JP2023525119A - アデノ随伴ウイルス粒子またはアデノウイルスを精製するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、アルキルジメチルアミンオキシドの群から選択される洗浄剤を使用して、細胞を溶解する、ならびに、アデノ随伴ウイルス粒子またはアデノウイルス粒子を単離するおよび/あるいは精製するための、組成物および方法に関する。
Description
本発明は、アルキルジメチルアミンオキシドの群から選択される洗浄剤を使用して、細胞を溶解し、およびよってアデノ随伴ウイルス粒子またはアデノウイルスを精製するための組成物および方法に関する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)ならびにアデノウイルス(AdV)は、遺伝子を、培養された細胞中にin vitroでおよびまたin vivoに送達する強力なウイルスベクターとして特徴付けられ、および開発されてきた。その一方で、AAVは、遺伝子治療のin vivo送達のための主要なプラットホームである。AdVは、遺伝子治療のためにおよびワクチンとして使用される。AAVは、およそ4.7kbの一本鎖DNAゲノムを含有する、小さな非エンベロープウイルスであり、T形状の2次構造を形成し、およびゲノム複製の起点として作用することができ、4つの重複する複製タンパク質、Rep78、Rep68、Rep52、およびRep40をコードする1つのrep領域、ならびに、3つの構造タンパク質VP1、VP2、およびVP3と、集合活性化タンパク質(AAP)とをコードする1つのcap領域の2つの逆方向末端反復(ITR)からなる。AAVウイルスの天然に単離された血清型1~9はゲノム構造を共有するが、これらの血清型は異なる組織指向性を表示し得る。AAVは非病原性であるように見え、効率的な形質導入および安定した発現を示すため、それらは最も有望な遺伝子送達ビヒクルの一つであるとみなされている。アデノウイルス(AdV)は、二本鎖DNAゲノムを含有する20面体のヌクレドカプシドを有する、標準サイズの、非エンベロープウイルスである。遺伝子治療およびワクチン開発において使用されるほとんどのAdVは、血清型2(Ad2)および5(Ad5)に由来する。
AAVベクターは、一過的なトランスフェクションまたは重感染方法を使用して、付着性細胞培養のフォーマットまたは浮遊細胞培養のフォーマットにおいて、様々な細胞株において産生され得る。特定の血清型および産生回数に依存して、完全種、部分種、および空種を包含するウイルス粒子が細胞の外から培養培地中へ分泌されるか、または様々な比率にて細胞の内側に含有される。
最初に、安定したAAV産生細胞が、ITRカセットを含有するrAAVトランスファーベクターならびにRepおよびCapを含有するパッケージング構築物を有する、HeLaまたHEK293細胞などのヒト由来細胞のトランスフェクションおよび選択によって生成された。次いで、組み換えAAVベクター(rAAV)の産生が、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス(AdV)などの補助的なウイルスを用いた感染によって達成された。AAVベクターパッケージングに要求されるAdV遺伝子の同定後、ヘルパーウイルスを用いない方法が、補助的なウイルスの代わりに構築化ヘルパープラスミドを包含する2個または3個のプラスミドからなる二重のまたは三重のトランスフェクションプロトコルを使用して確立された。このシステムは、調査および創薬において幅広く使用される。加えて、バキュロウイルス発現ベクターの開発は、昆虫Sf9細胞におけるrAAVウイルスを産生する別の方法を提供する。これらの様々な技術は、実験室および臨床試験用の充分な質のrAAVウイルスを産生できることが示されている。
AdVベクターはまた、HEK293またはPER.C6細胞または誘導体によって接着細胞培養フォーマットまたは浮遊細胞培養フォーマットにおいて産生され得る。26~45kbの大きなゲノムに起因して、不可欠なウイルスの遺伝子のわずかなプラスミドへの再構築は実現可能ではなく、および組換えAdVの産生は同じウイルスベクターの単一の感染を通じて実現されてきた。
細胞溶解ステップは、一般に集菌時にウイルス粒子を上清中へ放出することが要求される。本出願について、典型的な細胞溶解試薬、例えば、Triton X-100、Tween 20、およびNaClなどが広く利用される。しかしながら、ある血清型(例として、AAV2)について、ウイルス粒子は、不溶性細胞構成要素に緊密に随伴し、よってウイルス放出の観点から細胞溶解試薬の効率を限定する傾向がある。
ウイルス、とくに細胞随伴ウイルスを放出する現方法は、例として物理的溶解方法は縮小拡大するのが難しいように、しばしば時間がかかるものであり、または、不要であり、かつ、除去するのが難しい不純物、例としてTriton X-100を導入し得うる。Triton X-100の分解産物は、オクチルフェノール、実証されたエストロゲン性効果をもつ生態毒素である。したがって、AAVおよびAdVなどのウイルスを、それらが産生された細胞を溶解し、および該細胞から単離し、および/または精製するのに有効な試薬方法を有することが好ましいだろうし、それによって方法は生態学的に疑問の余地のある試薬の使用を必要としないはずである。
本発明者らは、驚くべきことに、生態系に優しい洗浄剤のある群が細胞随伴ウイルスを放出するのにとくに好適であることを見出した。塩化ナトリウムなどの塩と組み合わせて、それらはTriton X 100を用いる既知の手順よりもさらに一層有効である。
よって、本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子またはアデノウイルス粒子を包囲する細胞を、該細胞の懸濁液を、細胞溶解と細胞からのAAVまたはAdV粒子の放出とを促進するアルキルジメチルアミンオキシドを含む有効量の組成物に接触させることによって、溶解させる方法であって、それによってウイルス粒子が影響を受けないまま残存する、前記方法に向けられる。
典型的には、この溶解方法は、ウイルスを精製するための方法の一部であり、それによってさらなる単離ステップまたは精製ステップが溶解ステップに加えて実施される。
典型的には、この溶解方法は、ウイルスを精製するための方法の一部であり、それによってさらなる単離ステップまたは精製ステップが溶解ステップに加えて実施される。
本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)またはアデノウイルス(AdV)のウイルス粒子を包囲する細胞を含む試料からウイルス粒子を精製するための方法であって、
a) 細胞およびウイルス粒子の懸濁液を、細胞溶解と細胞からのAAVまたはAdV粒子の放出とを促進するアルキルジメチルアミンオキシドを含む有効量の組成物に接触させること、
b) AAVまたはAdV粒子を単離すること、および/または、精製すること
による、前記方法にさらに向けられる。
a) 細胞およびウイルス粒子の懸濁液を、細胞溶解と細胞からのAAVまたはAdV粒子の放出とを促進するアルキルジメチルアミンオキシドを含む有効量の組成物に接触させること、
b) AAVまたはAdV粒子を単離すること、および/または、精製すること
による、前記方法にさらに向けられる。
