를 포함하는 DMEM(Sigma Corporation.)에 현탁한 293T/17 세포를 파종했다. 그 후에 37℃, CO₂ 농도 5%(v/v)의 CO₂ 인큐베이터에서 2일간 배양했다.

(2) rAAV5 제조용 플라스미드의 트랜스펙션

실시예 1-(1)에서 수득된 세포에, 칼슘인산염법을 사용해서 AAV2의 Rep 단백질 및 AAV5의 Cap 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 pRC5 Vector(TAKARA BIO INC.), 아데노바이러스의 E2A, VA, V4을 코딩하는 서열을 포함하는 pHelper Vector(TAKARA BIO INC.), AAV2 게놈에 2개의 ITR의 사이에 형광 단백질 ZsGreen1의 발현 카세트를 포함하는 pAAV-ZsGreen1 Vector(TAKARA BIO INC.)를 각각 25㎍씩 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 6시간 후, 배지를 완전하게 제거하고, 2% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 DMEM을 플라스크 1장당 40㎖ 첨가하고, 37℃, CO₂ 농도 5%(v/v)의 CO₂ 인큐베이터에서 2일간 배양했다.

(3) 시트르산 버퍼 처리에 의한 추출액의 취득

실시예 1-(2)에서 수득된 각 플라스크에, 0.5M EDTA(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.5㎖를 첨가하고, 실온에서 수분간 방치함으로써 세포를 박리시켰다. 그 후에 용액별로 세포를 회수하고, 1,750×g, 4℃, 10분간 원심 후, 상청액을 제거했다. 세포 펠릿을 2㎖의 시트르산 버퍼(38.1mM 시트르산, 74.8mM 시트르산 나트륨, 75mM 염화 나트륨, 100mM 염화 마그네슘, pH5)에서 재현탁하고, 15초간 볼텍스 믹서에서 혼화를 실시하고, 실온에서 5분간 방치, 재차 15초간 볼텍스 믹서에서 혼화를 실시했다. 그 후에 4,000×g, 4℃, 10분간 원심을 실시하고, 상청액을 회수했다. 수득된 상청액에 1/10량의 2M Tris-HCl(pH9.5)을 첨가한 용액을 추출액으로 했다.

(4) 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 침전물생성과 그것의 제거

실시예 1-(3)에서 수득된 추출액에, 1/100량의 20U/㎕ Cryonase(등록상표) Cold-active Nuclease(TAKARA BIO INC.)를 첨가 후(최종 농도 0.2U/㎕), 37℃에서 1시간 반응시켰다. 샘플을 5등분하고, 샘플 1에는 1/10량의 1M 시트르산만을 첨가했다. 샘플 2에는, 1/10량의 5%(v/v) 데옥시콜산 나트륨만을 첨가했다. 샘플 3에는 1/10량의 5%(v/v) 데옥시콜산 나트륨을 첨가하고, 37℃에서 30분간 방치 후, 추가로 1/40량의 1M 시트르산을 첨가했다. 샘플 4에는 1/10량의 5%(v/v) 데옥시콜산 나트륨을 첨가하고, 37℃에서 30분간 방치 후, 추가로 1/20량의 1M 시트르산을 첨가했다. 샘플 5에는 1/10량의 5%(v/v) 데옥시콜산 나트륨을 첨가하고, 37℃에서 30분간 방치 후, 추가로 1/10량의 1M 시트르산을 첨가했다. 각각의 샘플에 대해서, pH를 측정한 결과를 표 1에 나타낸다.

모든 샘플에서 침전물이 발생했으므로, 샘플을 5,000×g, 4℃, 5분간 원심을 실시하고, 상청액을 회수하는 것에　의해 침전물을 제거했다. 회수한 상청액을 포어직경 0.45㎛의 PVDF제의 가압식 필터 유닛 Millex(등록상표) (Merck Millipore Corporation., 이하, 포어직경 0.45㎛의 필터라고 기재한다)로 여과한 용액을 농축전 rAAV5(샘플 1∼5)로 했다.