好ましい態様において、懸濁液を、アルキルジメチルアミンオキシドおよび塩化ナトリウムなどの塩を含む有効量の組成物に接触させる。
極めて好ましい態様において、組成物は、LDAO(ラウリルジメチルアミン-N-オキシド)および/またはTDAO(テトラデシルジメチルアミン-N-オキシド)および塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウムを含む。とくに好ましいものは、LDAO(ラウリルジメチルアミン-N-オキシド)および/またはTDAO(テトラデシルジメチルアミン-N-オキシド)および塩化ナトリウムを含む組成物である。
別の好ましい態様において、ステップa)において、細胞を、30~180分間、好ましくは60~90分間、組成物に接触させる。
極めて好ましい態様において、組成物は、LDAO(ラウリルジメチルアミン-N-オキシド)および/またはTDAO(テトラデシルジメチルアミン-N-オキシド)および塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウムを含む。とくに好ましいものは、LDAO(ラウリルジメチルアミン-N-オキシド)および/またはTDAO(テトラデシルジメチルアミン-N-オキシド)および塩化ナトリウムを含む組成物である。
別の好ましい態様において、ステップa)において、細胞を、30~180分間、好ましくは60~90分間、組成物に接触させる。
別の態様において、ウイルス粒子は、AAVであり、とくにAAV2またはAAV9血清型である。
一態様において、組成物は、アルキルジメチルアミンオキシドおよび塩化ナトリウムなどの塩を含む水性溶液である。好ましくは、組成物は、水、1以上のアルキルジメチルアミンオキシド、塩化ナトリウム、および任意に緩衝剤構成要素のみを含有する。
好ましい態様において、組成物中のアルキルジメチルアミンオキシドの濃度は、細胞を有する混合物中の濃度が、1%(w/w)と4%(w/w)との間となるものである。
別の好ましい態様において、組成物中の塩化ナトリウムなどの塩の濃度は、細胞を有する混合物中の濃度が、0.05mol/lと1mol/lとの間となるものである。
一態様において、組成物は、アルキルジメチルアミンオキシドおよび塩化ナトリウムなどの塩を含む水性溶液である。好ましくは、組成物は、水、1以上のアルキルジメチルアミンオキシド、塩化ナトリウム、および任意に緩衝剤構成要素のみを含有する。
好ましい態様において、組成物中のアルキルジメチルアミンオキシドの濃度は、細胞を有する混合物中の濃度が、1%(w/w)と4%(w/w)との間となるものである。
別の好ましい態様において、組成物中の塩化ナトリウムなどの塩の濃度は、細胞を有する混合物中の濃度が、0.05mol/lと1mol/lとの間となるものである。
一態様において、ステップb)は、濾過および遠心分離によって実施される。
一態様において、本発明の方法は、1以上の以下のステップを含む:
- 清澄化
- 濾過
- 透析および透析濾過
- タンジェンシャルフロー濾過
- ヌクレアーゼ、例としてRNaseおよび/またはDNaseを用いる処置
- クロロホルムを用いる処置
- イオン交換クロマトグラフィー
- 親和性クロマトグラフィー
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー
- 遠心分離
- PEG沈殿。
一態様において、本発明の方法は、1以上の以下のステップを含む:
- 清澄化
- 濾過
- 透析および透析濾過
- タンジェンシャルフロー濾過
- ヌクレアーゼ、例としてRNaseおよび/またはDNaseを用いる処置
- クロロホルムを用いる処置
- イオン交換クロマトグラフィー
- 親和性クロマトグラフィー
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー
- 遠心分離
- PEG沈殿。
本発明は、1以上のアルキルジメチルアミンオキシドおよび塩化ナトリウムなどの塩を含む組成物にさらに向けられる。
好ましい態様において、組成物は、5%(w/w)~30%(w/w)TDAOおよび/またはLDAOと1 mol/l~6mol/l NaClとを含む水性溶液である。
好ましい態様において、組成物は6と9との間のpHを有する。
本発明は、本発明の組成物ならびにヌクレアーゼを含むキットにさらに向けられる。
好ましい態様において、組成物は、5%(w/w)~30%(w/w)TDAOおよび/またはLDAOと1 mol/l~6mol/l NaClとを含む水性溶液である。
好ましい態様において、組成物は6と9との間のpHを有する。
本発明は、本発明の組成物ならびにヌクレアーゼを含むキットにさらに向けられる。
ウイルスを産生する細胞を溶解するのに好適なアルキルジメチルアミンオキシドは、両親媒性であって、様々な長さの飽和炭化水素鎖と結合する帯電したアミンオキシドである。好ましくは、飽和炭化水素鎖の長さは、8と18との間の炭素原子である。好ましい態様において、アルキルジメチルアミンオキシドは、ジメチルデシルアミンオキシド、ジメチルウンデシルアミンオキシド、ジメチルドデシルアミンオキシド(LDAO)、ジメチルトリデシルアミンオキシドおよびジメチルテトラデシルアミンオキシド(TDAO)からなる群から選択される。
これらの化合物は、好ましくは、それらの重要なミセル濃度を超えた濃度にて使用される。重要なミセル濃度(CMC)は、ミセル形態および系に添加されるすべての追加の洗浄剤がミセルになる上記の洗浄剤の濃度として定義される。所与の媒体中の所与の洗浄剤についてのCMCの値は、温度、圧力に、ならびに(ときには強く)他の表面活性物質および電解質の存在および濃度に依存する。
塩化ナトリウムなどの塩の例は、K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+などの金属カチオン、およびF-、SO4
2-、HPO4
2-、アセタート、Cl-などのアニオン性構成要素を含む塩である。好ましいものは、単原子イオンを含む塩である。とくに好ましいものは、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩化物塩であり、ここで塩化ナトリウムが最も好ましい。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、パルボウイルス(Parvoviridae)ファミリーのメンバーである。AAVゲノムは、およそ4.7キロベース(kb)を含有し、および非構造上のRep(複製)および構造上のCap(カプシド)タンパク質をコードする2つの主要なオープンリーディングフレームからなる、線状の一本鎖DNA分子から構成される。AAVコード領域の両側にあるのは、およそ145個のヌクレオチドの長さにおける2つのシス作用性逆方向末端反復(ITR)配列であり、および、DNA複製の開始の間にプライマーとして機能するヘアピン構造中に折り畳むことができる遮断回文配列である。DNA複製におけるそれらの役割に加えて、ITR配列は、ウイルスの集積、宿主ゲノムからの救助、およびウイルスの核酸の成熟したビリオンへのカプシド形成に必要であることが示されている(Muzyczka、(1992) Cur.Top.マイクロ.Immunol.158:97-129)。
AAVの複数の血清型が存在し、および様々な組織指向性を提示する。既知の血清型は、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10およびAAV11を包含する。
AAVの複数の血清型が存在し、および様々な組織指向性を提示する。既知の血清型は、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10およびAAV11を包含する。
AAVに由来するベクターは、遺伝子の材料を送達するために具体的に魅力的であり、なぜならそれらは筋繊維およびニューロンを包含する多種多様な非分裂性および分裂性細胞型に感染させる(形質導入させる)ことができ、およびそれらはウイルス構造上の遺伝子がないため、それによってウイルス感染に対する自然の宿主細胞の応答、例として、インターフェロン媒介の応答を排除するからである。加えて、野生型ウイルスは、ヒトにおけるいかなる病的状態に関連したことはない。
本発明に従って、scAAVはまた、AAVの群内である。自己相補的アデノ随伴ベクター(scAAV)は、遺伝子治療用の天然に存在するアデノ随伴ウイルス(AAV)から改変されたウイルスベクターである。ScAAVは、「自己相補的」と用語が付され、なぜならコード領域が分子内の二本鎖DNAテンプレートを形成するように設計されているからである。
よって、いくつかの態様において、「AAV」は、これらに限定されないが、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV -5、AAV- 6、AAV-7、AAV -8、AAV-9、AAV-10およびAAV-11を包含するアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターまたはウイルスを意味する。AAVベクターは、全体または一部において削除された1以上のAAV野生型遺伝子、例として、repおよび/またはcap遺伝子を有するが、機能的な両側にあるITR配列を保持することができる。機能的ITR配列は、AAVビリオンの救助、複製およびパッケージングに必要である。よって、AAVベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングに提供される少なくともそれらの配列(例として、機能的ITR)を包含することが本明細書に定義される。ITRは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、および配列が機能的な救助、複製およびパッケージングを提供する限り、例として、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよい。一態様において、ベクターは、AAV-2由来のITRを有する、AAV-9ベクターである。また、「AAV」は、ベクター核酸の標的細胞の核への送達のための効率的なビヒクルを提供するタンパク質シェルまたはカプシドを意味する。
用語「AAV」は、本明細書に使用されるとき、組換えAAVも網羅することが意図される。
用語「AAV」は、本明細書に使用されるとき、組換えAAVも網羅することが意図される。
アデノウイルス(AdV)は、日本鎖DNAゲノムを含有する20面体ヌクレオカプシドを有する、標準サイズ(90~100nm)の、非エンベロープ(外側の脂質二重層がない)ウイルスである。それらは、広い範囲の脊椎動物宿主を有する;ヒトにおいて、7種(A~G)に属する、50個より多くの別個のウイルスの血清型が、広範な病気を引き起こすことが見出された。組換えAdVを調製し、およびそれらを好適な宿主細胞へパッケージングする方法は、当該技術分野において知られている。それらは、遺伝子治療のために、および外来抗原を発現させるワクチンとして使用される。アデノウイルスベクターは、複製欠陥性であり得る;ある不可欠なウイルスの遺伝子は削除され、および外来の治療的遺伝子を発現するカセットによって置き換えられている。複製適格性(腫瘍溶解性)ベクターは、がん遺伝子治療に採用される。腫瘍溶解性ベクターは、がん細胞において優先的に複製するように、および溶解性ウイルス複製の自然のプロセスを通じてがん細胞を破壊するように改変される。多くの臨床試験は、複製欠陥性および複製適格性アデノウイルスベクターが安全であり、治療的活性を有することを指し示している。
アデノウイルス(AdV)およびアデノ随伴ウイルス(AAV)は、本明細書においてウイルス、ウイルス粒子またはウイルスベクターとも呼ばれる。
アデノウイルス(AdV)およびアデノ随伴ウイルス(AAV)は、本明細書においてウイルス、ウイルス粒子またはウイルスベクターとも呼ばれる。
本明細書に使用されるとき、用語「細胞」または「細胞株」は、in vitroで連続的なまたは持続的な成長および分裂の可能な単細胞または細胞の集団を指す。いくつかの態様において、例として用語「HEK293細胞」、「293細胞」またはそれらの文法的等価物は、本明細書において互換的に使用され、および本明細書に開示される方法において使用される宿主/パッキン細胞株を指す。好適な細胞および細胞株は、AAVおよびAdVの産生用に記載されている。細胞それ自体は、原核生物(例として、細菌性)細胞ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物の細胞を包含する真核細胞を包含する、あらゆる生物学的生物から選択されてもよい。具体的に所望される宿主細胞は、任意の哺乳動物のうちから選択され、これらに限定されないが、A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、a HEK 293 cell、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2、ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを包含する哺乳動物に由来する初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞細胞を包含する。
一般に、発現カセットは、少なくとも、5'AAV逆方向末端反復(ITR)、その発現を指示する調節配列へ操作可能に連結された所望される治療的な免疫源、または抗原をコードする核酸配列、および3'AAV ITRから構成される。一態様において、AAV血清型2の5'および/または3'ITRが使用される。しかしながら、他の好適な供給源からの5'および/または3'ITRが選択されてもよい。カプシドタンパク質にパッケージ化され、AAVウイルスまたは粒子を形成するのがこの発現カセットである。
発現カセットに加えて、細胞は、細胞におけるAAVの発現を駆動する配列(cap配列)および発現カセットにおいて見出されるAAV ITRの供給源と同じ供給源のrep配列、または相互補完する供給源を含有する。AAV capおよびrep配列は、独立して、異なるAAV親配列から選択されてもよく、および当業者に知られる好適なやり方において宿主細胞中に導入されてもよい。完全長のrep遺伝子が利用され得る一方で、それらのより小さなフラグメント、すなわちrep78/68およびrep52/40は、AAVの複製およびパッケージングを許容するのに充分である。