(5) 농축전 rAAV5의 순도 확인

실시예 1-(3)에서 수득된 추출액 및 실시예 1-(4)에서 수득된 5종의 농축전 rAAV5에, 각각 등량으로 5×샘플 버퍼(TAKARA BIO INC.)를 첨가해서 혼합하고, 95℃, 10분간 처리를 실시했다. 각 처리액 4㎕을 4-12% 폴리아크릴아미드겔에 어플라이해서 전기영동을 실시했다. 영동 종료 후, 겔을 적당량의 Oriole 형광 겔 스테인 용액(Bio-Rad사)에 담그고, 차광해서 90분간 진탕했다. 진탕 후의 겔을 Luminoshot 400(TAKARA BIO INC.)로 촬영했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1 중, 레인(lane) C는 추출액, 레인 1∼5는 농축전 rAAV5(샘플 1∼5)이다.

도 1 중의 밴드는 전부 협잡 단백질의 밴드이다. 농축전의 단계에서는 rAAV5의 농도가 옅기 때문에, rAAV5의 밴드는 확인할 수 없다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 레인 1과 레인 2는 레인 C에 비해서 협잡 단백질의 밴드가 적었다. 이것은, rAAV5와 협잡 단백질의 혼합물에 시트르산을 첨가하는 것이나 데옥시콜산 나트륨을 첨가하는 것에　의해, 협잡 단백질을 침전시키고, 제거할 수 있는 것임을 나타낸다. 또, 도 1에 나타내는 바와 같이, 레인 3∼5은 레인 1이나 레인 2에 비해서 협잡 단백질의 밴드가 더 적었다. 이것은, 데옥시콜산 나트륨 첨가와 시트르산 첨가를 조합시키는 것에　의해, 추가로 효율적으로, 협잡 단백질을 침전시키고, 제거할 수 있는 것임을 나타낸다. 또, 협잡 단백질의 제거 효율은 데옥시콜산 나트륨 및 시트르산의 첨가량에 의존해서 변화되는 것으로 나타났다. 즉, 레인 4와 레인 5의 협잡 단백질의 밴드가 매우 적다는 점에서, 데옥시콜산 나트륨의 최종 농도를 0.5%(v/v)로 하고, pH4∼6이 되도록 시트르산을 첨가하면, 협잡 단백질이 효율적으로 제거되었다.

(6) 농축전 rAAV5의 회수율 측정

실시예 1-(3)에서 수득된 추출액 및 실시예 1-(4)에서 수득된 5종의 농축전 rAAV5의 게놈 역가를 측정했다. 게놈 역가 측정에는 AAVpro(등록상표) Titration Kit(for Real Time PCR) Ver.2(TAKARA BIO INC.)를 사용하고, 반응액의 조제 등의 조작은 키트 첨부의 설명서에 따랐다. 수득된 게놈 역가의 데이터를 사용해서 하기 식에 따라서 총 게놈 역가를 산출했다.

총 게놈 역가(VG) = 게놈 역가(VG/㎖)×총액량 (㎖)

추출액의 총 게놈 역가를 100으로 했을 때의 상대값(회수율)을 도 2에 나타낸다. 도 2 중, 종축은 회수율(%), 횡축의 레인 C는 추출액, 레인 1∼5는 농축전 rAAV5(샘플 1∼5)이다.

도 2에 나타내는 바와 같이, 샘플 1∼5의 회수율은 99% ∼113%이고, 100%에 가까웠다. 이것은, 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 rAAV5의 정제에 있어서, rAAV5의 회수율이 매우 높은 것을 나타낸다.

도 1과 도 2의 결과에 의해, 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 rAAV5의 정제는 매우 효율이 좋은 정제 방법인 것이 밝혀졌다. 즉, 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의해, 협잡 단백질을 침전시키고, 제거할 수 있다. 특히, 데옥시콜산 나트륨의 최종 농도를 0.5%(v/v)로 하고, pH4∼6이 되도록 시트르산을 첨가하는 것에　의해, rAAV5을 높은 회수율로 정제할 수 있음이 밝혀졌다.

실시예 2: rAAV5의 정제와 농축

(1) 데옥시콜산 나트륨 및 시트르산의 첨가량의 검토

실시예 1-(1)∼(3)과 동일한 방법으로 추출액을 취득했다. 수득된 추출액에, 1/100량의 20U/㎕ Cryonase(등록상표) Cold-active Nuclease를 첨가 후(최종 농도 0.2U/㎕), 37℃에 1시간 반응시켰다. 샘플을 4등분하고, 1/10량 또는 1/20량의 5%(v/v)데옥시콜산 나트륨을 첨가하고, 37℃에 30분간 방치 후, 또한 1/20량 또는 1/30량의 1M 시트르산을 첨가했다. 각각의 샘플에 대해서, pH를 측정한 결과를 표 2에 나타낸다.