細胞はまた、本発明のAAVをパッケージするためにヘルパー機能を要求する。任意に、これらのヘルパー機能は、ヘルペスウイルスによって供給されてもよい。別の態様において、必要なヘルパー機能は、ヒトまたは霊長類の非ヒト動物アデノウイルス供給源から提供される各々であり、例えば、American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va. (US)を包含する、様々な供給源から入手可能である。
緩衝剤または緩衝溶液は、pH変化を防止するために使用されるあるpHの溶液である。緩衝剤の例は、CO2/HCO3(カーボネート)、ホスファート、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPSおよびTRISである。
緩衝剤または緩衝溶液は、pH変化を防止するために使用されるあるpHの溶液である。緩衝剤の例は、CO2/HCO3(カーボネート)、ホスファート、HEPES、PIPES、ACES、BES、TES、MOPSおよびTRISである。
AAVの製造の間、カプシドのパーセンテージは、導入遺伝子のいずれも組み込まない可能性があり、空カプシドまたは空AAVと称される。加えて、導入遺伝子のフラグメントを含有するカプシドは、部分的カプシドまたは部分的AAVと呼ばれる。これらの望ましくない産物に関する不純物は、所望される導入遺伝子の完全長を含有する完全カプシドまたは完全AAVと共に産生される。同じ文言がAdVについても使用され得る。
精製は、標的分子、このケースにおいてAAVまたはAdVの純度を、1以上の不純物の量を除去するかまたは低減することによって増加させることを意味する。
精製は、標的分子、このケースにおいてAAVまたはAdVの純度を、1以上の不純物の量を除去するかまたは低減することによって増加させることを意味する。
用語「不純物」または「夾雑物」は、本明細書に使用されるとき、生物学的高分子、例えば、DNA、RNA、1以上の宿主細胞タンパク質、核酸など、内毒素、脂質、合成起源の不純物、例えば洗浄剤など、部分的および/または空AAVまたはAdV、ならびに精製され、およびよって1以上の不純物から分離される、ウイルス粒子を含有する試料中に存在し得る1以上の添加剤を包含する、あらゆる外来または好ましくない(objectionable)分子または種を指す。
バイオリアクターは、細胞が培養され得るあらゆる槽またはタンクである。インキュベーションは、典型的には、好適な温度等の好適な条件下で、および細胞の成長/培養を支持するための好適な培地を有して行われる。当業者は、細胞の成長/培養を支持するかまたは維持するための好適なインキュベーション条件を覚知している。
バイオリアクターは、細胞が培養され得るあらゆる槽またはタンクである。インキュベーションは、典型的には、好適な温度等の好適な条件下で、および細胞の成長/培養を支持するための好適な培地を有して行われる。当業者は、細胞の成長/培養を支持するかまたは維持するための好適なインキュベーション条件を覚知している。
本発明は、少なくともアルキルジメチルアミンオキシドベースの洗浄剤を含むあるタイプの組成物が、細胞を溶解し、およびウイルス粒子を含まないように設定するのにとくに好適であるという知見に基づく。AAVまたはAdVベクターは、一過的なトランスフェクション、感染または重感染方法を使用する接着細胞培養フォーマットまたは浮遊細胞培養フォーマットにおいて様々な細胞株において産生され得る。特定の血清型および産生回数に依存して、完全な、部分的、および空の種を包含するウイルス粒子は、細胞の外から培養培地中に分泌され、様々な比率にて細胞の内側に含有され得る。細胞溶解ステップは、一般に集菌時にウイルス粒子を上清中へ放出することが要求される。ときには、ウイルス粒子は、ウイルス放出の観点からある細胞溶解試薬の効率を限定する不溶性細胞構成要素に緊密に随伴する傾向がある。
アルキルジメチルアミンオキシドは、単独でまたは塩化ナトリウムなどの塩との組み合わせにおいて、細胞溶解とウイルス粒子の単離および/または精製とを促進するのにとくに好適であることが見出された。
アルキルジメチルアミンオキシドは、単独でまたは塩化ナトリウムなどの塩との組み合わせにおいて、細胞溶解とウイルス粒子の単離および/または精製とを促進するのにとくに好適であることが見出された。
AAVまたはAdVを含む細胞の産生は、当業者に知られている。典型的には、選択される細胞は、好適な条件下、バイオリアクター中、好適な細胞培地において拡大される。細胞は、接着培養物または浮遊培養物として成長されてもよい。例えば、HEK293細胞の浮遊培養において、トランスフェクション前の好適な播種数は、ml当たり0.5~1.1 e6生存細胞である。
形質導入のための好適な方法は、当該技術分野において知られている。一態様において、細胞は、rAAVまたはAdVと細胞とを、例として適切な培地中で、組み合わせる、および関心のあるDNAを内包するそれらの細胞を、例えば、サザンブロットおよび/もしくはPCRなどの従来の技法を使用するかまたは選択可能なマーカを使用してスクリーニングすることによって、in vitroで形質導入され得る。
形質導入のための好適な方法は、当該技術分野において知られている。一態様において、細胞は、rAAVまたはAdVと細胞とを、例として適切な培地中で、組み合わせる、および関心のあるDNAを内包するそれらの細胞を、例えば、サザンブロットおよび/もしくはPCRなどの従来の技法を使用するかまたは選択可能なマーカを使用してスクリーニングすることによって、in vitroで形質導入され得る。
トランスフェクションは、これらに限定されないが、電気穿孔、リポフェクション、例として、リポフェクタミン(lipofectamine)、カチオン性ポリマー、およびカチオン性脂質を包含する、当該技術分野において知られているあらゆる技法を使用して実施され得る。あらゆる好適なトランスフェクション培地が使用されてもよい。トランスフェクションプロセスの一態様において、接着または浮遊ヒト肺腎臓(HEK293)細胞は、三重のDNAプラスミドポリエチレンイミン(PEI)共沈を用いてトランスフェクトされる。
一態様において、本開示は、AAVまたはAdVベースのウイルスベクターを製造するための方法であって、以下のステップ:(i)バイオリアクターにおいて細胞を培養すること、(ii)細胞をプラスミドを用いてトランスフェクトして、AAV粒子の産生を可能にするか、または細胞をAdVベクターを用いて感染させて、同じAdV粒子を増幅する/産生すること、(iii)細胞およびウイルス粒子の混合物を、アルキルジメチルアミンオキシドおよび任意に塩化ナトリウムなどの塩を含む有効量の組成物に接触させて、細胞溶解と細胞からのウイルス粒子の放出とを促進すること、(iv)ウイルス粒子を単離すること、および/または、精製することを含む、前記方法を提供する。
トランスフェクションまたは感染後の好適なウイルス産生期間後、細胞は溶解され、およびウイルス粒子は集菌される。いくつかの態様において、細胞は、細胞溶解プロセスが開始される前にバイオリアクターから解離される。いくつかの態様において、細胞はin situで溶解される。
本発明に従って、溶解のために、細胞を、アルキルジメチルアミンオキシドおよび任意に塩化ナトリウムなどの塩を含む組成物に接触させる。好ましくは、細胞懸濁液および組成物の混合物が生成されるように、溶解溶液は細胞の懸濁液を含むバイオリアクターに添加される。細胞とアルキルジメチルアミンオキシドおよび任意に塩化ナトリウムなどの塩とを含む混合物のインキュベーションが、典型的には、30~180分、好ましくは60と90分との間のインキュベーション時間行われる。より短いおよびより長い時間はまた、適切であり得る。
インキュベーションの間の混合物のpHは、広い範囲において変化し得る。それは、例えば、pH4とpH10との間であり得、典型的には、それは、pH6とpH9との間であり得る。
インキュベーションの間の混合物の温度もまた、広い範囲において変化し得る。それは、例えば、20℃と37℃との間であり得る。
インキュベーションの間の混合物の温度もまた、広い範囲において変化し得る。それは、例えば、20℃と37℃との間であり得る。
細胞溶解と細胞からのAAV粒子の放出とを促進するアルキルジメチルアミンオキシドを含む有効量の組成物を有するために、組成物のアルキルジメチルアミンオキシドの濃度は、それが細胞溶解を有効に誘導する、上記に記載されるとおりの好適な条件下で組成物を用いるインキュベーション後に、細胞の少なくとも80%、好ましくは100%が溶解されることを意味するようなものである。このために、細胞を有する最終的な混合物中のアルキルジメチルアミンオキシドの濃度は、好ましくはそのCMCより上である。TDAO、N,N-ジメチルトリデシルアミン N-オキシドに対しては、細胞を有する混合物中の濃度は、典型的には、0.1%(w/w)と5%(w/w)との間、好ましくは1%(w/w)と4%(w/w)との間である。典型的には、添加される組成物の体積は、細胞培養物の体積よりも小さい。
その結果として、組成物中のアルキルジメチルアミンオキシド、とくにTDAOの好適な濃度は、10%(w/w)と30%(w/w)との間である。細胞懸濁液に添加される組成物中の塩化ナトリウムなどの塩の好適な濃度は、細胞懸濁液を有する混合物中の最終的な濃度が0.05mol/lと1mol/lとの間であるように、1mol/lと6mol/lとの間、典型的にはほぼ3mol/lと5mol/lとの間である。
好ましい態様において、使用される洗浄剤は、単一の構成要素として、またはNaClとの混合物としてのいずれかで、TDAO、N,N-ジメチルトリデシルアミン N-オキシドおよび/またはLDAOである。
極めて好ましい態様において、組成物は水性溶液である。それはまた、1以上の緩衝剤を含んでもよい。
極めて好ましい態様において、組成物は水性溶液である。それはまた、1以上の緩衝剤を含んでもよい。
上記に定義されるとおりの組成物が細胞の溶解を有効に誘導すること、ならびにとくに細胞に張り付く傾向のあるウイルス粒子および細胞の残骸が細胞から有効に分離され得ることが見出された。
溶解組成物を用いたインキュベーション後、次いで放出されたAAVまたはAdVは単離される、および/または、精製される。これは、あらゆる方法を用いて行われ得る。典型的には、濾過および/または遠心分離を包含する1以上の方法ステップによって行われる。
溶解組成物を用いたインキュベーション後、次いで放出されたAAVまたはAdVは単離される、および/または、精製される。これは、あらゆる方法を用いて行われ得る。典型的には、濾過および/または遠心分離を包含する1以上の方法ステップによって行われる。
一態様において、混合物は、巨大分子夾雑物および細胞の残骸を除去するが、AAVがそこを通過することを許容するフィルターを通じて濾過される。
一態様において、放出されたウイルス粒子は、清澄化を使用して、細胞培養培地から分離され、および精製され得る。清澄化は、溶解された細胞および/または不純物などの相対的により大きい構成要素が溶液から除去されるマイクロ濾過プロセスであり得る。清澄化フィルターは、深層濾過、帯電した深層濾過、および同様のマイクロ濾過技法を包含する。
一態様において、放出されたウイルス粒子は、清澄化を使用して、細胞培養培地から分離され、および精製され得る。清澄化は、溶解された細胞および/または不純物などの相対的により大きい構成要素が溶液から除去されるマイクロ濾過プロセスであり得る。清澄化フィルターは、深層濾過、帯電した深層濾過、および同様のマイクロ濾過技法を包含する。
タンジェンシャルフロー濾過は、精製されたウイルス粒子の混合物を濃縮するために、ならびに、塩およびタンパク質を除去するために使用され得る。タンジェンシャルフロー濾過(TFF)は、標的産物および/または不純物を含有する溶液の濾過または精製のための一般に迅速なおよび効率的な方法を指し、その間溶液または液体流が濾過膜に並行して流れる。
遠心分離は、例えば細胞の残骸などのより大きい粒子を除去する低速遠心分離であり得る。これは、例えば、10~30分間、10000~12000gにて行われ得る。放出されるウイルス粒子は、上清において見出され得る。
遠心分離は、例えば細胞の残骸などのより大きい粒子を除去する低速遠心分離であり得る。これは、例えば、10~30分間、10000~12000gにて行われ得る。放出されるウイルス粒子は、上清において見出され得る。
AAVの単離および/または精製は、典型的には、1以上の以下のプロセスステップを包含する:
- 清澄化
- 濾過
- 透析/透析濾過
- タンジェンシャルフロー濾過
- ヌクレアーゼ、例としてRNaseおよび/またはDNaseを用いる処置
- クロロホルムを用いる処置
- イオン交換クロマトグラフィー
- 親和性クロマトグラフィー
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー
- 遠心分離
- PEG沈殿。
- 清澄化
- 濾過
- 透析/透析濾過
- タンジェンシャルフロー濾過
- ヌクレアーゼ、例としてRNaseおよび/またはDNaseを用いる処置
- クロロホルムを用いる処置
- イオン交換クロマトグラフィー
- 親和性クロマトグラフィー
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー
- 遠心分離
- PEG沈殿。
いくつかの態様において、ヌクレアーゼ、典型的にはエンドヌクレアーゼが、例として宿主細胞DNAの量を低減するために、添加される。それは、溶解の前、間、または後に、バイオリアクター中の混合物へ直接的に添加され得る。ヌクレアーゼは、DNAおよびRNAの両方を分解するものであり得る。一態様において、エンドヌクレアーゼは、名称Benzonase(登録商標)(EMD Millipore)下で販売されるSerratia marcescensからの遺伝子学的に改変されたエンドヌクレアーゼである。
様々な態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、さらなる精製のために適用される。これは、例えば、アニオン交換クロマトグラフィー(AEX)またはカチオン交換クロマトグラフィー(CEX)ステップであり得る。かかるステップは、例として、宿主細胞タンパク質、宿主細胞DNA、宿主細胞脂質、洗浄剤、および他のプロセスに関する不純物を分離するために、使用される。カチオンおよびアニオン交換クロマトグラフィーの原理は、当該技術分野において周知である。試料は充填され、およびカラムは充填する緩衝剤を用いて洗浄される。最終的に、溶離緩衝剤は関心のある試料をカラムから溶離するために使用され、および試料を含有する画分は回収される。