모든 샘플에서 침전물이 발생했으므로, 샘플을 5,000×g, 4℃, 5분간 원심을 실시하고, 상청액을 회수하는 것에　의해, 침전물을 제거했다. 회수한 상청액을 포어직경 0.45㎛의 필터로 여과한 것을 농축전 rAAV5로 했다.

(2) 한외 여과막에 의한 rAAV5의 정제와 농축

실시예 2-(2)에서 수득된 농축전 rAAV5를 100kDaK의 한외 여과막(Merck Millipore Corporation.)에 넣고, 2,000×g, 4℃, 10분간 원심하고, 그 여과액을 폐기했다. 또, 「한외 여과막에 10㎖의 D-PBS를 첨가 후, 현탁하고, 상기의 조건으로 원심하고, 그 여과액을 폐기하는 조작(세정 조작)」을 5회 반복하고, 최종 농축액을 정제 rAAV5(샘플 a∼d)로 했다. 이것들 일련의 조작에 의해, 저분자량의 불순물을 제거하는 동시에 rAAV5를 10배로 농축했다.

(3) rAAV5의 순도확인

실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 실시예 2-(2)에서 수득된 정제 rAAV5의 순도를 확인했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3 중, 레인 M은 Protein Molecular Weight Marker(Broad)(TAKARA BIO INC., 위에서부터 200, 116, 97, 66, 44, 29, 20kDa), 레인 a∼d는 정제 rAAV5(샘플 a∼d)이다.

도 3 중, 3개의 굵은 밴드는 rAAV5의 구조 단백질(VP1, VP2, VP3)의 밴드, 기타의 밴드는 협잡 단백질의 밴드이다. 도 3에 나타내는 바와 같이, 레인 a는 협잡 단백질의 밴드가 적었다. 이것은, 데옥시콜산 나트륨 첨가(최종 농도 0.5%(v/v))와 시트르산 첨가(pH5)에 의해 발생한 침전물을 제거 후, 추가로 100kDaK의 한외 여과막 처리하는 것에 의해 rAAV5를 정제 및 농축할 수 있는 것임을 나타낸다.

실시예 3: 여러 가지 세로타입의 rAAV ( rAAV1 , rAAV2 , rAAV3 , rAAV6 )의 정제

(1) rAAV 제조용 세포의 파종

실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 rAAV제조용 세포를 파종했다.

(2) rAAV 제조용 플라스미드의 트랜스펙션

실시예 1-(2)와 동일한 방법으로 rAAV 제조용 플라스미드를 실시예 3-(1)에서 수득된 세포에 트랜스펙션했다. 단, 조제하는 rAAV의 세로타입에 맞추어서, pRC5 Vector의 대신에, pRep-Cap1 AAV Helper Plasmid(Applied Viromics사), pRC2-mi342 Vector(TAKARA BIO INC.), pRep-Cap3 AAV Helper Plasmid(Applied Viromics사), pRC6 Vector(TAKARA BIO INC.)를 사용했다.

(3) 시트르산 버퍼 처리에 의한 추출액의 취득

실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 각 세로타입의 rAAV의 추출액을 취득했다.

(4) 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 침전물의 생성과 그것의 제거

실시예 3-(3)에서 수득된 각 추출액에, 1/100량의 20U/㎕ Cryonase(등록상표) Cold-active Nuclease를 첨가 후(최종 농도 0.2U/㎕), 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후에 각 샘플에 1/10량의 5%(v/v) 데옥시콜산 나트륨을 첨가하고, 37℃에서 30분 이상 방치 후, 추가로 1/20량의 1M 시트르산을 각 샘플에 첨가했다. 각각의 샘플에 대해서, pH를 측정한 바, pH4∼6이었다.

모든 샘플에서 침전물이 발생했으므로, 샘플을 5,000×g, 4℃, 5분간 원심을 실시하고, 상청액을 회수하는 것에　의해, 침전물을 제거했다. 회수한 상청액을 포어직경 0.45㎛의 필터로 여과한 것을 농축전 rAAV로 했다.