他の好適なクロマトグラフの方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーである。結合-溶離モードの代わりに、フロースルーモードもまた好適であり得る。
ポリエチレングリコール(PEG)を用いるAAVまたはAdVの沈殿もまた、実行可能である。このため、PEGは、ウイルスの試料へ添加される。PEGの分子量は、典型的には約3.000g/mol~約15.000g/molである。沈殿溶液中のPEGの濃度は、随時調整され得、それは、例えば、ほぼ5%(w/w)である。
ポリエチレングリコール(PEG)を用いるAAVまたはAdVの沈殿もまた、実行可能である。このため、PEGは、ウイルスの試料へ添加される。PEGの分子量は、典型的には約3.000g/mol~約15.000g/molである。沈殿溶液中のPEGの濃度は、随時調整され得、それは、例えば、ほぼ5%(w/w)である。
クロロホルムは、脂質を溶解する、および豊富なタンパク質を不活性化させるために添加され得る。ウイルス粒子は、相分離および/または遠心分離によって後に分離され得るクロロホルムの影響を受けない。
塩化ナトリウムなどの塩は、透析によってウイルス粒子から除去され得る。溶液を含有するウイルスは、除去される不純物に依存して、水または別の溶液に対して透析され得る。
塩化ナトリウムなどの塩は、透析によってウイルス粒子から除去され得る。溶液を含有するウイルスは、除去される不純物に依存して、水または別の溶液に対して透析され得る。
典型的なAAV精製プロセスは、清澄化、タンジェンシャルフロー濾過を使用する濃縮および透析濾過、親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用することによるクロマトグラフィー精製を包含する。いくつかのプロセスにおいて、超遠心分離および勾配超遠心分離は、クロマトグラフィーの代わりに、またはクロマトグラフィーに加えて使用される。AAV精製における最終的なステップは、典型的には、好適な賦形剤緩衝剤組成物および滅菌濾過物への濃縮および透析濾過を伴う。
本発明はさらに、アルキルジメチルアミンオキシドおよび塩化ナトリウムの水性溶液を含む本発明の方法において使用される組成物に向けられる。組成物中のアルキルジメチルアミンオキシドの濃度は、組成物が溶解される細胞を含む懸濁液に添加されるとき、アルキルジメチルアミンオキシドの最終的な濃度が0.1%(w/w)より高く、好ましくは1%(w/w)と4%(w/w)との間であるように調整され得るように、典型的には、1%(w/w)より高く、好ましくは10%(w/w)と30%(w/w)との間である。
好ましい態様において、使用される洗浄剤は、単一の構成要素として、またはNaClとの混合物としてのいずれかで、TDAO、N,N-ジメチルトリデシルアミンN-オキシドおよび/またはLDAOである。最も好ましくは、TDAOとNaClとの混合物である。
極めて好ましい態様において、組成物は水性溶液である。それはまた、1以上の緩衝剤を含んでもよい。
組成物中の塩化ナトリウムなどの塩の濃度は、細胞懸濁液を有する混合物中の最終的な濃度が0.05mol/lと1mol/lとの間であるように、典型的には、1mol/lと6mol/lとの間、好ましくは、ほぼ3mol/lと5mol/lとの間である。
好ましい態様において、組成物は、水、1以上のアルキルジメチルアミンオキシド、塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、ならびに任意に緩衝剤のみからなる。
極めて好ましい態様において、組成物は水性溶液である。それはまた、1以上の緩衝剤を含んでもよい。
組成物中の塩化ナトリウムなどの塩の濃度は、細胞懸濁液を有する混合物中の最終的な濃度が0.05mol/lと1mol/lとの間であるように、典型的には、1mol/lと6mol/lとの間、好ましくは、ほぼ3mol/lと5mol/lとの間である。
好ましい態様において、組成物は、水、1以上のアルキルジメチルアミンオキシド、塩化ナトリウムおよび/または塩化カリウム、ならびに任意に緩衝剤のみからなる。
本発明はまた、上記に記載されるとおりの本発明の組成物、およびヌクレアーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ、最も好ましくはBenzonase(登録商標)を含むキットにも向けられる。キットは、典型的には、2つの構成要素を有する、2つの容器、例として瓶を含むが、それはまた、さらなる構成要素、およびよってさらなる容器を含んでもよい。
例からわかるとおり、本発明の方法は、極めて効率的である。本発明の方法を使用して、ウイルスが放出されながら、細胞の少なくとも80%、最も好ましくは100%が溶解され得る。細胞溶解は、例えば、顕微鏡画像化を介して検出され得る。本発明の溶解方法を用いて放出されるウイルス粒子の数は、Triton X100もしくは塩化ナトリウム、またはさらにそれらの組み合わせによって放出されるウイルス粒子の数を超える。これは、予測され得ない。本発明の方法および組成物は、厳密に細胞に随伴するAAV血清型にとくに好適である。
例えば、AAV2懸濁液において、0.5% Triton X-100(T100)または0.5M NaClのいずれかを使用して、共に37℃にて、90分間、細胞溶解ステップを包含する上流のプロセスはウイルス力価を有意に低減したことが観察された(図1)。これとは対照的に、はるかにより高いウイルス力価が、0.5M 塩化ナトリウムおよび1% TDAOを含む溶解溶液を同じ時間使用するときに到達できた(図2を参照)。
本発明の別の利点は、細胞溶解およびウイルス放出のために使用される、洗浄剤および任意に塩化ナトリウムなどの塩が、タンジェンシャルフロー濾過を使用して除去され得ることである。タンジェンシャルフロー濾過において、限外濾過膜は、ウイルス粒子を精製および濃縮し、ならびに洗浄剤を除去する透析濾過を実施するために、使用され得る。
本発明は、以下の図および例によってさらに例証されるが、それに制限されるものではない。
上記および下記において引用されるすべての出願、特許、および刊行物、ならびに2020年5月14日に提出された米国仮特許出願第63/024,643号の全体の開示が、参照によって本明細書に組み込まれる。
上記および下記において引用されるすべての出願、特許、および刊行物、ならびに2020年5月14日に提出された米国仮特許出願第63/024,643号の全体の開示が、参照によって本明細書に組み込まれる。
例
以下の例は、本発明の実用的な適用を提示する。
例1-比較例