(5) 한외 여과막에 의한 rAAV의 정제와 농축

실시예 3-(4)에서 수득된 농축전 rAAV를 100kDaK의 한외 여과막에 넣고, 2,000×g, 4℃, 5분 이상 원심하고, 그 여과액을 폐기했다. 추가로 「한외 여과막에 14㎖의 D-PBS를 첨가 후, 현탁하고, 상기의 조건으로 원심하고, 그 여과액을 폐기하는 조작(세정 조작)」을 5회 반복하고, 최종 농축액을 정제 rAAV로 했다. 이것들 일련의 조작에 의해, 저분자량의 불순물을 제거하는 동시에 rAAV를 3∼5배로 농축했다.

(6) rAAV의 순도 확인

실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 각 세로타입의 rAAV의 추출액(레인 C), 농축전 rAAV(레인 Pre) 및 정제 rAAV(레인 F)의 순도를 확인했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.

도 4 중, 레인 C와 레인 Pre의 밴드는 전부 협잡 단백질의 밴드이다. rAAV는 이 단계에서는 농도가 옅기 때문에, rAAV의 밴드는 확인할 수 없다. 한편, 레인 F의 3개의 굵은 밴드는 rAAV의 구조 단백질(VP1, VP2, VP3)의 밴드이다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 각 세로타입의 rAAV에 있어서, 레인 Pre는 레인 C에 비해서 협잡 단백질의 밴드가 적었다. 이것은, rAAV의 세로타입에 관계없이, 데옥시콜산 나트륨 첨가와 시트르산 첨가에 의해, 불순물 단백질을 침전시키고, 제거할 수 있는 것임을 나타낸다. 또, 각 세로타입의 rAAV에 있어서, 레인 F는 rAAV의 구조 단백질(VP1, VP2, VP3)의 밴드 이외에, 협잡 단백질의 밴드는 거의 없었다. 이것은, rAAV의 세로타입에 관계없이, 100kDaK의 한외 여과막처리에 의해, rAAV를 농축하는 동시에 저분자량의 협잡 단백질을 제거할 수 있는 것임을 나타낸다.

(7) rAAV의 회수율측정

실시예 1-(6)와 동일한 방법으로 각 세로타입의 rAAV의 게놈 역가를 측정하고, 각 공정의 rAAV의 총 게놈 역가를 산출했다. 추출액의 총 게놈 역가를 100으로 했을 때의 상대값(회수율)을 표 3에 나타낸다.

표 3에 나타내는 바와 같이, 농축전 rAAV(Pre)의 회수율은 89% ∼120%이고, 100%에 가까웠다. 이것은, 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 rAAV의 정제에 있어서, rAAV의 세로타입에 관계없이, rAAV의 회수율이 매우 높은 것임을 나타낸다.

도 4와 표 3의 결과에 의해, rAAV의 세로타입에 관계없이, 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 rAAV의 정제는 매우 효율이 좋은 정제 방법인 것이 밝혀졌다. 즉, 데옥시콜산 나트륨의 최종 농도를 0.5%(v/v)로 하고, pH4∼6이 되도록 시트르산을 첨가하는 것에　의해, 협잡 단백질을 침전시키고, 제거할 수 있다. 또, 100kDaK의 한외 여과막 처리를 추가하는 것에　의해, 추가로 고순도의 rAAV를 수득되는 것이 분명하게 되었다.

실시예 4: 폴리에틸렌글리콜 첨가에 의한 rAAV6의 회수율 개선

(1) 농축전 rAAV6의 취득

실시예 3-(1)∼(4)와 동일한 방법으로 농축전 rAAV6을 취득했다.

(2) 한외 여과막에 의한 rAAV6의 정제와 농축(폴리에틸렌글리콜 첨가)

농축전 rAAV6을 3등분하고, 샘플 1은 폴리에틸렌글리콜 첨가없는 샘플로 했다. 샘플 2에는 최종 농도 0.4%(w/v)가 되도록, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-6000(SIGMA사) 용액을 첨가했다. 샘플 3에 최종 농도 0.8%(w/v)가 되도록, PEG-6000 용액을 첨가했다. 각각의 샘플을 100kDaK의 한외 여과막에 넣고, 2,380×g, 실온, 10분 이상 원심하고, 여과액을 폐기했다. 추가로 「한외 여과막에 각각의 최종 농도의 폴리에틸렌글리콜을 함유한 10∼14㎖의 PBS를 첨가 후, 현탁하고, 상기의 조건으로 원심하고, 그 여과액을 폐기하는 조작(세정 조작)」을 3회 반복했다. 샘플 2와 샘플 3에만 PBS에 의한 세정 조작을 추가로 실시하고, 최종 농축액을 정제 rAAV6로 했다. 이것들 일련의 조작에 의해, 저분자량의 불순물을 제거하는 동시에 rAAV6을 6∼12배로 농축했다.