様々な濃度にてのTriton X-100(T100)もしくはTDAOなど、または0.5M NaClの様々な単一の試薬を使用する細胞溶解ステップを包含する、AAV2懸濁液の上流のプロセスを、すべて37℃にて実施する。試料を溶解後、異なる時点にて、5分間、13000gにて遠心分離し、上清を除去し、アッセイのために-70℃にて保管した。物理的な力価をAAV2 Tiration ELISA kit (Progen)を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、続いて製造業者のプロトコルによって測定し、ゲノム力価をトランスファーベクター内の特定の配列を標的にする定量的PCR(qPCR)によって測定した。すべての試薬およびアッセイプロトコルは、別要に特定されない限りMilliporeSigmaからである。試験したすべての条件のうち、0.5M NaClは、e10 vp/mLの物理的な力価およびe9 gc/mLレベルのゲノム力価にて、有意な量のAAV2を放出することができる唯一のものであった(図1)。その上、すべての3つの単一の試薬についての溶解後30分~90分間からの時間依存性の効果、および両方の単一の洗浄剤についての0.5%~1%からの濃度依存性の効果が観察された(図1)。しかし、いずれの単一の試薬も、典型的な、e11 vp/mLの物理的な力価およびe10 gc/mLのゲノム力価にて、AAV放出を満足することを示さなかった。
図1において、各バーは2希釈×2アッセイウェルまたは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。
以下の例は、本発明の実用的な適用を提示する。
例1-比較例
様々な濃度にてのTriton X-100(T100)もしくはTDAOなど、または0.5M NaClの様々な単一の試薬を使用する細胞溶解ステップを包含する、AAV2懸濁液の上流のプロセスを、すべて37℃にて実施する。試料を溶解後、異なる時点にて、5分間、13000gにて遠心分離し、上清を除去し、アッセイのために-70℃にて保管した。物理的な力価をAAV2 Tiration ELISA kit (Progen)を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、続いて製造業者のプロトコルによって測定し、ゲノム力価をトランスファーベクター内の特定の配列を標的にする定量的PCR(qPCR)によって測定した。すべての試薬およびアッセイプロトコルは、別要に特定されない限りMilliporeSigmaからである。試験したすべての条件のうち、0.5M NaClは、e10 vp/mLの物理的な力価およびe9 gc/mLレベルのゲノム力価にて、有意な量のAAV2を放出することができる唯一のものであった(図1)。その上、すべての3つの単一の試薬についての溶解後30分~90分間からの時間依存性の効果、および両方の単一の洗浄剤についての0.5%~1%からの濃度依存性の効果が観察された(図1)。しかし、いずれの単一の試薬も、典型的な、e11 vp/mLの物理的な力価およびe10 gc/mLのゲノム力価にて、AAV放出を満足することを示さなかった。
図1において、各バーは2希釈×2アッセイウェルまたは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。
例2
同じプロセスを、例1におけるとおり、しかし異なる洗浄剤を組み合わせたNaClを用いて実施する。
1% TDAOの0.5M NaClへの添加、しかし1% Triton X-100は添加しないことが、AAV2解離の3~9倍の増加を促進したことが実証された(図2)。加えて、3時間のより長い溶解時間が、90分のより短い時間と比較して等価であると評価された(図2)。
図2において、各バーは2希釈×2アッセイウェルまたは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。
同じプロセスを、例1におけるとおり、しかし異なる洗浄剤を組み合わせたNaClを用いて実施する。
1% TDAOの0.5M NaClへの添加、しかし1% Triton X-100は添加しないことが、AAV2解離の3~9倍の増加を促進したことが実証された(図2)。加えて、3時間のより長い溶解時間が、90分のより短い時間と比較して等価であると評価された(図2)。
図2において、各バーは2希釈×2アッセイウェルまたは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。
例3
例1の一般手順に従って実施した細胞溶解を、異なる試薬を用いて実施し、濁度低減および溶解効率の観点から比較した。注目すべきことに、1% TDAOおよび0.5 NaClの組み合わせは、0.5M NaClまたは0.5% Triton X-100のみの単一の試薬と比較して、より早くおよびより完全な細胞溶解を生成した。(表2)。
例1の一般手順に従って実施した細胞溶解を、異なる試薬を用いて実施し、濁度低減および溶解効率の観点から比較した。注目すべきことに、1% TDAOおよび0.5 NaClの組み合わせは、0.5M NaClまたは0.5% Triton X-100のみの単一の試薬と比較して、より早くおよびより完全な細胞溶解を生成した。(表2)。
表2における各濁度は、1~3バイオリアクター×2測定の平均である。PT=トランスフェクション後(post transfection)。溶解前に、濁度はHEK293由来の細胞について300~400 NTUおよびHEK293T由来の細胞について500~600 NTUであった。細胞計数を溶解前および溶解後30分にてViCell XRによって行い、%細胞溶解を溶解前の合計細胞に対する溶解された細胞の比率として算出した。
例4
0.5M NaClと組み合わせるTDAOの最適な濃度を調査するために、0~4%のTDAOを使用し、60分の追加の溶解時間を包含する、AAV2解離試験を実施した。図3に示されるとおり、TDAOの0.5M NaClへの添加によるAAV2解離の少なくとも3~5倍の増加が前述同様に確認され、0.5% NaClとの組み合わせにおいて、2% TDAOの最適な濃度が同定された。さらにまた、90分の最適な溶解時間が、ゲノム力価に基づき、前述同様に確認された。物理的な力価に対するゲノム力価の比率としての%完全ウイルス粒子(vp)を算出するとき、2% TDAOはまた、未知の機構に起因する、溶解後90分にての~100%完全VPを伴う、完全ウイルス粒子の放出を経時的に進めたことが注記される(図4)。
図3において、各バーは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。図4において、各バーは、1つの実験からの1のデータのみを提示する。
0.5M NaClと組み合わせるTDAOの最適な濃度を調査するために、0~4%のTDAOを使用し、60分の追加の溶解時間を包含する、AAV2解離試験を実施した。図3に示されるとおり、TDAOの0.5M NaClへの添加によるAAV2解離の少なくとも3~5倍の増加が前述同様に確認され、0.5% NaClとの組み合わせにおいて、2% TDAOの最適な濃度が同定された。さらにまた、90分の最適な溶解時間が、ゲノム力価に基づき、前述同様に確認された。物理的な力価に対するゲノム力価の比率としての%完全ウイルス粒子(vp)を算出するとき、2% TDAOはまた、未知の機構に起因する、溶解後90分にての~100%完全VPを伴う、完全ウイルス粒子の放出を経時的に進めたことが注記される(図4)。
図3において、各バーは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。図4において、各バーは、1つの実験からの1のデータのみを提示する。
例5