(3) rAAV6의 회수율 측정

실시예 1-(6)과 동일한 방법으로 각 rAAV6의 게놈 역가를 측정하고, 각 공정의 rAAV6의 총 게놈 역가를 산출했다. 추출액의 총 게놈 역가를 100으로 했을 때의 상대값(회수율)을 표 4에 나타낸다.

표 4에 나타내는 바와 같이, 한외 여과막을 사용해서 rAAV6을 정제 및 농축할 때에, 폴리에틸렌글리콜을 첨가 하는 것에 의해 rAAV6의 회수율을 향상시킬 수 있었다. 기타 세로타입의 rAAV에 있어서도 한외여과를 실시할 때에 폴리에틸렌글리콜을 첨가하면, rAAV의 회수율을 향상시킬 수 있을 것으로 생각된다.

실시예 5: 여러 가지 종류의 산성 용액 검토

(1) rAAV6 추출액의 취득

실시예 3-(1)∼(3)과 동일한 방법으로 rAAV6 추출액을 취득했다.

(2) 데옥시콜산 나트륨 첨가 및 여러가지 종류의 산성 용액 첨가에 의한 침전물의 생성과 그것의 제거

실시예 5-(1)에서 수득된 rAAV6 추출액에, 1/100량의 20U/㎕ Cryonase(등록상표) Cold-active Nuclease를 첨가 후(최종 농도 0.2U/㎕), 37℃에서 1시간 반응시켰다. 샘플의 일부를 3등분한 후, 각 샘플에 1/10량의 5%(v/v) 데옥시콜산 나트륨을 첨가하고, 37℃에서 30분 이상 방치 후, 추가로 1/20량의 1M 시트르산, 1/20량의 1M 염산, 또는 1/20량의 1M 아세트산을 각각 첨가했다. 각각의 샘플의 pH를 측정하고, 산성인 것임을 확인했다. 각각의 샘플의 조건을 표 5에 나타낸다.

모든 샘플에서 침전물이 발생했으므로, 샘플을 5,000×g, 4℃, 5분간 원심을 실시하고, 상청액을 회수하는 것에　의해, 침전물을 제거했다. 회수한 상청액을 포어직경 0.45㎛의 필터로 여과한 것을 농축전 rAAV6으로 했다.

(3) 농축전 rAAV6의 순도 확인, 및 회수율 측정

실시예 1-(5)와 동일한 방법으로, 농축전 rAAV6의 순도를 확인한 바, 산성의 용액 종류에 관계 없이 동등한 순도를 나타냈다. 또, 실시예 1-(6)와 동일한 방법으로 농축전 rAAV6의 게놈 역가를 측정하고, 회수율을 산출한 바, 산성의 용액 종류에 관계 없이 동등한 회수율을 나타냈다. 이것은, rAAV와 협잡 단백질의 혼합물에 데옥시콜산 나트륨 및 산성의 용액을 첨가할 때에, 어떤 종류의 산성 용액을 사용해도, 협잡 단백질을 침전시키고, 제거할 수 있는 것임을 나타낸다.

실시예 6: 여러 가지 종류의 계면활성제 검토

(1) rAAV2 추출액의 취득

실시예 3-(1)∼(3)과 동일한 방법으로 rAAV2 추출액을 취득했다.

(2) 여러가지 계면활성제 첨가 및 시트르산 첨가에 의한 침전물의 생성과 그것의 제거

실시예 6-(1)에서 수득된 rAAV2 추출액에, 1/100량의 20U/㎕ Cryonase(등록상표) Cold-active Nuclease를 첨가 후(최종 농도 0.2U/㎕), 37℃에서 1시간 반응시켰다. 샘플의 일부를 3등분한 후, 각 샘플에 1/10량의 5%(v/v) 데옥시콜산 나트륨, 5%(v/v) 케노데옥시콜린산 나트륨, 또는 5%(v/v) 콜산 나트륨을 첨가하고, 37℃에서 30분 이상 방치 후, 추가로 1/20량의 1M 시트르산을 각각 첨가했다. 각각의 샘플의 pH를 측정하고, 산성인 것임을 확인했다. 각각의 샘플의 조건을 표 6에 나타낸다.