AAV9懸濁液の上流のプロセスを、例1におけるとおり、しかし両方の単一の試薬およびNaClと組み合わせる二重の試薬を使用して実施する。図1におけるAAV2結果とは対照的に、単一の洗浄剤TDAOまたはTriton X-100のいずれかが、0.5M NaClのみと比較して、AAV9解離を2~5倍増強した(図5)。しかしながら、1% TDAOと比較して2% TDAOを用いる二重の試薬について何らの利益も観察されなかったが、図2におけるAAV2結果と同様に、1% TDAOおよび0.5M NaClの組み合わせが、夫々の単一試薬と比較して、AAV9解離の2~17倍の増加が促進した(図5)。これらの結果は、AAV9およびAAV2は異なる方法において異なる細胞構成要素と相互作用をする可能性があるが、TDAOおよびNaClの組み合わせがこれらの異なる血清型のAAV解離を促進し得ることを実証した。また、AAV2とAAV9との間において、TDAOおよびNaClの組み合わせが、単一の試薬よりも、はるかにより高い%完全VPを伴う完全なウイルス粒子の放出が進めたことが一致している。
それにもかかわらず、かかる現象についての内在する機構は目下未知である。
図5において、各バーは2希釈×2アッセイウェルまたは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。図6において、各バーは、1つの実験からの1のデータのみを提示する。
AAV9懸濁液の上流のプロセスを、例1におけるとおり、しかし両方の単一の試薬およびNaClと組み合わせる二重の試薬を使用して実施する。図1におけるAAV2結果とは対照的に、単一の洗浄剤TDAOまたはTriton X-100のいずれかが、0.5M NaClのみと比較して、AAV9解離を2~5倍増強した(図5)。しかしながら、1% TDAOと比較して2% TDAOを用いる二重の試薬について何らの利益も観察されなかったが、図2におけるAAV2結果と同様に、1% TDAOおよび0.5M NaClの組み合わせが、夫々の単一試薬と比較して、AAV9解離の2~17倍の増加が促進した(図5)。これらの結果は、AAV9およびAAV2は異なる方法において異なる細胞構成要素と相互作用をする可能性があるが、TDAOおよびNaClの組み合わせがこれらの異なる血清型のAAV解離を促進し得ることを実証した。また、AAV2とAAV9との間において、TDAOおよびNaClの組み合わせが、単一の試薬よりも、はるかにより高い%完全VPを伴う完全なウイルス粒子の放出が進めたことが一致している。
それにもかかわらず、かかる現象についての内在する機構は目下未知である。
図5において、各バーは2希釈×2アッセイウェルまたは3アッセイウェルの平均を提示し、エラーバーは標準偏差である。図6において、各バーは、1つの実験からの1のデータのみを提示する。
Claims (15)
- アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子またはアデノウイルス(AdV)粒子を包囲する細胞を溶解させる方法であって、該細胞の懸濁液を、細胞溶解と細胞からのAAVまたはAdV粒子の放出とを促進するアルキルジメチルアミンオキシドを含む有効量の組成物に接触させることによる、前記方法。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)またはアデノウイルス(AdV)のウイルス粒子を包囲する細胞を含む試料からウイルス粒子を精製するための方法であって、
a) 細胞およびウイルス粒子の懸濁液を、細胞溶解と細胞からのウイルス放出とを促進するアルキルジメチルアミンオキシドを含む有効量の組成物に接触させること、
b) ウイルス粒子を単離すること、および/または、精製すること
による、前記方法。 - 組成物が、LDAO(ラウリルジメチルアミン-N-オキシド)および/またはTDAO(テトラデシルジメチルアミン-N-オキシド)および塩化ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- ステップa)において、細胞を組成物に30~180分間接触させることを特徴とする、請求項2または3に記載の方法。
- ウイルス粒子が、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子であることを特徴とする、請求項2~4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)において得られた、細胞およびウイルス粒子の懸濁液と有効量の組成物との混合物における、アルキルジメチルアミンオキシドの濃度が、1%(w/w)と4%(w/w)との間であることを特徴とする、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)において得られた、細胞およびウイルス粒子の懸濁液と有効量の組成物との混合物における、K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+から選択される金属カチオンおよびF-、SO4 2-、HPO4 2-、アセタート、Cl-から選択されるアニオン性構成要素を含む塩の濃度が、0.05mol/lと1mol/lとの間であることを特徴とする、請求項2~6のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が、アルキルジメチルアミンオキシドおよび塩化ナトリウムを含む水性溶液であることを特徴とする、請求項2~7のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物におけるアルキルジメチルアミンオキシドの濃度が、10%(w/w)と30%(w/w)との間であることを特徴とする、請求項2~8のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物における塩化ナトリウムの濃度が、1mol/lと6mol/lとの間であることを特徴とする、請求項2~9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)が、濾過ステップおよび/または遠心分離ステップを含むことを特徴とする、請求項2~10のいずれか一項に記載の方法。
- 本発明の方法が、以下のステップ:
- 清澄化および濾過
- 透析および透析濾過
- ヌクレアーゼ、例としてRNaseおよび/またはDNaseを用いる処置
- クロロホルムを用いる処置
- イオン交換クロマトグラフィー
- 親和性クロマトグラフィー
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー
- 遠心分離
- PEG沈殿
の1以上を含むことを特徴とする、請求項2~11のいずれか一項に記載の方法。 - 1以上のアルキルジメチルアミンオキシドと、K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+から選択される金属カチオンおよびF-、SO4 2-、HPO4 2-、アセタート、Cl-から選択されるアニオン性構成要素を含む塩とを含む、組成物。
- 組成物が、10%(w/w)~30%(w/w)TDAOおよび/またはLDAOと1mol/l~6mol/l NaClとを含む水性溶液であることを特徴とする、請求項11に記載の組成物。
- 請求項13または14に記載の組成物ならびにヌクレアーゼを含む、キット。
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