모든 샘플에서 침전물이 발생했으므로, 샘플을 5,000×g, 4℃, 5분간 원심을 실시하고, 상청액을 회수하는 것에　의해 침전물을 제거했다. 회수한 상청액을 포어직경 0.45㎛의 필터로 여과한 것을 농축전 rAAV2로 했다.

(3) 한외 여과막에 의한 rAAV2의 정제와 농축

실시예 6-(2)에서 수득된 농축전 rAAV2을 100kDa의 한외 여과막에 넣고, 2,000×g, 4℃, 5분 이상 원심하고, 그 여과액을 폐기했다. 추가로 「한외 여과막에 14㎖의 D-PBS를 첨가 후, 현탁하고, 상기의 조건으로 원심하고, 그 여과액을 폐기하는 조작(세정 조작)」을 5회 반복하고, 최종 농축액을 정제 rAAV2로 했다. 이것들 일련의 조작에 의해, 저분자량의 불순물을 제거하는 동시에 rAAV2를 농축했다.

(4) rAAV2의 순도 확인

실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 rAAV2 추출액(레인 C), 농축전 rAAV2(레인 Pre) 및 정제 rAAV2(레인 F)의 순도를 확인했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

도 5 중, 레인 C와 레인 Pre의 밴드는 전부 협잡 단백질의 밴드이다. rAAV2는 이 단계에서는 농도가 옅기 때문에, rAAV2의 밴드는 확인할 수 없다. 한편, 레인 F의 3개의 굵은 밴드는 rAAV2의 구조 단백질(VP1, VP2, VP3)의 밴드이다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 모든 계면활성제에 있어서, 레인 Pre는 레인 C에 비해서 협잡 단백질의 밴드가 적었다. 이것은, 계면활성제의 종류에 관계없이, 계면활성제 첨가와 시트르산 첨가에 의해, 불순물 단백질을 침전시키고, 제거할 수 있는 것임을 나타낸다.

(산업상의 이용가능성)

본 발명의 비엔벨로프 바이러스의 제조방법에 의해, 번잡한 조작 없이 고순도의 비엔벨로프 바이러스 입자를 얻을 수 있다. 본 발명의 제조방법으로 조제된 비엔벨로프 바이러스 입자나 당해 입자를 유효성분으로 하는 조성물은 유전자 치료의 기초 연구, 또는 임상 응용의 분야에서의 유전자 도입방법으로 매우 유용하다.

Claims

비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법으로써,
(a) 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료에, 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질을 첨가하는 공정;
(b) 상기 물질을 첨가한 시료를 산성으로 하는 공정; 및
(c) 상기 (b)공정에서 발생한 침전물을 제거하고, 비엔벨로프 바이러스 입자를 포함하는 분획을 취득하는 공정;을 포함하는 방법.
제1 항에 있어서,
(c)공정의 후에, 추가로, (d) 비엔벨로프 바이러스 입자를 정제하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서,
산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질이 계면활성제인 방법.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
산성으로 하는 공정이 산성의 용액을 첨가하는 공정인 방법.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,
비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료가,
비엔벨로프 바이러스 생산세포의 용해물 혹은 파쇄물, 비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 비엔벨로프 바이러스 생산세포의 배양 상청액, 또는 비엔벨로프 바이러스 생산세포로부터 수득되는 추출물인 방법.
제5 항에 있어서,
비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료가,
비엔벨로프 바이러스 생산세포를 산성의 용액으로 처리해서 수득되는 추출물의 중화물인 방법.
제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서,
비엔벨로프 바이러스 입자를 함유하는 중성 또는 염기성의 시료가 뉴클레아제 처리가 실시된 시료인 방법.
제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서,
비엔벨로프 바이러스 입자가 아데노 관련 바이러스 입자인 방법.
제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 실시하기 위한 키트로써,
(1) 산성 조건하에서 단백질의 용해도를 저하시키는 물질 및/또는 산성 조건하에서 침전하는 물질; 및
(2) 산성의 용액;을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
제9 항에 있어서,
추가로, 중화액을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.